Misurazione ottica di pH e DO in sistemi monouso

Technical Note
Misurazione ottica di pH e DO
in sistemi monouso
I sensori ottici della Sartorius Stedim Biotech permettono una
misurazione non invasiva del valore di pH e dell’ossigeno disciolto.
I sensori sono integrati in diversi sistemi. Nell’UniVessel® SU le
strisce sensore si trovano sul fondo del recipiente monouso e qui
vengono lette direttamente mediante elementi optoelettronici
a raggio libero. Nel Cultibag RM e STR le strisce sensore sono
applicate sulla parete flessibile della sacca oppure per mezzo
di una porta per sensore. Qui ha luogo la lettura mediante un
cavo a fibre ottiche. Tutti i sistemi sono concepiti per processi di
coltura cellulare e fermentazione microbica scalabili a partire
dallo sviluppo del progetto fino al livello produttivo.
Per la produzione di prodotti biofarmaceutici il monitoraggio di
parametri critici è un fattore decisivo per garantire gli standard di qualità
e di sicurezza. Grazie alla soluzione offerta da Sartorius Stedim Biotech
è possibile rilevare online due parametri di processo critici in un sistema
di sensori monouso durante il processo.
La misurazione della concentrazione di ossigeno disciolto svolge un ruolo
fondamentale nei processi con cellule vive (microrganismi, colture cellulari). Il valore di DO (termine inglese per ossigeno disciolto) è una misura
indicante la percentuale di ossigeno disciolto contenuto nel mezzo del
processo. Per la maggior parte delle cellule vive l’ossigeno è indispensabile
e viene consumato da queste per la produzione di metaboliti durante
il metabolismo. Affinché vi sia un apporto ottimale di ossigeno verso le
cellule, si deve misurare e regolare l’ossigeno in modo continuo durante
il processo. Differentemente dai metodi tradizionali, con il principio di
misura ottico non vi è un consumo di O2 nel mezzo durante la misurazione. La misurazione è indipendente dal valore di pH e dalla forza ionica e
pertanto può avere luogo senza alcun problema nell’intero range del
valore di pH.
(1)
(2)
Un ruolo di pari importanza viene svolto dalla misurazione del valore
di pH. Con questa misurazione si può misurare e regolare in continuo
il rapporto acido o alcalino. Grazie ai sensori SU ottici, il valore di pH,
che è uno dei parametri di processo rilevati più di frequente, può essere
misurato in tempo reale senza ricorrere al prelievo di campioni.
(3)
Figura 1:
Sistemi della Sartorius Stedim Biotech GmbH con sensori di pH e DO.
(1) UniVessel® SU, (2) Cultibag RM, (3) STR
Applicazione
I sensori SU ottici sono già precalibrati, i parametri di calibrazione specifici del lotto di sensori sono riportati sull’etichetta di calibrazione applicata alla sacca. Dopo un tempo
di equilibrazione di 2 ore nel mezzo del processo per raggiungere un equilibrio della temperatura e di CO2 viene
eseguita una calibrazione iniziale. Il motivo di questa calibrazione è dato dalle differenze del mezzo del processo
rispetto al sistema di riferimento, nel quale sono stati
determinati i parametri di calibrazione. Per la calibrazione
iniziale del sensore di DO, il mezzo viene insufflato con aria
e il sistema rileva il valore al 100% di saturazione di aria.
Per la calibrazione iniziale dei sensori di pH viene misurato
esternamente un campione che funge da riferimento e il
valore viene inserito nel menu di calibrazione.
Operazioni da eseguire prima dell’avvio del processo
– I sensori devono rimanere a contatto con il mezzo alla
temperatura di processo per 2 ore
– Inserimento o scansione dei parametri di calibrazione
– Sensore di pH: f(min), f(max), dpH, dp0
– Sensore di DO: Phi (100 % sat. aria), Phi (0 % sat. aria)
– Calibrazione iniziale di entrambi i sensori
Composizione del sensore di pH
In questo caso si deve fare attenzione che la misurazione
del campione di riferimento venga eseguita in tempo reale
con un elettrodo di pHin vetro, alla stessa temperatura e
senza effetto dell’oscillazione, poiché, altrimenti, la misurazione potrebbe essere falsata a causa del comportamento
di reazione e dall’emissione di CO2 nel campione. Inoltre
prima della misurazione di riferimento si deve eseguire una
calibrazione a due punti dell’elettrodo di pH in vetro.
Si consiglia di eseguire ogni giorno una ricalibrazione dei
sensori di pH. Allo stesso modo la ricalibrazione è necessaria qualora la forza ionica del mezzo venga modificata a
seguito dell’aggiunta di mezzi di alimentazione. Ai fini della
ricalibrazione il valore di pH nel mezzo viene determinato
esternamente e poi inserito nel sistema mediante il menu di
calibrazione.
– Matrice polimera con due coloranti legati
– Indicatore di pH: derivato della fluorescina idrofobo sensibile
al pH con efficienza quantica e fotostabilità elevate
– Riferimento: complesso Rudpp integrato in nanoparticelle
di acrilato
Composizione del sensore di DO
– Matrice polimera con colorante integrato (PtOep)
– Matrice polimera: silicone permeabile all’ossigeno
– Colorante: PtOep con efficienza quantica elevata, grande
spostamento di Stokes, lunga durata della luminescenza
– Isolamento ottico nero
– Nessuna sensibilità incrociata rispetto a metanolo ed etanolo
Figura 2:
Etichette di calibrazione per il sensore di pH
e di DO con i parametri di calibrazione specifici
del lotto
Principio di misura
La determinazione del valore di pH e della concentrazione dell’ossigeno
disciolto si basa sul principio della fluorescenza o luminescenza. Le strisce
sensore contengono coloranti fluorescenti che possono essere eccitati
mediante luce a modulazione sinusoidale. Gli elementi optoelettronici
integrati nel sistema DCU, ossia nell’unità di controllo, emettono luce
avente una lunghezza d’onda definita verso le strisce sensore, per cui si
può registrare l’intensità di emissione che dipende dal valore di pH o di O2
attraverso lo spostamento di fase tra il segnale di eccitazione e il segnale
fluorescente. La relazione tra lo spostamento di fase e il tempo di decadimento può essere descritta come segue:
tan = 2π·fmod·τ ↔
Intensità fluorescenza nom.
ϕ Spostamento di fase
fmodFrequenza
τ
Tempo di decadimento
Calibrazione dei sensori di pH ottici
Dopo la sterilizzazione per radiazione con 35 kGy a T= 37°C
i parametri di calibrazione vengono determinati a lotti
come segue.
Dalla funzione di calibrazione sigmoidale vengono determinati per approssimazione quattro parametri di calibrazione
f(min), f(max), dpH e pH0 mediante un adattamento della
curva secondo l’equazione di Boltzmann.
f(min)
f(max)
dpH pH0 eccitazione
emissione
tempo [µs]
Più precisamente, la misurazione ottica del pH si basa sul metodo DLR
(Dual Lifetime Referencing) e quella del valore di DO sulla determinazione
della durata della luminescenza.
limite superiore del campo dei valori
limite inferiore del campo dei valori
pendenza della funzione
punto di inflessione della funzione
I parametri di calibrazione dei sensori di pH ottici devono
trovarsi all’interno del seguente campo di valori:
f(min)
f(max)
pH0
dpH
51.00° - 60.00°
15.00° - 30.00°
6.50 – 7.10
0.45 – 0.70
Calibrazione dei sensori di DO ottici
Metodo DLR (Dual Lifetime Referencing)
Lo spostamento di fase dipende dal rapporto dell’intensità di entrambi
i luminofori. In questo caso l’intensità della fluorescenza dell’indicatore
di pH è l’unico parametro variabile, per cui lo spostamento di fase è
proporzionale alla concentrazione dell’analita.
Eccitazione della luminescenza: 480 nm
Emissione:
570 nm
Per la misurazione DLR lo spettro dell’eccitazione e dell’emissione del
colorante sensibile al pH e del colorante di riferimento si sovrappongono
così che lo spostamento di fase del segnale di emissione rispetto al segnale di eccitazione è dipendente dall’intensità del segnale del colorante di pH.
Determinazione del tempo di decadimento della luminescenza
L’emissione dipende dalla concentrazione di ossigeno, poiché l’ossigeno
molecolare ha la capacità di smorzare (quenching) la luminescenza dei
luminofori. Durante lo smorzamento lo stato eccitato del colorante viene
disattivato dalla collisione con le molecole di ossigeno. Questo processo
viene anche detto quenching dinamico della fluorescenza.
Eccitazione della luminescenza: 505 nm
Emissione:
630 nm
La correlazione tra la concentrazione di ossigeno e la durata
della luminescenza è data dall’equazione di Stern‑Volmer.
I0
Intensità della luminescenza in assenza di O2
I
Intensità della luminescenza in presenza di O2
τ0Tempo di decadimento della luminescenza
in assenza di O2
τTempo di decadimento della luminescenza
in presenza di O2
Ksv
Costante di Stern-Volmer
pO2 Concentrazione di ossigeno disciolto
Durante la calibrazione dei sensori di DO i parametri di
calibrazione vengono generati con l’equazione di
Stern-Volmer. A tale scopo i sensori di DO vengono letti
con l’ossigeno al 100% (21% di pO2) e con l’ossigeno allo
0% e i valori di misura vengono registrati in un diagramma.
L’equazione permette di calcolare mediante la relazione
lineare la costante di Stern-Volmer (pendenza).
Specifiche dopo la sterilizzazione per radiazione
con 35 kGy
Sensore di pH
Sensore di DO
Campo di misura 6,0 – 8,0
0 – 110 % a 37 °C
Risoluzione
± 0,01 unità di pH
0,01 % di
saturazione aria
Precisione
0,1 pH in ± 0,50
unità di pH intorno
al valore della
calibrazione a
1 punto
0,05% all’1% di
saturazione aria
a 37°C
1,0% al 100% sat.
aria
Deriva
<0,1 unità di
pH/giorno
< 0,5 %
di saturazione
aria | vita utile
Campo di
temperatura
5 °C – 45 °C
5 °C – 45 °C
Sensibilità
trasversale
Forza ionica,
piccole molecole
fluorescenti
CL2, SO2,
soluzioni
organiche
Punti di misura* 20.000
200.000
* I punti di misura indicati e le specifiche dei sensori sono
garantiti tenendo in considerazione i disturbi e l’esecuzione di una
ricalibrazione se vi sono valori di misura offline divergenti.
Disturbi
Sensore di pH
Sensore di DO
Incidenza della luce
Le strisce sensore devono essere assolutamente conservate fino all’inizio
del processo nella confezione a tenuta di luce. Se esposti a forte irradiazione luminosa i sensori si danneggiano irreversibilmente e non sono più
utilizzabili. Anche durante il processo l’incidenza luminosa proveniente
da luce parassita deve essere mantenuta più bassa possibile.
Flashes
Durante la misurazione del valore
di pH lo spot del sensore di pH
viene irraggiato con luce a modulazione sinusoidale (flashes) e può
registrare 20.000 punti di misura.
Con una frequenza di misura di
1/min è possibile una misurazione
in continuo per un periodo di circa
14 giorni.
Flashes
Durante la misurazione della pressione parziale dell’ossigeno disciolto
lo spot del sensore di pH viene
irraggiato con luce a modulazione
sinusoidale. Si possono registrare
200.000 punti di misura senza una
deriva di rilievo (0,25%). Con una
frequenza di misura di 10/min
è possibile una misurazione in
continuo per un periodo di circa
14 giorni.
Forza ionica
La forza ionica è una misura per
determinare la concentrazione
complessiva degli ioni in una
soluzione. Se vi è una modifica
della forza ionica (per es. alimentazione discontinua) si deve eseguire tempestivamente una nuova
ricalibrazione del sensore di pH
per compensare l’errore.
Solventi
L’azione di solventi polari e non
polari può polarizzare le molecole
nel mezzo del processo, spostando o
attenuando gli spettri della fluorescenza e la loro intensità. Per questo
motivo la misurazione ottica deve
essere eseguita in mezzi di processo
privi di solventi.
Sostanze fluorescenti
Concentrazioni elevate di piccole
molecole fluorescenti provocano
nella striscia sensore una fluorescenza di fondo. Pertanto l’uso dei sensori
di pH ottici è adatto solo in processi
che presentano una bassa fluorescenza propria.
Sartorius Stedim Biotech GmbH
August-Spindler-Strasse 11
37079 Goettingen, Germany
Phone +49.551.308.0
Fax +49.551.308.3289
www.sartorius-stedim.com
USA Toll-Free +1.800.368.7178
UK +44.1372.737159
France +33.442.845600
Italy +39.055.63.40.41
Spain +34.90.2110935
Russian Federation +7.812.327.5.327
Japan +81.3.4331.4300
Specifications subject to change
without notice. Printed and copyrighted
by Sartorius Stedim Biotech GmbH. | W
Publication No.: SLL1003-i131101
Order No.: 85037-543-02
01 | 2013
2012
Ver. 11

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