ライフテクノロジーズ情報誌 NEXT 8 月号 2014 / August / No.26 NEXT Interview 誰もが使いこなすゲノム編集時代の幕開けへ鍵は、技術の使い分けと新たな基盤技術の開発山本卓氏（広島大学大学院理学研究科数理分子生命理学専攻生命理学講座教授） P. 04 P. 05 TRA-1-60 Alexa Fluor® Conjugate Kit for Live Cell Imaging P. 09 QuantStudio ® 3Dデジタル PCRシステム CD44 Alexa Fluor® 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging P. 10 Lipofectamine ® 3000 Transfection Kit Pluripotent Stem Cell Immunocytochemistry Kit P. 13 EVOS ® FL Auto Imaging System with Onstage Incubator 3-Germ Layer Immunocytochemistry Kit P. 14 Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit（ prototype ） P. 15 StemPro ®-34 SFM P. 07 GeneArt ® Elements™ Vector Construction P. 08 Ion Chef™ システム & Ion Reporter™ ソフトウェア Invitrogen™ Next_26.indd 1 Vybrant ® DyeCycle™ 、FxCycle™ 試薬 LIVE/DEAD ® Fixable Dead Cell Stain キット P. 06 Applied Biosystems® P. 18 Gibco® Molecular Probes® Western Dot ® 二次抗体 Novex® Ambion® Ion Torrent™ 14/07/24 13:51 NEXT Interview page 02 誰もが使いこなすゲノム編集時代の幕開けへ鍵は、技術の使い分けと新たな基盤技術の開発山本卓氏（広島大学大学院理学研究科数理分子生命理学専攻生命理学講座教授） 2013 年 1 月、作成が容易なゲノム編集技術として CRISPR/Casシステムが登場、ゲノム編集技術の一般化が大きく加速します。広島大学の山本卓氏は、2008 年からZFN ※ 1 を使ったゲノム編集技術にいち早く取り組み、続く第二世代の TALEN ※ 2 の改良を手掛けつつコンソーシアムを立ち上げ、多くの研究者の技術利用を強力にサポートしてきました。ゲノム編集に精通する山本氏に、この技術を使いこなすための重要なポイントや今後の展開を伺いました。使いやすく、効率の良いくいきませんでしたが、Z F N で培った経導入効率で遺伝子を改変することを報告ゲノム編集技術の開発験やアッセイ系を活用し、TA L E N の系をしました。「なるべく多くの研究者が使え半年で立ち上げました」と山本氏。時を置るように、技術開発に取り組みました。ま 2010 年、第二世代のゲノム編集技術としかず、TA L E N の D N A 結合モジュールのた研究者有志に声をかけて『ゲノム編集コて TA L E N が報告された頃、山本氏の研アミノ酸配列を改変し、培養細胞におけンソーシアム』を立ち上げました。人工ヌ究室では、Z F N の実験を進めていました。る活性評価を行うことで高い活性を持つクレアーゼ（ TA L E N ）の作製および様々「その時、苦労しながら Z F N の実験を進 P l a t i n u m TA L E N を開発、効率的に作な生物でのゲノム編集利用の支援、情報めていた大学院生が TA L E N の方が格段製するシステムとして P l a t i n u m G a t e 提供を行うことによって、日本のゲノム編と使いやすそうだと言うのを聞き、早速 system を独自に確立します。そしてカエ集のレベルアップを図るためです」と山本試すことにしました。最初はなかなかうまルやラットにおいて 50% 以上の高い変異氏は語ります。 Next_26.indd 2 14/07/24 13:51 開発 page インタビュアー：ライフテクノロジーズサイエンスコミュニケーター橋本裕子 03 ゲノム編集技術との出会いテムの登場を「これからは P C R 法のように、ゲノム編集も多くのラボで日常的に長年の研究テーマは、発生に関する遺伝子使われる技術になるだろう」と予想します。の転写調節機構。「大量の同調胚を採取で Z F N や TA L E N は、D N A 結合部位とヌクきる棘皮動物のウニなどをモデルにして発レアーゼからなる融合タンパク質ですが、生という現象を定量的に捉えたい。そのた CRISPR/Cas システムでは RNA が標的めに数理的アプローチで発生過程におけ配列を認識します。RNA 誘導型ヌクレアーる遺伝子発現の調節機構を調べたりしてゼなので、ガイド役の RNA を作り変えればいました」と山本氏。「しかし10 年くらい前標的ごとに融合タンパク質を作る必要がなは、発生過程をスナップショット的に解析すく、複数の遺伝子を一度に改変することもるのが精いっぱい。進展するイメージングできます。山本氏の研究室でも 7 つのガイ技術を利用し、生きたままの透明のウニ胚ドRNA を 1 つのベクターに組み込むシステの遺伝子発現をリアルタイムに追跡できムを開発しました。「短時間で比較的容易ないか、機能に影響を与えずに標的遺伝子に作成でき、同時に複数の遺伝子破壊もでに 1 コピーだけレポーター遺伝子を入れるきることから、基礎研究ばかりでなく、網羅方法がないか、と常々考えていました。そ的な遺伝子破壊や潜伏中のプロウイルスんな時、Z F N という技術を知り、これしかの不活化など、医学研究への応用も広がっないと思い、早速大学院生に試してもらうゲノム編集を利用し、生きたままのウニ胚で遺伝子発現を可視化 ZFN で GFP 遺伝子をETS1 遺伝子座にノックインし、受精 30 時間後のウニ胚。下の蛍光画像の真ん中は非特異的な蛍光、周辺に見える複数の小さな緑のドットがETS1 遺伝子を発現中の細胞。上は明視野写真。Proc Natl Acad Sci USA, 109: 10915-10920, 2012 ている」とその影響の大きさを語ります。組み合わせ、薬物代謝関連遺伝子を一気にことにしたのです」。しかし、いざ始めてみ「ただしCRISPR/Cas システムでは、ガイると手間と高度な技術が必要なことがわかド R N A が認識するのは片方の D N A 鎖のれ以外にも農水産関係や藻類をはじめとすります。ZFN による塩基の認識機構は 1 モみ。オフターゲットのリスクを考慮する必要るバイオエネルギー開発など、CRISPR/ があるので、ゲノムが未解読だったり、ゲノ Cas システムと同様、その可能性は計り知しかも複数のモジュールジュールで 3 塩基、を連結すると干渉しあい、各モジュールの特異性が変化してしまいます。様々な組み合わせを試すために、ジンクフィンガーのランダムライブラリーをゼロから作り上げるなど、大学院生とともに試行錯誤を繰りムサイズが大きな生物の場合は、改変個所れません。これから世界中で様々なチャレを確認できないかもしれず注意が必要でンジが始まりますが、やはり大事なのは、ゲす。さらに認識個所付近には 3 塩基の PAM ノム編集のような基盤技術の開発だと思い配列が必要という制約があるので、遺伝子ます」と山本氏は語ります。の調節部位を特異的に狙う場合など、細や返したそうです。「 2 年ほどかかりましたが、かなゲノム編集には向かないかもしれません」とアドバイスします。その努力が実って 2010 年にノックアウト、2 年後には念願のレポーター遺伝子のノックインを報告しました。個体レベルで ZFN を使ったノックインの成功例は、世界的にも数えるほどしかありません」と山本氏は貴重な研究について語ります。第三世代のゲノム編集技術の衝撃 Z F N 、TA L E N とゲノム編集技術を素早く使いこなし、多くの共同研究を推進してきた山本氏。彼は C R I S P R / C a s シス若い研究者の方へ「生命現象の解明には精緻なゲノム改変はそれぞれの特徴を知り、必要不可欠で、ゲノム編集はそのための有さらに強力に研究を進める効な技術になります。ゲノム編集技術の開発は、米国、中国、韓国を中心に進められて「これに対して TA L E N のヌクレアーゼのいて日本は遅れをとっていますが、海外の Fok1 は、二量体化して始めて二重鎖 DNA 編集ツールの開発や改変技術開発は、必ずを切断します。そのためオフターゲットのリしも現場の研究と直結していないように感スクが低く、ヒトへの応用が期待されるES じています。国内での技術開発体制を構築細胞や iPS 細胞でのゲノム編集に適していし、ライフサイエンス研究に役立つ全く新そうです。特に私が注目しているのは、エピしいゲノム編集技術を一緒に開発したいでゲノム編集。DNA 認識部位であるTALE は、すね」と山本氏は若い研究者へエールを送ヌクレアーゼだけでなく、別の機能ドメインります。とも融合できます。ゲノムを修飾する様々 ※ 1 ZFN:zinc-finger nuclease な酵素と融合させればゲノム配列はそのままで、修飾部分のみを自在に変化させるこ ※ 2 TALEN:transcriptional activator-like effecter nuclease とができるはずです。例えば、がんになりに山本卓（やまもとたかし）くいエピゲノム修飾を導入することで新し 1989 年広島大学理学部生物学科動物学専攻卒業い治療への道も開けるかもしれません。また広い領域へ多数の遺伝子を導入することにも興味があります。例えば人工染色体と Next_26.indd 3 導入できれば、創薬にも貢献しそうです。そ後、同大大学院理学研究科動物学専攻。博士（理学）。 1992 年熊本大学理学部助手、2002 年広島大学大学院理学研究科講師、2003 年助教授を経て、2004 年同大学教授に就任。現在へ至る。 14/07/24 13:51 Gibco® page 04 多能性幹細胞研究に最適な試薬と培地のベストマッチ！Gibco ® と M iPS 細胞は再生研究の要であり、リプログラミングや多能性細胞としてのキャラクタリゼーションの確認は、その後の研究の基盤ともなるステップです。また未分化状態の確認や、効率的な分化は、これからの再生研究の発展に欠かせません。この度、Gibco ® の細胞培養における豊富な経験とMolecular Probes ® の高精度な細胞イメージング技術を結集し、多能性幹細胞研究のキーステップに便利な 4 種類の製品を開発しました。一連の再生研究を再現性良く進めるためには、信頼のキットで各ステップを確認しつつ推進することをお勧めします。このような作業により、無駄な実験が省け、最終的な効率向上へつながります。多能性幹細胞を生きたままで高感度に検出！ NEW! ■ TRA-1-60 Alexa Fluor Conjugate Kit for Live Cell Imaging ■ CD44 Alexa Fluor ® 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging ® ヒト多能性幹細胞マーカー TRA-1-60 や CD44 を特異的に検出するキットです。※ CD44 のキットはマウスでも使えます。 ●生細胞の健康さを維持できるFluoroBrite™ 培地 ●光シグナルを最大化するAlexa 修飾抗体 ● 37 ℃、30 分のインキュベート後、培地洗浄だけのシンプルなプロトコール ●扱いやすいアジ化ナトリウム不含のキット TRA-1-60 Alexa Fluor ® 594 Conjugate Kitを用いた iPS 細胞の生細胞イメージング Gibco ® iPSCs（ Cat. No. A18945 ）をマウス胚フィーダー細胞層上で培養後、AlexaFluor ®標識した繊維芽細胞マーカー CD44 の抗体と多能性幹細胞マーカー TRA-1-60 の抗体と反応。FluoroBrite™ DMEM（製品番号 A1896701 ）へ培地交換後、EVOS ® FLシステム（ AMF4300 ）でイメージングしました。製品名サイズ製品番号価格 TRA-1-60 Alexa Fluor® 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging 50回分（ 8ウェルチャンバースライド） A25618 ¥40,000 TRA-1-60 Alexa Fluor® 555 Conjugate Kit for Live Cell Imaging 50回分（ 8ウェルチャンバースライド） A24879 ¥40,000 TRA-1-60 Alexa Fluor® 594 Conjugate Kit for Live Cell Imaging 50回分（ 8ウェルチャンバースライド） A24882 ¥40,000 CD44 Alexa Fluor® 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging 50回分（ 8ウェルチャンバースライド） A25528 ¥40,000 最適化された多能性幹細胞マーカー 2 重染色キット NEW! ■ Pluripotent Stem Cell Immunocytochemistry Kit ヒト多能性幹細胞のキャラクタリゼーションに重要な 4 種のタンパク質（ OCT4, SOX2, SSEA4, TRA-1-60 ）を検出します。 ● O C T 4 + S S E A 4 + D A P I 、S O X 2 + T R A - 1 - 60+DAPI のマルチプレックス検出が可能 ●フィーダー細胞の有無に関係なく使用できます ●洗浄ステップはたったの一回。時間節約だけでなく、細胞の損失を回避します。（ 1 次抗体と 2 次抗体のインキュベーション後のみ） 4 種類のマーカーを蛍光染色した iPS 細胞 CD34+ 臍帯血由来の iPS 細胞（ Gibco ® Human Episomal iPSC Line, Cat. No. A18945 ）を Essential 8™ 培地（ Cat. No.A1517001 ）およびビトロネクチン（ Cat.No.A14700 ）でフィーダーフリー培養後、PSC 4-Marker ICC Kitで染色しました（左：OCT4 とSSEA4 、右：SOX2とTRA-1-60 ）。 Next_26.indd 4 製品名サイズ製品番号価格 Pluripotent Stem Cell 4-Marker Immunocytochemistry Kit 10回分（ 8ウェルチャンバースライド） A24881 ¥74,000 Pluripotent Stem Cell Immunocytochemistry Kit（ SOX2, TRA-1-60 ） 10 回分（ 8ウェルチャンバースライド） A25525 ¥48,000 Pluripotent Stem Cell Immunocytochemistry Kit（ OCT4, SSEA4 ） A25526 ¥48,000 10 回分（ 8ウェルチャンバースライド） 14/07/24 13:51 page Molecular Probes® 05 co ® とMolecular Probes ® が、再生研究を加速します。 TRA-1-60 Alexa Fluor® Conjugate Kit for Live Cell Imaging CD44 Alexa Fluor® 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging ドナー細胞選定 3-Germ Layer Immunocytochemistry Kit リプログラミング iPS 細胞培養分化 PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit（ prototype ） Pluripotent Stem Cell Immunocytochemistry Kit ヒト多能性幹細胞の 3 胚葉分化能解析に最適！ NEW! ■ 3-Germ Layer Immunocytochemistry Kit ヒト多能性幹細胞から自然に分化した胚様体を 3 胚葉に特徴的なマーカーで検出します。 ●明るく光安定性の高い Alexa Fluor ®で修飾した抗体でヒト多能性幹細胞（ hPSC ）の未分化状態をチェック ※ 外胚葉：β I I I チューブリン（ T U J 1 ）、中胚葉：平滑筋アクチン（ SMA ）、内胚葉：α-フェトプロテイン（ AFP ）の各抗体で検出 ● 洗浄ステップはたった一回。時間節約だけでなく、細胞損失を回避します。（ 1 次抗体と 2 次抗体のインキュベーション後のみ） 3-Germ LayerICC Kit で染色した H9 由来細胞 Geltrex ®（ A1569601 ）でコートした96ウェルプレート上でKnockOut™ Serum Replacement（ 10828028 ）とDMEM/F12 培地中で17 ∼ 20日間ランダムに分化させたH9 由来の胚葉体を3-Germ Layer ICC Kitで染色しました（左： SMAとAFP 、中： TUJ1と AFP 、右：TUJ1とSMAとAFP ）。製品名サイズ製品番号価格 3-Germ Layer Immunocytochemistry Kit 20 回分（ 8ウェルチャンバースライド） A25538 ¥74,000 わずか 8 日間で、多能性幹細胞を高品質な拍動心筋へ NEW! ■ PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit（ prototype ）多能性幹細胞から心筋細胞分化へのワークフローヒト多能性幹細胞を心筋細胞へ分化させるキットです。血清や動物性由来成分を含まない 3 種類の培地から多能性幹細胞の培養 / 増殖構成されています。 ●短期間で心筋細胞を産生：わずか 8 日間で心筋細 Essential 8™ Medium （A1517001） 0-2日中胚葉へのコミットメント Medium A 2-4日心臓中胚葉への誘導 Medium B 4-14日心筋細胞への成熟 Medium 胞を産生、15 日以上維持できます。 Human Cardiomyocyte ICC kit（A25973）分化 10日目の心筋細胞の染色画像 ●質の高い心筋細胞： TNNT2, Nkx2.5, MYH6, 緑：TNNT2 α-actinin 等主要な心筋マーカーを発現します。ピンク：Nkx2.5 ●手間を省いた設計：融解・希釈不要な 1×培地。温めたらすぐに使用できます。キーマーカーによる分化確認青：DAPI PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit 製品名サイズ製品番号 PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit（ prototype ） 1 キット A25042-SA ¥39,800 価格 500ml A25037-DJ ¥11,000 構成品 : Cardiomyocyte Differentiation Media A（ prototype ）100ml Cardiomyocyte Differentiation Media B（ prototype ）100ml Cardiomyocyte Maintenance Media A（ prototype ）500ml Cardiomyocyte Maintenance Medium（ prototype ） ※製品名に記載しているプロトタイプという意味は、cGMP 規制下で安定性テストを実施中という意味です。 Next_26.indd 5 14/07/24 13:51 Gibco® page 06 User's Voice 松浦勝久氏（東京女子医科大学先端生命医科学研究所准教授）ヒト iPS 細胞の三次元高密度浮遊培養で再生医療の推進へ細胞凝集塊は StemPro ® -34 SFM 培地で安定に培養ヒト iPS 細胞の再生医療や創薬スクリーニングへの応用には大量培養が必要となりますが、一般的なシャーレでの二次元培養には限界があります。東京女子医科大学の松浦勝久氏らは、iPS 細胞を量産する技術として、高密度の三次元浮遊攪拌培養リアクターの開発を進めています。場合、100ml の培養液中での約 2 週間の組織全体に酸素や栄養を行き渡らせる血分化誘導後、約 1×10 8 個の心筋細胞を得管も一緒に移植する必要があります。同じることができます」と語ります。大学の研究グループが血管付きの筋組織大量培養技術を支えることに成功しています。「将来的には、細胞を作製し、シート状の細胞を多層化させる StemPro ® -34 SFM シート間に血管床を挟み込み、動静脈血「 iPS 細胞を安定的に浮遊培養するためには、凝集塊を作る細胞同士の接着性を維持することが鍵となります。しかも分化に細胞へのストレスを軽減した三次元浮遊撹拌培養法伴い、細胞間の接着性は変化する可能性があります。私たちのグループでは、2011 年ごろよりStemPro -34 SFM を使い ® 「試行錯誤を繰り返し、攪拌装置の大き始めましたが、他の培地と比べて凝集塊をな羽を緩やかに回転させることで、200− 安定化でき、分化後の心筋細胞が機能す 300µm の細胞塊を浮遊させたまま、培地ることも確認できました」と松浦氏。分化を均一化できるようになりました。一定の誘導後の細胞塊は、一度酵素でバラバラ速さで撹拌している間は、ほとんど物理的にしてからシート状に形を整え、移植技術ストレスなく、浮いたままで細胞は増殖をへつなげていくとのこと。細胞の量産化に、続けます」と松浦氏。「この条件の下で生 StemPro ® -34 SFM が貢献しているよう体内の発生過程と同じように、適切なタイです。ミングで特異的な分化誘導因子を加えて管や膵臓の細胞を効率的に分化させるこ機能を有する、より厚みのあるヒト組織へとができます。例えば心筋へ分化させるたとえば移植用の心筋組織を作る場合、いくことで、大量の iPS 細胞から心筋や血管をつなぎとめた組織をヒトiPS 細胞から作ることを目指しています。心臓という臓器は、均一な心筋細胞からできているのではなく、血管や接着性が高い繊維芽細胞など複数の種類の細胞がバランスよく配置されて初めてその機能を発揮します。生体内できちんと機能する組織を、できる限り生体外で構築して移植するという、組織工学的なアプローチで再生医療の実現へ迫りたい」と松浦氏は語ります。松浦氏らが開発中の高密度三次元浮遊攪拌培養リアクター高い増殖能を提供する無血清培地 ■ StemPro ® -34 SFM ヒト造血細胞用に開発された無血清培地です。IMDM+20%FBS など、従来の培地よりすぐれた細胞増殖能を発揮します。骨髄、末梢血、または新生児臍帯血から造血細胞を培養したり、増殖能の高い浮遊細胞などに広く使われています。正常ヒト骨髄について性能テスト済みなので、安心してお使いいただけます。また複数のドナー臍帯血由来の CD34+ 細胞を含むキットも提供しています。このキットには、凍結細胞の融解時に使用する栄養サプリメントも含まれています。製品名サイズ製品番号 StemPro ®-34 SFM（ 1X ） 500 ml 10639-011 StemPro ®CD34+ Cell Kit 1キット A14059 価格 ¥27,300 ¥132,000 構成品：StemPro ®CD34+ cells（ 0.5X10 6cells ）、StemPro ®-34 SFM（ 1X ） StemPro®-34 Nutrient Supplement（ 40X ） Next_26.indd 6 14/07/24 13:51 page Invitrogen™ 07 思い思いのベクターを、人工遺伝子合成技術で構築 ■ GeneArt ® Elements™ Vector Construction NEW! 人工遺伝子技術によるお客様のオリジナルベクター構築サービスです。GeneArt ® オンラインオーダーシステムに登録されている 400 種類以上の GeneArt ® Elements™ DNA パーツ（プロモーターや精製タグ、制限酵素認識サイトなど）や、任意配列を組み合わせながらシステムの中で欲しいベクターを設計します。設計したベクターはそのまま GeneArt ® オンラインオーダーシステム上で発注できます。［特長］ ● 設計の手間を省略：登録済みパーツを選択し、方向性や挿入個所を指定しながらデザイン ● ベクター入手が困難な生物種を研究されているお客様に最適 ● 余分な配列を入れない、ミニマムベクターの構築参考納期：合成困難な配列領域を含まない場合およそ 5kbp で 5 週間∼ 参考価格：ベクターの全長（ bp ）× 88 円∼ ※ ※一部の特別なパーツを含んだり、複雑なアセンブリ法を採用する場合には、追加料金が発生します。具体的な価格はオンラインオーダーシステム www. lifetechnologies.com/genesynthesis でご確認いただくか、弊社オーダーサポート [email protected] までお問い合わせください。 ▶ ベクターのカスタマイズ設計が簡単！ GeneArt ®オンラインオーダーシステムは、直観的に操作できる画面構成なので、ベクター構築を簡便に行えます。リポジトリからパーツを選択し、設計中のベクターへ挿入したり方向性変更やパーツの削除も容易です。しかも 24 時間お客様のパソコンから、いつでもログインして設計、見積、発注できます。この便利なシステムをぜひご利用ください。オンラインオーダー画面の一例お客様の任意の新しい配列も挿入できますベクター設計スペースリポジトリには 400 種類以上のパーツが登録ドラッグ & ドロップで設計中のベクターへ挿入 GeneArt ®オンラインオーダーはこちらから → www.lifetechnologies.com/genesynthesis Next_26.indd 7 14/07/24 13:51 Ion Torrent™ page 08 前処理とデータ解析をアップグレードして、NGS を快適に！ ■ Ion Chef™ システム & Ion Reporter™ ソフトウェア ▶ 次世代システムのワークフロー次世代シーケンスを始めたいけど、前処理やデータ解析に不安を感じていませんか？ Ion Torrent™ システムなら前処理を自動化でき、専門家がいなくても結果を出せる使いやすいデータ解析環境を準備しています。前処理 Ion Chef™ システムシーケンスデータ解析 Ion PGM™ シーケンサ Ion Proton™ シーケンサ Ion Reporter™ ソフトウェア Ion Chef™ システム Ion Reporter™ ソフトウェア次世代シーケンサ用のライブラリーを作製後ライブラリーと次世代シーケンサのラン終了後、サーバー内のデータを Ion 半導体チップをセットすれば、半導体チップを自動で準備し R e p o r t e r ™ ソフトウェアに転送。目的のワークフローを Web 上のアプリケーションで選び、簡単な設定をするだけで、ます。同時に2 チップ準備できるので、半導体シーケンサを 1 日に続けて 2 ランできます。誰でも次世代シーケンサのデータ解析ができ、結果を確認できます。［特長］ ● ● ● 15 分のハンズオンだけの簡単操作 2 ラン分のチップ準備が完全自動化 Ion Torren™ 半導体シーケンサに対応 Ion PGM™ シーケンサ Ion Proton™ シーケンサ［特長］ NGS 専用ワークフローを用意 DNA 変異解析、アノテーションコピー数 / 染色体異数性解析 16Sメタゲノム解析 ● サーバー型とクラウド型（ 100GB まで無料）の 2 タイプの ● 解析環境を提供 Next_26.indd 8 ▶まずはビデオで使いやすさをチェック！ ▶まずはビデオで使い勝手をチェック！ http://youtu.be/qpsd93d2mcc http://youtu.be/BmitoBr4t2o 製品名サイズ製品番号 Ion Chef™ システム一式 4484177 ¥5,700,000 価格 Ion Reporter™ ローカルサーバーシステム一式 IRSERVER-01 ¥6,600,000 Ion Reporter™ ソフトウェア（クラウド型） 100GBまで無料 14/07/24 13:51 page Applied Biosystems® 09 デジタル PCR で、正確な NGS ライブラリーの定量を ■ QuantStudio ® 3D デジタル PCR システム次世代シーケンサのワークフローの中で、テンプレート調製前の精密なライブラリー定量は重要なステップです。ライブラリーの量が多すぎても少なすぎても、シーケンシングの読み取りデータ総量が減り、システム全体の処理能力が低下します。QuantStudio ® 3D デジタル PCR システムは、Ion Torrent™ NGS ライブラリー定量のためにデザインされた TaqMan ® Assay を使い、簡単で正確な定量を行います。 ● 標準曲線やリファレンスサンプルが不要なので、少ないサンプル数でも効率よく定量します。 ● 専用の TaqMan ® Assay が、再現性高く、高精度の定量を可能にします。 ● 密封されたチップベースのデジタル PCR なので、他の核酸のコンタミネーションリスクを最小限に抑えます。 ● コストパフォーマンスに優れたシステムと消耗品により、全体のコスト節約を提案します。 ▶ QuantStudio ® 3D デジタル PCR システムを含む NGS ライブラリー定量ワークフローライブラリー作成ライブラリー定量［ポイント！］テンプレート調整シーケンスデータ解析ライブラリー濃度は、デジタル PCR のレンジに入るように希釈します。一般的には、1X TE で 1：200,000 に希釈したライブラリーをサンプルとして 2µl 使用します。 ※ QuantStudio ® 3D チップには20,000 個のウェルがあり、1ウェルあたり平均 0.1∼ 1.7コピーになるように調製します。この範囲に入らない場合は、希釈率を調節します。 ▶ Ion Torrent™ NGSライブラリー定量のための TaqMan ® Assay フォワードプライマー QuantStudio ® 3D デジタル PCR システム TaqMan ® プローブリバースプライマー Ion PGM™ システム、または Ion Proton™ システム用のライブラリーにおけるP1 アダプターからA アダプターにわたるようにプライマーがデザインされています。そのため両方のアダプター配列を含むフラグメント国内導入台数 100 台突破記念キャンペーン ▶ 従来のリアルタイム PCRと高い相関を確認デジタル PCRとリアルタイム PCR の相関関係サイズの異なる複数のライブラリーをデジタル PCR（縦軸）とリアルタイムPCR（横軸）で定量した結果を右に示します。 dPCR で測定した濃度（ nM ）のみを特異的に検出、定量します。発売以来、大変ご好評をいただき、国内の導入台数が 1 0 0 台を突破します。これを記念して、キャンペーン期間中にシステムをご購入いただいたお客様に、 QuantStudio ® 3D デジタル PCR システム特製グッズをプレゼントします。［プレゼント期間］ 2014 年 12 月26 日弊社受注分まで qPCR で測定した濃度（ nM ）製品名サイズ製品番号 QuantStudio ® 3D デジタル PCR システム GeneAmp ® PCRシステム9700 付き一式 QS3D-GA ¥5,900,000 価格 QuantStudio ® 3D デジタル PCR システム ProFlex™ PCRシステム付き一式 QS3D-PF ¥5,900,000 TaqMan ® Gene Expression Assays, Inventoried 250 反応 4331182 ¥29,800 IonTorrent™ Library Quantification Assay（ Assay ID: Ac04347676_a1）ご注文にはオンラインオーダーシステムへの事前登録が必要です。詳細は弊社ウェブサイトをご覧ください。→ www.lifetechnologies.com/taqman-order Next_26.indd 9 14/07/24 13:51 Invitrogen™ page これまでの試薬とは一線を画すトランスフェクションを ■ Lipofectamine ® 3000 Transfection Kit 10 NEW! ［特長］ ● 優れたパフォーマンス ── 導入困難な細胞から一般的な細胞まで、高い導入効率を実現 ● 細胞生存率の向上 ── 細胞に優しく、低毒性 ● 高い汎用性 ── 1 つの試薬で DNA 、RNA 、co-transfectionに対応本年初めの発売以来、すでに多くの研究者の方々から貴重な情報をいただきました。今後数回シリーズで、本製品のユーザーボイスや実験条件をご紹介します。次はあなたの細胞でも試してみませんか？これまでとは違うアプローチを可能にするパフォーマンスを実感できるはずです。林謙一郎氏（大阪大学医学系研究科医学専攻准教授）上皮間葉転換に関わる MRTF-A/B の細胞内局在メカニズムを探る User's Report / vol.01 Lipofectamin ® 3000 を使い、効率よく血管内皮細胞で発現大阪大学の林謙一郎氏は、平滑筋細胞分化のマスター遺伝子であるmyocardin（ Mycd ）とそのファミリーであるMRTF-A/B の細胞内局在制御の相違やその機能について研究中です。昨年より開始した血管内皮細胞におけるMRTF-A/B の局在制御解析が Lipofectamin ® 3000 を用いて効率良く遺伝子導入が可能になったことで、さらに研究の進展が加速したと語ります。アクチンダイナミズムとMRTF-A/B の細胞内局在 ▼ 「転写補助因子 M y c d が恒常的に核に局在するのに対し、 MRTF-A/B は細胞質に局在し、Rho シグナル依存性に一過的に核移行します。このことから細胞形態に影響するアクチンダイナミクスとMRTF-A/B の細胞内局在は関連しています」と林氏。さらに「 MRTF-A/B が過剰に機能活性化すると上皮細胞は筋上皮細胞（筋線維芽細胞）に形質転換します。この現象を上皮間葉転換と呼んでいます。この結果、コラーゲンなどの細胞外基質を過剰産生して組織の線維化を惹起させたり、運動能が亢進することでがん細胞の転移・浸潤が促進されます。また、動脈硬化巣では血管平滑筋細胞の本来の機能を欠失した脱分化平滑筋細胞の増殖及び運動能の亢進にも MRTF-A の過剰発現が関わっています。この結果、血ところが昨年から始めた血管内皮細胞へのトランスフェクションでつまずいてしまいます。「 Lipofectamin ® 2000 を始め、複数の会社の 4 、5 種類の試薬を使ったり、条件を変えたりしたものの遺伝子導入がうまくいきませんでした。他の研究者に聞いても、血管内皮細胞へのトランスフェクションは難しいと言われ、半ば諦めかけていました」と林氏。そんな時、新しい Lipofectamin ® 3000 を使ってみたそうです。「 6 割ほどの効率でトランスフェクションに成功しました。細胞へのダメージもほとんどなく、血管内皮細胞における細胞内局在をしっかり確認できました。MRTF-A/B は分子量が大きなタンパク質であり、細胞内局在のダイナミックな変化と細胞機能との相関は非常に面白い知見に満ちています」と目を輝かせます。すでに論文も投稿直前とのこと。一気に加速した研究の詳細が楽しみです。管が閉塞する方向へ進むことが知られています」とMRTF-A/B の多彩な機能について語ります。［実験メモ］細胞種：血管内皮細胞（初代細胞を購入後、継代 3 ∼ 4 回目で使用）難しかった血管内皮細胞へのトランスフェクションに成功プロトコル：マニュアル通り ▼ 目的：タンパク質発現と細胞内局在確認そんな林氏の研究で鍵となるのが、トランスフェクションにより細導入効率： 60-70% 細胞コンフルエンシー： 30-40% 胞内で強制発現させた M R T F - A / B の細胞内局在の観察でした。 Next_26.indd 10 14/07/24 13:51 page Invitrogen™ 11 User's Report / vol.02 大西伸幸氏（慶應義塾大学医学部先端医科学研究所遺伝子制御研究部門特任助教）悪性脳腫瘍治療の方法論確立に向けたマウス発がんモデルの構築 Lipofectamine ® 3000 で再現性・導入効率・作業効率が大幅アップ現在も効果的な治療が確立されていない悪性脳腫瘍。これまでの研究はヒトがん細胞株をマウス脳に移植する手法で行われてきました。それに対し、慶應義塾大学医学部の大西伸幸氏らは、より正常に近い細胞を移植し、脳内でのがん化プロセスを調べるマウス脳腫瘍モデルの開発を進めています。新しい研究アプローチでこの難病に挑む大西氏（写真左）にお話を伺いました。脳腫瘍モデルの構築脳内のがん化に関わる責任分子の特定を目指して ▼ ▼ 近年大西氏らのグループはヒト悪性脳腫瘍において高頻度に異「がん遺伝子を導入した iCSC は、培養時は正常な細胞という認識常がみられる Ink4a/Arf 遺伝子欠損マウスの神経幹細胞に H-Ras です。この細胞を脳に移植すると、周囲の細胞との相互作用でがん V12 遺伝子を導入し、マウス脳内に移植することでマウス脳腫瘍モ化が起こると考えています。今後はヒトiCSC をヌードマウス脳内にデルを構築しました。「現在様々ながん遺伝子を導入した神経幹細移植し、がんの発症に関わる遺伝子やシグナル伝達の変化を解析し胞を作製中です。例えば Myc は学部生の松田紘典さん（写真右）ていけば、この仕組みが詳細に分かってくるはずです」と大西氏。正が進めています。また単一の遺伝子を誘導的に発現させることで常細胞が脳内でがん化していく瞬間を、現行犯でとらえられる日もがん化を引き起こすものも含まれています。このようながん遺伝近いかもしれません。子を導入した細胞を私たちは人工がん幹細胞（ induced Cancer 「様々な遺伝子 Stem Cells; iCSCs ）と呼んでいます」と大西氏。を導入した iCSCsによって脳内で細胞がどのようにがん化していく［実験メモ］他社製品 F か、その仕組みを明らかにしたい」と語ります。細胞種：神経幹細胞トランスポゾンへの導入と Lipofactamine ® 3000 の使用で研究を加速プロトコル：マニュアル通り細胞コンフルエンシー： 60-70% 目的：タンパク質発現と移植後のがん化 Lipofectamine ®3000 ▼ これまで遺伝子導入効率が高いレトロウイルスを使い、正常細胞にがん遺伝子を導入してきた大西氏。しかし導入時の細胞へのダ図 1. 導入効率の比較 24 時間後の導入効率をクサビラオレンメージが避けられず、別の方法を試すことに。「レトロウイルス作ジの発色で比較。上は他社製品 F 、下は製細胞の培養時に使用する血清は神経幹細胞を分化させてしま Lipofectamine ®3000 の結果。うので、ウィルス感染時に残存血清を極力減らす努力をしてきました。しかしトランスポゾンへ直接導入すれば血清の混入を排除 MFI でき、細胞樹立の時間も短縮できると考えました。しかし問題は導入試薬。最初に使った試薬は導入効率が低く使えませんでしたが、 Lipofectamine ® 3000 を試したところ、導入効率も細胞あたりの発現量も向上しました（図１、2 ）。さらにこの発現細胞を選択マー Fold カーで濃縮後、レトロウイルス作製細胞と比較すると、驚いたことに今回の導入法の方が細胞あたりの発現量も高かったんです（図 3 ）」。さらに実際にマウスへ移植したところ、「レトロウイルスを使用した場合は腫瘍ができるまで 2 か月弱ほどかかり、死亡する日数にもば他社製品 F Lipofectamine ® 3000 図 2. 遺伝子発現量の比較図 3. 遺伝子発現量の比較遺伝子導入 6 日後の細胞あたりの発現レトロウイルスによる導入（オレンジ）とらつきがありましたが、今回の導入法では 2 週間ほどで同じ日に5 頭量を蛍光量で比較。測定は、Attune ® Lipofectamin ®3000を用いたトランス中 5 頭すべてのマウスが発症し、死亡するという結果を最初の実験 Acoustic Focusing Cytometer でポゾン直接導入法（他社 PiggyBac 使用）行った。（赤）の比較。測定は図 2と同じシステム。で得ました」と大きく加速した研究について話します。製品名サイズ製品番号 Lipofectamine ® 3000 Transfection Kit 0.1 ml L3000001 ¥9,000 Lipofectamine ® 3000 Transfection Kit 0.75 ml L3000008 ¥64,500 Lipofectamine ® 3000 Transfection Kit 1.5 ml L3000015 ¥97,000 Lipofectamine ® 3000 Transfection Kit 1.5 ml × 5 L3000075 ¥430,000 Lipofectamine ® 3000 Transfection Kit 15 ml L3000150 ¥720,000 Next_26.indd 11 価格 14/07/24 13:51 Life Technologies™ page 12 Technical Review E VO S ® F L A u t o イメージングシステムによる傷の治癒過程における細胞分裂とその移動の観察 70 時間にわたる創傷治癒アッセイを新生児ヒト皮膚繊維芽（ HDFn ）細胞（ Gibco ®プライマリー細胞）で観察しました。 EVOS ® FL AutoイメージングシステムにOnstage Incubatorを接続し、Molecular Probes ®の試薬で細胞を検出しました。その結果、細胞が分裂を繰り返し、傷を埋める形で移動することを確認しました。また受傷後すぐ、あるいは治癒進行中の 24 時間および 48 時間目に傷全体のタイリング画像を作成し、 EVOS ® FL Autoイメージングシステムの計測機能により、傷全体の面積を正確に測定しました。［方法］細胞培養条件： HDFn 細胞を 6- ウェルプレート（ 35mm ）に撒いてコンフルエントになるまで培養し、1µM CellTracker™ Red CMTPX でラベルしました。細胞層へのひっかき傷は 20µｌのピペットチップでつけました。タイムラプス撮影： EVOS ® Onstage Incubator を EVOS ® F L A u t o イメージングシステムに設置し、1 0 x 対物レンズと Texas Red チャンネルで撮影しました。システムのタイムラプス機能で、2 時間毎に70 時間画像を取得しました（図 1 ）。タイリングおよびスティッチングスキャン：傷全体の撮影は、4x 対物レンズで行い、システムのスキャン機能を用いて、受傷直後と24 時間後、48 時間後に行いました（図 2 ）。傷全体の面積は測定機能を使用して計算しました。図 1. 受傷後の HDFn 細胞のタイムラプス画像 ※ HDFn 細胞が分裂して、傷の部分への移動するタイムラプス動画を下記サイトからご覧いただけます。 www.lifetechnologies.com/evosflautogallery ［結果および考察］コンフルエントに達したシート状の HDFn 細胞に大きなひっかき傷が確認できます（図 1A 、図 2B ）。図 2 は、一連の画像（ 4x 対物レンズ使用）をタイリングおよびスティッチングすることで、1 枚の画像として表示しています。これにより傷全体を解析したり、測定しました。 EVOS ® FL Autoイメージングシステムの測定機能を使用し、受傷直後の面積は 1.82 x10 7 µm 2でした（図 2A ）。その後、時間の経過とともに、傷の両側の残った細胞が分裂し、傷を埋める形で移動しました（図 1B から1H 、図 2C ）。最終的には新しい健康な細胞で傷全体がほぼ覆われました（図 1Ⅰ、図 2D ）。さらに EVOS ® FL Auto イメージングシステムのタイムラプス撮影や、イメージタイリング機能、イメージスティッチング機能を使うことで、薬剤処理の有無といった条件を変えて、創傷治癒の図 2. より広節な傷をタイリングにより表示した画像現象を効果的に解析することもできます。の面積を計算したり、傷の治癒の進行を観察しました。製品名サイズ製品番号 Human Dermal Fibroblasts, neonatal（ HDFn ） 1バイアル C-004-5C Human Epidermal Melanocytes, neonatal, lightly pigmented donor,（ HEMn-LP ） 1バイアル C-002-5C ¥69,300 C34552 ¥59,600 CellTracker™ Red CMTPX Dye Next_26.indd 12 4x 対物レンズを使用して、24 枚の一連の画像を撮影後、スティッチングにより合成。創傷領域 20 × 50µg Medium 106 500 ml M106500 Low Serum Growth Supplement（ LSGS ） 10 ml S00310 価格 ¥50,500 ¥9,500 ¥12,400 14/07/24 13:51 page Life Technologies™ 13 限りなくシンプルな生細胞イメージング & タイムラプスを実現 ! ■ EVOS ® FL Auto Imaging System with Onstage Incubator EVOS ® FL Auto Imaging System ● タッチスクリーンで、スマートフォンのような直観的な操作性 LED 光源で、起動から観察までをスピーディーに ● ● 画像の貼り合わせやつなぎ合せが簡単 & キレイです EVOS ® Onstage Incubator ● 温度、湿度、CO 2 濃度、O 2 濃度を正確に制御 ● EVOS ® FL Auto Imaging System 専用で設置・取り付けが簡単 ● 充実した Molecular Probes ® 蛍光試薬との最強コンビネーションを発揮製品名 Ⓡ EVOS FL Auto System 対物レンズ Light Cube 4XPh, 10XFl, 20XFl, 40XFl GFP,RFP,DAPI メカニカル XYステージ電動カメラ価格モノクロ & カラー ¥6,800,000 ※上記は組み合わせの 1 例です。用途にあわせて多数のアクセサリーからカスタマイズできます。製品名サイズ製品番号 EVOS ® Onstage Incubator 1式 AMC1000 価格 ¥1,690,000 ※ EVOS Ⓡ FL Auto System 専用です。他のシステムではお使いいただけません。おめでとう若手研究者応援プロジェクトございます！「ライフテクノロジーズジャパン賞」今村公紀氏（京都大学霊長類研究所分子生理研究部門遺伝子情報分野助教）京都大学霊長類研究所の今村公紀氏（写真右）が「第 18 回リバネせたばかりなので、本助成は私にとって非常に大きなサポートとス研究費ライフテクノロジーズジャパン賞」を受賞しました。研究なります」と語ります。大学院時代は、奈良先端科学技術大学院大課題は、「 iPS 細胞を利用した霊長類進化生物学」。マーモセット、学と京都大学再生医科学研究所で山中伸弥氏の研究室に所属し、ニホンザル、チンパンジーなど様々な霊長類から iPS 細胞を樹立し、医学研究だけでなく「進化」を軸に基礎研究への貢献を目指 iPS 細胞誕生の瞬間にも立ち会ったとか。その後慶應義塾大学へ移動し、霊長類におけるiPS 細胞研究の重要性を認識したそうですという内容です。昨年 12 月に移動した研究所で大学院生の北す。今年の夏には、「霊長類への展開へ向けた幹細胞・生殖細胞・島龍之介氏（写真左）と共同研究を進めています。「ヒトに近い霊エピゲノム研究」という研究会をオーガナイズします。マウスから長類から iPS 細胞を樹立することで、一つめはそれぞれの細胞の霊長類へ、再生医療への新たなアプローチが加速します。EVOS ® 特性の違いからヒトとサルの進化を細胞レベルで解き明かすこと、 FLoid ® Cell Imaging Station の貸与と研究費助成が、これか二つめは医療応用のために、霊長類の iPS 細胞について基礎研究らの今村氏の研究に少しでもお役に立つことを願っています。を充実させること」と今後の抱負を語ります。研究会の情報はこちらから → h t t p : / / w w w. p r i . k yo t o - u . 今村氏は今回の受賞について、「独立した研究グループを発足さ ac.jp/research/meetings/2014mt-j.html EVOS の使いやすさをご体験ください ! EVOS ®シリーズは、蛍光顕微鏡を含め全部で 5 機種。すべて使いやすいシステムです ! お申し込みはこちらから → www.lifetechnologies.com/EVOS Next_26.indd 13 14/07/24 13:52 Applied Biosystems® page 14 2014年秋研究を加速する！次世代フローサイトメーター DEBUT! ■ Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer Love it！ Use it! See it! Acoustic Focusing（音響技術）を利用し、高 ▶ 蛍光検出は最大 14 色までまずは web から www.lifetechnologies.com/attune-jp いフローレートで高精度に測定します。しかも 1~4 本のレーザーを選択できます。レーザーとカラーオプションの幅が広がり、驚 ▶ Acoustic Focusing（音響技術）を利用異的なスピードでレアイベントを検出。アナラデータ精度を全く犠牲にせず、短い解析時間で測定イザートップクラスのパフォーマンスが体感でできます。 ▶ 独自開発の使いやすいソフトウェアきます。直感的に操作でき、未経験者からベテランユーザーまで満足いく使い心地です ▶ ラボに適したサイズ実験ベンチにピッタリ収まるサイズ。スペースを有効に使えます。40cm×58cm×43cm（ H×W×D ）［リアルラボ］＠ライフテクノロジーズジャパン株式会社最先端の機器で DNA を調べ、何の肉かを鑑定しよう！ 6 月初めの日曜日、日本科学未来館（東京・お台場）のクラブ Miraikanメンバー 20 名が、弊社共催の特別実験教室に参加しました。内容は 3 種類の肉の小さな切れ端から、PCR 法を使って何の肉かを調べるというもの。一人ひとりが自分で選んだサンプルの解析に挑みました。リアルタイム PCR の説明を真剣に聞いたり、試薬をマイクロピペッターで加えたり、研究者と同じ実験器具や機械を使い、実験ノートにしっかり記録する姿が印象的でした。この日は、私たち社員もグローバルボランティアデイの一環として参加。テクニカルサポートや営業、人事など様々な職種のスタッフが、未来館スタッフと共に実験をサポートしました。ピペットの使い方や、機器の説明など、本当に楽しく新鮮な一日でした！ Next_26.indd 14 14/07/24 13:52 page Molecular Probes® 15 生細胞、固定細胞で正確な細胞周期解析を！ ■ Vybrant ® DyeCycle™ 、FxCycle™ 試薬フローサイトメーター専用 ↓ G0/G1 のピーク ● 正確：生細胞における細胞周期解析 ● 安全：低い細胞毒性のため、セルソーティングを始め、生細胞を用いた実験に最適 ↓ G2/M の S 期ピーク ● フレキシブル：通常のレーザーに対応する複数の色素が利用できます。レーザー蛍光（ nm ）アッセイ数製品番号 UV 461 - H3570 Hoechst 33342 価格 ¥17,000 Vybrant ® DyeCycle™ Violet Stain 405 437 200 V35003 ¥41,200 Vybrant ® DyeCycle™ Green Stain 488 、532 534 200 V35004 ¥41,200 Vybrant ® DyeCycle™ Orange Stain 488 、532 、561 563 200 V35005 ¥41,200 488 、633 686 400 V10273 ¥61,800 405 461 500 F10347 ¥60,000 488 、532 617 200 F10797 ¥18,000 Vybrant ® DyeCycle™ Ruby Stain FxCycle™ Violet 固定細胞用 Jurkat 生細胞を Vybrant ® DyeCycle™ Violet Stain で染色した際、の DNA 含量の分布を示しています。G0/G1 および G2/ M のピークが S 期によって隔てられています。405nm（紫色）励起光と 440/40nm のバンドパスフィルターを使用しました。製品名生細胞用 Vybrant ® DyeCycle™ Violet Stain を使用した細胞周期解析 FxCycle™ PI/RNase Staining Solution FxCycle™ Far Red SYTOX ® AADvanced™ Dead Cell Stain kit 633 658 500 F10348 ¥60,000 488 、532 、561 647 100 S10349 ¥18,000 固定も OK! 細胞の生死判定試薬 ■ LIVE/DEAD ® Fixable Dead Cell Stain キットフローサイトメーター専用原理 ● 固定可能：染色は固定後も保持されるので生死を LIVE/DEAD ® Fixable Dead Cell Stain キットは、反応性の蛍光色簡便な解析と細胞胞内の抗原で解析可能素が細胞タンパク質のアミノ基と反応する性質を利用しています。この反応では、生細胞と死細胞の蛍光強度の違いが 50 倍以上になるので、 ● シンプル：ほとんどすべての染色これら2 つの集団を同時に区別できます。もしくは抗原解析プロトコールが使用できますさらに色素がタンパク質に共有結合するため、細胞内のイムノフェノタ ● 高い柔軟性：UV 、405nm 、488nm 、633nmレーザーに対応する8 色から選択可能イピングや病原体不活性化のために一般に使用されるホルムアルデヒドによる固定後も生死の識別が可能です。死細胞生細胞生細胞と死細胞を明確に区別できます生細胞死細胞付属のプロトコールに従い、生細胞・死細胞が混在する Jurkat 細胞に本キットを使用しました。染色反応後、細胞を 3.7% ホルムアルデヒドで固定し、405nm 励起でフローサイトメトリーで分析しました。生細胞集団と死細胞集団を容易に区別できました。製品名色素は細胞膜を透過できな反応性色素がダメージを受けた膜いので、細胞表面のタンパクを透過し、細胞内部および外部のタ質のみが色素と反応し、弱くンパク質が染色される結果、より強染色されます。く染色されますレーザー蛍光（ nm ）アッセイ数製品番号価格 LIVE/DEAD ® Fixable Blue Dead Cell Stain Kit UV 450 200 L23105 ¥48,000 LIVE/DEAD ® Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit 405 526 200 L34957 ¥48,000 LIVE/DEAD ® Fixable Violet Dead Cell Stain Kit 405 451 200 L34955 ¥48,000 LIVE/DEAD ® Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit 405 575 200 L34959 ¥48,000 LIVE/DEAD ® Fixable Green Dead Cell Stain Kit 488 520 200 L23101 ¥48,000 LIVE/DEAD ® Fixable Red Dead Cell Stain Kit 488 615 200 L23102 ¥48,000 LIVE/DEAD ® Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit 633/635 665 200 L10120 ¥48,000 LIVE/DEAD ® Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit 633/635 775 200 L10119 ¥48,000 LIVE/DEAD ® Fixable Dead Cell Stain Sampler Kit すべてすべて各 40 L34960 ¥55,000 Next_26.indd 15 14/07/24 13:52 Molecular Probes® page 16 Technical Review The New ProLong® Diamond and SlowFade® Diamond Antifade Mou さらに高性能の退色防止効果を持つ封入剤へ Scott Sweeney（ Staff Scientist at Thermo Fisher Scientific ）専門はナノ粒子合成とその機能化研究。現在、アメリカ本社で細胞解析のための新しい蛍光プローブと退色防止剤を開発中。イメージングのワークフローにおいてしばしば見落とされがちですが、は、蛍光色素分子の光化学的な破壊のことです。イメージングの最中固定細胞や組織の最適な蛍光イメージングでは、適切な封入剤の選択や周辺光へさらされたときに蛍光シグナルの減少となって表れ、画像が重要であり、欠くことのできない要素です。ProLong ® Diamond 、の質に大きな影響を及ぼすだけでなく、シグナルの定量や少量のター S l o w Fa d e D i a m o n d および I m a g e - i T N o n - a q u e o u s Mountant をはじめとする、ライフテクノロジーズの封入剤のポートフォリオは、従来のあらゆる色素や、高品質色素、Qdot ® プローブや蛍ゲットのイメージングが困難になります。ProLong ® Diamond お ® ® 光タンパク質に優れた適合性を示し、最高レベルの画像品質と圧倒的なシグナルの保存性を提供します。よび SlowFade ® Diamond 封入剤は、従来の色素（ FITC, Texas Red ® , Cy ® 5 など）や、蛍光タンパク質（ EmGFP, TagRFP など）や、高品質色素（ Alexa Fluor ® 488, Alexa Fluor ® 594 など）を含め、一般的に使用されている蛍光色素分子の不可逆的な光退色を防ぐために開発されました（図 1 、2 ）。光退色を防止する卓越した性能に加え、 ProLong ® Diamond および SlowFade ® Diamond 封入剤は、光これらの封入剤は大変優れた初期蛍光強度とシグナル対バックグラン退色を抑える上で最高の性能を発揮し、蛍光イメージングにおいて優ド比を提供し、目的のターゲットが少量でもイメージングを可能にしまれたシグナルとシグナル対バックグラウンド比を提供します。光退色とす。ProLong ® Diamond は、高倍率の油浸対物レンズでのイメージ ━━ ProLong® Diamond 図 1. 共焦点顕微鏡で取得した、FITC 、Alexa ━━ ProLong® Gold Fluor ® 594 、EmGFP の経時的なシグナル損 ━━ 他社V製品（硬化性）失を示す光退色曲線 ━━ PBS/Glycerol（1:1） ━━ PBS 上段は硬化性封入剤、下段は非硬化性封入剤の結果です。ProLong ® Diamond および SlowFade ® Diamond 封入剤は、あらゆる種類の蛍光色素分子に対して最大の退色防止性能を発揮します。 ━━ SlowFade® Diamond ━━ SlowFade® Gold ━━ 他社V製品（非硬化性） ━━ PBS/Glycerol（1:1） ━━ PBS 図 2. 60 秒毎のタイムラプス撮影画像固定した H e L a 細胞を F I T C - p h a l l o i d i n （ F 4 3 2 ）で標識後、P ro L o n g ® D i a m o n d 、 ProLong ® Gold および 50% PBS/Glycerol でマウント。標準的な 100ワットの水銀アークランプで連続照射、20x 対物レンズを用いて 12 秒間隔で撮影しました。 ProLong ® 封入剤の使用により、光退色に対する耐性の向上が示されました。 Next_26.indd 16 14/07/24 13:52 page Molecular Probes® 17 NEW! ade Mountants for Fluorescence Microscopy へングに理想的な屈折率（ 1.47 ）をもつ硬化性の封入剤です。シグナ硬化性封入剤ル強度をほとんど損なうことなく、顕微鏡観察用サンプルを長期非硬化性封入剤 ProLong® Diamond ProLong® Gold 他社 V製品 DAPI 92% 89% Hoechst 97% 95% EmGFP 94% AF488 アを用いてきちんと密封すれば、SlowFade ® Diamond でマウントされたサンプルは数週間保存することが可能です。間（数週間から数か月）保存するのに適しています。SlowFade Slowfade® Gold V製品 90% 92% 93% 93% 89% 100% 97% 91% 37% 86% 94% 52% 94% 95% 84% 93% 98% 84% 85% FITC 90% 84% 88% 93% 85% 89% BODIPY FL 98% 72% 53% 98% 87% 88% AF546 100% 100% 100% 100% 100% 100% ® Diamond は非硬化性の封入剤で、迅速にイメージングを行うサンプルや、イメージングの後でさらに他の実験のためにサンプルを取り外す必要がある場合などに適しています。ワックスやマニキュ他社 Slowfade® Diamond AF555 95% 93% 90% 94% 92% 90% TagRFP 72% 31% 56% 93% 45% 79% mCherry 72% 63% 70% 72% 71% 72% TRITC 82% 76% 85% 95% 77% 74% ことは避ける必要があります。Q d o t ® プローブのみを使用する Cy3 83% 79% 78% 84% 77% 72% 場合には、溶剤ベースの硬化性封入剤である Image-iT ® Non- AF568 90% 71% 86% 94% 80% 94% aqueous Mountant が適しています。マウントする前にサンプル AF594 99% 96% 94% 99% 94% 93% Texas Red 92% 93% 87% 96% 92% 89% TO-PRO 87% 90% 92% 98% 78% 95% AF647 93% 98% 0% 95% 90% 0% Cy5 100% 100% 94% 96% 100% 90% ただしProLong ® Diamond や SlowFade ® Diamond 封入剤、あるいは退色防止性のあるその他のあらゆる封入剤は、Qdot ® プローブの蛍光を抑制してしまうため、これらを一緒に使用するの脱水を必要とするイメージングワークフローでの使用にも理想的です。この製品は、油浸対物レンズの屈折率に非常に近い屈折率（ 1.49 ）をもつことから、高解像度イメージングを行う際の優れた選択肢となります。素早く硬化する封入剤であるため、マウントし表 1. 褪色防止性能の比較詳細てから1 時間以内でイメージングが行えます。共焦点顕微鏡 15スキャン後、最初の蛍光強度と比較し、パーセントで評価しました。もっとも高性能の試薬の数値のカラムを青で示しました。幅広い蛍光波長において、ProLong ® DiamondとSlowFade ® Diamond 封入剤の退色防止効果が高いことが示されました。あらゆるイメージングワークフローにおいて、ライフテクノロジーズの P ro L o n g ® D i a m o n d 、S low Fa d e ® D i a m o n d および Image-iT ® Non-aqueous Mountants をご使用いただくことで、最高品質の画像を取得することができ、蛍光色素、Qdot ® プローブや蛍光タンパク質のスペクトル全体において、画像から最も意味のあるデータを導くことができます。図 3. 様々な細胞における代表的画像（ A ）染色したHeLa 細胞をSlowFade ® Diamondでマウント詳細はこちらをご参照ください。 www.lifetechnologies.com/antifades Next_26.indd 17 （ B ）ProLong ® DiamondでマウントしたiPS 細胞（ C ）Qdot ® Probe で染色したHUVEC 細胞を Image-iT ® Non-aqueous Mounting Mediumでマウント製品名サイズ製品番号価格 ProLong ® Diamond Antifade Mountant 1 × 2ml P36965 ¥6,000 ProLong ® Diamond Antifade Mountant with DAPI 1 × 2ml P36966 ¥7,000 ProLong ® Diamond Antifade Mountant 5 × 2ml P36961 ¥26,200 ProLong ® Diamond Antifade Mountant with DAPI 5 × 2ml P36962 ¥27,500 SlowFade ® Diamond Antifade Mountant 1 × 2ml S36967 ¥6,000 SlowFade ® Diamond Antifade Mountant with DAPI 1 × 2ml S36968 ¥7,000 SlowFade ® Diamond Antifade Mountant 5 × 2ml S36963 ¥22,600 SlowFade ® Diamond Antifade Mountant with DAPI 5 × 2ml S36964 ¥24,400 Image-iT ® Non-aqueous Mountant 5 × 2 ml I36969 ¥9,500 14/07/24 13:52 Molecular Probes® page 18 ウェスタンブロットで複数の種類のタンパク質を同時検出！ ■ Western Dot ®二次抗体 NEW! 異なる蛍光で標識した二次抗体を組み合わせて使うことで、複数の種類のタンパク質を同一メンブレンで同時に検出できます。リプロービングやストリッピングなどの面倒な作業を省き、二次抗体添加後、別途検出試薬を加える必要もありません。手間とコストを削減し、各種の蛍光検出機器と組み合わせ、新しい Western 検出の道が開けます。図 1. WesternDot ® 二次抗体を用いて目的タンパク質とローディングコントロールを同時検出［特長］ Jurkat 細胞抽出液をバックグラウンドとして、組換え AKT タンパク質の希釈系列を総タンパク質量 5µg に固定してロードしました。ブロットは、マウス抗 AKT 抗体およびウサギ抗 GAPDH 抗体で処理後、WesternDot ® 655 ヤギ抗マウスコンジュゲート（画面上では緑色の疑似カラー）および WesternDot ® 800 ヤギ抗ウサギコンジュゲート（赤色の疑似カラー）と反応後、GE Healthcare FLA9000 イメージャーで画像化しました。 ● 複数のタンパクを同一メンブレン上で同時に検出 ● リプロービング、ストリッピング不要 ● ECL 法と同等の高感度検出図 2. Qdot ® 二次抗体コンジュゲートによる3 種類のタンパク質の同時検出未刺激の A 4 3 1 細胞（レーン 2 - 5 ）および h E G F で刺激した A 4 3 1 細胞（レーン 6–9 ）から得られたライセートの希釈系列（ 20-3µg タンパク質）を含むサンプルを電気泳動後、タンパク質を膜へトランスファーしました。ウェスタンブロットは、マウス抗 EGFR 抗体およびウサギ抗リン酸化 EGFR 抗体、チキン抗 GAPDH 抗体で処理後、（ A ）WesternDot ® 800 ヤギ抗マウス抗体（青の疑似カラー）、（B）（ C ）WesternDot ® WesternDot ® 605 ヤギ抗ウサギ抗体（赤の疑似カラー）、 6 5 5 ヤギ抗チキン抗体（緑の疑似カラー）の各コンジュゲートで検出しました。（ D ）A ∼ C の重ね合わせ画像。赤と青がマージすると紫に見えています。レーン 1 は MagicMark™ XP Western Protein Standard（製品番号 LC5603 ）を泳動、読み取りは GE Healthcare LAS-4000 ゲルイメージャーで行いました。製品名製品番号製品名製品番号製品名製品番号 WesternDot ® 585 donkey anti-mouse W10800 WesternDot ® 625 donkey anti-mouse W10805 WesternDot ® 655 donkey anti-mouse W10810 WesternDot ® 585 donkey anti-rabbit W10801 WesternDot ® 625 donkey anti-rabbit W10806 WesternDot ® 655 donkey anti-rabbit W10811 WesternDot ® 585 donkey anti-goat W10802 WesternDot ® 625 donkey anti-goat W10807 WesternDot ® 655 donkey anti-goat W10812 WesternDot ® 585 goat anti-mouse W10803 WesternDot ® 625 goat anti-mouse W10808 WesternDot ® 655 goat anti-mouse W10813 WesternDot ® 585 goat anti-rabbit W10804 WesternDot ® 625 goat anti-rabbit W10809 WesternDot ® 655 goat anti-rabbit W10814 WesternDot ® 800 goat anti-mouse W10815 WesternDot ® 800 goat anti-rabbit W10816 サイズはすべて［ 500µl, 25 回分］、価格は ¥18,000 です。 Easy! Fast! Clear! ウェスタン解析を支える強力なトータルワークフローウェスタンブロッティングの 3 ステップの手間を極力省き、データ品質を改善する高性能ツールと技術です。ルーチンワークのウェスタン解析を効率的に行うことで、他の実験に集中できます。 Separate Next_26.indd 18 Transfer Western Dot ®はここで使用 Detection ［クリアなタンパク質分離］［わずか 7 分で転写完了］［抗体反応を自動化］ ■ Bolt ® プレキャストゲル & 泳動槽 ■ iBlot ® 2ドライブロッティングシステム ■ iBind™ Western System 14/07/24 13:52 page Life Technologies™ 19 いつ行く ? どうする ? 海外留学 Title Name アイデアと情熱で勝負！若いうちに、海外でラボを立ち上げよう。藤田恭之氏（北海道大学遺伝子病制御研究所分子腫瘍分野 Number 08 教授）「正常な細胞に周りを取り囲まれたら、素行の悪いがん細胞はきな成果を出して一流のジャーナルに論文を出すこと。それ仲間外れにされるのでは？」大学院生時代にふとひらめいたアがボスの方針です。そのためにはオリジナリティの高い研究イデアから、正常細胞とがん細胞の相互作用を「細胞競合」とをしないと話になりません。ポスドクという、先が見えない不いう切り口で新たな分野で切り拓く藤田恭之氏。独創的な研究安の中で、人生で一番つらい時期でした」と振り返ります。そを進めるバイタリティは、海外でポスドク（博士研究員）としてれでも「ポスドク同士で飲みに行き、ボスの愚痴をこぼしたり、過ごした 5 年間、PI（主任研究者）として研究室を率いた 8 年間幅広い分野の研究を語り合うことで視野が広がり、今でも交の得難い経験の中で培われたと語ります。流のあるたくさんの友人ができました」とも語ります。最初は苦労した研究も、Hakai（破壊）と名づけた新しいタンパク大学院生時代にひらめいたアイデア医学部卒業後、病院勤務を経験。「 3 年ほどでしたが、がん患者さんを助けたいという思いを強くしました」と藤田氏。そ質の論文が Nature Cell Biology に掲載されるなど、着実に業績を上げていきます。ゼロからラボを立ち上げるの後、進学した大学院で冒頭のアイデアがひらめきます。転機は偶然訪れます。「夜、電気泳動をしている間に暇つぶ「実験の後片付けをしない同級生を注意した時、そんなに気になるならあなたが片付ければいいと逆キレされたんです。頭を冷やそうと一人トイレへ入り、ふと『彼は研究室のがんだ』とつぶやいた瞬間、がん細胞が人間社会と同じようにしにと手にとった Nature 誌のたまたま開いたページに PI 募集の記事がありました」。80 人の応募者から 2 人に絞られる厳しい審査を突破して、35 歳でロンドン大学 MRC 研究所に着任。一番苦労したのは「ヒューマンマネジメント」だと断言周囲の正常な細胞から排除される様子が目に浮かびました」。します。文化や働くことに対する意識や考え方も違う海外のしかし当時は、分子の流れに沿ってがん化のメカニズムを研大学院生やポスドクをまとめ上げ、成果を出し続けていくた究する時代。そのアイデアを試す機会はなかなか巡ってきませんでした。めには「画一的な教育ではなく、一人ひとりに合った教育が必要」ということを痛感します。そして国籍の異なることを楽一流のジャーナルに載るような研究しかしむ活気あるラボを作り上げていきます。きちんと研究を軌道に乗せ、8 年間温めてきた大学院時代の意味がない !? アイデアを試す時が来ます。「もっとも信頼するポスドクの研究者キャリアは、ドイツのベルリンでポスドクとしてスターキャサリンと8 か月かけて実験系を組み立て、細胞の挙動をト。15 人ものポスドクがひしめく大所帯の研究室です。ボスのバルター・ビルヒマイヤー博士は「 1 年でこの中の 1 人か 2 人が成功すれば、それで十分」とパーティーで公言するような厳しい環境。「小さな成功よりも、5 年に 1 度でいいから大タイムラプスで観察しました。その結果には本当に興奮しましたね。がん細胞が、正常上皮細胞の集団からはじき出されていく様子が記録されていたからです」（藤田氏）。海外で研究する人へのメッセージ「若いときから、独立を目指して欲しい。ポスドクとして留学するだけでも成長できますが、海外で P I になると全く別の世界が広がります。実力だけの世界で、ゼロからラボを立ち上げ、人を育てた経験は大きな自信につながります」とアドバイスします。 1 9 6 5 年生まれ。京都大学医学部卒業。病院勤務、アフリカでの医師ボランティアを経験 2005 年、ロンドンの研究室で 2008 年極真空手英国選手権大会（型の部優勝） Next_26.indd 19 後、医学博士を取得。1997 年よりドイツ・ベルリンでポスドク、2002 年より英ロンドン大学 MRC 研究所グループリーダー。2010 年より現職。 14/07/24 13:52 INFORMATION 2014 / August / No.26 「 NEXT FORUM 2014 」開催のご案内今年も東京六本木のニコファーレスタジオで「 NEXT フォーラム日時：10 月 24 日金曜日 18 時より（予定） 2014 」を開催します。テーマは「生命の根源に迫る最先端テクノロ出演者：山本卓氏（広島大学大学院理学研究科教授）ジー」。ゲノム編集・再生医療研究など、最前線で活躍する研究者の谷口英樹氏（横浜市立大学大学院医学研究科教授）、他講演とパネルディスカッションをニコニコ動画でリアルタイムに配信します。そして研究者川柳コンテストや表彰式も実施予定。内容「 NEXT フォーラム 2014 」特設サイト： www.lifetechnologies.com/amazingscience は、随時更新します。特設サイトでご確認ください。ボスの言う「最近どう ? 」は KT1374 様「結果まだ ? 」　今年もやります！川柳 in the ラボ 2014 昨年大きな反響を呼んだ「研究者川柳」。ライフサイエンス研究者が一日の大半を過ごす研究室のできごとを川柳に託してみませんか？「研究メンバーとの衝撃的な出会い」、「涙なしでは語れない日々」、「思わずキュンとした瞬間」、そして「堂々の感激的実験結果」まで。多くの方から、波乱万丈な川柳をお持ちしています。募集開始は、9 月上旬の予定。川柳は、上記「 NEXT FORUM 2014 」特設サイトから受け付けます。抽選で QUOカードプレゼント ! NEXT 8 月号はいかがでしたか ? 特集は、今最もホットな「ゲノム編集」を使いこなす山本卓氏。この技術の浸透へ向けた技術開発や若い方へのメッセージを伺いました。新製品情報も、幹細胞研究やイメージングを効率化する製品が目白押し。そして人気の留学記は英国で 8 年間の PI（主任研究者）を経験した藤田恭之氏。ユニークなアイデアと情熱に溢れた研究生活を語ります。読後はアンケートにご協力ください。抽選で 10 名様に Quo カード（ 2000 円分）をプレゼントします。バックナンバーや抜粋記事もご覧いただけます。→ URL: www.lifetechnologies.com/nextforum photographs: ryouichi morikawa（p.02-03） art direction & design: masami furuta（opportune design）販売店公式 Facebook ページ&Twitterもチェック! facebook.com/LifeTechnologiesJapan @LifetechJPN ● 記載価格は 2014 年 8 月現在の価格です。● 消費税は含まれていません。● 価格は予告なしに変更する場合がありますのであらかじめご了承ください。● 最新の価格および在庫数は、弊社ホームページ右上の “製品価格と在庫の検索” でご確認いただけます。● 研究用にのみ使用できます。● 診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。● 記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。● 販売条件はこちらをご覧ください。www.lifetechnologies.com/TC For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. © 2014 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified. Printed in Japan. 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