DNAPac PA200 と PA200 RS カラム

CHROMATOGRAPHY CONSUMABLES
Product Specifications
DNAPac PA200 と
PA200 RS カラム
核酸分析のソリューション
Thermo Scientific™ DNAPac™ PA200 HPLC と DNAPac
20 ∼ 22mersの分離。DNAPac PA100と比較して DNAPac PA200の方が高分離
PA200 RS（高速分離）UHPLC用カラムは、ssDNAおよび
1 3
2
RNAを高分離するカラムです。
・分離とスループットの改善
・移動相の pH、塩の種類、移動相の種類で選択性と保持をコン
mAu260
・オリゴヌクレオチド鎖および立体異性体を高分離
DNAPac PA200
カラム:
DNAPac PA200 分析カラムと
移動相 A:
移動相 B:
流速:
注入量:
カラム温度:
グラジエント:
サンプル:
20 mM Tris、pH 8.0
移動相Aと1.25 M NaCl
1.2 mL/min
8 µL
25 °
C
B 22.8%∼43.7%（12分）
d（AC）10–11
ピーク:
1. 20mer
2. 21mer
3. 22mer
トロール
・nから n-1の塩基を分離
ガードカラム
DNAPac PA100
2.5
7.5
Time（min）
12.5
陰イオン交換クロマトグラ
フィーによる ssDNAと
RNAの高分離
フィーは、
逆相とは異なる有用なアプロー
オリゴヌクレオチドは、
DNAの塩基配列決
サーモフィッシャーサイエンティフィック
定法のプライマー、
治験薬の PCR、
遺伝子
は、高分解能質量分析と UHPLC用陰イ
機能の研究など、さまざまなアプリケー
オン交換カラムを利用した構造解析や、
定
ションに関わっており、
分子生物学におい
量方法をご提供しています。
て幅広く利用されています。これらのアプ
リケーションの性質上、
合成されたオリゴ
ヌクレオチドの純度は非常に重要です。
特に治療に使用されるオリゴヌクレオチ
ドの純度の確認は、
これら医薬品の有効性
と安全性を保証する重要なステップです。
HPLCは、不完全なオリゴヌクレオチドを
シーケンスや不純物から高速で分離でき
る分析手段です。逆相 HPLCでオリゴヌ
クレオチドを精製すると、
不完全な配列が
混入することがあるため、
純度を確認する
ためには逆相 HPLCとは異なる分離方法
を利用する必要があります。DNAPacカラ
ムによる陰イオン交換クロマトグラ
チです。
陰イオン交換クロマトグラフィーでは、
オ
80
リゴヌクレオチドの負電荷に基づいて保
87.5%
Full-length
Trityl-oﬀ
持および分離が行われます。長いオリゴ
ヌクレオチドほど負電荷が増えるため、
よ
り長く保持されます。オリゴヌクレオチド
が6 ∼ 8において同じ長さのオリゴヌクレ
オチドは、
すべてほぼ同じ電荷を持つこと
55.8%
mAu260
残基につき一個の負電荷を持つため、
pH
Failure
sequences
Trityl-oﬀ
Full-length
Trityl-on
1.25 M NaCI:
22.8%
になります。これらの pHでは、
逆相とは異
なり、オリゴヌクレオチドは水素結合を
22.8%
保ったトリチルオフ（Trityl-off ）状態（図
1）で分離されます。
DNAPac PA200 HPLCおよび DNAPac
0
0
PA200 RS UHPLCカラムは、一本鎖 DNA
および RNAの分離をコントロールできる
ように開発された陰イオン交換カラムで
す。オリゴヌクレオチドの選択性は、移動
8
Time（min）
24
16
図1 : 合成オリゴヌクレオチドにおける失敗配列と、トリチル基有りの配列、トリチル
基無しの配列の分離
相の pH、溶媒、異なる塩の使用など、さま
ざまなパラメーターでコントロールでき
DNAPac PA100
るため、
特定のアプリケーションの必要条
件に合わせて分離を調整できます。
広範囲の pHにおける
安定性
pHに安定なポリマー樹脂を使用した強陰
イオン交換クロマトグラフィーは、
オリゴ
ヌクレオチドをシンプルかつ効果的に分
離します。高い pHの移動相で得られた変
性条件は、ワトソンクリック（Watson-
Crick ）水素結合を排除し、自己相補配列
（self-complimentary ）やポリ G（poly-G ）
ストレッチのような問題配列の分離を可
能にします。このため、オリゴヌクレオチ
ドの分析には、高 pHでの陰イオン交換ク
ロマトグラフィーが適しています。不完
全配列を室温かつ高 pH移動相で分離する
ことは、非常に有効です。また、高 pHの移
動相を用い、
昇温プログラムによって分離
することもあります。こうした条件下では、
イオン交換カラムの劣化が早まる可能性
があり、
カラム寿命が短くなる場合があり
ます。DNAPac PA200は、
アルカリ条件下
でも安定しており（図2）
、
ピークキャパシ
ティと分解能が改善されています（表紙
図）
。これは、
DNAPac PA200では固定相
の修飾が改善されたためです。
DNAPac PA200
1.0
Fraction of initial capacity
2
25 ºC
1.0
45 ºC
C
25 °
0.8
65 ºC
0.8
0.6
0.6
45 °
C
0.4
0.4
0.2
0.2
C
65 °
0.0
0.0
0
20
40
60
80
Time (h)
100
120
0
20
40
60
80
Time (h)
100
120
図2：塩化ナトリウム移動相を使用したときの、アルカリ条件下における安定性。
DNAPac PA200の安定性が向上。
縦軸は、各々の保持容量を初期値で割ったもの。測定成分は硫酸イオン
移動相の pHによる
保持コントロール
CH3CN 不使用
流速: 1.20 mL/min
mAu260
pH 12
pH 11
図3および図4で示すように、移動相の pH
pH 10
pH 9
が高くなると、異なる塩基から成るオリ
pH 8
ゴヌクレオチドの保持は顕著に強くなり
pH 6.5
0
ます。この効果は、
G（グアニン）と T（チ
10
20
Time（min）
30
流速: 1.20 mL/min
mAu260
O
O
20% CH3CN
H
pH 12
pH 11
pH 10
pH 9
N
N
とによって起こります。オリゴヌクレオ
チドが C（シトシン）と A（アデニン）の
塩基だけから成る場合、この効果は確認
N
HO
されません。多くの場合、異なる塩基か
R
R
ら成るオリゴヌクレオチドは Gと Tの割
pH 11
pH 7
8
Time（min）
イオン状態となり、負電荷が増加するこ
–
N
O
pH 8
pH 6.5
0
ミン）の塩基中の酸素が pH9 ∼ 11の間で
合が異なるため、表面電荷に対する pHの
16
影響により、長さが同じでも塩基含有量
図3：塩化ナトリウム移動相を使用したときのグアニンとチミンを含むオリゴヌクレ
オチドの分離。pHにより保持時間が変化
の違いによって分離されます。図3と図4
は、
有機溶媒の添加により、
pHによる選択
性を保ったまま保持時間が短縮すること
を示しています。
CH3CN 不使用
流速: 1.20 mL/min
75.0%
pH 12
pH 11
55.8%
mAu260
pH 10
0.33 M NaClO4:
pH 9
pH 8
21.2%
0
8
mAu260
20% CH3CN
流速: 1.20 mL/min
0
2.5
Time（min）
21.2%
塩基配列:
A 5C5G6 T 9
pH 6.5
16
O
O
pH 12
pH 11
pH 10
pH 9
pH 8
pH 6.5
7.5
Time（min）
H
N
R
12.5
N
N
O
pH 7
–
N
HO
R
pH 11
図4：過塩素酸ナトリウム移動相を使用したときのグアニンとチミンを含むオリゴヌ
クレオチドの分離。pHにより保持時間が変化
3
サイズによる分離
塩基の長さが21 ∼ 25で、
3’末端と5’末端の塩基配列が異なる21種類のオリゴヌクレ
オチドが、同一条件下で分離されました。図5は、各々の長さで最初と最後に溶出され
たオリゴヌクレオチドを示しており、同じ長さでも、
n、n-1と n＋1に分離しています。
また、
オリゴヌクレオチドの長さの順に分離できています。同一条件下では、
図5と図6
に示すように、
オリゴヌクレオチドのサイズに基づいて分離しています。図6は、
4 .6 x
150 mmの DNAPac PA200 RS UHPLCカラムを使用すると、長さ250 mmの PA200
に相当する分離度が得られ、分析時間が25 %短縮されることを示しています。また、
DNAPac PA200 4 .6 x 150 mm、粒子径4 µmのカラムでは、DNAPac PA200 4 .0 x
250 mm、粒子径8 µmのカラムに比べて約2倍の検出感度が得られました。
15
オリゴヌクレオチドの長さ
22 23 24 25
カラム:
移動相A:
移動相B:
流速:
注入量:
カラム温度:
グラジエント:
検出:
Dx96
Dx94
Dx91
Dx90
Dx88
Dx86
Dx87
D84
D80
21
Dx98
30.1%
DNAPac PA200
過塩素酸ナトリウム水溶液
（pH 6.5）
/アセトニトリル（80:20, v/v）
移動相Aと0.33 M NaClO4
1.2 mL/min
8 µL
25 °
C
B 21%∼43%（12分）
260 nm（UV）
mAu260
4
0.33 M 過塩素酸ナトリウム
22.8%
0
3
4
5
Time（min）
6
7
図5：長さによるオリゴマーの分離
55.0
DNAPac PA200 RS（4.6 × 150 mm）
2
4
3
1
DNAPac PA200 RS（4.6 × 150 mm）
20 mM Tris pH 8
と
20 mM Tris（pH8）
1.25 M 塩化ナトリウム
流速:
1.2 mL/min
注入量:
7.5 µL
カラム温度: 30 °
C
グラジエント: B 28-54%（4 CV*）
サンプル:
オリゴヌクレオチド混液
* CV = column volumes
カラム:
移動相 A:
移動相 B:
6
5
mAU
ピーク:
-5.0
5.00
7.00
1:
2:
3:
4:
5:
6:
9.00
Time（min）
30.0
DNAPac PA200（4.0 × 250 mm）
2
DNAPac PA200（4.0 × 250 mm）
20 mM Tris pH 8
と
20 mM Tris（pH8）
1.25 M 塩化ナトリウム
流速:
1.2 mL/min
注入量:
7.5 µL
カラム温度: 30 °
C
グラジエント: B 28-54%（4 CV*）
サンプル:
オリゴヌクレオチド混液
* CV = column volumes
カラム:
移動相 A:
移動相 B:
6
5
1
mAU
-5.0
7.6
4
3
10.0
13.0
ON 34
ON 35
ON 44
ON 45
ON 54
ON 55
16.0
Time（min）
図6：核酸が一つ違うオリゴヌクレオチドを分離。DNAPac PA200 RS 4 .6 x 150
mm は、標準サイズの4 .0 x 250 mmと比較してオリゴヌクレオチドの感度が
向上
同じ長さの
オリゴヌクレオチドの分離
X=GA, Y=TGA
X=TGA, Y=TG
おける、
pHの影響を示します。pHが9と
X=GA, Y=TGA
るだけでなく、溶出順序が逆転します
（pH10と pH10 .5を比較）
。
mAu260
る2つの23塩基のオリゴヌクレオチドに
pHが高くなるにつれて、ピークが分離す
pH 11
X=TGA, Y=TG
図7は、
3 '末端と5 '末端の塩基だけが異な
9 .5では、ピークが分離されていません。
5
流速: 1.20 mL/min
pH 10.5
pH 10
X=TGA, Y=TG
X=GA, Y=TGA
pH 9.5
X=TGA, Y=TG
X=GA, Y=TGA
pH 9
X=TGA, Y=TG
X=GA, Y=TGA
高分離
DNAPac PA200のハイスループット条
件では、通常の長さのオリゴヌクレオチ
4
8
12
Time（min）
図7：塩化ナトリウム移動相を使用し、pHを調整したときの23merオリゴヌクレオチ
ド（5 'X-G4 C4 A3 T7 -Y3 ' ）の選択性
ド（13 ∼ 25ヌクレオチド）
を分離します。
これに加えて、ホスホロチオエート
A. DNAPac PA200 RS
4.6 × 50 mm
（phosphorothioate ）結合によるジアステレ
オマーを分離します。図8では、
より小さい
A. DNAPac PA200 RS 4.6 × 50 mm
B: DNAPac PA200 RS 4.6 × 150 mm
C: DNAPac PA200 RS 4.6 × 250 mm
移動相 A:
20 mM Tris pH 8
移動相 B:
移動相Aと1.25 M NaCl
流速:
A: 1.30 mL/min
B: 1.30 mL/min
C: 1.30 mL/min
注入量:
10 µL
カラム温度: 30 °
C
グラジエント: B 28∼54%（4 CV*）
サンプル:
2´,5´ linkage isomers
カラム:
1
2
mAU
4 µm樹脂を充填した DNAPac PA200 RS
の結果を示します。より小さな粒子を充填
0
したカラムで分離が改善し、
粒子径が8 µm
のカラムよりも、
明らかにスループットが向
2
3
B: DNAPac PA200 RS
4.6 × 150 mm
上しています。DNAPac PA200 RS カラム
の外側はステンレス（SST ）で、内側はバ
1
* CV = カラム容量
1
ピーク:
1:
2:
2
mAU
Phosphorothioate isomer“A”
Phosphorothioate isomer“B”
イオイナートの PEEK™ 配管です。高効
率かつ小さな樹脂ビーズにより高い圧力
0
が生じるため、外側の SSTが高圧からカ
6
C: DNAPac PA200 RS
4.6 × 250 mm
ラム本体を保護します。
内側のPEEKスリー
ブは、
SSTとオリゴヌクレオチドの不要な
相互作用を排除します。図8は、
DNAPac
3
9
1
2
mAU
PA200 RSカラムの3つのサイズを使用し
て、ホスホロチオエートのジアステレオ
マーをハイスループット分離した例で
す。この例では、
4 .6 x 50 mmの分析時間
は2 .5分で、長さ250 mmのカラムと比較
して約1 /4となり、大幅にスループットが
向上しました。
0
5
Time（min）
10
15
図8：ホスホロチオエート、ジアステレオマー分離の比較。長さや、ハイスループット
が異なるカラムを使用して比較
6
A. DNAPac PA200 RS, 4.6 × 150 mm
A. DNAPac PA200 RS, 4.6 × 150 mm
B: DNAPac PA200 RS, 4.6 × 250 mm
C: DNAPac PA200, 4.0 × 250 mm
移動相 A:
20 mM Tris pH 8.0
移動相 B:
20 mM Tris (pH8.0)と 1.25 M NaCl
流速:
A: 1.30 mL/min
B: 1.12 mL/min
注入量:
6 µL
カラム温度: 30 °
C
グラジエント: B 20∼54%（4 CV*）
サンプル:
2́,5́ linkage isomers
カラム:
流速:
1.300 mL/min
80
mAU
54
* CV = カラム容量
0 1.25M NaCl: 3
28%
6
ピーク:
9
1:
2:
3:
B: DNAPac PA200 RS, 4.6 × 250 mm
,5’
-linkage isomers）
Dio-6（two 2’
Dio-1（no 2’
,5’
-linkage isomers）
Dio-9（one 2’
,5’
-linkage isomers）
流速: 1.300 mL/min
結合異性体（Linkage Isomers ）
の分離
mAU
結合異性体は、たとえば一本鎖から二本
鎖RNAへアニーリング（annealing）
中に、
0
5
10
高温にさらされることで RNAオリゴヌク
15
レオチド中に形成されることがありま
C: DNAPac PA200, 4.0 × 250 mm
80
流速: 0.85 mL/min
す。図9は、
3つの同じ配列中に、0個、1個、
または2個の2’,5’結合を含むオリゴヌク
54
mAU
レオチドの分離を示しています。Dio-1は
結合がなく、
Dio-9は1個、Dio-6は2個の結
合を含んでいます。DNAPac PA200
0
1.25M NaCl:
28%
5
10
Time（min）
図9：RNAオリゴヌクレオチドの異性体分離
15
（250 mm ）と PA200 RS（250 mm ）は、
これら同じ配列のオリゴヌクレオチドを
10分未満で分離しました。図9は、スルー
プットの改善により、
DNAPac PA200
RS（4 .6 x 150 mm ）のカラムでも同様
高効率な
の結果が得られることを示しています。
Thermo Scientific
MicroBead™ 樹脂
DNAPac PA200の粒子径8 µmの充填剤
と、
DNAPac PA200 RSの粒子径4 µmの
充填剤は、溶媒耐性を有する無孔性ポリ
マー基材を使用しています。130 nmの
マイクロビーズには、
4級アンモニウム官
能基を結合しています（図10）
。この充填
剤の利点として、高速な物質移動、従来の
高度に架橋したコア
（55%）
陰イオン交換（4級アミン）官能基を持った
ラテックスマイクロビーズ
（130 nm）
8 µm DNAPac PA200
4 µm DNAPac PA200 RS
無孔性基材よりも高い負荷容量、そして
優れた耐久性が挙げられます。
高性能
DNAPac PA200と PA200 RSカラムのユ
ニークなペリキュラー樹脂は、幅広い pH
範囲にわたって優れた選択性と安定性を
提供します。高密度に架橋された構造に
よりカラム寿命が長く、洗浄も容易です。
製造工程（樹脂合成、アミノ化、充填と検
査）
では、
すべての DNAPac PA200および
PA200RSにおいて再現性が得られるよう
にコントロールしています。DNAPacカラム
は、
ロット間の再現性を dT19-24の混合標準
溶液でテストしています。
図10：DNAPac PA200と PA200 RSの、ペリキュラー型陰イオン交換樹脂の概略図
仕様
7
DNAPac PA200
DNAPac PA200 RS
固定相
55%架橋した非多孔質ポリマーは、4級アミン官能基を持ったラテックス構造の
粒子径
8 µm
4 µm
イオン交換容量
∼ 14 µeq/mL
∼ 20 µeq/mL
使用可能な pH範囲
pH 4 ∼ 10（塩を使用する場合はpH 12.5。詳細はマニュアルをご確認ください）
耐圧
4,000 psi
マイクロビーズで覆われています
10,000 psi
カラム温度
≦ 85°C
流速
0.1 ∼ 1.5 mL/min 推奨
耐溶媒性
100 %アセトニトリルまたはメタノール
超純水（18 MΩ -cm ）、塩化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、緩衝液、
酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム
移動相
界面活性剤との互換性
非イオン、陽イオンまたは両性イオン
オーダーインフォメーション
製品番号
UHPLC用分析カラム（粒子径4 µm ）
082510
DNAPac PA200 RS, 4 µm High Resolution Analytical Column（4 .6 × 250 mm ）
082509
DNAPac PA200 RS, 4 µm Analytical（4 .6 × 150 mm ）
082508
DNAPac PA200 RS, 4 µm Fast Analytical Column（4 .6 × 50 mm ）
製品番号
HPLC用分析カラムおよびガードカラム（粒子径8 µm ）
063425
DNAPac PA200 Analytical, 8 µm（2 × 250 mm ）
063423
DNAPac PA200 Guard, 8 µm（2 × 50 mm ）
063000
DNAPac PA200 Analytical, 8 µm（4 × 250 mm ）
062998
DNAPac PA200 Guard, 8 µm（4 × 50 mm ）
063421
DNAPac PA200 Analytical, 8 µm（9 × 250 mm ）
063419
DNAPac PA200 Guard, 8 µm（9 × 50 mm ）
SP6734
DNAPac PA200 Semi-Preparative, 8 µm（22 × 250 mm ）
SP6731
DNAPac PA200 Guard, 8 µm（22 × 50 mm ）
Product Specifications
Ⓒ 2014 Thermo Fisher Scientific Inc. 無断複写・転載を禁じます。
ここに掲載されている会社名、製品名は各社の商標、登録商標です。掲載されている価格は消費税を含んでおりません。
ここに掲載されている内容は、予告なく変更することがあります。詳細については、販売代理店にお問い合わせください。
サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社
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TEL 0120-753-670 FAX 0120-753 -671
〒221-0022 横浜市神奈川区守屋町3 -9
E-mail : [email protected]
www.thermoscientific.jp
販売店
E1406

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