薬物代謝酵素阻害試験 被験物質が薬物代謝酵素に与える影響をヒト肝ミクロソームや発現酵素を用 いたin vitro 系で評価します。IC50およびKi値の算出や時間依存的阻害作用 の評価を実施します。 酵素源 • ヒト肝ミクロソーム，各種発現酵素（CYP、FMO、UGT等） 測定方法 • LC/MS、LC/MS/MS、HPLC（UV、蛍光、ラジオアイソトープ） 評価酵素 Typical metabolite reaction Enzyme CYP1A2 Phenacetin O-deethylation UGT CYP2A6 CYP2B6 Enzyme CYP Typical metabolite reaction UGT1A1 Estradiol 3 β-glucuronidation Coumarin 7-hydroxylation Bupropion hydroxylation UGT1A4 UGT1A6 Estradiol 17 β-glucuronidation 1-Naphthol β-D-glucuronidation CYP2C8 Paclitaxel 6α-hydroxylation Amodiaquine N-deethylation CYP2C9 Diclofenac 4’-hydroxylation CYP2C19 (S)-Mephenytoin 4’-hydroxylation UGT1A9 UGT2B7 FMO3 DPD Propofol glucuronidation AZT β-D-glucuronidation Benzydamine N-oxidation Dihydropyrimidine dehydrogenation CYP2D6 Bufuralol 1’-hydroxylation Others その他の酵素活性については、ご相談ください。 Dextromethorphan O-demethylation CYP2E1 Chlorzoxazone 6-hydroxylation CYP3A4/5 Midazolam 1’-hydroxylation Testosterone 6β-hydroxylation Nifedipine N-oxidation CYP4A11 Lauric acid 12-hydroxylation 代謝阻害に関する相互作用の評価 • 市販医薬品との代謝に関する相互作用を評価致します。 •被験物質が市販医薬品に及ぼす影響 •被験物質が市販医薬品から受ける影響 • 市販医薬品の代謝活性測定法について調査、確立から実施しております。 方法 NADPH生成系 Direct inhibition (DI) インキュベーション 予備加温 基質の代謝反応 開始 (緩衝液，ミクロソーム， 被験物質，基質) 基質の代謝反応 停止 Time-dependent inhibition (TDI) ・希釈法 ・非希釈法 被験物質をミクロソームとプレインキュベーション 基質 NADPH生成系 NADPH生成系 プレインキュベーション 予備加温 インキュベーション プレインキュベーション 予備加温 一部を移す (緩衝液，ミクロソーム，被験物質) 基質の代謝反応 開始 基質の代謝反応 停止 (緩衝液，ミクロソーム，被験物質） プレインキュベートされたミクロソームと基質をインキュベーション 予備加温 (緩衝液，NADPH生成系，基質) 結果 インキュベーション 基質の代謝反応 開始 IC50 CYP2D6 (Bufuralol 1'-hydroxylation) 120 120 100 100 Remaining activity (%) Remaining activity (%) CYP2C9 (Diclofenac 4'-hydroxylation) 80 60 40 20 0 0.01 0.1 1 10 ○: Direct inhibition, ●: Time-dependent inhibition (非希釈法：30 min pre-incubation) 80 60 40 20 0 0.01 0.1 Tienilic acid (μmol/L) 1 10 Paroxetine (μmol/L) Inhibition parameters (Ki) − DI − CYP2C8 (Amodiaquine N-deethylation) vs Montelukast ・Dixon plot ・Michaelis-Menten plot 1/v 10 1.2 8 1 6 0.8 0.6 4 0.4 2 0.2 0 -0.2 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 1 2 3 4 5 6 Amodiaquine (umol/L) 7 Montelukast (μmol/L) Inactivation parameters (KI, kinact) − TDI − CYP3A4 (Midazolam 1’-hydroxylation) vs Verapamil LN (% of control) 5 0.03 0.02 4 0.01 3 0 0 10 20 Pre-incubation time (min) 30 0 5 10 15 Verapamil (umol/L) 20 8 基質の代謝反応 停止
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