User Guide Duolink In Situ – Probemaker ® sigma.com/japan SAJ1711 Instructions for Duolink In Situ Probemaker PLUS (Cat. No. DUO92009-1KT) and Duolink In Situ Probemaker MINUS (Cat. No. DUO92010-1KT) Duolink® In Situ 目次はじめに............................................................................................................................................ 2 アプリケーション .......................................................................................................................... 3 2.1 同一種由来抗体の利用 2.2 任意の生物種由来抗体の利用抗体の条件 ....................................................................................................................................... 4 3.1 濃度・容量 3.2 バッファー試薬の準備・保存 .......................................................................................................................... 5 プロトコール ................................................................................................................................... 6 5.1 コンジュゲーションプロトコール ................................................................. 6 5.2 PLAプローブプロトコール .............................................................................. 7 5.2.1 PLAプローブプロトコール ――カスタム溶液と標識一次抗体の場合 ................................. 8 5.2.2 PLAプローブプロトコール ――カスタム溶液と標識二次抗体の場合 ................................. 9 5.2.3 PLAプローブプロトコール ――Duolink In Situ溶液と標識一次抗体の場合.................. 10 5.2.4 PLAプローブプロトコール ――Duolink In Situ溶液と標識二次抗体の場合.................. 11 1 はじめに Duolink® In Situ Probemakerは、一次抗体をダイレクトに標識するほか、マウス、ウサギ、ヤギ以外の生物種やハプテンに対する二次抗体を標識する場合、PLA® oligonucletide armsを迅速かつ簡便に結合させることができます。 Duolink In Situ試薬はin situ PLA（proximity ligation assay）テクノロジーにもとづいており、一対のオリゴヌクレオチドで標識された抗体（PLAプローブ）のシグナルは、同一または2種類の一次抗体がごく近接した状態でサンプルに結合し、それぞれPLUS、MINUSの二つのPLAプローブが連結した場合のみ発生します。一対のPLAプローブから検出されたシグナルは、個々のスポットとして可視化されます。これらのPLAシグナルは、顕微鏡画像にもとづいて定量化（カウント）できるとともに、その細胞内部位を帰属することも可能です。 Probemaker試薬を使用して抗体をPLA oligonucletideで標識することにより、各自で目的のPLAプローブを作り出すことができます。一連のDuolinkアッセイを実施する際は、Duolink In Situ Probemaker PLUS、Duolink In Situ Probemaker MINUSを各1つと、検出試薬、洗浄バッファー、マウント液をそれぞれ選択して揃えていただく必要があります。全製品リストは sigma.com/duolink をご覧ください。 2 アプリケーション 2.1 同一種由来抗体の利用タンパク質―タンパク質相互作用やタンパク質の修飾、あるいは単一タンパク質の研究に同一種由来の二つの一次抗体を使用する場合、一方の抗体をPLUSオリゴ、もう一方をMINUSオリゴで標識します（図1）。図1 同一種由来一次抗体を利用したタンパク質相互作用の検出 2.2 任意の生物種由来抗体の利用タンパク質―タンパク質相互作用、タンパク質の修飾や単一タンパク質の研究において、一方あるいは両方の一次抗体がマウス、ウサギ、ヤギ以外に由来する場合は、それぞれの二次抗体のうち一方の二次抗体を PLUSオリゴ、もう一方をMINUSオリゴで標識するか、一方の二次抗体のみ標識し、これとDuolink In Situ PLAプローブ二次抗体のスタンダード製品を組み合わせて使用することができます（図2）。図2 一方または両方がマウス、ウサギ、ヤギ以外に由来する一次抗体を利用したタンパク質相互作用の検出 3 抗体の条件 3.1 濃度・容量標識する抗体は、濃度を1mg/mLとしてください。1回のコンジュゲーションにつき必要な量は20µg （＝20µL）となります。注意：モノクローナル抗体の場合、プロテインAまたはプロテインG精製品を使用してください。 3.2 バッファー抗体は、必ずアミンフリーのバッファーにしてください。理想的にはPBSです。キャリアや保存剤については、フリーではない場合でも、含有量は0.1% BSA、5% トレハロース、0.02% アジ化ナトリウムまでとしてください。もし、各自で保存している抗体のバッファー組成に不安があれば、コンジュゲーションの前に、透析によるバッファー交換をぜひおこなってください。それぞれの抗体の供給元やメーカーによって、残留する1級アミンの含有量には違いがあり、この多くは、抗体を抗原アフィニティー精製する際、酸溶出の段階で使用されたグリシンによるものです。もし、製品表示がPBSとなっていても、1級アミンが残存している可能性を完全に否定することはできません。 Olinkでは、標準的なバッファー交換の方法として、次のような手順が推奨されています。注意：この操作は、高濃度のBSAや、その他高分子量物質を低減させるものではありません。 illustra MicroSpin G-50 Columnsスピンカラム（GE Healthcare, Art. no. 27-5330-01）を、 1xPBSを用いて最初に3000rpmで1分間スピンします。続いて400µLの1xPBSを添加して1分間の再スピンを4回繰り返し、平衡化します。終了後、未使用の遠心チューブにカラムをセットします。それぞれの抗体（12 50µL）をカラムに添加し、3000rpmで2分間スピンします。回収された抗体の濃度は、ODで確認してください。この際、1mg/mLのOD 280nm値を1.4とみなしてください。 Duolink® In Situ Probemakerのコンジュゲーションの前に、希薄な抗体溶液を濃縮することは、その抗体溶液を大量に所持していない限りおすすめできません。フィルター型の濃縮ツールを使用すると、非常に大きなロスが生じるためです。 4 試薬の準備・保存未使用のProbemakerは、-20° Cで保存してください。使用期限は、ロットごとに記載されています。標識した抗体は、4° Cで保存してください。保存溶液には、バッファーと標識抗体の安定化、保存用の試薬が入っています。抗体によっては、その他の成分が必要な場合がありますので注意してください。 1キットあたり、濃度1mg/mL、20µgの抗体標識分の試薬が用意されています。 Duolink® In SituオリゴヌクレオチドPLUSまたはMINUS ―― -20° C保存 1バイアルで、濃度1mg/mL、20µgの抗体を1回標識分の活性化オリゴヌクレオチドが凍結乾燥されています。コンジュゲーションバッファー ―― -20° C保存コンジュゲーション反応用のバッファー試薬です。使用前にボルテックスしてください。溶液はそのまま使用します。停止試薬 ―― -20° C保存コンジュゲーション反応の停止用試薬です。使用前にボルテックスしてください。溶液はそのまま使用します。保存溶液 ―― -20° C保存標識抗体（PLA®プローブ）保存用のバッファーです。使用前にボルテックスしてください。溶液はそのまま使用します。アッセイ試薬（20x）―― -20° C保存各自最適化した抗体希釈液に添加するための専用の試薬です。使用前にボルテックスしてください。標識抗体（PLAプローブ）を希釈する前に、各自最適化した抗体希釈液で1:20に希釈します。注意：各抗体用のブロッキング溶液や抗体希釈液があらかじめ最適化されていない場合は、 Probemakerキットに用意されたブロッキング溶液とPLAプローブ希釈液をぜひ利用してください。ブロッキング溶液 ―― -20° C∼4° C保存 Duolink In Situによる染色の前、各自サンプルのブロッキングに使用します。使用前にボルテックスしてください。溶液はそのまま使用します。1滴は約40µLです。 PLAプローブ希釈液 ―― -20° C保存標識抗体（PLAプローブ）を最終アッセイ濃度に希釈する際に使用します。使用前にボルテックスしてください。溶液はそのまま使用します。 5 プロトコールこのプロトコールは、以下、5.1項のコンジュゲーションプロトコールと、5.2項のPLA®プローブプロトコールで構成されています。最初の5.1項コンジュゲーションプロトコールは、それぞれの抗体をPLUSまたはMINUSオリゴヌクレオチドで標識し、PLAプローブを作製する方法を示しています。コンジュゲーションの手順に続き、5.2項に示したカスタム溶液と標識一次抗体（5.2.1）、カスタム溶液と標識二次抗体（5.2.2）、Duolink® In Situ溶液と標識一次抗体（5.2.3）、Duolink In Situ溶液と標識二次抗体（5.2.4）の4つのPLAプローブプロトコールのうち、いずれかに進みます。これは、各自で用意したカスタムのブロッキング溶液や抗体希釈液を使用するか、またはDuolink In Situ製品の溶液を使用するか、さらには一次抗体と二次抗体のどちらの標識にProbemakerを使用するかによって決まります。また、一連の Duolink In Situアッセイを実施してPLAシグナルを得るためには、検出試薬、洗浄バッファー、マウント液を選ぶ必要があります。検出プロトコールは、sigma.com/duolinkサイトのDuolink In Situユーザーマニュアルで紹介しています。 5.1 コンジュゲーションプロトコール使用する抗体の濃度が1mg/mLであることを確認してください。1回のコンジュゲーションにつき20µg （=20µL）の抗体が必要となります。抗体バッファーは、キャリアや保存剤がフリーのものが望ましく、そうでない場合でも、含有量は0.1% BSA、5% トレハロース、0.02% アジ化ナトリウムまでとしてください。抗体とPLAオリゴヌクレオチドのコンジュゲーション 1）抗体20µLにコンジュゲーションバッファー2µLを添加します。抗体濃度は1mg/mLです 2）ピペットで穏やかに混合します。 3）抗体溶液を、凍結乾燥されたオリゴヌクレオチド（PLUSまたはMINUS）のバイアル1本に移します。注意：バイアルを開けたらすぐに抗体溶液を添加してください。 4）ピペットで穏やかに混合します。 5）室温で一晩、インキュベートします。 6）反応液に2µLの停止試薬を添加します。 7）室温で30分間インキュベートします。 8） 24µLの保存溶液と、抗体によっては安定化用のその他試薬を添加します。 9）コンジュゲーションは完了です。各PLAプローブは、保存溶液中、+4° Cで安定です。ブロッキング溶液、抗体希釈液の選択や、一次抗体と二次抗体のどちらを標識したかによって、次の5.2 項に示した4つのPLAプローブプロトコールのうち、いずれかに進みます。 6 5.2 PLA®プローブプロトコール標識抗体（PLAプローブ）のブロッキングと希釈の際は、各自、あらかじめ最適化したブロッキング溶液と抗体希釈液を用いるか、それぞれの抗体メーカーから推奨されるものを使用してください。また、標識抗体を希釈する前に、各自の抗体希釈液にアッセイ試薬（20x）を添加する必要がありますので、この点、注意してください。各自で準備したブロッキング溶液と抗体希釈液を使用する場合で、標識した抗体が一次抗体の場合は5.2.1項、二次抗体の場合は5.2.2項のPLAプローブプロトコールにしたがってください。標識抗体用のブロッキング溶液や抗体希釈液があらかじめ最適化されていない場合は、Probemakerキットに用意されたブロッキング溶液とPLAプローブ希釈液を使用してください。これらの試薬は、ブロッキング剤にBSAを使用しています。こちらを利用する場合で、標識した抗体が一次抗体の場合は5.2.3項、二次抗体の場合は5.2.4項のPLAプローブプロトコールにしたがってください。スタート前に、それぞれのサンプルをスライドガラス上に適切に配置し、固定化、抗原回復や透過処理などの前処理をすませてください。反応領域は、疎水性バリアを形成するペンなどで区切り、反応液の使用量は、それぞれ囲った反応面積に応じて決定してください（sigma.com/duolinkサイトのReaction Volume Guideページ参照）。カバースリップなしで液滴がオープンな状態で使用し、インキュベーションはすべて、加湿チャンバーでおこなってください。 7 5.2.1 PLA®プローブプロトコール ――カスタム溶液と標識一次抗体の場合一次抗体の標識にProbemakerを利用し、各自で準備したブロッキング溶液、抗体希釈液を使用する場合、次のプロトコールにしたがってください。 1. ブロッキング各自、あらかじめ最適化したブロッキング溶液を使用します。もし、Duolink In Situ検出試薬 Brightfieldを使用する場合には、ブロッキングの前に、ペルオキシダーゼクエンチングのステップを実施するようにしてください。 a）各サンプルにそれぞれのブロッキング溶液を添加します。 b）スライドをインキュベートします。 2. PLAプローブ標識抗体（PLAプローブ）の希釈には、各自、あらかじめ最適化した抗体希釈液を使用してください。 a）アッセイ試薬（20x）をそれぞれの抗体希釈液で1:20に希釈します。 b） PLUSとMINUSで標識した各抗体（PLAプローブ）を、1xアッセイ試薬を含む各自の抗体希釈液で、目的の濃度に希釈します。この混合液を、室温で20分間置きます。注意：PLAプローブは、適切な濃度に設定する必要があります。その一次抗体を通常のIFやIHCで使用する場合よりも、高い濃度で開始することをおすすめします。 c）スライドのブロッキング溶液を除去します。各スライドで残存量が同等になるよう試みてください。再現性に影響する可能性が考えられます。また、PLAプローブの添加前に、サンプルが乾燥しないようにしてください。バックグラウンドの原因となります。 d）各サンプルに、希釈したPLAプローブを添加します。 e）加湿チャンバー内でインキュベートします。それぞれの抗体に最適な温度と時間でおこなってくだ 3. 検出プロトコールさい。 sigma.com/duolinkサイトのDuolink In Situユーザーマニュアル7.3項に進んでください。 8 5.2.2 PLA®プローブプロトコール ――カスタム溶液と標識二次抗体の場合二次抗体の標識にProbemakerを利用し、ブロッキング溶液とPLAプローブ希釈液もProbemakerキットに用意された試薬を使用する場合には、次のプロトコールにしたがってください。 1. ブロッキング各自、あらかじめ最適化したブロッキング溶液を使用します。もし、Duolink In Situ検出試薬 Brightfieldを使用する場合には、ブロッキングの前に、ペルオキシダーゼクエンチングのステップを実施するようにしてください。 a）各サンプルにそれぞれのブロッキング溶液を添加します。 b）スライドをインキュベートします。 2. 一次抗体一次抗体の希釈には、各自、あらかじめ最適化した抗体希釈液を使用してください。 a）各自の一次抗体を、それぞれ用意した抗体希釈液で目的の濃度に希釈します。 b）スライドのブロッキング溶液を除去します。各スライドで残存量が同等になるよう試みてください。再現性に影響する可能性が考えられます。また、一次抗体の添加前に、サンプルが乾燥しないようにしてください。バックグラウンドの原因となります。 c）各サンプルに一次抗体を添加します。 d）加湿チャンバー内でインキュベートします。それぞれの一次抗体に最適な温度と時間でおこなってください。 3. PLAプローブ標識抗体（PLAプローブ）の希釈には、各自、あらかじめ最適化した抗体希釈液を使用してください。 a）アッセイ試薬（20x）をそれぞれの抗体希釈液で1:20に希釈します。 b） PLUSとMINUSで標識した各抗体（PLAプローブ）を、1xアッセイ試薬を含む各自の抗体希釈液で、目的の濃度に希釈します。この混合液を、室温で20分間置きます。注意：PLAプローブは、適切な濃度に設定する必要があります。その二次抗体を通常のIFやIHCで使用する場合と同じ濃度で開始することをおすすめします。 c）スライドの一次抗体溶液を除去します。 d）それぞれの一次抗体用の洗浄バッファーで、スライドを洗浄します。洗浄は、染色ジャーに最低でも70mLを入れ、シェーカー（クレードル）上で、穏やかな速度で実施してください。洗浄バッファーは、使用前に室温に戻してください。 e）各サンプルに、希釈したPLAプローブ溶液を添加します。 f）スライドを、予熱した加湿チャンバーで37° C、1時間インキュベートします。 4. 検出プロトコール sigma.com/duolinkサイトのDuolink In Situユーザーマニュアル7.3項に進んでください。 9 5.2.3 PLA®プローブプロトコール ――Duolink In Situ溶液と標識一次抗体の場合一次抗体の標識にProbemakerを利用し、ブロッキング溶液とPLAプローブ希釈液もProbemakerキットに用意された試薬を使用する場合には、次のプロトコールにしたがってください。 1. ブロッキング Duolink In Situ検出試薬Brightfieldを使用する場合には、ブロッキングの前に、ペルオキシダーゼクエンチングのステップを実施するようにしてください。 a）ブロッキング溶液を1cm2あたり1滴の割合で添加します。1滴は約40µLです。 b）スライドを、予熱した加湿チャンバーで37° C、30分間インキュベートします。 2. PLAプローブ a） PLUSとMINUSで標識した各抗体（PLAプローブ）を、PLAプローブ希釈液で目的の濃度に希釈します。注意：PLAプローブは、適切な濃度に設定する必要があります。その一次抗体を通常のIFやIHCで使用する場合よりも、高い濃度で開始することをおすすめします。 b）スライドのブロッキング溶液を除去します。各スライドで残存量が同等になるよう試みてください。再現性に影響する可能性が考えられます。また、PLAプローブの添加前に、サンプルが乾燥しないようにしてください。バックグラウンドの原因となります。 c）各サンプルに、希釈したPLAプローブを添加します。 d）加湿チャンバー内でインキュベートします。それぞれの一次抗体に最適な温度と時間でおこなって 3. 検出プロトコールください。 sigma.com/duolinkサイトのDuolink In Situユーザーマニュアル7.3項に進んでください。 10 5.2.4 PLA®プローブプロトコール ――Duolink® In Situ溶液と標識二次抗体の場合二次抗体の標識にProbemakerを利用し、ブロッキング溶液とPLAプローブ希釈液もProbemakerキットに用意された試薬を使用する場合には、次のプロトコールにしたがってください。 1. ブロッキング Duolink In Situ検出試薬Brightfieldを使用する場合には、ブロッキングの前に、ペルオキシダーゼクエンチングのステップを実施するようにしてください。 a）ブロッキング溶液を1cm2あたり1滴の割合で添加します。1滴は約40µLです。 b）スライドを、予熱した加湿チャンバーで37° C、30分間インキュベートします。 2. 一次抗体 a）各自の一次抗体を、ブロッキング溶液で目的の濃度に希釈します。 b）スライドのブロッキング溶液を除去します。各スライドで残存量が同等になるよう試みてください。再現性に影響する可能性が考えられます。また、一次抗体の添加前に、サンプルが乾燥しないようにしてください。バックグラウンドの原因となります。 c）各サンプルに一次抗体を添加します。 d）加湿チャンバー内でインキュベートします。それぞれの一次抗体に最適な温度と時間でおこなってください。 3. PLAプローブ a） PLUSとMINUSで標識した各抗体（PLAプローブ）を、PLAプローブ希釈液で目的の濃度に希釈します。注意：PLAプローブは、適切な濃度に設定する必要があります。その二次抗体を通常のIFやIHCで使用する場合と同じ濃度で開始することをおすすめします。 b） c）スライドの一次抗体溶液を除去します。スライドを、1x洗浄バッファーAまたはそれぞれの一次抗体用の洗浄バッファーで、できれば5分間 ×2回洗浄してください。洗浄は、染色ジャーに最低でも70mLを入れ、シェーカー（クレードル）上で、穏やかな速度で実施してください。洗浄バッファーは、使用前に室温に戻してください。 d）各サンプルに、希釈したPLAプローブ溶液を添加します。 e）スライドを、予熱した加湿チャンバーで37° C、1時間インキュベートします。 4. 検出プロトコール sigma.com/duolinkサイトのDuolink In Situユーザーマニュアル7.3項に進んでください。 11 【 memo 】 12 【 memo 】 13 This product is for research use only. Not for use in human diagnostic or therapeutic procedures. This product includes a license for non-commercial use of the Duolink product. Commercial users will require additional licenses. Please contact Olink AB for details. There are no warranties, expressed or implied, which extend beyond this description. Olink AB is not liable for property damage, personal injury, or economic loss caused by this product. The following trademarks are owned by Olink AB: Olink®, Olink Bioscience, Duolink® and PLA®. This product is covered by several patents and patent applications including US 6,511,809, US 6,558,928, US 6,878,515, US 7,074,564, US 5,665,539 and related US and foreign patents. For use only as licensed by Amersham Biosciences Corp (part of GE Healthcare Bio-Sciences) and Molecular Staging Inc. The Phi 29 DNA polymerase may not be re-sold or used except in conjunction with the other components of this product. See U.S. Patent Nos. 5,854,033, 6,124,120, 6,143,495, 5,001,050, 5,198,543, 5,576,204, and related U.S. and foreign patents. The oligonucleotide labeling components in this kit utilise Lightning-Link™ technology and are provided under license from Innova Biosciences. © 2012 Olink AB. All third party trademarks are the property of their respective owners. © 2014 Sigma-Aldrich Co. LLC. All rights reserved. SIGMA, SAFC, SIGMA-ALDRICH, ALDRICH, and SUPELCO are trademarks of Sigma-Aldrich Co. LLC, registered in the US and other countries. FLUKA is a trademark of Sigma-Aldrich GmbH, registered in the US and other countries. SAFC brand products are sold through Sigma-Aldrich, Inc. Purchaser must determine the suitability of the product(s) for their particular use. Additional terms and conditions may apply. Please see product information on the Sigma-Aldrich website at sigma-aldrich.com. MISSION is a registered trademark of Sigma-Aldrich Co. LLC. 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