一23一平成12年12月(2000年) マウスリンパ組織のレプチンレセプター発現細胞の検出阪口恵子,佐藤久湊紘子,徳永雅美,西津尚子,松永美沙子,宮田 Identification of leptin in lymphoid 堅司 receptor-expressing tissues cells of the mouse Keiko Sakaguchi, Hiroko Satoh, Masami Tokunaga, Shyoko Hisaminato, 景子, Keiko Nishitsu, Misako Matsunaga and Kenji Miyata Leptin, the product of the ob gene expressed in adipocytes, is shown to influence energy intake and expenditure, proliferation of CD4+ T cells, neovascularization and intracellular triglycerides homeostasis in non-adipocytes. Leptin acts on target cells through receptor (OB-R) . There are at least five different types of OB-R in mouse due to alternative splicing from db gene transcripts. OB-Ra OB-Rd share identical extracellular and transmembrane domains and JAK binding consensus sequence at cytoplasmic domain. Only OB-Rb has an additional STAT binding motif and is essential for most of leptin' s physiological functions through JAK-STAT pathway. OB-Ra is also reported to transduct weakly leptin's signal through JAK-phospholyration pathway. On this paper we examined which kinds of cell express OB-Ra or OB-Rb in lymphoid and fat tissues of the mouse. Both types of OB-R were detected in thymus, spleen and gastrolienal fat tissue by RTPCR method, then the constitutive cells were separated from dissected tissues and cultured in GIT medium with 10% heat-inactivated FBS. Primary cultured lymphocytes isolated from thymus or spleen expressed both OB-Ra and OB-Rb. On the other hand, in adhesive cells disparsed with enzymatic digestion and primary cultured OB-Rb was not detected, though OB-Ra detectable. Similarly, primary cultured adhesive cells of gastrolienal fat tissue expressed only OB-Ra. It is therefore most parsimonious to conclude that only lymphocytes express OB-Rb and response effectively to leptin in thymus. 1.は Ra∼OB-Rdの細胞外領域および膜貫通領域は同一であり,細胞内領域のみアミノ酸配列が異なる。じめに脂肪細胞の産生するレプチンは,エネルギー摂取を抑制し消費を促すホルモン作用のみでなく,サイトカインとして種々の生理機能を有していることが OB-Reは細胞外領域のみからなる可溶性レセプターである。5種は302アミノ酸残基からなる最も長い細胞内領域を明らかにされつつある。レプチンはレセプター持ち,OB-R (OB-R)をる。はdb遺介して標的細胞に作用する1,2)0マ伝子の転写産物であるpre-mRNAのライシングの違いにより,少 OB-Reの5種ウスでスプなくともOB-Ra∼ 類のレセプターが存在する1-3)。 OB一類のレセプターの中で,OB-Rb Long type(OB-RL)と前報において4),マウスのリンパ組織における OB-Rbの胸腺,お発現を検討し,一次リンパ性器官であるよび二次リンパ性器官である脾臓,リ節およびバイエル板でOB-Rbが京都女子大学家政学部食物栄養学科栄養学第二研究室も呼ばれていと,さンパ発現しているこらに,胸腺および脾臓から分離したリンパ球ー 2 4- 5号食物学会誌・第 5 が OB-Rbを発現していることを明らかにした。リ間後に培養液を交換することにより浮遊細胞を取りンパ組織では，上皮様の細胞がネットワーク構造を除いた。その後 3~4 日毎に培養液を交換しながら，とり枠組みを構成している。これらの細胞間隙にリほぼコンフルエントな状態になるまで培養を継続すンパ球やマクロファージが存在する。また，結合組ることにより付着性細胞集団を得た。織性の被膜やトラベキュラには線維芽細胞などの結 2 . RNAの抽出合組織性細胞が存在する。これらの細胞の中でリン 1 ) 器官，組織およびリンパ球の RNAの抽出パ球は浮遊性であり，その他の細胞は付着性を示す。したがって，リンパ組織を酵素処理することにより分散させた細胞集団を培養すれば，リンパ球以外の凍結した器官，組織およびリンパ球より，酸性グアニジウムチオシアン酸フェノールム法によってトータル RNAを抽出し，エタノール付着性細胞の集団を得ることができる。本報では，沈殿法により精製した 5 .九胸腺および牌臓で OB-Raおよび OB-Rbを発現し 2 ) 付着性細胞の RNAの抽出ている細胞の同定を試みた。また，脂肪組織の構成付着性の細胞がほぼコンフルエントな状態になった後にトータル RNAを抽出した。生理食塩水 1ml 細胞についても同様の検討を行った。法 1 方クロロホルで培養ディッシュを 2回洗浄し，顕徴鏡下に細胞が付着していることを確認後氷上で冷却した。 8 00μl 1.材料 3週齢の雌 BALB/cマウス ( 体重 9~12 g，のグアニジウムチオシアン酸溶液を加え，ピペッティング操作により細胞を溶解させた後エッベンチ SLC)を用いた。ューブに移した。その後，酸性グアニジウムチオシ 1)器官，組織の摘出アン酸ーフェノールークロロホルム法にしたがって頚椎脱臼後開腹開胸し，胸腺，牌臓，胃牌間膜脂トータル RNAを抽出し，エタノール沈殿法により肪組織を摘出した。摘出した試料はサンプルチュー精製した。ブに入れ，直ちに液体窒素中で凍結した後 -800C 3 . RTPCR トータル RNAを鋳型として RTPCRを行った。で保存した。 2 ) リンパ球の分離逆転写反応は M・MLV リパーストランスグリプ無菌的に摘出した胸腺および牌臓を生理食塩水中ターゼ (RT-PCRh i g h，東洋紡)， 6塩基ランダムで細切し，ピンセットで軽く圧迫することにより遊プライマーを用い， 3 0 Cで 1 0分，さらに 4 20C で離してくる細胞を遠心操作(約 8 00g ) により集め 1時間行った。 ggoCで 5分処理することにより反た。細胞ベレットを GIT培養液(日本製薬)で洗応を停止させた。この反応産物に， OB-Rを増幅す浄後， 10%FBSを加えた GIT培養液で培養した。るためのプライマーおよびリコンビナントタック 1日後遠心操作により得た細胞ベレットを生理食塩水 1mlに再懸満し，マウスリンパ球分離溶液 Lym- DNAポリメレースを加え PCRを行った。マウス p h o l y t e M( C e d a r l a n eL a b o .L t d .， Canada)2mlにの 3種類のプライマーを準備した。重層した。lOOC，1 ，3 0 0gで2 0分間遠心し，上層と 0 の OB-Raおよび OB-Rbを検出するために，下記プライマー OBR-F3 5 ' p-ACACTGTT AA TTTCACACCAGAG 下層の界面の細胞をパスツールピペットで分取した。生理食塩水で洗浄後，遠心操作により細胞を回プライマー OBRB2 幽 5 ' p-TGGATAAACCCTTGCTCTTCA 収した4)。細胞ベレットを液体窒素中で凍結した後，プライマー OBR-B4 -800Cで保存した。 3 ) 付着性細胞の分離 5 ' p-ATTTGAACTCAGGACCTTTGGA 無菌的に摘出した胸腺，牌臓および胃牌間膜脂肪を 5ml生理食塩水中で細切した。 2.5%トリプシンプライマー OBR-F3と OBR-B2 との組み合わせによって，マウスのレプチンレセプターの中で， OB- 液(大日本製薬) 0 . 5mlを加え， 3 7 C， 5分間イ 4 6 Rbの cDNAの膜貫通領域から細胞質側領域の 4 ンキュベートした。 GIT培養液 5mlを加え，ピペ塩基対の DNAフラグメントが増幅され6)，プライッティング操作により遊離してきた細胞を遠心操作マー OBR-F3と OBR-B4との組み合わせによってにより回収した。 GIT培養液で洗浄後， 10%FBS OBRaの cDNAの膜貫通領域から細胞質側領域の含有 GIT培養液に懸濁し培養ディッシュ ( T i s s u e 6 5 7 塩基対の DNAフラグメントが増幅される 3，7 L 0 C u l t u r eD i s h3 5m m，IW AK I)に播種した。 4 8時司 PCRの条件は，反応溶液容量 5 0 μ1，鋳型変性温平成 1 2 年1 2月 ( 2 0 0 0 年) 2 5 度9 60Cおよび変性時間 3 0秒，プライマーアニーリ製したトータル RNA約 3 00ngを鋳型としてング温度 5 50Cおよびアニーリング時間 1分，相補 RTPCRを行った。いずれのリンパ球においても，鎖合成反応温度 7 2Cおよび反応時間 2分， 3 5サイ OB-Raおよび OB-Rbの発現を示す増幅バンドが認クルに設定した。。 ) められた(図 3 0 PCR終了後，反応産物溶液 1 0 μ lをアガロースゲルで、電気泳動した。電気泳動終了後，エチジュウ 3 . 胸腺および牌臓の付着性細胞のレプチンレセプターの検出ムブロマイド液で染色し，ポラロイド撮影を行った。トリプシン処理により分離してくる細胞を 1 0日間マーカー DNAO/HindI I I) O .5μgを同時に電気以上培養し，付着性の細胞集団を得た。この細胞集泳動し，増幅されたノミンドの大きさを確認した。団を顕微鏡観察すると，胸腺では，線維芽細胞，胸 4 . ジェノミック DNAの抽出腺上皮様の細胞，樹状細胞，敷石状にコロニーを形凍結した牌臓の組織片より，プロテネース K 処成した細胞が多く認められ，さらに，マクロファー理，フェノール抽出法によりジェノミック DNAをジや脂肪滴を蓄積した細胞も認められた。牌臓で、は，抽出した 8)。線維芽細胞，粁状の細胞，マグロファージが多く認められた。これらの付着性の細胞集団から精製した i l l .結果トータル RNA約 3 0 0ngを鋳型として RTPCRを 1 . リンパ性器官および脂肪組織のレプチンレセプ行った。いずれの場合にも， OB-Raの発現を示す増幅パンドが認められた。 OB-Rbの発現を示すバターの検出胸腺，牌臓，胃牌間膜脂肪のトータル RNA1μg を鋳型として RTPCRを行った。胸腺および牌臓では OB-Raおよび OB-Rbの発現をあらわす明瞭ンドは認められなかった(図的。 4 . 胃牌間膜脂肪組織の付着性細胞のレプチンレセプターの検出な増幅バンドが認められた(図 1)。胃牌間膜脂肪胃牌間膜をトリプシン処理することにより分離し組織では OB-Raの増幅バンドは認められたけれどてくる細胞を 1 0日間以上培養し，付着性の細胞集団も，試料によっては OB-Rbの明瞭な増幅バンドはを得た。この細胞集団には線維芽細胞および敷石状 ) 認められなかった(図 2。にコロニーを形成した細胞が認められた。これらの 2 . リンパ球のレプチンレセプターの検出胸腺および牌臓から培養分離したリンパ球から精 4321m 4 321m ~~コ図 1 胸腺および牌臓の OB-Rの検出トータル RNA1μgを鋳型として RTPCR を行った。いずれの器官においても OB-Ra および OB-Rbに特異的な 6 57b . p .および 4 4 6b . p .の増幅パンドが認められた。レーン m;マーカ -DNA， 1 ;胸腺 OBRa，2 ，胸腺 OB-Rb，3 ;牌臓 OB-Ra，4 ; 牌臓 OB-Rb ~~コ図 2 胃牌間膜脂肪組織の OB-Rの検出トータル RNA1μgを鋳型として RTPCR を行った。試料 A では OB-Raおよび OB-Rb に特異的な増幅バンドが認められた。試料 B では OB-Raの増幅パンドは認められたけれども， OB-Rbに特異的なパンドは認められなかった。レーン :m;マーカー DNA， 1 ;試料 AOBRa， 2 ;試料 A OB-Rb， 3 ;試料 BOBRa， 4 ;試料 BOB-Rb ← 2 6 食物学会誌・第 5 5号 4321m 付着性の細胞集団から精製したトータル RNA約 3 0 0ngを鋳型として RTPCRを行った。 OB-Raの発現を示す増幅バンドは認められたけれども， OB- Rbの発現を示すパンドは認められなかった ( 図 4。 ) 5 . ジェノミック DNAを鋳型とする PCR 次に，これらの 4 4 6 塩基対あるし、は 6 5 7 塩基対の増幅バンドが，混在する DNAによるものではないことを確かめた。牌臓から抽出した DNA0 .1 ， 0.5 ~é コおよび1.0μgを鋳型として PCRを行ったけれども，いずれの増幅パンドも認められなかった。町.考察図3 リンパ球の OB-Rの検出 4時間培胸腺および牌臓から遊離した細胞を 2 養し付着細胞を取り除いた。非付着性細胞からリンパ球分離溶液を用いて分離したリンパ 00ngを鋳型として球のトータル RNA約 3 RTPCRをおこなった。胸腺および牌臓リンパ球ともに OB-Raおよび OB-Rbに特異的な増幅パンドが認められた。レーン m;マーカー DNA， 1 ;胸腺リンパ球 OB-Ra， 2 ;胸腺リンパ球 OB-Rb， 3 ; 牌臓リンパ球 OBRb， 4 ;牌臓リンパ球 OB-Ra 司マウスレプチンのレセプターには，同ーの遺伝子転写産物のスプライシングの違いにより 5種類のアイソタイプ OB-Ra~ OB-Reが存在することが知られている 1-3)。これらの細胞外領域のアミノ酸配列は同一であり，レプチン結合サイトを有している。 OB-Ra~ OB-Rdは2 1アミノ酸残基からなる共通の膜貫通領域を持ち，さらに膜貫通領域に続く細胞質 9 残基も共通している。この領域には内のアミノ酸 2 J AK ( J anusk i n a s e )結合サイトが存在する九 OBRbは 302アミノ酸残基からなる最も長い細胞質内領域を有し， ST AT( S i g n a lt r a n s d u c e randa c t i v a - 654321m t o ro ft r a n s c r i p t i o n ) と相互作用するモチーフおよびチロシン 3残基が存在する 10)0 OB-Rbにレプチンが作用すると，細胞質内領域に結合している JAK2がリン酸化され，リン酸化された JAK2により STAT3がリン酸化され細胞核にシグナルを伝える。 SHP-2(SH2domainc o n t a i n i n gp r o t e i nt y r o - s i n ephosphatase2 ) によって JAK2が脱リン酸化 657→ されて応答が終了すると考えられている 12， 13L したがって，レプチンの種々の生理機能の発現には OB- Rbが寄与していると考えられており，器官，組織 3， 1 3 1 7 ) 。レベルで、の発現部位が多数報告されている 2， 7 ) ，RNAsep r o t e c t i o n マウスの脳では， RTPCR法2，図 4 付着性細胞の OB-Rの検出胸腺，牌臓，および胃牌間膜脂肪から分離培 0 0ng 養した付着性細胞のトータル RNA約 3 を鋳型として RTPCRをおこなった。いずれの付着性細胞でも OB-Raに特異的な増幅パンドが認められたけれども， OB-Rbに特異的なバンドは認められなかった。レーン :m;マーカー DNA， 1 ;胸腺付着性細胞 OB-Ra， 2 ;胸腺付着性細胞 OB-Rb， 3 ，牌臓付着性細胞 OB-Ra， 4 ;牌臓付着性細胞 OB-Rb， 5 ;胃牌間膜脂肪付着性細胞 OB-Ra， 6 ; 胃牌間膜脂肪付着性細胞 OB-Rb 法 13)，i ns i t uh y b r i d i z a t i o n法 J4， 1 5により脈絡叢や視床下部で OB-Rbが強く発現していることが示されており，神経細胞が発現していると考えられている。細胞レベルで、調べた報告もなされており，ヒト末梢血から分離した CD4十リンパ球が OB-Rbを発現している 16L また，合成ペプチドを抗原とするウサギ抗 OB-Rポリクローナル抗体により，ヒト瞬帯静脈内皮細胞が OB-Rbを発現していることが示された l7L 脈絡叢や，その他多くの組織で発現している OB- 平成 1 2 年1 2月 ( 2 0 0 0 年) 一 2 7- Raの機能は明らかでない。しかし OB-Raおよびの説明となり得る。たとえば，腎臓や肺では発現し ]AKを発現している COS-1形質転換細胞では，ていないとの報告2.13)，および発現しているとの報 ]AKのリン酸化に始まり MAPK経路が活性化さ告3.15) の両者が存在する。この矛盾は，試料中にリれることより， OB-Raもシグナル伝達能を有してンパ球が多く混在してくるかどうかに基ずく可能性いると示唆されている l l Lその他のアイソタイプのが高い。したがって，組織レベルではなく，どの種機能は明らかにされていないけれども， OB-Reは類の細胞が発現しているのかを解明することが重要その構造からレプチンの運搬やクリアランスに関与となる。そのためには，組織切片を用いた i ns i t u していると考えられている l L ハイブリダイゼーション法による検討や，各器官の本報では，膜貫通領域と細胞質領域の境界域に対する共通のリパースプライマーと，それぞれに特異細胞を分離して検討することが必要となる。以上より，胸腺および牌臓で，非付着性細胞であ的な細胞質領域に対するフォワードプライマーとをるリンパ球と付着性細胞集団とに分離し OB-Rの用いて，胸腺および牌臓，脂肪組織の付着性細胞の発現を調べ， OB-Raおよび OBRbの検出を試みた。胸腺や牌臓ることを明らかにした。付着性の細胞集団では OB- から分離培養した付着性の細胞としては線維芽細 Rbが検出されなかったので，これらの細胞をさら胞，上皮様細胞，樹状細胞が多く認められる。これに分離することは試みなかった。ただし付着性細らの細胞集団では OB-Raが検出されたけれども，胞集団のなかで培養中に分裂増殖しない少数の細胞 OB-Rbは検出されなかった。前報では，一次およが OB-Rbを発現している可能性は存在する。脂肪び二次リンパ組織において OB-Rbが発現している組織の付着性細胞も同様であった。幽こと，および胸腺および牌臓から分離したリンパ球が OB-Rbを発現していることを報告した 4)。したがって，胸腺および牌臓において発現している OB- v .要リンパ球のみが OB-Rbを発現してい約 BALB/c雌 3週齢マウスの胸腺，牌臓，および Rbはリンパ球に由来するものであることが明らか胃牌間膜脂肪組織でレプチンレセプター OB-Raおとなった。マウス胸腺では，遅くとも 3週齢時にはよび OB-Rbが発現していることを明らかにした。脂肪細胞が存在しレプチンを産生しているので6)，また，これらの器官・組織を構成する細胞を一次培 OB-Rbを介してレプチンがサイトカインとしてリ養することにより，どの種類の細胞が発現しているンパ球に作用していることが示唆された。胸腺内でのかを検討した。胸腺および牌臓のリンパ球は OB- はこの伝達経路はリンパ球特異的と考えられ， Raおよび OB-Rbを発現していた。付着性の細胞リンパ球の分化等に関与していることが示唆される。は OB-Raを発現していたけれども OB-Rbは検出 OB-Raはリンパ球および付着細胞で発現しており，されなかった。胃牌間膜脂肪組織の付着性細胞でもホメオスタティックな機能に関与すると考えられ OB-Raは検出されたけれども OB-Rbは検出されなる。たとえば，レプチンの新しい機能として種々のかった。 5種類のレセプターの中で OB-Rbが細胞の脂肪酸およびトリグリセリド量のホメオスタ ]AK-STAT経路を介してシク守ナル伝達に関与するシスに関与することが示唆されている 18L とされている。したがって，胸腺で加齢に伴って増マウス脂肪組織では OB-Rbが極徴量発現してい殖してくる脂肪細胞が産生するレプチンが，サイトることが報告されている 2，13L 胃牌間膜脂肪組織でカインとしてリンパ球のみに作用している可能性がは OB-Rbの発現を示すパンドが認められない試料示唆された。も存在した。同一試料で同時に RTPCRを行い，共通のリパースプライマーを用いて OB-Raは検出されるので，鋳型とした RNAが分解されたり，逆転写反応や PCRの段階に障害が存在するとは考え文献 1 )] .M.Friedmanand] .L .H a l a a s :N a t u r e ，3 9 5， 7 6 3( 19 9 8 ) 難い。今回，胃牌間膜の一次培養した付着性の細胞 2 ) G-H. Lee，R . Proenca，] . M. Montez，K .M. 集団では OB-Rbの発現は認められなかった。した C a r r o l l， ] .G .D a r v i s h z a d e h， ] .I .Leeand].M. がって，脂肪組織中に混在するリンパ球数によって F r i e d m a n :N a t u r e ，3 7 9，6 3 2( 19 9 6 ) OB-Rbの検出結果が異なる可能性が示唆された。 3 ) H. Chen，O . Cha r 1 a t，L .A. T a r t a g l i a，E .A. このことは，これまで報告されている種々の器官・ Woolf，X.Weng，S . ] .E l l i s，N .D . Lakey，] . 組織での OB-Rbの発現に関する結果が異なること C u l p e p p e r，K.].Moore，R .E .B r e i t b a r t，G .M. 2 8- 食物学会誌・第 5 5号 Duyk，R .1 . Tepper and J .P. Morgenstern: 1 1 )C .B j O r b e k，S .U o t a n i，B .daS i l v aandJ e 宜r e y C e l l ，8 4， 4 9 1( 19 9 6 ) i o l .Chem.，2 7 2，3 2 6 8 6( 1 9 9 7 ) S .F l i e r :JB 1 2 )C .L iand] .M.F r i e d m a n :P r o c .N a t l .A c a d . 4 )井固めぐみ，草信映子，鈴木真知子，酒井奈美，白井能富子，永尾命子，職川智子，宮田堅司: 本誌， 5 4，1 ( 19 9 9 ) 5 )P . Chomczynski and N .S a c c h i :A n a l y t i c a l 6 2，1 5 6( 19 8 7 ) B i o c h e m .，1 6 ) 春那美由紀，星島直子，井田めぐみ，草信映子，鈴木真知子，坪田いずみ，林小百合，宮田堅司: 3，1 3( 1 9 9 8 ) 本誌， 5 7 )1 .A. T a r t a g l i a，M. Dembski，X. Weng，N . Deng，J .Culpepper，R .Devos，G .J .R i c h a r d s， 1 .A. Campfieid，F .T. C l a r k，J . Deeds，C . Muir，S .Sanker，A.M o r i a r t y，K . ] .Moore，J . S . Smutko，G .G . Mays，E .A . Woolf，C .A. . Tepper: C e l l，83，1263 Monroe and R .1 ( 1 9 9 5 ) 8 )] . Sambrook，E .F .F r i t s c handT.M a n i a t i s : M o l e c u l a rC l o n i n gA Lab o r a t o η Manu α1 ，2凶 ed，9 .1 6( 1 9 8 9 ) 9 ) M.N a r a z a k i，A.B .Witthuhn，K .Yoshida，O . S i l v e n n o i n e n，K . Yasukawa，N.J .I h l e，T . K i s h i m o t oandT .Taga:Pr o c .N a t l .A c a d .S c i . ，9 1， 2 2 8 5( 1 9 9 4 ) USA 1 0 ) H.Baumann ，] .A .Symes，R .M.Comeau，K . K.M o r e l l a，Y.Wang，D .F r i e n d，F .S .Z i e g l e r， S .] .FinkandP .D .G e a r i n g :M o l .C e l . lB i o l .， 1 4， 1 3 8( 19 9 4 ) S c i .USA ，9 6，9 6 7 7( 19 9 9 ) S .Z i e g l e r， A.W i e s t n e r， R .S t o f f e l， 1 3 )N .G h i l a r d i， M.H .Heima n dR .C .S k o d a :P r o c .N a t l .A c a d . S c i .USA，9 3，6 2 3 1( 1 9 9 6 ) 1 4 )J .G .Mercer，N .Hoggard，L .M.W i l l i a m s，C . .T .Hannaha n dP .T r a y h u r n : B .Lawrence，1 FEBSLet t .，3 8 7，1 1 3( 19 9 6 ) 1 5 ) H.F e i，H.J .Okano， C .L i， G . H .Lee，C .Z h a o， R .D a r n e l landJ .F r i e d m a n :P r o c .N a t l .A c a d . S c i .USA ，9 4，7 0 0 1( 19 9 7 ) .M a t a r e s e，J .K .Howard，R . ] . 1 6 )G .M.Lord，G S .R .Blooma n dR .I .L e c h l e r :Nature ， Baker， 3 9 4， 8 9 7( 19 9 8 ) 1 7 ) M.R . S i e r r a H o n i g m a n n， A .K . Nath， C . 王a mi， G . G a r c i a C a r d e n a， A . Mural W.C .S e s s a， 1 .A .Madge， J . P a p a p e t r o p o u l o s， S .S c h e c h n e r，M.B .Schwabb，P . ] .P o l v e r i n i c i e n c e ，2 81 ，1683 andJ .R .F l o r e s -R i v e r o s :S ( 19 9 8 ) .H .Unger，Y .T .Zhouand1 .O r c i :P r o c . 1 8 )R N a t l .A c a d .S c i .USA ，9 6，2 3 2 7( 19 9 9 )