博士論文 豚におけるサルモネラおよび 大腸菌感染系の確立と 抗菌剤代替物質評価への応用 2014 年 8 月 田中剛志 1 The development of infection models for S . Typhimurium and E. coli and their application for evaluation of antimicrobial substitution Tsuyoshi Tanaka 2 目次 第一章 緒論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・4 第二章 豚 サ ル モ ネ ラ ・ テ ィ フ ィ ム リ ウ ム 感 染 系 の 確 立 ・ ・ ・ ・ ・ 11 第三章 豚サルモネラ・ティフィムリウム感染系を用いた乳酸添加飼 料 の 評 価 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 35 第四章 豚 大 腸 菌 感 染 系 の 確 立 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 47 第五章 豚 大 腸 菌 感 染 系 を 用 い た 乳 酸 添 加 飼 料 の 評 価 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 68 第六章 総 括 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 81 論 文 目 録 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 84 参 考 文 献 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 85 謝 辞 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 100 3 第一章 緒論 4 抗 菌 剤 は 、家 畜 の 健 康 を 守 り 、安 全 な 畜 産 物 の 安 定 生 産 を 確 保 す る 上 で 重 要 な 資 材 で あ る が 、そ の 使 用 に よ る 薬 剤 耐 性 菌 の 出 現 か ら ヒ ト や 家 畜 に 対 す る 健 康 リ ス ク が 懸 念 さ れ て い る [1]。 家 畜 に お け る 健 康 リ ス ク と は 、 病 原 細 菌 が 対 象 動 物 に 使 用 さ れ た 薬 剤 に 対 し て 耐 性 化 し 、そ れ に よ っ て 治 療 が 困 難 に な る リ ス ク で あ る [2]。 一 方 、 家 畜 に 対 す る 抗 菌 剤 の 使 用 に お け る ヒ ト へ の 健 康 リ ス ク と は 、動 物 か ら ヒ ト に 耐 性 化 し た 菌 あ る い は 耐 性 遺 伝 子 が 感 染 あ る い は 伝 播 す る リ ス ク で あ る [3]。 1969 年 の 英 国 の ス ワ ン レ ポ ー ト に よ り 、 初 め て 家 畜 由 来 の 薬 剤 耐 性 菌 の 公 衆 衛 生 へ の 影 響 に つ い て 注 目 さ れ る よ う に な っ た [4]。そ こ で は 、「家 畜 に 成長促進目的で使用される飼料添加の抗菌性物質が薬剤耐性菌や R プラス ミ ド の 増 加 を 促 す 原 因 と な り 、ひ い て は ヒ ト お よ び 食 用 動 物 の 健 康 を 損 な う 恐 れ が あ る た め 、 十 分 な 規 制 措 置 が 必 要 」と 報 告 さ れ て い る 。 こ の ス ワ ン レ ポ ー ト を 契 機 と し て 、各 国 で 家 畜 へ の 抗 菌 性 物 質 使 用 に よ る 薬 剤 耐 性 問 題 が 立 ち 上 が り 、各 種 の 対 応 が 図 ら れ る よ う に な っ た 。例 え ば 、デ ン マ ー ク で は 、 1999 年 か ら 全 て の 抗 菌 性 成 長 促 進 剤 の 使 用 が 中 止 さ れ た [5]。し か し 、デ ン マークでは抗菌性成長促進剤の使用が中止された後に治療用の抗菌剤の使 用 量 が 増 加 し 、全 体 と し て 抗 菌 剤 の 使 用 量 を 大 幅 に 削 減 す る ま で に は 至 ら な か っ た [6]。 一 方 EU で は 、 EU 委 員 会 傘 下 で 飼 料 添 加 物 の 科 学 的 評 価 を 行 う 機 関 で あ る 家 畜 栄 養 科 学 委 員 会( SCAN)が「 抗 菌 性 飼 料 添 加 物 の 使 用 が 家 畜 や 人 に 危 害 を 及 ぼ す と い う 根 拠 が な く 、動 物 由 来 の 薬 剤 耐 性 遺 伝 子 が 人 の 消 化 管 内 細 菌 に 伝 達 す る こ と を 証 明 す る 新 た な 根 拠 は 示 さ れ て い な い 」と の 審 査 結 果 を 提 出 し た が [4]、EU 委 員 会 は 疑 い が あ る 限 り は そ の 使 用 を 中 止 す べ き と す る “ 予 防 の 原 則 ” に 則 っ た 対 応 を 行 い 、 2006 年 1 月 か ら 成 長 促 進 を 目的とした抗菌性飼料添加物の使用が全面的に中止されることになった。 EU の 抗 菌 剤 を め ぐ る 薬 剤 耐 性 菌 へ の 懸 念 は 、 そ の 後 治 療 用 の 動 物 用 医 薬 品にも向けられ、特にヒト医療上重要度の高い、フルオロキノロン系薬剤、 第三および第四世代セファロスポリン系薬剤およびマクロライド系薬剤の 3 系 統 の 薬 剤 に 対 す る リ ス ク 評 価 が 行 わ れ 、フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 薬 剤 と 第 三 お よ び 四 世 代 セ フ ァ ロ ス ポ リ ン 系 薬 剤 に 対 し て は 、他 剤 無 効 例 に そ の 使 用 を 温 存 す る 、マ ク ロ ラ イ ド 系 薬 剤 に 対 し て は 適 正 使 用 を 強 力 に 推 し 進 め る 必 要 5 が あ る と い っ た 、 い わ ゆ る “ 慎 重 使 用 ” が 打 ち 出 さ れ て い る [4]。 こ の よ う に デ ン マ ー ク を は じ め EU 諸 国 で は 、 薬 剤 耐 性 菌 へ の 懸 念 か ら 家 畜 に お け る 抗菌剤の使用に厳しい目が向けられている。 ま た 、 EU 以 外 で も 米 国 で は ヒ ト 医 療 上 重 要 視 さ れ る 抗 菌 性 物 質 の 動 物 へ の 治 療 的 使 用 を 中 心 に 対 策 が 進 め ら れ て お り [4]、 具 体 的 に は 科 学 的 に リ ス ク を 評 価 し 、対 策 を 考 慮 す る と い う も の で 、現 在 ま で に セ フ ァ ロ ス ポ リ ン 系 お よ び マ ク ロ ラ イ ド 系 の リ ス ク 評 価 が 行 わ れ て い る 。そ の 他 に も オ ー ス ト ラ リ ア 、カ ナ ダ 、韓 国 な ど 各 国 で 動 物 に お け る 適 切 な 抗 菌 剤 使 用 へ の 対 策 が 進 められている。 一 方 、 我 が 国 に お い て は 、 諸 外 国 の 動 き も 受 け て 、 平 成 7 年 度 ( 1995 年 度 ) か ら 家 畜 病 原 細 菌 の 薬 剤 耐 性 調 査 を 開 始 し 、 平 成 12 年 度 か ら は 家 畜 衛 生 分 野 に お け る 薬 剤 耐 性 モ ニ タ リ ン グ 体 制 (JVARM: Japan Veterinary Antimicrobial Resistance Monitoring System)を 設 立 し 、 食 用 動 物 に お け る抗菌剤使用量の調査および野外流行株や食品媒介病原性細菌等における 薬 剤 耐 性 調 査 を 実 施 し 、こ れ ら の 結 果 を「 治 療 効 果 を 最 大 化 し 、薬 剤 耐 性 菌 の 出 現 を 最 少 化 す る 」と い う“ 慎 重 使 用 ”に 反 映 さ せ る こ と と な っ て い る [7]。 我 が 国 に お い て は 現 在 、ヒ ト 医 療 で の 重 要 度 が 高 い フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 、第 三および第四世代セファロスポリン系およびマクロライド系を中心に臨床 獣 医 師 に 対 し て“ 慎 重 使 用 ”の 呼 び か け が 行 わ れ て い る 。実 際 、我 が 国 の 畜 産 領 域 で の 抗 菌 剤 等 抗 菌 性 物 質 の 使 用 量 を 、2001 年 度 と 2011 年 度 で 比 較 す る と 飼 料 添 加 物 と し て 2001 年 は 233 ト ン 、一 方 2011 年 度 は 234 ト ン 、動 物 用 医 薬 品 と し て は 2001 年 で 1,059 ト ン 、一 方 2011 年 度 は 781 ト ン で 、こ れ ら を 合 計 し た 使 用 量 は 2001 年 度 が 1,292 ト ン で 、2011 年 度 は 1,015 ト ン と 減 少 傾 向 に あ る [7、 8]。 し か し な が ら 、 2012 年 度 に 我 が 国 で 使 用 さ れ た 抗 菌 物 質 等 の 抗 生 物 質 の 合 計 1,693 ト ン の 内 飼 料 添 加 用 に 175 ト ン 、家 畜 の 治 療 用 に 727 ト ン の 併 せ て 902 ト ン と 、実 に 半 分 以 上 が 畜 産 現 場 で 使 用 さ れ て い る [9](図 1)。 ま た 、 我 が 国 の 消 費 者 か ら も 抗 菌 性 物 質 に 関 す る 責 任 あ る 慎 重 な 使 用 を 求 め る 声 が 上 が っ て お り [10]、今 後 そ の 使 用 量 を 減 ら す 取 り 組 みをさらに強化する必要がある。 一 方 、畜 産 現 場 に お い て 、抗 菌 剤 は 畜 産 物 の 安 定 生 産 に は 不 可 欠 な 資 材 と 6 し て 使 用 さ れ て い る 。 畜 種 別 に み る と 、 2001 年 で は 動 物 用 抗 菌 剤 の 販 売 高 の 実 に 54%を 豚 が 占 め て お り 、 次 い で 水 産 用 に 22%、 鶏 用 に 16%、 牛 用 に 8% と な っ て い る [7、8]。ま た 、我 が 国 で ヒ ト 医 療 上 重 要 度 が 高 い た め に 、第 二 次 選 択 薬 と し て 承 認 さ れ 特 に 強 く“ 慎 重 使 用 ”が 求 め ら れ て い る 上 記 3 系 統 ( フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 、第 三 お よ び 第 四 世 代 セ フ ァ ロ ス ポ リ ン 系 お よ び マ ク ロ ラ イ ド 系 ) の 動 物 用 抗 菌 剤 の 中 で 、 2012 年 度 に 使 用 実 績 が あ っ た フ ル オ ロキノロン系薬剤および第三および第四世代セファロスポリン系薬剤のそ れ ぞ れ 25.5%お よ び 45.8%が 豚 で 使 用 さ れ て お り [11]、 こ れ ら “ 慎 重 使 用 ” を 求 め ら れ て い る 薬 剤 で も 豚 で の 使 用 が 多 く な っ て い る 。こ の よ う に 治 療 用 抗 菌 剤 の 使 用 量 が 豚 で 多 い 理 由 と し て 、採 卵 鶏 で は 産 卵 期 間 中 の 抗 菌 剤 の 使 用 は 原 則 と し て 禁 じ ら れ て お り 、ま た ブ ロ イ ラ ー で は 飼 養 期 間 が 短 い た め に 抗菌剤の使用による休薬期間を考慮すると実際に投薬できる期間が短いこ と が あ げ ら れ る 。一 方 で 、牛 や 豚 は 飼 養 期 間 も 長 く 休 薬 期 間 も 守 り や す い が 、 牛 で は 個 体 診 療 に よ る 注 射 や 飼 料 添 加 が 中 心 で 、豚 で は 群 で の 管 理 が 一 般 的 で あ り 、群 全 体 へ の 投 薬 が 行 わ れ る た め に 豚 で の 使 用 量 が 増 え る も の と 考 え ら れ る 。ま た 、豚 で は 呼 吸 器 感 染 症 や 腸 管 感 染 症 に 多 く の 病 気 が あ り 、そ の 対 策 と し て 、ワ ク チ ン と 併 せ て 抗 菌 剤 の 飼 料 添 加 が 衛 生 プ ロ グ ラ ム に 組 み 込 まれている農場が多いことも一因となっている。 実 際 に 多 く の 養 豚 場 に は 複 数 の 病 原 体 が 浸 潤 し て お り [12]、中 で も 豚 の 腸 管 感 染 症 は 多 く の 養 豚 場 に お い て 頻 繁 に 認 め ら れ て い る 。豚 の 腸 管 感 染 症 の 原 因 と な る 主 な 病 原 体 と し て サ ル モ ネ ラ と 大 腸 菌 が 挙 げ ら れ る [13、 14]。 豚 の サ ル モ ネ ラ 症 は 我 が 国 で の 発 症 例 の 報 告 も あ り [15]、豚 の 下 痢 便 か ら も 高 率 に 分 離 さ れ て い る [16]。加 え て 、サ ル モ ネ ラ は ヒ ト 食 中 毒 の 主 な 原 因 菌 と し て も 知 ら れ て お り 、特 に EU で は 1990 年 代 に 発 生 し た ヒ ト の サ ル モ ネ ラ 食 中 毒 の 20%程 度 が 豚 肉 の 喫 食 と 関 連 し て い た と 報 告 さ れ て い る [17]。そ の た め EU 諸 国 で は 、 生 産 農 場 か ら 食 卓 ま で 全 て の 段 階 で 畜 産 物 の 食 中 毒 対 策 に 取 り 組 む “ Farm to Table” を 実 践 す る こ と で 、 ヒ ト 食 中 毒 の 発 生 を 減 少 さ せ る 成 果 を 挙 げ て お り [18]、生 産 現 場 か ら の コ ン ト ロ ー ル が 有 効 で あ る こ と が 示 さ れ て い る 。養 豚 場 に お け る サ ル モ ネ ラ 対 策 と し て は 、飼 養 環 境 の 改 善 や オ ー ル イ ン・オ ー ル ア ウ ト の 実 践 等 と 併 せ て 、抗 菌 剤 を 用 い た 対 策 も 7 行 わ れ て い る [19、20]。し か し 、サ ル モ ネ ラ に お け る 薬 剤 耐 性 菌 の 出 現 が 報 告 さ れ て お り [21]、慎 重 使 用 が 求 め ら れ て い る 第 二 次 選 択 薬 を 使 用 せ ざ る を 得ない事例も発生している。 一 方 、大 腸 菌 は 豚 で は 新 生 期 下 痢 症 、離 乳 後 下 痢 症 お よ び 浮 腫 病 等 の 原 因 菌で、多くの農場から分離されており、我が国でも発症が認められている [22]。大 腸 菌 の 対 策 も サ ル モ ネ ラ と 同 様 に 飼 養 管 理 の 改 善 や 飼 養 環 境 の 整 備 と 併 せ て 生 菌 剤 の 給 与 や 抗 菌 剤 の 投 与 が 行 わ れ て い る 。し か し 、大 腸 菌 で も 薬 剤 耐 性 菌 の 出 現 が 報 告 さ れ て い る [23]。 そ の た め 、 サ ル モ ネ ラ と 同 様 に 、 慎重使用が求められている第二次選択薬を使用せざるを得ない事例も発生 している。 近 年 、こ れ ら 抗 菌 剤 の 慎 重 使 用 の 呼 び か け や 豚 を 含 め た 家 畜 に お け る 重 要 な 病 原 体 で の 薬 剤 耐 性 菌 の 出 現 を 受 け 、抗 菌 剤 代 替 物 質 の 研 究 が 活 発 に 行 わ れ て い る [24、25]。抗 菌 剤 代 替 候 補 物 質 と し て プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス 、有 機 酸 、 ハ ー ブ 類 な ど に つ い て 得 に 多 く 報 告 さ れ て お り 、実 際 に 野 外 養 豚 場 で 応 用 さ れ て い る も の も あ る 。し か し 、こ れ ら 代 替 物 質 の 中 で 野 外 養 豚 場 に お い て 安 定 し た 効 果 を 示 し て い る も の は 少 な い [26、27]。そ の 原 因 と し て こ れ ら 代 替 物 質 の 評 価 試 験 が in vitro や 齧 歯 類 で は 多 く 行 わ れ て い る が 、 対 象 動 物 で ある豚に対応した試験が十分に行われていないためと考えられる。例えば、 ヒトの特定保健用食品でも対象となるヒトでの効果を確認する試験が求め ら れ て お り [28]、家 畜 で も 同 様 に 対 象 動 物 で 効 果 を 確 認 す る 試 験 が 不 可 欠 と 考 え ら れ る 。家 畜 を 用 い た 抗 菌 剤 代 替 物 質 の 評 価 試 験 の 中 で も 、特 に 病 原 体 に対する効果を確認する感染試験を用いた評価はほとんど行われておらず、 世 界 の 先 進 国 の 中 で も 日 本 に お け る 取 り 組 み は 特 に 遅 れ て い る 。そ こ で 本 研 究 で は 、ま ず 豚 の 重 要 な 病 原 体 で あ る サ ル モ ネ ラ と 大 腸 菌 の 感 染 系 の 確 立 を 目的とし、第二章で豚サルモネラ・ティフィムリウム感染系の確立を試み、 第四章で豚大腸菌症感染系の確立を試みた。 ま た 、第 二 章 お よ び 第 四 章 で 確 立 し た 豚 を 用 い た 感 染 系 が 抗 菌 剤 代 替 物 質 の 評 価 に 応 用 で き る か を 、有 機 酸 の 一 種 で あ る 乳 酸 を 用 い て 検 討 し た 。有 機 酸 は 畜 産 分 野 で は 飼 養 効 率 の 改 善 等 を 目 的 と し て 使 用 実 績 が あ り 、非 乖 離 状 態 で は 直 接 的 な 殺 菌 作 用 が あ る [29]。殺 菌 作 用 の 機 序 は 非 乖 離 型 の 有 機 酸 が 8 細 菌 の 中 に 侵 入 し て 細 菌 内 の pH を 低 下 さ せ プ ロ ト ン ポ ン プ を 過 剰 に 活 動 さ せ 、細 菌 の エ ネ ル ギ ー を 枯 渇 さ せ 死 滅 さ せ る と さ れ て い る 。ま た 、乳 酸 に は 野 外 養 豚 場 で サ ル モ ネ ラ や 大 腸 菌 対 策 と し て 有 効 で あ る と の 報 告 が あ り [30、 31]、 本 研 究 で 確 立 し た 感 染 系 を 評 価 す る に は 適 し て い る と 考 え ら れ る 。 そ こ で 、第 三 章 で は 豚 サ ル モ ネ ラ・テ ィ フ ィ ム リ ウ ム 感 染 系 を 用 い て 乳 酸 添 加 飼 料 の 評 価 を 行 い 、第 五 章 で は 豚 大 腸 菌 感 染 系 を 用 い て 同 様 に 乳 酸 添 加 飼 料 の評価を実施した。 9 農薬 (91t) 水産用 (182t) 抗菌性飼料添加物 (175t) ヒト医療用 (517t) 総量 1,693t 家畜治療用 (727t) 図 1 2012 年 度 に 我 が 国 で 使 用 さ れ た 抗 生 物 質 の 目 的 別 割 合 [9] 10 第二章 豚サルモネラ・ティフィムリウム感染系 の確立 11 【諸言】 Salmonella に は 多 く の 血 清 型 が あ り 、 豚 か ら 分 離 さ れ る 血 清 型 も 多 岐 に 渡 る が 、 豚 に 対 し て 病 原 性 が 強 く 、 単 独 で 臨 床 症 状 を 起 こ す Salmonella は Salmonella Typhimurium と Salmonella Choleraesuis の 2 血 清 型 と 考 え ら れ て い る [13]。前 者 は 主 に 下 痢 を 発 症 し 、後 者 は 主 に 敗 血 症 や 肺 炎 を 発 症 さ せ る 。 S . Typhimurium を 原 因 と し た 下 痢 は 我 が 国 で も 頻 繁 に 認 め ら れ 、 我 が 国 の 養 豚 場 の 下 痢 便 か ら Salmonella の 分 離 を 試 み た 試 験 で は S . Typhimurium が 最 も 高 率 に 分 離 さ れ て い る [16]。さ ら に 、 S . Typhimurium は ヒ ト の Salmonella を 原 因 と し た 食 中 毒 事 例 か ら も 頻 繁 に 分 離 さ れ て い る [32]。日 本 で は 、2011 年 度 と 2010 年 度 に 蒸 し 豚 が 原 因 の ヒ ト の サ ル モ ネ ラ 食 中 毒 事 例 が 発 生 し て い る が [ 33]、 豚 肉 を 原 因 と し た ヒ ト 食 中 毒 事 例 は 少 な く 、 豚 肉 か ら の Salmonella 分 離 率 も 1~3%と 低 い 値 を 示 し て い る [ 34]。 一 方 、 EU 諸 国 で は 1990 年 代 に 発 生 し た ヒ ト の サ ル モ ネ ラ 食 中 毒 の 20%程 度 が 豚 肉 の 喫 食 と 関 係 あ る と さ れ て い た が 、近 年 は 農 場 段 階 か ら 食 卓 ま で 全 て の 段 階 で 食 中 毒 対 策 に 取 り 組 む “ Farm to Table” の を 実 践 す る こ と で 、 ヒ ト 食 中 毒 の 発 生 を 低 下 さ せ て お り [ 18]、 農 場 で の Salmonella コ ン ト ロ ールがヒト食中毒にも有効であることが示されている。そこで、本章では Salmonella の 中 で も 、 豚 と ヒ ト の 両 方 で 注 目 さ れ る S . Typhimurium を 用 いた感染系の確立を目指した。 現 在 報 告 さ れ て い る 豚 を 用 い た Salmonella 感 染 試 験 の 多 く は 、肥 育 期 の 豚 を 対 象 と し て い る 。 そ の 背 景 に は 、 EU 諸 国 で は 養 豚 場 で 下 痢 を 伴 う 豚 Salmonella 症 が 殆 ど 発 生 し て い な い こ と も あ り 、 養 豚 場 に お け る Salmonella 対 策 が 豚 肉 を 介 し た ヒ ト 食 中 毒 の 予 防 に 主 眼 が 置 か れ て お り 、 生 産 現 場 に お い て は 出 荷 豚 の Salmonella 陽 性 率 を 低 下 さ せ る こ と が 求 め ら れ て い る た め で あ る 。そ の た め 、農 場 に お い て 症 状 を 伴 わ ず 糞 便 に 間 欠 的 に Salmonella を 排 泄 す る 不 顕 性 感 染 豚 に よ る 豚 群 内 で の Salmonella 感 染 拡 大 を 予 防 す る 方 法 が 研 究 、 提 案 さ れ て い る 。 特 に 出 荷 豚 の Salmonella 陽 性 率 に 直 接 関 係 す る 肥 育 期 間 中 の 豚 群 内 で の Salmonella 感 染 拡 大 の 予 防 法 に つ い て 多 く の 提 案 が な さ れ て い る [35-37]。 そ れ ら の 提 案 の 中 に は 、 豚 を 用 12 いた感染試験で出荷豚や肥育豚を対象に下痢を伴わない不顕性の豚 Salmonella 感 染 を 再 現 し た 報 告 も あ る 。そ れ ら 豚 を 用 い た 感 染 試 験 の 中 で 、 豚 の Salmonella 感 染 は 感 染 菌 数 が 多 い ほ ど 臨 床 症 状 が 強 く 発 現 し 、糞 便 中 の 菌 数 も 多 く な る こ と が 示 唆 さ れ て い る [38、 39]。 豚 群 内 で の Salmonella の 感 染 が 主 に 糞 口 感 染 に よ る こ と か ら 、豚 群 内 に お け る Salmonella 感 染 拡 大の予防には糞便中の菌数を減少させることが重要であると考えられてい る。 一 方 、 我 が 国 で は 下 痢 を 伴 う 豚 Salmonella 症 が 発 生 し て お り [16]、 そ の 好 発 時 期 が 離 乳 後 で あ る こ と か ら 、EU 諸 国 の 取 り 組 み と は 別 に 、離 乳 期 の 臨 床 症 状 を 伴 っ た Salmonella 症 の 対 策 を 提 案 す る 必 要 が あ る 。過 去 に 離 乳 豚 を 用 い た 感 染 系 も 報 告 さ れ て い る が [39]、 糞 便 に 含 ま れ る Salmonella 数 を 測 定 し た 情 報 は 少 な く 、特 に 下 痢 や 軟 便 等 の 糞 便 性 状 と そ れ ら に 含 ま れ て い る Salmonella 数 に つ い て の 調 査 は 全 く 行 わ れ て い な い 。そ こ で 本 試 験 で は、糞便中に含まれる菌数を定量し、糞便性状との関連を調査することで、 今 後 の 抗 菌 剤 代 替 物 質 の 評 価 を 行 う 際 に 糞 便 中 の Salmonella 数 が 指 標 と な りうるかも合わせて調査した。 【材料と方法】 1. 供 試 菌 株 の 選 抜 供 試 豚:21 日 齢 あ る い は 22 日 齢 の SPF 豚 20 頭 を 当 所 に 導 入 し 、馴 致 期 間 中 に 糞 便 検 査 に よ り Salmonella 陰 性 を 確 認 し 、 試 験 に 供 試 し た 。 供 試 菌 株 : そ れ ぞ れ 異 な る 野 外 養 豚 場 か ら 分 離 さ れ た S . Typhimurium-5 (ST-5)株 、 S . Typhimurium-8 (ST-8)株 、 S . Typhimurium-64 (ST-64)株 お よ び S . Typhimurium-116 (ST-1116)株 そ れ ぞ れ に 当 所 で リ フ ァ ン ピ シ ン 耐 性 を 付 与 し 、 ST-5 Rif r 株 、 ST-8 Rif r 株 、 ST-64 Rif r 株 お よ び ST-116 Rif r 株として供試した。 接 種 菌 の 菌 液 調 整 で は 各 株 を DHL 寒 天 培 地 ( 栄 研 化 学 株 式 会 社 、 東 京 ) 13 に そ れ ぞ れ 発 育 さ せ 、 発 育 し た 各 株 の 単 一 コ ロ ニ ー を 200mL の SCD 液 体 培 地 に そ れ ぞ れ 接 種 し 37℃ で 5 時 間 振 盪 培 養 し た 後 に 、 培 養 液 の 菌 濃 度 を PBS で 調 整 し 、 最 後 に 等 量 の 20% Skim Milk と 混 合 し て 接 種 菌 液 と し て 供 試した。 感 染 試 験:供 試 豚 を 導 入 時 に 各 区 5 頭 の 4 区( ST-5 株 区 、ST-8 株 区 、ST-64 株 区 お よ び ST-116 株 区 )に 分 け 、5 日 間 の 馴 致 期 間 を 経 た 26 日 齢 あ る い は 27 日 齢 時 に 、4 区 そ れ ぞ れ に 異 な る S . Typhimurium 株 を 経 口 で 接 種 し た 。 具 体 的 に は 、 ST-5 株 区 で は ST-5 Rif r 株 を 1 頭 あ た り 4.1×10 9 CFU/mL を 10mL、ST-8 株 区 で は ST-8 Rif r 株 を 1 頭 あ た り 2.6×10 9 CFU/mL を 10mL、 ST-64 株 区 で は ST-64 Rif r 株 を 1 頭 あ た り 2.0×10 9 CFU/mL を 10mL、 ST-116 株 区 で は ST-116 Rif r 株 を 1 頭 あ た り 2.0×10 9 CFU/mL を 10mL そ れぞれ経口で接種した。 観 察 期 間 中 は 臨 床 症 状 の 観 察 を 毎 日 行 い 、糞 便 性 状 の ス コ ア 化 お よ び 糞 便 の 採 取 を 随 時 実 施 し た 。体 温 測 定 と し て 直 腸 温 度 の 測 定 を 毎 日 実 施 し た 。剖 検 は 経 時 的 に 実 施 し 、 接 種 後 3 日 目 、 7 日 目 お よ び 14 日 目 に 各 区 か ら そ れ ぞれ 1 頭、2 頭および 2 頭を無作為に選抜し剖検に供試した。 2. 接 種 菌 数 の 検 討 供 試 豚 : 28 日 齢 の SPF 豚 15 頭 を 当 所 に 導 入 し 、 馴 致 期 間 中 に 糞 便 検 査 お よ び 血 清 を 用 い た 抗 体 検 査 に よ っ て Salmonella 陰 性 で あ る こ と を 確 認 し 、 供試した。 供 試 菌 株 : 野 外 養 豚 場 か ら 分 離 さ れ 、 上 記 「 1. 供 試 菌 株 の 選 抜 」 で 選 抜 さ れ た ST116Rif r 株 を 供 試 し た 。接 種 菌 の 菌 液 調 整 は「 1.供 試 菌 株 の 選 抜 」 と 同 様 に 実 施 し た 。 つ ま り 、 DHL 寒 天 培 地 ( 栄 研 化 学 株 式 会 社 、 東 京 ) に 発 育 さ せ た ST116Rif r の 単 一 コ ロ ニ ー を 200mL の SCD 液 体 培 地 に 接 種 し 37℃ で 5 時 間 振 盪 培 養 し た 後 に 、 そ の 培 養 液 の 菌 濃 度 を PBS で 調 整 し 、 最 後 に 等 量 の 20% Skim Milk と 混 合 し て 接 種 菌 液 と し て 供 試 し た 。 14 感 染 試 験 : 導 入 時 に 供 試 豚 を 各 区 5 頭 の 3 区 ( ST-9 区 、 ST-7 区 お よ び ST-5 区 )に 分 け 、7 日 間 の 馴 致 期 間 を 経 た 35 日 齢 時 に 3 区 そ れ ぞ れ に 異 な る 菌 数 の ST116Rif r を 経 口 で 接 種 し た 。 具 体 的 に は 、 ST116Rif r を ST-9 区 で は 1 頭 あ た り 3.2 ×10 8 CFU/mL を 10mL、 ST-7 区 で は 1 頭 あ た り 3.2× 10 6 CFU/mL を 10mL お よ び ST-5 区 に は 1 頭 あ た り 3.2×10 4 CFU/mL を 10mL そ れ ぞ れ 経 口 で 接 種 し た 。 観 察 期 間 中 は 臨 床 症 状 の 観 察 を 毎 日 行 い 、糞 便 性 状 の ス コ ア 化 お よ び 糞 便 の 採 取 を 随 時 実 施 し た 。体 温 測 定 と し て 直 腸 温 度 の 測 定 を 毎 日 実 施 し た 。採 血 は 毎 週 実 施 し た 。観 察 期 間 中 に 著 し い 脱 水 症 状 や 沈 鬱 が 認 め ら れ た 際 に は 、 ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル を 用 い た 安 楽 殺 を 施 し た 。 接 種 後 39 日 目 に は 耐 過 豚 全 頭の剖検を実施し、主要臓器および腸管内容物を採取した。 3. 観 察 お よ び 検 査 項 目 糞便性状のスコア化:糞便性状は随時スコア化して記録した。すなわち、 正 常 便 を ス コ ア 0、 軟 便 を ス コ ア 1、 下 痢 便 を ス コ ア 2 と し た 。 糞 便 中 お よ び 腸 管 内 容 物 中 の 接 種 S . Typhimurium 数 の 測 定 、増 菌 お よ び 遅 延 二 次 増 菌 培 養:観 察 期 間 中 の 糞 便 の 採 取 は 各 個 体 か ら 直 接 行 い 、糞 便 採 取 後 は す ぐ に 接 種 S. Typhimurium 数 の 測 定 を 行 っ た 。 菌 数 測 定 で は 糞 便 1g を PBS で 10 倍 段 階 希 釈 し 、 適 切 な 希 釈 段 階 の 糞 便 希 釈 液 を 100μ g/mL リ フ ァ ン ピ シ ン 含 有 DHL 寒 天 培 地( RFDHL)に 塗 抹 し 、37℃ で 24 時 間 培 養 後 に 発 育 し た コ ロ ニ ー 数 を 計 測 し た 。菌 数 測 定 で 接 種 S . Typhimurium が 検 出 さ れ な か っ た 検 体 に つ い て は 、引 き 続 い て 増 菌 培 養 を 行 っ た 。増 菌 培 養 で は 糞 便 1g を 10mL の PBS で 希 釈 し た 上 記 の 糞 便 希 釈 液 か ら 1mL 採 取 し 、 そ れ を 10mL の ハ ー ナ・テ ト ラ チ オ ン 酸 塩 培 地( 栄 研 化 学 株 式 会 社 )に 接 種 し 、 41.5℃ で 24 時 間 培 養 後 に RFDHL 寒 天 培 地 に 塗 抹 し 37℃ で 24 時 間 培 養 し 、 コ ロ ニ ー 形 成 の 有 無 を 観 察 し た 。 菌 数 測 定 お よ び 増 菌 培 養 で S. Typhimurium が 検 出 さ れ な か っ た 際 に は 遅 延 二 次 増 菌 培 養 を 実 施 し た 。 遅 15 延 二 次 増 菌 培 養 で は 増 菌 培 養 で 用 い た ハ ー ナ・テ ト ラ チ オ ン 酸 塩 培 地 を 増 菌 培 養 終 了 後 に 室 温 で 1 週 間 静 置 し た 後 に 、 培 養 液 を 1mL 採 取 し 、 10mL の ハ ー ナ ・ テ ト ラ チ オ ン 酸 塩 培 地 に 接 種 し 、 41.5℃ で 24 時 間 培 養 し た 培 養 液 を RFDHL 寒 天 培 地 に 塗 抹 し 、37℃ で 24 時 間 培 養 後 に RFDHL 寒 天 培 地 で のコロニー形成の有無を観察した。 剖 検 時 に 採 取 し た 腸 管 内 容 物 に つ い て も 同 様 に 菌 数 測 定 、増 菌 培 養 お よ び 遅延二次増菌培養を実施した。 各 種 臓 器 に お け る S . Typhimurium の 検 出 : 剖 検 時 に は 肝 臓 、 肺 、 脾 臓 、 腎 臓 、 腸 間 膜 リ ン パ 節 、 空 腸 内 容 物 お よ び 盲 腸 内 容 物 を 各 1g ず つ 無 菌 的 に 採 取 し た 。腸 管 内 容 物 以 外 の 各 臓 器 は 表 面 を 火 炎 滅 菌 し た 後 に 、10mL の ハ ー ナ ・ テ ト ラ チ オ ン 酸 塩 培 地 に 懸 濁 し 41.5℃ で 24 時 間 培 養 し た 。ま た 、腸 内 容 物 も 同 様 に 10mL の ハ ー ナ ー・テ ト ラ チ オ ン 酸 塩 培 地 に 懸 濁 し 、41.5℃ で 24 時 間 培 養 し た 。 臓 器 お よ び 腸 内 容 物 は 培 養 終 了 後 に 培 養 液 を RFEHL 培 地 に 塗 抹 し 、 37℃ で 24 時 間 培 養 し 、 コ ロ ニ ー 形 成 の 有 無 を 観 察 し た 。 発 育 が 観 察 さ れ な か っ た 際 に は 、上 記 と 糞 便 中 の S . Typhimurium の 遅 延 二 次 増菌培養と同様に遅延二次増菌培養を実施した。 抗 体 測 定 : 豚 抗 O4 抗 体 を 市 販 さ れ て い る ELISA キ ッ ト ( SALMOTYPE Pig Screen, Labor Diagnostik, Leipzg, Germany)を 用 い て 測 定 し た 。キ ッ ト の 操 作 は 全 て 使 用 説 明 書 に 従 っ た 。 キ ッ ト の 説 明 書 に 従 い 、 10 OD% 以 上を陽性とした。 統 計 処 理:測 定 さ れ た S . Typhimurium 各 株 の 菌 数 は 対 数 変 換 し 、検 出 限 界 以 下 と な っ た 検 体 は 0 と し た 。菌 数 測 定 で は S . Typhimurium が 検 出 さ れ ず 、増 菌 培 養 あ る い は 遅 延 二 次 増 菌 培 養 で S . Typhimurium が 検 出 さ れ た 検 体 は 一 律 に 10 2 CFU/g と し て 統 計 処 理 を 行 っ た 。 S . Typhimurium 数 は Student’s t -test で 有 意 差 の 判 定 を 行 っ た 。ま た 、体 温 測 定 で は 試 験「 1.供 試 菌 株 の 選 抜 」 で は 各 区 の 接 種 前 2 日 間 の 体 温 と 、 試 験 「 2. 接 種 菌 数 の 検 討 」で は 各 区 接 種 前 5 日 間 の 体 温 と Student’s t -test で 比 較 し て 有 意 差 を 示 16 し た 際 に 発 熱 と し た 。 糞 便 性 状 の ス コ ア は Mann-Whitney U -test で 統 計 処 理 を 行 っ た 。 特 に 記 載 の な い 場 合 に は p <0.05 で 有 意 差 あ り と し た 。 【結果】 1. 供 試 菌 株 の 選 抜 臨 床 症 状:全 区 全 頭 で 試 験 期 間 中 に 著 し い 臨 床 状 態 の 悪 化 を 示 す 個 体 は 認 め られず、全頭が生残耐過した。 ST-64 株 区 お よ び ST116 株 区 で は 接 種 後 1 日 目 か ら 糞 便 性 状 の 悪 化 が 認 め ら れ 、接 種 後 2 日 目 お よ び 3 日 目 に は ほ ぼ 全 頭 で 下 痢 が 認 め ら れ た 。両 区 と も 接 種 後 5 日 目 以 降 は 下 痢 が 認 め ら れ ず 、 ST-116 株 区 で は 試 験 終 了 ま で 接 種 後 12 日 目 を 除 く 各 観 察 日 で 1~2 頭 で 軟 便 が 観 察 さ れ た が 、ST-64 株 区 で は 接 種 後 7 日 目 に は 全 頭 で 正 常 便 と な り 、そ の 後 は 軟 便 の 発 現 は 散 発 的 で あ っ た 。 一 方 、 ST-5 株 区 お よ び ST-8 株 区 で は 糞 便 性 状 の 悪 化 は 殆 ど 認 め ら れ ず 、 ST-5 株 区 で 下 痢 お よ び 軟 便 が 観 察 さ れ た の は 、 接 種 後 3 日 目 に 1 頭 が 下 痢 を 発 現 し た 1 回 の み で あ っ た ( 図 2、 3)。 全 区 で 接 種 翌 日 か ら 体 温 上 昇 が 見 ら れ た が 、 ST-8 株 区 で は 発 熱 に は 至 ら な か っ た 。 一 方 、 ST-5 株 区 で は 接 種 後 1 日 目 か ら 3 日 目 に 、 ST-64 株 区 で は 接 種 後 1 日 目 か ら 4 日 目 に か け て 、 ST-116 株 区 で は 接 種 後 2 日 目 か ら 4 日 目 に か け て 発 熱 が 認 め ら れ た ( 図 4)。 各 区 と も 接 種 後 1 週 間 以 内 に 体 温 上昇は収まった。 糞 便 中 の 接 種 S . Typhimurium 数 の 推 移:接 種 後 1 日 目 か ら 全 区 全 頭 の 糞 便 か ら S. Typhimurium が 検 出 さ れ 、 観 察 期 間 中 に は 全 頭 の 糞 便 か ら 複 数 回 検 出 さ れ た 。 各 区 の 平 均 S. Typhimurium 数 も 接 種 後 1 日 目 に は 1 × 10 4 CFU/g 以 上 と な っ た( 図 5)。各 区 の 糞 便 中 S. Typhimurium 数 の 平 均 の ピ ー ク は ST-5 株 区 で は 接 種 後 2 日 目 の 2.3×10 6 CFU/g、 ST-8 区 で は 接 種 後 1 日 目 の 2.7×10 4 CFU/g、ST-64 株 区 で は 接 種 後 3 日 目 の 2.3×10 7 CFU/g お よ び ST-116 株 区 で は 接 種 後 3 日 目 の 2.2×10 8 CFU/g と な っ た 。 観 察 期 17 間 を 通 じ て ST-8 株 区 は 他 の 3 区 と 比 べ て 低 い 菌 数 で 推 移 し 、接 種 後 2 日 目 に は 他 の 3 区 と 、接 種 後 3 日 目 に は ST-64 株 区 お よ び ST-116 株 区 の 両 者 と 有 意 差 が 示 さ れ た 。 ST-5 株 区 の 平 均 S. Typhimurium 数 は 接 種 後 2 日 目 ま で は ST-64 株 区 お よ び ST-116 株 区 と 同 程 度 を 示 し た が 、 3 日 目 以 降 は 低 値 を 示 し た 。接 種 後 3 日 目 に は ST-5 株 区 と ST116 株 区 間 で 有 意 差 が 示 さ れ た 。 ST-64 株 区 と ST-116 株 区 間 で は 有 意 差 は 示 さ れ な か っ た が 、 全 測 定 日 で ST116 株 区 の 方 が ST-64 株 区 よ り も 多 い 菌 数 を 示 し た 。 各 種 臓 器 か ら の 接 種 S . Typhimurium の 分 離:接 種 後 3 日 目 、7 日 目 お よ び 14 日 目 に 剖 検 を 実 施 し 、 各 種 臓 器 か ら 接 種 菌 の 分 離 を 試 み た が 、 最 も 高 率 に 菌 が 分 離 さ れ た の は 各 区 と も 接 種 後 7 日 目 で あ り 、 ST-5 株 区 、 ST-64 株 区 お よ び ST-116 株 区 で は 10 検 体 中 9 検 体 で 陽 性 と な っ た が 、 ST-8 株 区 は 10 検 体 中 3 検 体 の み が 陽 性 と な っ た( 表 1)。接 種 後 14 日 目 に は ST-5 株 区 、 ST-64 株 区 お よ び ST-116 株 区 で も 検 出 率 が 低 下 し 、 そ れ ぞ れ 10 検 体 中 2 検 体 、 3 検 体 お よ び 3 検 体 が 陽 性 と な っ た 。 接 種 後 3 日 目 に は ST-64 株 区 お よ び ST-116 株 区 で は 5 検 体 中 そ れ ぞ れ 3 お よ び 4 で 陽 性 と な り 、 ST-5 株 区 お よ び ST-8 株 区 で は 両 区 と も 5 検 体 中 2 検 体 が 陽 性 と な っ た 。 2. 接 種 菌 数 の 検 討 臨 床 症 状:全 区 に 共 通 し て 下 痢 等 の 臨 床 症 状 は ST116Rif r 接 種 後 1 週 間 以 内 に 多 く 観 察 さ れ 、 そ れ 以 降 は 回 復 す る 傾 向 に あ っ た ( 図 6)。 ST-9 区 で は 著 し い 脱 水 症 状 と 沈 鬱 を 示 し た た め に ST116Rif r 接 種 後 3、4、 5 お よ び 7 日 目 に そ れ ぞ れ 1 頭 ず つ に 安 楽 殺 が 施 さ れ 、観 察 期 間 を 耐 過 し た のは 5 頭中 1 頭のみで、その 1 頭でも接種後 3 日目および 4 日目に下痢が 観 察 さ れ た 。 一 方 、 ST-7 区 お よ び ST-5 区 で は 全 頭 が 観 察 期 間 を 耐 過 し た 。 ST-7 区 で は 接 種 後 3 日 目 に 2 頭 お よ び 接 種 後 12 日 目 に 1 頭 で 下 痢 が 観 察 さ れ 、 全 頭 で 軟 便 が 観 察 さ れ た 。 ST-5 区 で は 下 痢 は 観 察 さ れ な か っ た が 、 5 頭 中 4 頭 で 軟 便 が 観 察 さ れ た 。接 種 後 3 日 目 に は ST-5 区 と 他 の 2 区 の 間 で 接 種 後 4 日 目 に ST-9 区 と 他 の 2 区 の 間 で 糞 便 性 状 ス コ ア で 有 意 差 が 認 め ら 18 れた。 体 温 は 接 種 翌 日 か ら 上 昇 し 、ST-9 区 で は 接 種 後 1、3 お よ び 5 日 目 、ST-7 区 で は 接 種 後 2 日 目 か ら 6 日 目 、 ST-5 区 で は 接 種 後 2 お よ び 4 日 目 に 発 熱 が 認 め ら れ た ( 図 7)。 抗 体 価 の 推 移 : ST-9 区 で は 接 種 後 3 週 目 に は 耐 過 し た 1 頭 で 抗 体 が 陽 性 と な っ た( 図 8)。ST-7 区 で も 接 種 後 4 週 目 に は 5 頭 中 3 頭 で 抗 体 陽 性 と な り 、 39 日 間 の 観 察 期 間 中 に 全 頭 で 抗 体 陽 性 と な っ た 。 一 方 、 ST-5 区 で は 接 種 後 5 週目でも 5 頭中 2 頭が抗体陽性となった。 糞 便 中 ST116Rif r 数 の 推 移:各 区 の 糞 便 中 の ST116Rif r 数 は 接 種 後 7 日 目 ま で に ピ ー ク と な り 、 ピ ー ク 時 の 糞 便 中 ST116Rif r 数 は ST-9 区 で は 4.8× 10 8 CFU/g、 ST-7 区 で は 1.0×10 6 CFU/g お よ び ST-5 区 で は 3.2×10 4 CFU/g と な っ た ( 図 9)。 有 意 差 は 接 種 後 3 日 目 お よ び 4 日 目 に 3 区 間 と も に 認 め ら れ 、 接 種 後 6 日 目 に は ST-9 区 と ST-5 区 の 間 で 認 め ら れ た 。 糞 便 性 状 毎 の ST116Rif r 数 : 本 試 験 で は 下 痢 便 が ST-9 区 お よ び ST-7 区 で そ れ ぞ れ 7 回 と 3 回 観 察 さ れ 、合 計 で は 10 回 観 察 さ れ た 。一 方 、軟 便 は ST-9 区 、 ST-7 区 お よ び ST-5 区 で そ れ ぞ れ 6 回 、 10 回 お よ び 9 回 観 察 さ れ 、 合 計 で は 25 回 観 察 さ れ た 。 正 常 便 は 92 回 観 察 さ れ た 。 本 試 験 で 観 察 さ れ た 10 個 の 下 痢 便 中 に 含 ま れ て い た ST116Rif r 数 は 平 均 で 1.0×10 8 CFU/g と な っ た ( 表 2)。 一 方 、 25 個 の 軟 便 中 お よ び 92 個 の 正 常 便 中 に 含 ま れ て い た ST116Rif r 数 は 、 そ れ ぞ れ 1.6×10 4 CFU/g お よ び 7.1×10 1 CFU/g と な り 、 各 糞 便 性 状 間 で 有 意 差 が 示 さ れ た 。 ま た 、 正 常 糞 便 95 検 体 中 5 検 体 に お い て ST116Rif r が 1×10 6 CFU/g 以 上 検 出 さ れ た 。 剖 検 時 臓 器 か ら の 菌 分 離:観 察 期 間 中 に 安 楽 殺 を 施 さ れ た 個 体 で は 臓 器 か ら 高 率 に ST116Rif r が 分 離 さ れ た が 、 39 日 間 の 観 察 期 間 を 耐 過 し た 豚 で は 肝 臓 、 肺 、 脾 臓 お よ び 腎 臓 か ら は ほ と ん ど 分 離 さ れ な か っ た ( 表 3)。 一 方 、 扁桃、腸間膜リンパ節、空腸および盲腸内容物中からは耐過豚でも高率に 19 ST116Rif r が 分 離 さ れ た 。耐 過 豚 の 試 験 期 間 中 の 糞 便 性 状 と 剖 検 時 の 各 種 臓 器からの菌分離陽性率に関連は認められなかった。 20 図2 S . Typhimurium 実 験 感 染 豚 で 再 現 さ れ た 下痢便(左)および下痢発症豚で観察された発育不良(右) 21 22 糞便スコアと剖検実施の頭数 2 1 0 剖検頭数計 2 1 0 剖検頭数計 2 1 0 剖検頭数計 2 1 0 剖検頭数計 2 ●●●●● ● ●●●● ●●●●● ●●●●● 3 ●●●● ● ● ●●● ● ●●●●● ● ●●● ● ● 5 6 ●●●● ● ●●●● ● ●●●●● ● ●●●● ● 接種後日数 ●●● ● ● ●● ●● ● ●●●●● ● ●●●● ● 7 ●● ●●● ●●● ●●● ●● ●●● ●● ●●● 8 ●● ●●● ●● ●●● ●● ●●● ●● ●●● 11 ● ● ●●● ● ● ●●● ●● ●●● ●● ●●● 12 ●● ●●● ●● ●●● ●● ●●● ●● ●●● 13 ● ● ●●● ● ● ●●● ●● ●●● ●● ●●● 糞便性状スコアは 0 が正常便、1 が軟便および 2 が下痢便を示す。 各区の糞便性状スコアの推移と剖検頭数を示す。表中の●が供試豚 1 頭を示す。 S . Typhimurium 株 接 種 後 の 糞 便 性 状 の 推 移 と 剖 検 頭 数 1 0 図3 ●●● ● ● ●●● ●● ●●●●● ●●●●● ●●●●● ST‐116 株 ●●●●● ST‐64株 ●●●●● ST‐8株 ●●●●● ST‐5株 42.0 41.5 * * 体温(℃) 41.0 * * * * 40.5 * * * * 40.0 39.5 39.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 S. Typhimurium接種後日数 図4 S . Typhimurium 株 接 種 後 の 体 温 の 推 移 各 区 の 平 均 体 温 を 示 す 。各 記 号 は ● が ST-5 株 区 、▲ が ST-8 株 区 、■ が ST-64 株 区 お よ び ◆ が ST-116 株 区 を 示 す 。 * は 各 区 の 接 種 前 体 温 と の 有 意 差 ( p <0.05)を 示 す 。 23 10.0 9.0 各区接種 S. Typhimurium株数 (Log CFU/g) d 8.0 b 7.0 b c b b 6.0 b 5.0 a 4.0 b 3.0 a 2.0 1.0 0.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S. Typhimurium接種後日数 図5 S . Typhimurium 株 接 種 後 の 糞 便 中 の S . Typhimurium 数 の推 移 各 区 の 平 均 糞 便 中 S . Typhimurium 数 を 示 す 。各 記 号 は ● が ST-5 株 区 、▲ が ST-8 株 区 、 ■ が ST-64 株 区 お よ び ◆ が ST-116 株 区 を 示 す 。 a, b は 異 符 号 間 で 有 意 差 ( p <0.05)を 示 す 、接 種 後 3 日 目 は a と c お よ び d、b と d で 有 意 差 ( p <0.05)を 示 す 。 24 25 肺 0/1* 1/1 0/1 0/1 1/4 2/2 1/2 2/2 2/2 7/8 1/2 2/2 1/2 2/2 6/8 14/20 * : 陽 性 検 体 数 /供 試 検 体 数 ST-5株 ST-8株 ST-64株 ST-116株 小計 7 ST-5株 ST-8株 ST-64株 ST-116株 小計 14 ST-5株 ST-8株 ST-64株 ST-116株 小計 合計 区 0/1 1/1 0/1 1/1 2/4 2/2 1/2 2/2 2/2 7/8 0/2 0/2 1/2 0/2 1/8 10/20 肝臓 0/1 0/1 1/1 1/1 2/4 2/2 0/2 1/2 2/2 5/8 0/2 0/2 0/2 0/2 0/8 7/20 腎臓 1/1 0/1 1/1 1/1 3/4 1/2 0/2 2/2 1/2 4/8 0/2 0/2 0/2 0/2 0/8 7/20 脾臓 腸間膜 リンパ節 1/1 0/1 1/1 1/1 3/4 2/2 1/2 2/2 2/2 7/8 1/2 1/2 1/2 1/2 4/8 14/20 2/5 2/5 3/5 4/5 11/20 9/10 3/10 9/10 9/10 30/40 2/10 3/10 3/10 3/10 11/40 計 4 株 の S . Typhimurium 接 種 試 験 で の 剖 検 時 の 各 種 臓 器 か ら の S . Typhimurium の 分 離 率 接種後 日数 3 表1 26 糞便スコアと安楽殺豚の頭数 4 ● ●●●● b ● ●●●● 6 ●●● ●● ●●●● ● ●● ●●● 12 ●● ●●● ●●●● ● ● ●●●● 15 19 ●●●●● ●●●●● ● ●●●● 接種後日数 ●●●●● ●●●●● ● ●●●● 22 ●●●●● ●●●●● ● ●●●● 26 ●●●●● ●●●●● ● ●●●● 29 ●●●●● ●●●●● ● ●●●● 33 ●●●●● ●●●● ● ● ●●●● 糞便性状スコアは 0 が正常便、1 が軟便および 2 が下痢便を示す。 ●●●● ● ● ●●●● 36 ●●●●● S . Typhimurium 接 種 後 の 糞 便 性 状 の 推 移 お よ び 安 楽 殺 頭 数 3 0 図6 ●●●●● b ●●● ●● b ●●●● a ●●● ● ●●●●● ST‐5 ●●●●● ST‐7 ●●●●● a ●● a 各区の糞便性状スコアの推移と剖検頭数を示す。表中の●が供試豚 1 頭を示す。 安楽殺 2 1 0 安楽殺 2 1 0 安楽殺 2 1 0 ST‐9 42.0 41.5 * 体温(℃) 41.0 40.5 40.0 ** ** * * * * 39.5 39.0 38.5 0 7 14 21 28 35 接種後日数 図7 S . Typhimurium 接 種 後 の 体 温 の 推 移 各 区 の 平 均 体 温 を 示 す 。各 記 号 は ● が ST-9 区 、▲ が ST-7 区 お よ び ■ が ST-5 区 を 示 す 。 * は 各 区 の 接 種 前 体 温 と の 有 意 差 ( p <0.05)を 示 す 。 27 60 50 抗体価 (OD%) 40 30 20 10 0 0 7 14 21 28 35 38 接種後日数 図 8 S . Typhimurium 接 種 後 の 抗 O4 抗 体 価 の 推 移 各 区 の 平 均 抗 体 価 を 示 す 。 各 記 号 は ● が ST-9 区 、 ▲ が ST-7 区 お よ び ■ が ST-5 区 を 示 す 。 28 10 a a a (Log cfu/g) 8 b 6 ST116Rifr数 b b 4 c c 2 0 0 5 10 15 20 25 30 35 接種後日数 図9 S . Typhimurium 接 種 後 の 糞 便 中 の S . Typhimurium 数 の 推 移 各 区 の 平 均 糞 便 中 S . Typhimurium116Rif r 数 を 示 す 。 各 記 号 は ● が ST-9 区 、 ▲ が ST-7 区 お よ び ■ が ST-5 区 を 示 す 。 a、 b、 c は 異 符 号 間 で 有 意 差 ( p <0.05)を 示 す 。 29 表 2 糞 便 性 状 別 の S . Typhimurium 数 糞便性状 下痢 検体数 検出限界以下 軟便 検体数 正常便 検体数 2 40 2 26 <2.0-≦3.0 4 <3.0-≦4.0 3 7 <4.0-≦5.0 3 5 <5.0-≦6.0 5 5 5 <6.0-≦7.0 2 4 <7.0-≦8.0 2 1 <8.0-≦9.0 4 1 <9.0-≦10.0 2 平均±標準誤差 (Log CFU/g) 有意差(p<0.05) 8.01±1.08 4.20±2.27 1.85±2.01 a b c 30 31 4/4 0/3 1/7 0/1 4/4(a) 下痢発症豚 0/3 軟便発症豚 1/7 非発症豚 0/1 a: 陽 性 検 体 数 /供 試 検 体 数 耐過豚 安楽殺豚 肺 肝臓 3/4 0/3 1/7 0/1 4/4 3/3 6/7 0/1 4/4 0/3 2/7 0/1 脾臓 扁桃 腎臓 腸間膜 リンパ節 4/4 1/3 3/7 0/1 腸管内容物 空腸 盲腸 4/4 4/4 3/3 3/3 5/7 3/7 0/1 0/1 各 種 臓 器 お よ び 腸 管 内 容 物 か ら の S . Typhimurium 検 出 率 臨床症状 表3 【考察】 本 章 で は S . Typhimurium 感 染 系 を 確 立 す る た め 、「 1. 供 試 菌 株 の 選 抜 」 で は 異 な る 野 外 養 豚 場 で 分 離 さ れ た 4 株 の S . Typhimurium を 感 染 さ せ 、豚 に 対 す る 病 原 性 を 比 較 し た 。 具 体 的 に は そ れ ぞ れ 10 1 0 CFU/頭 程 度 を 経 口 で 接 種 し 、糞 便 性 状 の 悪 化 と 糞 便 中 に 排 泄 さ れ る 接 種 S . Typhimuirum 数 等 を 測 定 し た 。そ の 結 果 、4 株 の S . Typhimuirum 内 の 2 株 で は 供 試 豚 に 高 率 で 下 痢 が 認 め ら れ た が 、残 り の 2 株 で は 糞 便 性 状 の 悪 化 は 殆 ど 認 め ら れ な か っ た 。ま た 、糞 便 中 へ の S . Typhimurium の 排 菌 数 も 、糞 便 性 状 を 悪 化 さ せ た 2 株 の 方 が 他 の 2 株 よ り も 高 い 値 で 推 移 し た 。近 年 の 研 究 に よ り Salmonella の 病 原 因 子 は 200 種 類 以 上 が 報 告 さ れ て お り [40]、 S . Typhimurium は 株 毎 に 病 原 性 が 異 な っ て い る こ と が 知 ら れ て い る 。 例 え ば 、 Namimatsu ら は 死 亡 に 至 る 敗 血 症 を 引 き 起 こ す S . Typhimuirum は 、病 原 性 プ ラ ス ミ ド を 高 率 に 保 有 し て い る こ と を 報 告 し て い る [41]。ま た 、毒 素 、線 毛 お よ び 鞭 毛 も そ の 病 原 性 の 発 現 に 関 与 す る こ と が 報 告 さ れ て い る [40]。本 章 の 研 究 に お い て 、 S . Typhimurium 株 間 で 豚 に お け る 病 態 に 違 い が 認 め ら れ た 事 も 、そ れ ぞ れ の 株 が 保 有 す る こ れ ら 病 原 因 子 が 異 な る た め と 考 え ら れ る 。各 株 が ど の よ う な病原因子を保有しているかについては、今後更なる研究が必要である。 次 い で 4 株 の 中 で 臨 床 症 状 が 強 く 発 現 し 、糞 便 中 か ら も 多 量 の 菌 の 排 泄 が 認 め れ ら た S . Typhimurium 株 1 株 を 用 い て 、適 切 な 感 染 菌 数 を 調 査 す る た め 、 S . Typhimurium の 感 染 菌 数 を 3 段 階 に 設 定 し て 豚 に 経 口 接 種 さ せ た 。 そ の 結 果 、感 染 菌 数 が 多 い ほ ど 生 残 率 、下 痢 や 軟 便 等 の 糞 便 性 状 お よ び 発 熱 が 悪 化 す る こ と が わ か っ た 。豚 で の Salmonella 感 染 で は 感 染 菌 数 が 多 い ほ ど 臨 床 症 状 が 悪 化 す る こ と は 以 前 か ら 報 告 さ れ て お り 、今 回 の 結 果 も そ れ ら を 支 持 す る も の と な っ た [38 、 42-44] 。 ま た 、 Salmonella の 感 染 菌 数 と Salmonella の 糞 便 中 へ の 排 菌 数 も 、 感 染 菌 数 が 多 く な る ほ ど 糞 便 中 へ 排 泄 さ れ る S . Typhimurium 数 も 多 く な る こ と が 明 ら か と な り 、こ れ に つ い て も 過 去 の 報 告 を 支 持 す る も の と な っ た [42、 44]。 本 試 験 に よ り 、今 ま で 科 学 的 な 解 析 が 十 分 に 行 わ れ て い な か っ た 糞 便 性 状 毎 の 糞 便 中 S . Typhimurium 数 に つ い て 解 析 す る こ と が で き 、糞 便 性 状 が 悪 32 化 す る ほ ど 糞 便 中 の S . Typhimurium 数 が 多 く な る こ と を 見 出 し た 。 一 方 、 正 常 便 の 中 に も 1×10 6 CFU/g 以 上 の S . Typhimurium を 含 ん で い る 糞 便 が 認 め ら れ た 。Pires ら に よ る と 、Salmonella 陽 性 の 野 外 養 豚 場 か ら 出 荷 さ れ る 不 顕 性 感 染 豚 の 糞 便 中 で 、1×10 6 CFU/g 以 上 の Salmonella が 検 出 さ れ た と 報 告 し て い る [45]。こ の こ と は 、離 乳 豚 お よ び 肥 育 豚 が 排 泄 し て い る 正 常 便 中 に も ま れ に 多 量 の Salmonella が 含 ま れ て い る こ と を 示 唆 し て い る 。 ま た 、 Salmonella 感 染 を 成 立 さ せ る た め に 必 要 な Salmonella 数 に つ い て 、 5 × 10 2 CFU/g 程 度 の S . Typhimurium が 含 ま れ て い る 糞 便 や [46] 、 4 × 10 2 CFU/100cm 2 の Salmonella で 汚 染 さ れ て い る 環 境 で 、 Salmonella の 感 染 が 成 立 す る と 報 告 さ れ て い る こ と か ら [47] 、 正 常 便 で も 豚 群 内 の Salmonella 感 染 源 と な る こ と が 示 唆 さ れ た 。こ の こ と は 、 Salmonella 陽 性 の 豚 群 内 で Salmonella の 感 染 拡 大 を 予 防 す る た め に は 、野 外 養 豚 場 に お い て 、 Salmonella 症 に よ る 臨 床 症 状 の 悪 化 を 予 防 す る こ と と 同 時 に 、 臨 床 症 状 を 示 さ な い 健 康 豚 で あ っ て も 、糞 便 中 の Salmonella 数 を 低 下 さ せ る 取 り 組みが重要であることを示唆している。 【小括】 本 章 で は 豚 に お け る S . Typhimurium 実 験 感 染 系 を 確 立 し 、野 外 よ り 分 離 さ れ た ST116Rif r 株 を 10 9 CFU/頭 程 度 経 口 感 染 さ せ る と 下 痢 や 著 し い 脱 水 症 状 を 示 し 、10 7 CFU/頭 程 度 経 口 感 染 さ せ る と 下 痢 や 軟 便 を 示 し 、10 5 CFU/ 頭 程 度 感 染 さ せ る と 軟 便 程 度 の 糞 便 性 状 等 を 示 す こ と が わ か っ た 。ま た 、感 染 菌 数 が 10 5 CFU/頭 で も 糞 便 中 か ら は 安 定 し て ST116Rif r が 検 出 さ れ 、糞 便 性 状 に よ り 糞 便 に 含 ま れ る ST116Rif r 数 が 異 な る こ と も 示 唆 さ れ た 。 今 後 、 本 実 験 感 染 系 に お い て 抗 菌 剤 代 替 物 質 の 評 価 を 行 う 上 で 、臨 床 症 状 と 共 に 糞 便 中 の 菌 数 を 測 定 す る こ と で 、臨 床 症 状 を 抑 え る 効 果 と 、豚 群 内 で の 感 染 予 防効果を評価できるものと考えられた。 33 第三章 豚サルモネラ・ティフィムリウム感染系を 用いた乳酸添加飼料の評価 34 【諸言】 Salmonella は 日 本 の 養 豚 場 の 22%か ら 分 離 さ れ た と 報 告 さ れ て お り [ 48]、 ま た 下 痢 便 を 対 象 と し た 調 査 で も 19%の 農 場 か ら 分 離 さ れ た と 報 告 さ れ て い る [ 16]。 Salmonella に よ る 下 痢 や 軟 便 の 発 現 は 事 故 率 の 増 加 だ け で な く 、 飼 養効率の悪化を招くこともあるため対策が必要で、一部養豚場では陰性化に成 功 し て い る [ 19、 20]。 Salmonella 陰 性 農 場 に お け る Salmonella 対 策 は 、 ま ず 第 一 に 、 導 入 豚 、 ヒ ト お よ び 車 両 等 を 介 し た 農 場 へ の Salmonella 侵 入 を 防 止 す る た め の バ イ オ セ キ ュ リ テ ィ を 確 立 す る こ と で あ る [13]。一 方 、Salmonella 陽 性 農 場 で は 、 サ ル モ ネ ラ 症 の 発 症 に よ る 事 故 豚 の 増 加 、下 痢 や 軟 便 の 発 現 に よ る 飼 養 効 率 の 悪 化 を 防 ぐ こ と が 必 要 と な る 。ま た 、Salmonella 陽 性 農 場 で は 、Salmonella 陽 性 豚 を 出 荷 す る こ と に よ り 、豚 肉 を 介 し た ヒ ト 食 中 毒 の 発 症 の リ ス ク が あ る た め 、出 荷 豚 の Salmonella 陽 性 率 の 低 下 に 継 続 し て 取 り 組 む 必 要 が あ る 。 下 痢 や 死 亡 事 故 が 見 ら れ る 豚 サ ル モ ネ ラ 症 の 発 生 農 場 で は 、発 症 を 抑 え る ために抗菌剤の投与が一般的に行われている。しかし、薬剤耐性化した Salmonella の 出 現 が 報 告 さ れ て お り [49]、 例 え ば S . Typhimurium DT104 のように 5 剤(アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン お よ び サ ル フ ァ 剤 )に 対 し て 耐 性 を 示 す よ う な 、複 数 の 抗 菌 剤 に 対 し て 耐 性 を 示 す 多 剤 耐 性 化 し た Salmonella も 国 内 養 豚 場 か ら 分 離 さ れ て い る [50、51]。そ の た め 、養 豚 場 の 中 に は 通 常 使 用 し て い る 抗 菌 剤 で は 効 果 が 認 め ら れ な く な っ た た め 、第 二 次 選 択 薬 を 使 用 す る 事 例 も 認 め ら れ て い る 。し か し 、第 二 次 選 択 薬 で あ る フ ル オ ロ キ ノ ロ ン や 第 三 お よ び 第 四 世代セファロスポリンに対しても耐性化したサルモネラも報告されるよう に な り [52、 53]、 抗 菌 剤 代 替 物 質 が 益 々 求 め ら れ て い る 。 一 方 、 豚 サ ル モ ネ ラ 症 の 発 症 が 認 め ら れ て い な い Salmonella 不 顕 性 感 染 の 養 豚 場 に お い て も 、 Salmonella 陽 性 豚 の 出 荷 に よ る 豚 肉 を 介 し た ヒ ト の 食 中 毒 発 症 の リ ス ク を 回 避 す る た め 、 出 荷 豚 の Salmonella 陽 性 率 を 下 げ る こ と が 求 め ら れ て い る [18]。出 荷 豚 の 陽 性 率 を さ げ る た め に は 、養 豚 場 の 豚 群 内 に お け る Salmonella の 伝 播 を 抑 え る 必 要 が あ る [30、 54]。 養 豚 場 で の 35 Salmonella の 伝 播 の 主 な 経 路 は 糞 口 感 染 で あ る が 、 感 染 菌 数 が 少 な い 際 に は Salmonella の 感 染 が 成 立 し な い こ と も あ る [46、 47, 55]。 ま た 、 感 染 菌 数 が 少 な い ほ ど 、 感 染 後 の 臨 床 症 状 や 糞 便 中 に 含 ま れ る Salmonella 数 が 少 な い こ と が 示 唆 さ れ て い る [38、39]。こ れ ら の こ と か ら 、不 顕 性 感 染 豚 群 内 の Salmonella 陽 性 率 を 下 げ る た め に は 、糞 便 中 の Salmonella 数 を 減 少 さ せ ることが重要な対策と考えられる。 以 上 の こ と か ら 、 Salmonella 対 策 に 用 い ら れ る 抗 菌 剤 代 替 物 質 は 、 臨 床 症 状 を 伴 う 豚 サ ル モ ネ ラ 症 の 発 症 を 抑 え ら れ る こ と と 、 Salmonella 不 顕 性 感 染 豚 の 糞 便 中 へ の 排 菌 数 を 低 下 さ せ ら れ る こ と が 重 要 と 考 え ら れ る 。こ れ ま で に 、 豚 Salmonella 対 策 の 抗 菌 剤 代 替 物 質 と し て 幾 つ か の 候 補 が 提 案 さ れ て お り 、 そ の 中 に は プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス [56]、 有 機 酸 [30、 39]、 ハ ー ブ 類 [57]や 発 酵 飼 料 な ど が あ る [58]。 中 で も 本 研 究 で は 、 Jorgensen ら が 飼 料 に 2.8%添 加 し た 結 果 、 Salmonella 陽 性 農 場 で の 陽 性 率 を 低 下 さ せ た と 報 告 し て い る 有 機 酸 の 一 種 で あ る 乳 酸 [30]に 着 目 し 、第 二 章 で 確 立 し た 感 染 系 で そ の効果について評価した。 【材料と方法】 供 試 豚:21 あ る い は 22 日 齢 の SPF 豚 20 頭 を 当 所 に 導 入 し た 。導 入 豚 は 馴 致 期 間 中 に 糞 便 か ら の Salmonella 分 離 を 試 み 、Salmonella 陰 性 で あ る こ とを確認した後に試験に供試した。 供 試 菌 株:本 研 究 の 第 二 章「 豚 サ ル モ ネ ラ・テ ィ フ ィ ム リ ウ ム 感 染 系 の 確 立 」で 選 抜 さ れ た 、野 外 か ら 分 離 さ れ た S. Typhimurium 116 株 に リ フ ァ ン ピ シ ン 耐 性 を 付 与 し た S. Typhimuirum 116 Rif r 株 ( ST116Rif r 株 ) を 供 試 し た 。第 二 章 で 示 し た よ う に 、ST116Rif r 株 は 豚 に 1 頭 あ た り 10 7 CFU を 経 口 接 種 す る こ と で 下 痢・軟 便 を 発 現 し 、10 5 CFU を 経 口 接 種 す る こ と で 軟 便 を 発 現 す る 。ま た 、ど ち ら の 感 染 菌 数 に お い て も ST116Rif r 接 種 後 の 糞 便 か ら は 安 定 し て ST116Rif r が 検 出 さ れ る 。 接 種 菌 液 の 調 整 も 第 二 章「 豚 サ ル モ ネ ラ・テ ィ フ ィ ム リ ウ ム 感 染 系 の 確 立 」 36 と 同 様 に 行 っ た 、 す な わ ち 、 DHL 寒 天 培 地 ( 栄 研 化 学 株 式 会 社 、 東 京 ) に 発 育 さ せ た ST116Rif r の 単 一 コ ロ ニ ー を 200mL の SCD 液 体 培 地 に 接 種 し 37℃ で 5 時 間 振 盪 培 養 し 、 そ の 後 培 養 液 の 菌 濃 度 を PBS で 調 整 し 、 最 後 に 等 量 の 20% Skim Milk と 混 合 し て 接 種 菌 液 と し て 供 試 し た 。 感 染 試 験:導 入 時 に 供 試 豚 を 各 区 5 頭 の 4 区( LA-hiST 区 、LA-loST 区 、 C-hiST 区 お よ び C-loST 区 )に 分 け 、LA の 2 区 で は 導 入 時 か ら 試 験 終 了 ま で 市 販 飼 料 に 乳 酸 を 2.8%添 加 し た 乳 酸 添 加 飼 料 を 給 与 し た 。 一 方 、 C の 2 区では導入時から試験終了まで市販飼料を給与した。馴致期間が終了した 51 あ る い は 52 日 齢 時 に ST116Rif r を hiST の 2 区 で は 1 頭 あ た り 5.6× 10 6 CFU/mL を 10mL 経 口 で 接 種 し 、 loST の 2 区 で は 1 頭 あ た り 5.6× 10 4 CFU/mL を 10mL 経 口 で 接 種 し た 。 観 察 期 間 中 は 臨 床 症 状 の 観 察 を 毎 日 行 い 、糞 便 性 状 の ス コ ア 化 お よ び 糞 便 の 採 取 を 随 時 実 施 し た 。観 察 期 間 中 に 著 し い 脱 水 症 状 や 沈 鬱 が 認 め ら れ た 際 に は 、 ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル を 用 い た 安 楽 殺 を 行 っ た 。 接 種 後 21 日 目 に は 耐 過豚全頭の剖検を実施し、主要臓器および腸管内容物を採取した。 糞 便 性 状 の ス コ ア 化:糞 便 性 状 は ス コ ア 化 し て 記 録 し た 。す な わ ち 、正 常 便 を ス コ ア 0、 軟 便 を ス コ ア 1、 下 痢 便 を ス コ ア 2 と し た 。 糞 便 中 お よ び 剖 検 時 の 腸 管 内 容 物 中 の S . Typhimurium 116Rif r 数 の 測 定 、 増菌および遅延二次増菌培養:観察期間中の糞便は各個体から直接採取し、 採 取 後 す ぐ に ST116Rif r 数 の 測 定 を 行 っ た 。菌 数 測 定 で は 糞 便 1g を PBS で 10 倍 段 階 希 釈 し 、適 切 な 希 釈 段 階 の 糞 便 希 釈 液 を 100μ g/mL リ フ ァ ン ピ シ ン 含 有 DHL 寒 天 培 地( RFDHL)に 塗 抹 し 、37℃ で 24 時 間 培 養 し た 後 に 発 育 し た コ ロ ニ ー 数 を 計 測 し た 。そ の 後 、菌 数 測 定 で ST116Rif r が 検 出 さ れ な か っ た 検 体 に つ い て 増 菌 培 養 を 行 っ た 。 増 菌 培 養 で は 糞 便 1g を 10mL の PBS で 希 釈 し た 上 記 糞 便 希 釈 液 か ら 1mL 採 取 し 、 そ れ を 10mL の ハ ー ナ ・ テ ト ラ チ オ ン 酸 塩 培 地 ( 栄 研 化 学 株 式 会 社 ) に 接 種 し 、 41.5℃ で 24 時 間 培 養 後 に RFDHL 寒 天 培 地 に 塗 抹 し 37℃ で 24 時 間 培 養 後 に 、コ ロ ニ ー 形 成 の 37 有 無 を 観 察 し た 。菌 数 測 定 、増 菌 培 養 で ST116Rif r が 検 出 さ れ な か っ た 際 に は 遅 延 二 次 増 菌 培 養 を 実 施 し た 。遅 延 二 次 増 菌 培 養 で は 増 菌 培 養 で 用 い た ハ ー ナ・テ ト ラ チ オ ン 酸 塩 培 地 を 増 菌 培 養 終 了 後 に 室 温 で 1 週 間 静 置 し た 後 に 、 培 養 液 を 1mL 採 取 し 、 10mL の ハ ー ナ ・ テ ト ラ チ オ ン 酸 塩 培 地 に 接 種 し 、 41.5℃ で 24 時 間 培 養 し た 培 養 液 を RFDHL 寒 天 培 地 に 塗 抹 し 、 37℃ で 24 時 間 培 養 後 に RFDHL 寒 天 培 地 で の コ ロ ニ ー 形 成 の 有 無 を 観 察 し た 。。 腸 管 内 容 物 は 上 記 の 糞 便 中 の ST116Rifr の 測 定 と 同 様 に 、 ST116Rif r 数 の 測 定 、 増菌培養および遅延二次増菌培養を実施した。 臓 器 か ら の S. Typhimurium116Rif r の 分 離:剖 検 時 に は 肝 臓 、肺 、脾 臓 、 腎 臓 、 扁 桃 、 腸 管 膜 リ ン パ 節 、 回 腸 内 容 物 お よ び 盲 腸 内 容 物 を そ れ ぞ れ 1g ずつ無菌的に採取し、腸管内容物以外の各臓器は表面を火炎滅菌した後に、 10mL の ハ ー ナ・テ ト ラ チ オ ン 酸 塩 培 地 に 懸 濁 し 41.5℃ で 24 時 間 培 養 し た 。 培 養 終 了 後 の 培 養 液 は RFDHL に 塗 抹 し 、37℃ で 24 時 間 培 養 後 に コ ロ ニ ー 形 成 の 有 無 を 観 察 し た 。コ ロ ニ ー 形 成 が 観 察 さ れ な か っ た 際 に は 、上 記 と 同 様に遅延二次増菌培養を実施した 統 計 処 理:測 定 さ れ た ST116Rif r 数 は 対 数 変 換 し 、検 出 限 界 以 下 と な っ た 検 体 は 0 と し た 。菌 数 測 定 で は ST116Rif r が 検 出 さ れ な か っ た が 、増 菌 培 養 あ る い は 遅 延 二 次 増 菌 培 養 で ST116Rif r が 検 出 さ れ た 検 体 は 100CFU/g と し て 統 計 処 理 を 行 っ た 。 ST116Rif r 数 は Student’s t -test で 有 意 差 の 判 定 を 行 っ た 。ま た 、ST116Rif r 接 種 前 5 日 間 の 体 温 と 比 較 し て 優 位 差 を 示 し た 際 に 発 熱 と し た 。 糞 便 性 状 の ス コ ア は Mann-Whitney U -test で 有 意 差 判 定 を 行 っ た 。 特 に 記 載 の な い 場 合 に は p <0.05 で 有 意 差 あ り と し た 。 【結果】 臨 床 症 状 : LA-hiST 区 で は 下 痢 ・ 軟 便 等 の 糞 便 性 状 の 悪 化 は 認 め ら れ な か っ た が 、 C-hiST 区 で は 接 種 後 2 日 目 か ら 軟 便 が 観 察 さ れ 、 接 種 後 6 日 目 には 5 頭中 4 頭で下痢が観察され、接種後 9 日目に 1 頭で軟便が観察され 38 た以降は、下痢および軟便は観察されなかった。6 日目および 7 日目には LA-hiST 区 と C-hiST 区 間 で 有 意 差 が 認 め ら れ た ( 図 10)。 一 方 、 LA-loST お よ び C-loST で は 糞 便 性 状 の 悪 化 は 散 発 的 で あ っ た 。 LA-hiST 区 で は 体 温 上 昇 は 認 め ら れ な か っ た が 、 C-hiST 区 で は 接 種 後 2 か ら 9 日 目 に か け て 発 熱 が 認 め ら れ た( 図 11)。一 方 、LA-loST 区 で は 体 温 上 昇 は 認 め ら れ な か っ た が 、 C-loST 区 で は 接 種 後 5 か ら 8 日 目 に か け て 発 熱が認められた。 糞 便 中 S . Typhimurium 116Rif r 数 の 推 移 : 糞 便 中 ST116Rif r の ピ ー ク 時 の 菌 数 は LA-hiST 区 で は 接 種 後 2 日 目 の 3.2×10 1 CFU/g、C-hiST 区 で は 接 種 後 3 日 目 の 1.3×10 5 CFU/g と な り 、接 種 後 3、12 お よ び 16 日 目 に LA-hiST 区 と C-loST 区 間 で 有 意 差 が 認 め ら れ た ( 図 12)。 一 方 、 LA-loST 区 の ピ ー ク 時 の 糞 便 中 ST116Rif r 数 は 接 種 後 7 日 目 の 2.5CFU/g で 、 C-loST 区 で は 接 種 後 9 日 目 が ピ ー ク で 1.3×10 4 CFU/g と な り 、接 種 後 6、7、9 お よ び 12 日 目 に LA-loST 区 と C-loST 区 間 で 有 意 差 が 認 め ら れ た 。 剖 検 時 臓 器 お よ び 腸 管 内 容 物 か ら の S . Typhimurium 116Rif r の 分 離 : 接 種 後 21 日 目 に 実 施 し た 剖 検 で は 肝 臓 、 肺 、 脾 臓 お よ び 腎 臓 か ら は C-loST 区 の 肝 臓 の 1 検 体 の み で ST116Rif r が 検 出 さ れ た ( 表 4)。 一 方 、 扁 桃 、 腸 管 膜 リ ン パ 節 、空 腸 内 容 物 お よ び 盲 腸 内 容 物 中 か ら は 全 区 で ST116Rif r が 検 出 さ れ た 。 LA-hiST 区 、 C-hiST 区 、 LA-loST 区 お よ び C-loST 区 の 空 腸 内 容 物 か ら の ST116Rif r の 検 出 率 は そ れ ぞ れ 20% 、80% 、40% お よ び 80% と な り 、盲 腸 内 容 物 か ら の ST116Rif r の 検 出 率 は 80%、100%、40%お よ び 80% と な っ た 。盲 腸 内 容 物 中 の ST116Rif r 数 で は LA-hiST の 方 が C-hiST よ り 少 なく、有意差が認められた。 39 40 ●●●●● C-hiST ●●●●● LA-hiST 2 1 0 ●●●●● 1 ●●●●● ●●●●● ●●●●● ●●●●● 2 ●●●●● ●● ●●● ●●●●● ●●●●● 3 ● ●●●● ●●● ●● ●●●●● 接種後日数 ●●●●● 6 ●●●●● ● ●●●● b ●●●●● a ●●●● 7 ● ●● ●●● ● ●● ●● b ●●●●● a ● ● ●●● 9 ● ●●●● ● ●●●● ●●●●● ●●●●● 13 ●●●●● ●●●●● ●●●●● a、 b 異 符 号 間 で 有 意 差 あ り 。( p<0.05) 糞便性状スコアは 0 が正常便、1 が軟便および 2 が下痢便を示す。 各区の糞便性状スコアの推移と剖検頭数を示す。表中の●が供試豚 1 頭を示す。 S . Typhimurium 接 種 後 の 糞 便 性 状 の 推 移 ●●●●● 0 C-loST 2 LA-loST 1 0 ●●●●● 2 1 0 2 1 0 図 10 糞便スコア ●●●●● 16 ●●●●● ●●●●● ●●●●● 41 -1 A 2 * * * 5 * * * * 11 図 11. 接種後日数 8 * 17 20 B 38.5 -1 B 2 5 * * * 11 接種後日数 8 * S . Typhimurium 接 種 後 の 体 温 の 推 移 14 39.0 39.5 40.0 40.5 41.0 14 17 * は 各 区 の 接 種 前 体 温 と の 有 意 差 を 示 す ( p <0.05)。 右 側 の グ ラ フ B は 1 頭 あ た り 5.6×10 5 CFU を 経 口 接 種 し た 、 □ は LA-loST 区 、 △ は C-loST 区 を 示 す 。 左 側 の グ ラ フ A は 1 頭 あ た り 5.6×10 7 CFU を 経 口 接 種 し た 、 ■ は LA-hiST 区 、 ▲ は C-hiST 区 を 示 す 。 各区の平均体温を示す。 A 38.5 39.0 39.5 40.0 40.5 体温 (℃) 41.0 41.5 体温(℃) 20 42 A 0 1 2 3 4 5 6 7 8 3 図 12. 0 * 接種後日数 9 12 15 * 18 21 B 0 1 2 3 4 5 6 7 0 3 * 6 * 9 * 接種後日数 * 12 15 18 21 S . Typhimurium 接 種 後 の 糞 便 中 S . Typhimurium 数 の 推 移 6 * * は LA-hiST 区 と C-hiST 区 間 お よ び 。 LA-loST 区 と C-loST 区 間 の 有 意 差 を 示 す ( p <0.05)。 右 側 の グ ラ フ B は 1 頭 あ た り 5.6×10 5 CFU を 経 口 接 種 し た 、 □ は LA-loST 区 、 △ は C-loST 区 を 示 す 。 左 側 の グ ラ フ A は 1 頭 あ た り 5.6×10 7 CFU を 経 口 接 種 し た 、 ■ は LA-hiST 区 、 ▲ は C-hiST 区 を 示 す 。 各 区 の 平 均 糞 便 中 S . Typhimurium 116Rif r 数 を 示 す 。 ST116Rifr数 (log CFU/g) 9 ST116Rifr数 (log cfu/g) 43 肺 0/5 0/5 0/5 0/5 肝臓 0/5a) 0/5 0/5 1/5 0/5 0/5 0/5 0/5 脾臓 0/5 0/5 0/5 0/5 腎臓 5/5 4/5 1/5 2/5 扁桃 ST116Rifr検出率 2/5 3/5 4/5 3/5 腸間膜 リンパ節 1/5 4/5 2/5 4/5 空腸 4/5 5/5 2/5 4/5 盲腸 0.32±0.49 1.52±1.26 0.18±0.40 0.37±1.33 空腸 0.89±1.22b)* 2.02±1.30 ** 1.40±1.03 2.66±0.37 盲腸 各腸管内容物1g中のST116Rif r数 (Log CFU/g) 剖 検 時 の 各 種 臓 器 か ら の S . Typhimurium の 検 出 率 b:* と * * 間 で 有 意 差 あ り ( p<0.05)。 a:陽 性 検 体 数 /検 体 数 LA-hiST C-hiST LA-loST C-loST 区 表4. 【考察】 本 章 で は 、第 二 章「 豚 サ ル モ ネ ラ ・テ ィ フ ィ ム リ ウ ム 感 染 系 の 確 立 」で 確 立 さ れ た S . Typhimurium 感 染 系 を 用 い て 10 7 CFU/頭 の 経 口 接 種 に よ り 下 痢 を 伴 う 豚 サ ル モ ネ ラ 症 を 再 現 し 、 ま た 10 5 CFU/頭 の 経 口 接 種 で 糞 便 性 状 の 悪 化 等 の 臨 床 症 状 は 軽 度 だ が 安 定 し た 排 菌 が 認 め ら れ る Salmonella 不 顕 性感染を再現した。 今 回 、我 々 は 豚 S . Typhimurium 感 染 系 で 不 顕 性 感 染 を 再 現 し 、そ の 感 染 系 に お い て 2.8%乳 酸 添 加 飼 料 に よ り 糞 便 中 の Salmonella 陽 性 率 が 下 が る こ と を 確 認 し た 。 Jorgensen ら は 、 Salmonella の 不 顕 性 感 染 が 確 認 さ れ て い る 野 外 養 豚 場 に お い て 、 乳 酸 2.8%添 加 飼 料 を 給 与 す る こ と で 、 糞 便 中 の Salmonella 陽 性 率 が 低 下 す る こ と を 報 告 し た [30]。 我 々 は さ ら に 糞 便 中 に 排 泄 さ れ る S . Typhimurium 数 は 乳 酸 無 添 加 の 対 照 飼 料 と 比 べ て 乳 酸 添 加 飼 料 の 方 が 優 位 に 減 少 し て お り 、 ピ ー ク 時 で も 1×10 1 CFU/g 以 下 と 豚 群 内 の Salmonella 伝 播 に 必 要 と 報 告 さ れ て い る 1×10 3 CFU/g 以 下 に ま で 菌 数 を 低 下 し た こ と を 示 し た [46] 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 2.8% 乳 酸 添 加 飼 料 が Salmonella 不 顕 性 感 染 豚 群 内 の Salmonella 感 染 拡 大 防 止 に 有 効 で あ る こ とが示唆された。 一 方 、 S . Typhimuirum 感 染 系 で 再 現 さ れ た 下 痢 を 伴 う 豚 サ ル モ ネ ラ 症 に お い て も 2.8%乳 酸 添 加 飼 料 で は 下 痢 の 発 現 が 認 め ら れ ず 、S . Typhimurium 感 染 に よ る 糞 便 性 状 の 悪 化 を 改 善 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。第 二 章「 豚 サ ル モ ネ ラ・テ ィ フ ィ ム リ ウ ム 感 染 系 の 確 立 」で 示 さ れ た よ う に 、S . Typhimurium に よ る 糞 便 性 状 の 悪 化 に は 糞 便 中 の S . Typhimurium 数 の 増 加 を 伴 う が [59]、 本 研 究 で は 2.8%乳 酸 添 加 飼 料 が 糞 便 中 の S . Typhimurium 数 を 低 下 さ せ る こ と 、盲 腸 に お け る S . Typhimurium 数 を 低 下 さ せ る こ と が 示 さ れ た 。こ れ ら の こ と か ら 、乳 酸 添 加 飼 料 に は 腸 管 内 で の S . Typhimurium の 増 殖 を 抑 制 す る 効 果 が あ り 、そ れ ら が 糞 便 性 状 の 悪 化 等 の 臨 床 症 状 発 現 の 軽 減 に つ な が るものと考えられた。 乳 酸 の 殺 菌 作 用 は 、 pH3.7 の 環 境 中 で は 3 時 間 で 1/100 ま で Salmonella を 減 少 さ せ 、 pH4.0 の 環 境 中 で は 3 時 間 で 1/10 ま で Salmonella を 減 少 さ 44 せ る が 、 pH4.4 の 環 境 中 で は 殺 菌 作 用 は 発 揮 さ れ な い [60]。 豚 の 胃 の pH は 3.82-4.07 と 報 告 さ れ て お り [61]、 胃 で は 乳 酸 の 殺 菌 作 用 が 発 揮 さ れ る 環 境 にあることが示唆されている。しかし、胃を通過した後の乳酸については、 給 与 さ れ た 乳 酸 は 腸 管 に 移 行 す る と 、す ば や く 酢 酸 、プ ロ ピ オ ン 酸 、ギ 酸 に 変 換 さ れ る と の 報 告 や [62]、 乳 酸 は Salmonella の 病 原 性 に 関 与 す る 遺 伝 子 の発現に影響を与えることで鶏での感染防止に効果が認められたとの報告 も あ る [63]。 さ ら に 、 Salmonella 感 染 は 腸 内 菌 叢 の 変 化 の 影 響 も 受 け る と 報 告 さ れ て お り [56]、飼 料 に 添 加 さ れ た 乳 酸 の 作 用 機 序 の 詳 細 に つ い て は 今 後の更なる研究が必要となる。 豚 サ ル モ ネ ラ 対 策 に は 、 環 境 中 の Salmonella 数 を 減 ら す 飼 養 環 境 の 改 善 や オ ー ル ア ウ ト の 実 施 な ど と 併 せ て 、豚 の 体 内 に お け る Salmonella の 増 殖 を 抑 制 す る 取 り 組 み が 必 要 と な る 。 豚 体 内 の Salmonella の 増 殖 を 抑 制 す る に は 、現 時 点 で は 、豚 に ス ト レ ス を か け な い こ と と 併 せ て [64]、抗 菌 剤 の 使 用 は 避 け ら れ な い 。 し か し な が ら 近 年 の Salmonella 対 策 の 報 告 で は 、 飼 養 環 境 の 改 善 と 併 せ て 、生 菌 剤 等 の 使 用 が 報 告 さ れ て お り 、抗 菌 剤 代 替 物 質 の 使 用 が 広 ま り つ つ あ る [20]。本 章 で は 、2.8%乳 酸 添 加 飼 料 が そ れ ら 代 替 物 質 の 一 つ と し て 豚 Salmonella 対 策 に 応 用 で き る こ と を 示 唆 す る デ ー タ が 得 ら れ た 。ま た 、第 二 章 で 確 立 し た 豚 S . Typhimuirum 感 染 系 が 抗 菌 剤 代 替 物 質 の評価に応用できることも示され、その有用性が大いに期待された。 【小括】 豚 S . Typhimurium 感 染 系 を 用 い て 2.8%乳 酸 添 加 飼 料 の 評 価 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 臨 床 症 状 を 伴 う 豚 サ ル モ ネ ラ 症 を 再 現 し た 感 染 系 で は 2.8%乳 酸 添 加 飼 料 が 糞 便 性 状 の 悪 化 を 抑 制 し 、糞 便 中 へ の Salmonella 排 菌 数 も 減 少 さ せ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 ま た 、 Salmonella 不 顕 性 感 染 を 再 現 し た 感 染 系 で も 糞 便 中 へ の Salmonella 排 菌 数 を 減 少 さ せ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、第 二 章 で 確 立 し た 豚 S . Typhimurium 感 染 系 が 、抗 菌 剤 代 替 候 補 物 質 の 評 価 に 応 用 で き る こ と が 示 唆 さ れ た 。ま た 、乳 酸 添 加 飼 料 が Salmonella に 対 す る 抗 菌 剤 代 替 物 質 と し て 活 用 で き る こ と も 示 唆 さ れ た 。 45 第四章 豚大腸菌感染系の確立 46 【緒言】 大 腸 菌 に よ る 感 染 症 は ヒ ト 、豚 、牛 な ど 多 く の 宿 主 で 発 生 し 、そ の 病 態 は 下 痢 、 毒 血 症 、 敗 血 症 お よ び 尿 路 感 染 な ど と 多 様 で あ る [ 14]。 豚 に お け る 大 腸 菌 症 は 感 染 や 発 症 機 序 の 違 い か ら 、腸 管 感 染 症 で あ る 下 痢 症( 新 生 期 下 痢 症 、離 乳 後 下 痢 症 )お よ び エ ン テ ロ ト キ セ ミ ア( 浮 腫 病 、脳 脊 髄 血 管 症 )、 全 身 感 染 症 で あ る 敗 血 症 、局 所 感 染 で あ る 子 宮 内 膜 炎 等 に 分 け ら れ る 。こ れ らの原因となる大腸菌はそれぞれ異なる病原因子を保有する特定の大腸菌 株 で 、例 え ば 下 痢 を 起 こ す 大 腸 菌 の 1 種 で あ る 毒 素 原 性 大 腸 菌( ETEC)で は 付 着 因 子 と 下 痢 原 性 毒 で あ る 易 熱 性 エ ン テ ロ ト キ シ ン ( LT) や 耐 熱 性 エ ン テ ロ ト キ シ ン ( ST) の 両 方 あ る い は 片 方 を 保 有 し て い る こ と が 知 ら れ て いる。 我 が 国 で は 、 哺 乳 豚 や 離 乳 豚 の 下 痢 便 か ら 頻 繁 に ETEC が 分 離 さ れ て お り [ 22]、 多 く の 農 場 で 問 題 と な っ て い る [ 65]。 ETEC に よ る 下 痢 が 発 症 す る と 事 故 率 の 増 加 や 飼 養 効 率 の 悪 化 が 認 め ら れ 、経 済 的 な 損 害 を 与 え る た め に 対 策 を 行 う 必 要 が あ る [ 14]。 ETEC 対 策 と し て 、新 生 期 下 痢 症 で は 飼 養 環 境 の 改 善 と 併 せ て 抗 菌 剤 の 注 射 、移 行 抗 体 を 介 し て 子 豚 を 守 る た め の 母 豚 へ の ワ ク チ ン 接 種 等 が 行 わ れ て い る [66]。一 方 、離 乳 後 下 痢 症 で も 飼 養 環 境 の 改 善 と 併 せ て 、抗 菌 剤 の 飼 料 添 加 や 注 射 が 行 わ れ て お り [ 67]、 大 腸 菌 症 対 策 で は 抗 菌 剤 が 広 く 使 わ れ て い る 。し か し 、抗 菌 剤 の 使 用 に よ る 薬 剤 耐 性 菌 の 問 題 や [68]、抗 菌 剤 の 使 用 量 が よ り 少 な い 畜 産 物 を 求 め る 消 費 者 か ら の 要 望 も あ り 、抗 菌 剤 の 使 用 に は 厳 し い 目 が 向 け ら れ て い る 。特 に 、薬 剤 耐 性 菌 の 問 題 で は 複 数 の 抗 菌 剤 に 対 し て 耐 性 を 持 つ 多 剤 耐 性 の ETEC の 出 現 や [23、 69]、 豚 由 来 の 薬 剤 耐 性 菌 が ヒ ト へ 伝 播 す る こ と に よ る ヒ ト の 健 康 リ ス ク の 増 大 も 危 惧 さ れ て お り 、各 国 で 重 要 な 問 題 と な っ て お り 、抗 菌 剤 に 頼 ら な い 、抗 菌 剤 代 替 物 質 に よ る 対 策が求められている。 こ れ ら を 背 景 と し て 、ETEC 対 策 に 応 用 で き る 抗 菌 剤 代 替 物 質 の 研 究 が 活 発 に 行 わ れ て お り 、 そ の 候 補 物 質 と し て 有 機 酸 [31、 70]、 生 菌 剤 [71]お よ び 鶏 卵 抗 体 [72、 73]、 亜 鉛 [74]等 の 活 用 が 報 告 さ れ て お り 、 実 際 に 養 豚 場 で 応 用 さ れ て い る 資 材 も あ る [31、70、75]。し か し 、こ れ ら 資 材 の 中 で 養 豚 場 に 47 お い て も 安 定 し た 効 果 を 示 し て い る 資 材 は 少 な い [ 26、 27]。 そ の 理 由 の 一 つとしてそれら資材の開発段階で対象動物である豚に対応した評価が十分 に 行 わ れ て い な い こ と が 挙 げ ら れ 、特 に 豚 を 用 い た 大 腸 菌 感 染 対 策 で の 評 価 は遅れている。 そ こ で 、本 研 究 で は 抗 菌 剤 代 替 物 質 の 評 価 に 適 し た 豚 大 腸 菌 感 染 系 の 確 立 を 目 指 す こ と と し た 。豚 大 腸 菌 感 染 系 は 過 去 に も 報 告 さ れ て い る が 、離 乳 豚 を 用 い た 大 腸 菌 感 染 系 は 再 現 性 が 難 し い こ と が 知 ら れ て お り 、離 乳 豚 で の 安 定 し た 感 染 系 を 確 立 す る た め に 感 染 時 に 胃 酸 中 和 剤 の 給 与 や [76]、接 種 大 腸 菌 を 胃 を 通 過 さ せ る た め の 腸 溶 性 カ プ セ ル で 覆 っ た り [77]、感 染 前 に 豚 に ス ト レ ス を 与 え る 等 が 行 わ れ て い る 。ま た 、離 乳 豚 の 豚 大 腸 菌 感 染 の 発 症 に は 腸 内 菌 叢 が 関 与 す る こ と も 報 告 さ れ て お り [78]、安 定 し た 豚 大 腸 菌 感 染 症 を 確 立 す る に は 感 染 豚 の 腸 内 菌 叢 も 考 慮 す る 必 要 が あ る 。本 研 究 が 目 指 し て い る 、抗 菌 剤 代 替 物 質 の 評 価 に 応 用 で き る 豚 大 腸 菌 感 染 系 で は 、胃 酸 中 和 剤 や 豚 に ス ト レ ス を 与 え る 等 の 処 理 を 避 け る 必 要 が あ る 。そ の こ と か ら 、離 乳 豚 ではなく哺乳豚を用いた豚大腸菌感染系の確立を目指した。 一 方 、哺 乳 豚 の 大 腸 菌 症 は 移 行 抗 体 で 防 御 で き る こ と が 知 ら れ て お り [66]、 安 定 し た 感 染 系 を 確 立 す る に は 、移 行 抗 体 を 接 種 し て い な い 豚 を 供 試 す る 必 要がある。 そ こ で 、本 研 究 で は 移 行 抗 体 を 接 種 し て お ら ず 、腸 内 菌 叢 の 影 響 も 排 除 で き る よ う に 、 帝 王 切 開 で 作 出 し 、 初 乳 を 摂 取 し て い な い cesarean-derived, colostrum-deprived ( CDCD) 豚 を 供 試 す る こ と で 安 定 し た 豚 大 腸 菌 感 染 系の確立を目指した。 【材料と方法】 1. in vitro で の 菌 株 の 選 抜 供試菌株:野外より分離され、当所に保存されていた溶血性大腸菌 ( Enterotoxigenic Escherichia coli ; ETEC) 13 株 そ れ ぞ れ の リ フ ァ ン ピ シ ン ( Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) 耐 性 株 を 当 所 48 で 選 択 し 、 リ フ ァ ン ピ シ ン 耐 性 溶 血 性 大 腸 菌 13 株 を 供 試 し た 。 リ フ ァ ン ピ シ ン 耐 性 株 の 選 択 は 具 体 的 に は 、 リ フ ァ ン ピ シ ン を 100μ g/mL の 濃 度 に 含 む DHL 寒 天 培 地( Eiken Chemica, Co., Ltd., Tokyo, Japan)に 供 試 菌 株 を そ れ ぞ れ 濃 厚 に 塗 抹 し 、 37℃ で 24 時 間 培 養 し 、 そ れ ぞ れ の 株 で 発 育 し て き たコロニーをリファンピシン耐性株として供試した。 O 抗 原 の 検 出 : O8 、 O9 、 O20、 O21 、 O45 、 O64 、 O101、 O115 、 O138 、 O139 、 O141 、 O147 、 O149 、 O153 及 び O157 の 15 種 類 の 抗 O 血 清 ( Laboratorio de Referencia de E. coli 、 University of Santiago de Compostela, Santiago, Spain) を 用 い て 定 法 に 従 い 実 施 し た 。 付 着 因 子 の 検 出:毒 素 原 性 大 腸 菌 線 毛 抗 血 清「 生 研 」 ( Denka Seiken Co., Ltd. Tokyo, Japan) を 用 い て 定 法 に 従 い 実 施 し た 。 LT の 検 出 : 大 腸 菌 易 熱 性 エ ン テ ロ ト キ シ ン 検 出 用 キ ッ ト 「 コ リ ス ト EIA」 ( Denka Seiken Co., Ltd.) を 用 い て 定 法 に 従 い 実 施 し た 。 ST の 検 出 : 大 腸 菌 耐 熱 性 エ ン テ ロ ト キ シ ン 検 出 用 キ ッ ト 「 VET-RPLA 」 ( Denka Seiken Co., Ltd.) を 用 い て 定 法 に 従 い 実 施 し た 。 病 原 因 子 遺 伝 子 の 検 出 : 付 着 因 子 の F4ab、 F4ac お よ び F4ad[79]、 毒 素 の LT、 ST お よ び Vero Toxin の 遺 伝 子 検 出 を PCR 法 に て 実 施 し た [80]。 2. 豚 を 用 い た 供 試 菌 株 の 選 抜 供 試 豚:1 頭 の 母 豚 よ り 作 出 さ れ た CDCD 豚 7 豚 を 供 試 し た( 図 13)。供 試 豚 は 作 出 日 か ら 2 区 ( EC389 区 お よ び BD2699 区 ) に 区 分 け さ れ 、 各 区 別の部屋で単飼のケージで飼育された。 供 試 菌 株 : 「1. in vitro で の 菌 株 の 選 抜 」で 選 抜 さ れ た リ フ ァ ン ピ シ ン 耐 49 性 の 毒 素 原 性 大 腸 菌 ( ETEC) EC389Rif r 株 お よ び BD2699Rif r 株 の 2 株 を 供試した。 接 種 菌 の 菌 液 調 整 で は 、 そ れ ぞ れ の 株 を SCD 寒 天 培 地 で 培 養 し 、 発 育 し て き た コ ロ ニ ー を Minca ISO vitalex 寒 天 培 地( BBL Microbiology Systems Cookeysville, Md) に 塗 抹 し 、 37℃ で 一 晩 培 養 し た 。 そ の 後 、 Minca ISO vitalex に 発 育 し て き た コ ロ ニ ー を 掻 き 取 り 生 理 食 塩 水 に 懸 濁 し 、 生 理 食 塩 水を用いて菌濃度を調整した後に接種菌液として供試した。 供 試 飼 料:抗 菌 性 飼 料 添 加 物 お よ び 機 能 性 飼 料 原 料 が 添 加 さ れ て い な い 試 験 用 代 用 乳 飼 料 「 SPF-LAC」( Borden Inc., Norfolkk, VA) を 作 出 当 日 か ら 試験終了時まで給与した。 感 染 試 験 : 4 日 齢 時 の 供 試 豚 に EC389 区 ( n=4) に は EC389Rif r 株 を 、 BD2699 区 ( n=3 ) に は BD2699Rif r 株 を 、 そ れ ぞ れ 1 頭 あ た り 5.4 × 10 8 CFU/mL を 10mL お よ び 3.2×10 8 CFU/mL を 10mL 経 口 で 接 種 し た 。 観 察 期 間 中 は 臨 床 症 状 の 観 察 を 毎 日 行 い 、糞 便 性 状 の ス コ ア 化 と 糞 便 の 採 取も毎日行った。観察期間中に著しい脱水や食欲不振が認められた際には、 ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル を 用 い た 安 楽 殺 を 施 し た 。接 種 後 7 日 目 に 耐 過 豚 全 頭 の 剖検を実施し、主要臓器および腸内容物を無菌的に採取した。 3. 観 察 お よ び 検 査 項 目 糞 便 性 状 の ス コ ア 化:糞 便 性 状 は ス コ ア 化 し て 記 録 し た 。す な わ ち 、正 常 便 を ス コ ア 0、 軟 便 を ス コ ア 1、 下 痢 便 を ス コ ア 2 と し た 。 糞 便 中 お よ び 消 化 管 内 容 物 中 の 接 種 ETEC 数 の 測 定 : 観 察 期 間 中 の 糞 便 の 採 取 は 各 個 体 か ら 直 接 行 っ た 。 糞 便 は 採 取 後 す ぐ に 接 種 ETEC の 菌 数 測 定 に 供 試 し た 。 菌 数 測 定 で は 糞 便 1g を PBS で 10 倍 段 階 希 釈 し 、 適 切 な 希 釈 段 階 の 糞 便 希 釈 液 を 100 μ g/mL リ フ ァ ン ピ シ ン 含 有 DHL 寒 天 培 地 ( RFDHL) に 塗 抹 し 、 37℃ で 24 時 間 培 養 し た 後 に 発 育 し た コ ロ ニ ー 数 を 50 計測した。 各 種 臓 器 に お け る ETEC の 分 離 : 剖 検 時 に は 全 頭 か ら 肺 、 肝 臓 、 心 臓 、 腎 臓 、脾 臓 、扁 桃 、腸 間 膜 リ ン パ 節 お よ び 脳 を 無 菌 的 に 採 取 し 、観 察 期 間 中 に安楽殺を施した個体からは上記の部位に加えて血液を無菌的に採取した。 採取した血液以外の臓器は表面を火炎滅菌した後に各臓器検体の中央部で 切 断 し 、 そ の 割 面 を RFDHL 寒 天 培 地 に 押 し 付 け 、 37℃ 、 24 時 間 培 養 後 の コ ロ ニ ー の 発 育 の 有 無 で 判 定 を 行 っ た 。血 液 は 直 接 RFDHL 寒 天 培 地 に 塗 抹 し 、 37℃ 、 24 時 間 培 養 後 の コ ロ ニ ー の 有 無 で 判 定 を 行 っ た 。 4. 豚 を 用 い た 接 種 菌 数 の 検 討 供 試 豚 :2 頭 の 母 豚 よ り 作 出 さ れ た CDCD 豚 18 頭 を 供 試 し た 。供 試 豚 は 作 出 日 に 4 区 ( ETEC-4、 ETEC-6、 ETEC-8 お よ び 陰 性 対 照 区 ) に 区 分 け され、各区はそれぞれ別の部屋で、単飼用のケージで飼育された。 供 試 菌 株 :「 1. in vitro で の 菌 株 の 選 抜 」 お よ び 「 2. 豚 を 用 い た 供 試 菌 株の選抜」で選抜されたリファンピシン耐性を有する毒素原性大腸菌 EC389Rif r 株 を 供 試 し た 。 接 種 菌 の 菌 液 調 整 は 「2. 豚 を 用 い た 供 試 菌 株 の 選 抜 」と 同 様 に 行 っ た 、 す な わ ち EC389Rif r 株 を SCD 寒 天 培 地 で 培 養 し 、 発 育 し て き た コ ロ ニ ー を Minca ISO vitalex 寒 天 培 地( BBL Microbiology Systems Cookeysville, Md) に 継 代 、 塗 抹 し 、 37℃ で 一 晩 培 養 し た 。 そ の 後 、 Minca ISO vitalex に 発 育 し て き た コ ロ ニ ー を 掻 き 取 り 生 理 食 塩 水 に 懸 濁 し 、菌 濃 度 を 調 整 し た 後 に 接 種菌液として供試した。 供 試 飼 料:抗 菌 性 飼 料 添 加 物 お よ び 機 能 性 飼 料 原 料 が 添 加 さ れ て い な い 試 験 用 飼 料 「 SPF-LAC」( Borden Inc., Norfolkk, VA) を 作 出 当 日 か ら 試 験 終 了まで供試した。 51 感 染 試 験 : 供 試 豚 は 4 日 齢 時 に 供 試 菌 株 で あ る EC389Rif r 株 を 経 口 で 接 種 さ れ 、ETEC-8 区( n=4)で は 1 頭 あ た り 4.3×10 8 CFU、ETEC-6 区( n=5) で は 1 頭 あ た り 4.3×10 6 CFU、 ETEC-4 区 ( n=5) で は 1 頭 あ た り 4.3× 10 4 CFU を 経 口 で 接 種 さ れ 、 陰 性 対 照 ( n=4) に は 生 理 食 塩 水 を 接 種 し た 。 観 察 期 間 中 は 臨 床 症 状 の 観 察 を 毎 日 行 い 、糞 便 性 状 の ス コ ア 化 お よ び 糞 便 の 採 取 は 随 時 実 施 し た 。観 察 期 間 中 に 著 し い 脱 水 や 沈 鬱 頭 が 認 め ら れ た 際 に は 安 楽 殺 を 実 施 し た 。 接 種 後 14 日 目 に は 耐 過 豚 全 頭 の 剖 検 を 実 施 し 、 腸 管 内容物を採取した。 糞便性状のスコア化:糞便性状は随時スコア化して記録された。つまり、 正 常 便 を ス コ ア 0、 軟 便 を ス コ ア 1 お よ び 下 痢 便 を ス コ ア 2 と し た 。 糞 便 中 お よ び 腸 管 内 容 物 中 の E.Coli 389Rif r 数 の 測 定:観 察 期 間 中 の 糞 便 の 採 取 は 各 個 体 か ら 直 接 行 っ た 。 糞 便 中 の EC389Rif r 数 の 測 定 で は 、 糞 便 1g を PBS で 10 倍 段 階 希 釈 し 、 適 切 な 希 釈 段 階 の 糞 便 希 釈 液 を 100μ g/mL リ フ ァ ン ピ シ ン 含 有 DHL( RFDHL) に 塗 抹 し 、 37℃ で 24 時 間 培 養 後 に 発 育したコロニー数を計測した。 【結果】 1. in vitro で の 菌 株 の 選 抜 供 試 菌 株 の 選 抜:対 象 と し た 13 株 の 内 、付 着 因 子 は 12 株 で F4( K88)の 発 現 お よ び 遺 伝 子 が 保 持 さ れ て い る こ と が 確 認 さ れ 、残 り の 1 株 は F5 の 発 現 が 確 認 さ れ た ( 表 5)。 LT の 遺 伝 子 は 12 株 で 保 有 さ れ て お り 、 そ の 内 の 2 株 で 発 現 が 認 め ら れ た 。 一 方 、 ST は STⅠ 遺 伝 子 が 5 株 で 、 STⅡ 遺 伝 子 が 12 株 で 保 有 さ れ て お り 、 STⅠ 遺 伝 子 お よ び Ⅱ 遺 伝 子 の 両 方 を 保 有 し て い た 4 株 の 内 の 1 株 で ST の 発 現 が 確 認 さ れ た 。13 株 全 て で VT 遺 伝 子 の 保 有 は 認められなかった。 本 試 験 で は 、 凝 集 因 子 の F4 の 発 現 が 認 め ら れ 、 毒 素 と し て LT の 発 現 が 52 認 め ら れ た EC389Rif r 株 お よ び EC412Rif r 株 の 2 株 の 内 STⅠ お よ び STⅡ 両 方 の 遺 伝 子 の 保 有 が 認 め ら れ た EC389Rif r 株 と 、 F4 の 発 現 が 認 め ら れ 、 ST の 発 現 お よ び LT 遺 伝 子 の 保 有 も 認 め ら れ た BD2699Rif r 株 の 2 株 を 豚 を 用いた感染試験に供試し、最終選抜を実施することとした。 2. 豚 を 用 い た 供 試 菌 株 の 選 抜 臨 床 症 状 : EC389 区 で は 安 楽 殺 を 実 施 し た の は 、 接 種 後 1 日 目 の 1 頭 の み で あ っ た が 、BD2699 区 で は 接 種 後 2 日 目 に 3 頭 中 2 頭 の 安 楽 殺 を 実 施 し た 。 糞 便 性 状 の 悪 化 に つ い て は 接 種 後 8 時 間 目 に は EC389 区 お よ び BD2699 区 で そ れ ぞ れ 4 頭 中 3 頭 お よ び 3 頭 中 2 頭 で 軟 便 が 観 察 さ れ た( 図 14-15)。 接 種 後 1 日 目 に は EC389 区 で 3 頭 中 2 頭 が 下 痢 を 発 現 し 、 BD2699 区 で は 全 頭 で 下 痢 が 観 察 さ れ 。 両 株 と も ETEC 接 種 後 1 日 目 に は 糞 便 性 状 の 悪 化 が 認 め ら れ た 。接 種 後 1 日 目 以 降 は 観 察 期 間 を 通 じ て 耐 過 豚 全 頭 で 継 続 し て 下痢が観察された。 糞 便 中 の ETEC 数 推 移:接 種 後 8 時 間 目 に は EC389 区 お よ び BD2699 区 の 両 区 全 頭 の 糞 便 か ら 接 種 ETEC が 検 出 さ れ 、 糞 便 中 に は そ れ ぞ れ 6.2 × 10 7 CFU/g お よ び 2.5×10 8 CFU/g の 接 種 菌 数 が 検 出 さ れ た( 図 16)。そ の 後 試 験 終 了 ま で 両 区 と も 10 8 CFU/g 以 上 の 接 種 菌 が 継 続 し て 検 出 さ れ た 。観 察 期間中を通じて両区に有意差は認められなかった。 消 化 管 各 部 位 の ETEC 数:7 日 間 の 観 察 期 間 を 生 残 耐 過 し た 供 試 豚 で は 十 二 指 腸 で は EC389 区 お よ び BD2699 区 で そ れ ぞ れ 8.7×10 3 CFU/g お よ び 1.4 × 10 7 CFU/g の 菌 が 検 出 さ れ た 。 空 腸 で は 2.0 × 10 7 CFU/g お よ び 6.6 × 10 7 CFU/g の 菌 が 検 出 さ れ( 図 17)、十 二 指 腸 お よ び 空 腸 で EC389 区 の 方 が BD2699 区 よ り 少 な い 菌 数 を 示 し た 。 本 研 究 で 臨 床 症 状 が 著 し く 悪 化 し た た め に 安 楽 殺 を 施 し た EC389 区 の 2 頭 お よ び BD2699 区 の 1 頭 の 3 頭 で は 十 二 指 腸 で 2.0×10 8 CFU/g の 菌 が 検 53 出 さ れ 、 空 腸 で も 6.6×10 8 CFU/g の 菌 が 検 出 さ れ た 。 安 楽 殺 を 施 さ れ た 豚 の 十 二 指 腸 の ETEC 数 は EC389 区 の 生 残 豚 と 比 べ て 有 意 に 多 か っ た 。 各 種 臓 器 か ら の 接 種 ETEC の 分 離:EC389 区 お よ び BD2699 の 耐 過 豚 の 肺 、 肝 臓 、 腎 臓 、 脾 臓 、 心 臓 お よ び 扁 桃 か ら は 接 種 ETEC は 分 離 さ れ な か っ た が 、 EC389 区 で は 3 頭 全 頭 の 腸 間 膜 リ ン パ 節 か ら 分 離 さ れ た ( 表 6)。 一 方 、 安 楽 殺 を 施 さ れ た 豚 の 肺 、 腎 臓 、 扁 桃 か ら は 接 種 ETEC が 分 離 さ れ 、 さ ら に 血 液 か ら も 接 種 ETEC が 分 離 さ れ た 。 3. 豚 を 用 い た 接 種 菌 数 の 検 討 臨 床 症 状 : ETEC-6 区 お よ び ETEC-8 区 で は 接 種 後 1 日 目 に そ れ ぞ れ 5 頭 中 4 頭 お よ び 全 頭 で 下 痢 を 発 現 し た( 図 18)。一 方 、ETEC-4 区 で は 接 種 後 1 日 目 で は 5 頭 中 1 頭 で 下 痢 が 確 認 さ れ 、接 種 後 2 日 目 に は 全 頭 で 下 痢 が 確 認 さ れ た 。 ETEC-8、 ETEC-6 お よ び ETEC-4 区 で は 接 種 後 10 日 目 以 降 で は糞便性状の改善が認められた。 陰性対照区では接種後 2 日目に 4 頭中 2 頭で軟便が観察され、その後も 軟便が観察され続け、接種後 6 日目には全頭で下痢を発現した。接種後 7 日目以降では陰性対照区の糞便性状には改善が認められた。 糞 便 中 の E. coli 389Rif r 数 の 推 移 : 糞 便 中 の EC389Rif r 数 は 接 種 後 1 日 目 に は ETEC-6 区 お よ び ETEC-8 区 で 10 8 CFU/g ま で 増 加 し た( 図 19)。一 方 、 ETEC-4 区 の 糞 便 中 EC389Rif r 数 が 10 8 CFU/g ま で 増 加 し た の は 接 種 後 2 日 目 で あ っ た 。そ の 後 は 試 験 終 了 ま で 全 区 で 10 8 CFU/g 以 上 の 菌 数 が 検 出 さ れ た。 陰 性 対 照 区 で は 試 験 期 間 中 を 通 じ て 糞 便 か ら EC389Rif r は 検 出 さ れ な か った。 剖 検 時 腸 管 内 容 物 中 の E. coli 389Rif r 数:ETEC-4、ETEC-6 お よ び ETEC-8 区 の EC389Rif r 数 は 盲 腸 、 結 腸 お よ び 直 腸 で は 1×10 7 CFU/g 以 上 と な っ た 54 ( 図 20)。一 方 、ETEC-8、6 お よ び 4 区 の 3 区 全 て で EC389rif r 数 は 回 腸 、 空 腸 、十 二 指 腸 と 腸 管 上 部 に 移 行 す る に 従 い 減 少 し た が 、区 間 で 有 意 差 は 認 められなかった。 陰 性 対 照 区 か ら は 全 て の 腸 管 部 位 で EC389Rif r は 検 出 さ れ な か っ た 。 55 図 13 CDCD 豚 作 出 時 の 写 真 内部を滅菌したチャンバーを用意する(左上)。 母豚とチャンバーを滅菌させ、母豚の術野を殺菌する(右上)。 チャンバー内で子宮から子豚を取り出す(左下)。 56 57 BD2699 EC420 EC432 EC452 EC459 ECB-41 EC415 EC412 EC 3 8 9 EC382 EC374 EC376 EC379 株名 表5 毒素 F4 LT ST F5 F6 VT O抗原 (K88) (易熱性毒素) (耐熱性毒素) (K99) (987P) (Vero毒素) PCR PCR 凝集反応 凝集反応 PCR PCR 凝集反応 凝集反応 EIA F4ab F4ac F4ad LTⅠ LTⅠ STⅠ STⅡ + + + O149 + + O149 + + + + O149 + + + + O149 + + + + + O1 4 9 + + + + + + O149 + + + + + O149 + + + + O149 + + + + + + O149 + + O149 + + + + + + O149 + + O101 + + - O149 + + + + + + - 付着因子 当 所 保 存 ETEC 株 の 付 着 因 子 お よ び 毒 素 の 遺 伝 子 保 有 お よ び 発 現 図 14 ETEC 感 染 時 の 発 症 豚 と 下 痢 下痢発症豚の外観(左) 発現した下痢便(右) 58 59 ●●● 0 EBD2699 ●● ● 8hr ●●● ● 1 ●●● ● ● ●● 3 ●● ● ● ●●● 接種後日数 2 ●● ● ● ●●● 4 ●● ● ● ●●● 5 ●● ● ● ●●● 6 ●● ● ● ●●● 糞便性状スコアは 0 が正常便、1 が軟便および 2 が下痢便を示す。 各区の糞便性状スコアの推移と安楽殺頭数を示す。表中の●が供試豚 1 頭を示す。 EC389Rif r お よ び ECBD2699Rif r 接 種 時 の 糞 便 性 状 の 推 移 安楽殺頭数 2 1 0 EC389区 安楽殺頭数 2 1 0 ●●●● 図 15 糞便スコアと安楽殺実施の頭数 12 接種ETEC数 (Log CFU/g) 10 8 6 4 2 0 0(8hr) 図 16 1 2 3 4 接種後日数(時間) 5 6 EC389Rif r お よ び BD2699Rif r 接 種 時 の 糞 便 中 接 種 ETEC 数 の 推 移 ● は EC389 区 、 ▲ は BD2699 区 を 示 す 。 EC389Rif r 株 あ る い は BD2699Rif r 株 を 経 口 接 種した際に糞便中に排泄された接種菌の菌数を示す。 60 10 9 b 菌数 (Log CFU/g) 8 7 6 5 a 4 3 2 1 0 十二指腸 図 17 空腸 回腸 盲腸 結腸 直腸 剖 検 時 消 化 管 各 部 位 の EC389Rif r お よ び BD2699Rif r 数 バ ー は 左 が EC389 区 、 中 央 が BD2699 区 、 右 が 安 楽 殺 豚 を 示 す 。 a、 b 異 符 号 間 で 有 意 差 あ り ( p <0.05) 61 62 EC389区 耐過豚 BD2699区 小計 EC389区 安楽殺豚 BD2699区 小計 肝臓 0/3 0/1 0/4 0/1 0/2 0/3 肺 0/3(a) 0/1 0/4 1/1 1/2 2/3 0/3 0/1 0/4 0/1 1/2 1/3 腎臓 0/3 0/1 0/4 0/1 0/2 0/3 心臓 0/3 0/1 0/4 0/1 0/2 0/3 脾臓 0/3 0/1 0/4 0/1 2/2 2/3 扁桃 腸間膜 リンパ節 3/3 0/1 3/4 0/1 1/2 1/3 剖 検 時 各 種 臓 器 お よ び 血 液 か ら の 接 種 ETEC の 分 離 率 a:陽 性 検 体 数 /検 体 数 表6 NT NT NT 1/1 2/2 3/3 血清 63 糞便スコア ●●●● ● ● ●●● ● ●●●● ● ETEC-4 b, c ●●●●● ● 3 ●● 2 4 6 ●●●● ●●●●● ●●●●● 接種後日数 ●●●● b ●●●●● a ●●●●● a ●●●● 7 ●●● ● ●●●●● ●●●●● ● ●●● EC389Rif r 接 種 後 の 糞 便 性 状 の 推 移 ●●● b ●●●●● a ●●●●● a a ●●●● 8 ●●● ● ●●●●● ●●●●● ●●●● a、 b、 c: 異 符 号 間 で 有 意 差 を 示 す ( p <0.05) 糞便性状スコアは 0 が正常便、1 が軟便および 2 が下痢便を示す。 各区の糞便性状スコアの推移を示す。表中の●が供試豚 1 頭を示す。 図 18 a ●●●● ●● b ●●●●● a ●●●●● a a ●●●● a ●●●● ETEC-6 a, b ●●●● ETEC-8 2 陰性対照 c 1 0 ●●●● ●●●● 0 1 2 1 0 2 1 0 2 1 0 10 ●●● ● ●● ●● ● ●● ●● ● ●●● ● 12 ●●● ● ●●●● ● ●●● ●● ●●● ● EC389Rifr数 (Log CFU/g) 10 8 6 4 2 0 0 図 19 1 2 3 4 5 6 7 接種後日数 8 9 10 11 12 EC389Rif r 接 種 時 の 糞 便 中 接 種 EC389Rif r 数 の 推 移 ■ は ETEC-4 区 、▲ は ETEC-6 区 、● は ETEC-8 区 、◇ は 陰 性 対 照 区 を 示 す 。EC389Rif r 株 あ る い を 10 8 (ETEC-8 区 )、 10 6 (ETEC-6 区 )あ る い は 10 4 (ETEC-4 区 )CFU/頭 経 口 接 種 し た 際 に 糞 便 中 に 排 泄 さ れ た EC389Rif r 数 の 菌 数 を 示 す 。 64 10 9 EC389Rifr数 (Log CFU/g) 8 7 6 5 4 3 2 1 0 十二指腸 図 20 空調 回腸 盲腸 結腸 消 化 管 各 部 位 の EC389Rif r 数 バ ー は 左 か ら ETEC-4 区 、 ETEC-6 区 、 ETEC-8 区 を 示 す 。 65 直腸 【考察】 本 章 で は ETEC に よ る 下 痢 症 の 感 染 系 を 確 立 す る た め に 、 当 所 に 保 存 さ れ て い た 大 腸 菌 株 を 対 象 に 供 試 菌 株 の 選 抜 を 実 施 し た 。選 抜 さ れ 、そ の 後 の 感 染 試 験 に 供 試 さ れ た EC389Rif r 株 は 付 着 因 子 で あ る F4 遺 伝 子 、下 痢 原 性 毒 で あ る LT、 STⅠ お よ び STⅡ 遺 伝 子 を 保 有 し 、 そ れ ら の 内 F4 お よ び LT の 発 現 が 確 認 さ れ た 。 Katsuda ら が 我 が 国 の 哺 乳 豚 ・ 離 乳 豚 の 下 痢 便 か ら 分 離 し た 大 腸 菌 を 対 象 に 行 っ た 調 査 で は 、付 着 因 子 と 毒 素 の 組 み 合 わ せ で 最 も 多 か っ た パ タ ー ン が F4、 LT、 STⅠ お よ び STⅡ 遺 伝 子 を 保 有 し て い る も の で [22]、こ の パ タ ー ン は 本 研 究 で 感 染 試 験 に 供 試 し た EC389Rif r 株 と 同 じ で あ り 、 感 染 試 験 に 供 試 し た EC389Rif r 株 が 保 有 し て い る 付 着 因 子 お よ び 毒 素 の パ タ ー ン が 野 外 養 豚 場 に 浸 潤 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。一 方 、当 所 保存大腸菌株で最も多かった付着因子遺伝子および毒素遺伝子の保有パタ ー ン は F4、 LT お よ び STⅡ を 保 有 し て い る も の で あ っ た 。 Katsuda ら の 報 告で示された付着因子遺伝子および毒素因子遺伝子の保有パターンが当所 保 存 菌 株 の そ れ と 異 な っ て い た 理 由 と し て は 、 当 所 保 存 の 大 腸 菌 株 が 13 株 と 少 な か っ た こ と 、Katsuda ら と 当 所 保 存 菌 株 で は 分 離 さ れ た 時 期 、地 域 、 農場が異なっているためと考えられる。 豚を用いた大腸菌実験感染系では過去の報告と同様に接種後 1 日目ある い は 2 日 目 か ら 下 痢 の 発 現 が 認 め ら れ 、さ ら に 接 種 8 時 間 後 に は 糞 便 中 へ の 排 菌 も 確 認 さ れ た [81、82]。過 去 の 哺 乳 豚 を 用 い た 大 腸 菌 感 染 試 験 で は 1 頭 あ た り 10 8 CFU/頭 程 度 接 種 し て い る も の が 多 く 、 本 研 究 で 供 試 し た 接 種 菌 数 よ り 著 し く 多 い 。本 研 究 と そ れ ら 過 去 の 報 告 で は 、初 乳 を 摂 取 し て い な い 点 で は 一 致 す る 報 告 も あ る 。し か し 、哺 乳 豚 の 娩 出 方 法 が 、本 研 究 で は 帝 王 切 開 で 無 菌 的 に 行 い 、過 去 の 報 告 で は 通 常 通 り に 母 豚 か ら 分 娩 さ れ た 点 が 異 な っ て い る 。過 去 の 報 告 で は 分 娩 時 に 母 豚 や 環 境 中 の 菌 を 取 り 込 み 腸 内 菌 叢 が 形 成 さ れ た た め に 、い わ ゆ る 競 合 排 除 の よ う な 現 象 が 起 き [83]、無 菌 的 に 作 出 さ れ た 哺 乳 豚 と 比 較 し て 、感 染 成 立 に 多 量 の 感 染 菌 が 必 要 と な っ た と 考 えられる。 過去の豚を用いた大腸菌感染系では感染菌数と臨床症状や糞便中に排泄 66 さ れ る 菌 数 に つ い て の 報 告 は 多 く な い 。し か し 、過 去 の 報 告 で は 哺 乳 豚 で は 感 染 菌 数 が 10 8 CFU/頭 と 比 較 的 高 濃 度 に 接 種 し て い る[ 84、85]。ま た 、離 乳 豚 を 用 い た 感 染 系 で も 10 1 0 CFU/頭 と 高 濃 度 の ETEC を 接 種 し て い る こ と を 考 慮 す る と [86]、少 な い 接 種 菌 数 で は 感 染 が 成 立 し な い あ る い は 臨 床 症 状 が 認 め ら れ な か っ た と も 考 え ら れ る 。一 方 、本 研 究 で は 10 4 CFU/頭 の ETEC 接 種 で も 下 痢 が 発 現 し 、 糞 便 中 か ら も 安 定 し て ETEC が 検 出 さ れ た 。 こ れ は 、 本 研 究 で は CDCD 豚 が 用 い ら れ た 影 響 と 考 え ら れ る が 今 後 更 な る 検 討 が 必 要 で あ る 。さ ら に 、本 研 究 で は 感 染 菌 数 を 少 な く す る と 臨 床 症 状 の 発 現 お よ び 糞 便 中 へ の ETEC 排 泄 の 遅 延 が 示 さ れ た が 、 こ の こ と に つ い て も 接 種 ETEC が 少 な い と ETEC が 腸 管 内 で 発 症 レ ベ ル ま で 増 殖 す る の に 時 間 を 要したためとも考えられるが、更なる研究が必要となる。 本 研 究 で は 感 染 豚 の 糞 中 へ の 排 菌 数 は 10 8 CFU/g 程 度 で 安 定 し て お り 、過 去 の 報 告 で は 1 週 齢 健 康 豚 の 糞 便 中 で も 10 9 CFU/g 程 度 の 大 腸 菌 群 が 排 泄 さ れ て い る こ と か ら [ 87、 88]、 発 症 豚 で も 糞 便 中 の 大 腸 菌 数 は 著 し く 増 加 し て い な い こ と が 示 唆 さ れ た 。こ の こ と か ら 、ETEC に 対 す る 抗 菌 剤 代 替 物 質 の 効 果 を 評 価 す る 際 の 指 標 と し て 糞 便 中 ETEC 数 は 応 用 で き な い と 考 え ら れた。 剖 検 時 の 消 化 管 各 部 位 の ETEC 数 も 回 腸 よ り 下 部 の 消 化 管 で は 安 楽 殺 を 施 し た 豚 で も 、耐 過 豚 で も 10 8 CFU/g か ら 10 9 CFU/g 程 度 の ETEC が 検 出 さ れ て お り 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 一 方 、 接 種 し た ETEC の 2 株 の 内 、 死 亡 頭 数 が 少 な か っ た EC389 株 区 で は 回 腸 よ り 上 部 の 消 化 管 で は ETEC 数 が 減 少 し た が 、 も う 一 方 の BD2699 株 区 や 安 楽 殺 を 施 さ れ た 豚 で は 消 化 管 上 部 に 向 け て ETEC 数 の 減 少 は 認 め ら れ ず 、 十 二 指 腸 で は 安 楽 殺 し た 豚 と EC389 株 区 で 有 意 差 が 認 め ら れ た 。 過 去 の 報 告 で も ETEC の 発 症 に は 消 化 管 上 部 で の 増 殖 が 重 要 で あ る こ と が 報 告 さ れ て お り [89]、本 研 究 で も 消 化 管 上部で増殖した株や個体では臨床症状が強く発現したと考えられる。 本 研 究 で は ETEC を 接 種 し て い な い 陰 性 対 照 区 で も 下 痢 が 認 め ら れ た 。 本 研 究 を 実 施 し た 感 染 施 設 は 入 場 時 に は シ ャ ワ ー を 浴 び 、高 圧 蒸 気 滅 菌 に よ り 滅 菌 さ れ た 衣 類 の 着 用 が 行 わ れ て い る 。ま た 、持 ち 込 む 資 材 も 燻 蒸 あ る い は 浸 漬 に よ り 滅 菌 し て か ら 持 ち 込 ま れ て い る 。 更 に 、 入 気 口 に は HEPA フ 67 ィ ル タ ー が 設 置 さ れ 、各 室 は 陽 圧 に 保 た れ て い る 。そ の た め 外 部 か ら 病 原 体 が侵入したために陰性対照区で下痢が発生した可能性は低いと考えられる。 ま た 、本 研 究 で は 各 区 が 独 立 し た 部 屋 で 飼 育 さ れ て お り 、陰 性 対 照 区 の 給 餌 や 健 康 状 態 の 観 察 等 は 毎 回 一 番 最 初 に 実 施 さ れ て お り 、試 験 期 間 を 通 じ て 陰 性 対 照 区 か ら ETEC が 分 離 さ れ る こ と も な か っ た こ と か ら 、 ETEC が 誤 っ て 感 染 し た 可 能 性 も 低 い と 考 え ら れ る 。そ の た め 、陰 性 対 照 区 で の 下 痢 の 発 生は感染症によるものではなく、生理的な原因によるものと考えられた。 【小括】 本 章 で は 、 CDCD 豚 を 用 い て 豚 大 腸 菌 感 染 系 の 確 立 を 試 み 、 付 着 因 子 の F4、エ ン テ ロ ト キ シ ン の LT お よ び ST を 保 有 す る ETEC の EC389Rif r 株 を 選 抜 し 、感 染 系 に 供 試 す る こ と と し た 。EC389Rif r 株 を 10 4 CFU/頭 経 口 接 種 す る と 、接 種 後 2 日 目 に は 全 頭 で 下 痢 を 発 現 し 、糞 便 中 へ の 安 定 し た 排 菌 が 認められた。また、抗菌剤代替物質を評価する際の指標として糞便中の ETEC 数 で は な く 、 剖 検 時 の 小 腸 部 で の ETEC 数 の 方 が 活 用 で き る こ と が 示 唆 さ れ た 。 本 章 で は 14 日 間 の 観 察 期 間 を 設 け た が 、 試 験 用 代 用 乳 の 給 与 を 開 始 し た 11 日 目 以 降 に は ETEC 接 種 区 で も 糞 便 性 状 が 回 復 傾 向 に あ る こ と か ら 、観 察 期 間 を 試 験 用 代 用 乳 の 給 与 期 間 で あ る 7 日 間 程 度 に 設 定 す る こ とが望ましいと考えられた。 68 第五章 豚大腸菌感染系を用いた 乳酸添加飼料の評価 69 【緒言】 毒 素 原 性 大 腸 菌( ETEC)感 染 に よ る 豚 の 新 生 期 お よ び 離 乳 後 下 痢 症 の 対 策 に は 、 環 境 中 お よ び 豚 体 内 の 両 方 に お い て ETEC 数 を 減 少 さ せ る 必 要 が あ る 。 環 境 中 の ETEC 数 を 減 少 さ せ る た め に は 、 オ ー ル ア ウ ト の 実 施 、 豚 舎 や 豚 房 の 洗 浄 、 消 毒 お よ び 乾 燥 が 有 効 と さ れ て い る が [90] 、 末 吉 は 特 に ETEC が 乾 燥 に 弱 い こ と を 報 告 し て い る [ 67]。 一 方 、 豚 体 内 に お い て ETEC 数 の 増 加 を 抑 え る た め に は 、 ま ず 第 一 に 飼 養 環 境 の 改 善 が 挙 げ ら れ る [91]。飼 育 環 境 を 豚 の 適 温 に 調 整 す る こ と で 豚 大 腸 菌 症 に 改 善 が 認 め ら れ た 事 例 や 、隙 間 風 を 防 ぐ こ と も 有 効 と 報 告 さ れ て い る [92]。し か し 、ETEC に よ る 下 痢 が 発 生 し て い る 農 場 で は 、こ れ ら 飼 養 環 境 の 改 善 に 併 せ て 抗 菌 剤 に よ る 対 策 が 不 可 欠 と な っ て い る [92]。し か し な が ら 、 ETEC に も 薬 剤 耐 性 菌 の 出 現 が 認 め ら れ て お り [8]、 中 に は 複 数 の 抗 菌 剤 に 対 し て 耐 性 を 示 す 多 剤 耐 性 化 し た ETEC や [69]、我 が 国 で 特 に 慎 重 使 用 が 求 め ら れ て い る「 第 二 次 選 択 薬 」に 対 す る 耐 性 菌 の 出 現 も 報 告 さ れ て い る [93]。そ の た め 、農 場 で は 過 去 に ETEC 対 策 で 効 果 を 示 し た 抗 菌 剤 を 使 用 し て も 、ETEC が 耐 性 化 し た た め に 十 分 な 効 果 が 得 ら れ な い 例 も 出 て き て い る 。 また、消費者からは抗菌剤の使用量がより少ない畜産物が求められている。 そ の た め 、ETEC 対 策 に 有 効 な 抗 菌 剤 代 替 物 質 の 探 索 が 続 け ら れ て お り 、そ の開発も急務の課題として進められている。 ETEC 対 策 に 提 案 さ れ て い る 抗 菌 剤 代 替 物 質 等 に は 、 生 菌 剤 [ 75]、 有 機 酸 [ 1]、 ハ ー ブ 類 [ 31]、 鶏 卵 抗 体 [ 72、 94]、 飼 料 中 の 蛋 白 含 量 を 減 ら す 方 策 [ 95、 96]、 亜 鉛 [ 97] 等 が あ る 。 第 三 章 「 豚 サ ル モ ネ ラ ・ テ ィ フ ィ ム リ ウ ム 感 染 系 を 用 い た 乳 酸 添 加 飼 料 の 評 価 」で サ ル モ ネ ラ へ の 効 果 が 認 め ら れ た 乳 酸 等 の 有 機 酸 の ETEC に 対 す る 効 果 に つ い て は 、 Tsiloyiannis ら が 野 外 の ETEC に よ る 離 乳 後 下 痢 症 発 症 農 場 に お い て 、 1.6%乳 酸 添 加 飼 料 と 併 せ て 1.0%プ ロ ピ オ ン 酸 、1.2%ギ 酸 、1.2%リ ン ゴ 酸 、1.5%ク エ ン 酸 お よ び 1.5%フ マ ル 酸 添 加 飼 料 の 6 種 類 の 有 機 酸 添 加 飼 料 の ETEC に よ る 下 痢 の 発 現 、 死 亡 率 お よ び 糞 便 か ら の ETEC の 検 出 率 と 増 体 重 や 飼 養 効 率 を 比 較 し て い る [ 31]。 そ の 結 果 、 有 機 酸 添 加 飼 料 は 無 添 加 飼 料 よ り も 下 痢 の 発 現 、 70 事 故 率 お よ び 飼 養 効 率 等 で 改 善 が 認 め ら れ 、特 に 乳 酸 添 加 飼 料 に 改 善 が 認 め られたと報告されている。 Tsiloyiannis ら の 報 告 で は 乳 酸 の 作 用 機 序 に つ い て の 詳 細 な 検 討 は 行 わ れ な か っ た が 、Cole ら や Thomlinson ら は 有 機 酸 添 加 に よ り 消 化 管 内 の pH が 低 下 す る こ と を 見 出 し 、pH が 低 下 し た 結 果 ETEC の 増 殖 が 抑 制 さ れ る と 考 察 し て い る [98、99 ]。一 方 、Li ら は 豚 を 用 い た ETEC 実 験 感 染 で 、ETEC に 有 機 酸 添 加 飼 料 が 有 効 で あ る こ と を 報 告 し て い る が 、有 機 酸 添 加 飼 料 が 腸 管 の pH に は 影 響 を 与 え て い な い と 報 告 し て お り 、有 機 酸 添 加 飼 料 が 腸 内 菌 叢 に 影 響 を 与 え る こ と で ETEC に 効 果 を 示 す と 考 察 し て い る [ 100]。 こ の よ う に 、有 機 酸 添 加 飼 料 の 作 用 機 序 の 詳 細 に つ い て 、特 に 腸 管 内 pH 低 下 の 影響については明確にされていない。 そ こ で 、本 試 験 で は 乳 酸 添 加 飼 料 の 2 段 階 に 設 定 し 、ETEC に 対 す る 乳 酸 の 濃 度 に よ る ETEC に 対 す る 効 果 に つ い て 、 ETEC 感 染 系 で 検 証 す る と 共 に 、 乳 酸 添 加 飼 料 に よ る 消 化 管 内 の pH 低 下 に つ い て も 検 証 し た 。 【材料と方法】 供試豚:2 頭の母豚から帝王切開で作出され、初乳を摂取していない ( caesrean-derived and colostrum-derived) CDCD 豚 を 18 頭 供 試 し た 。 供 試 豚 は 作 出 日 に 4 区( 2%LA 区 、1%LA 区 、陽 性 対 照 区 お よ び 陰 性 対 照 区 ) に区分けされ、各区別の部屋で単飼ケージで飼育された。 供 試 菌 株 : 前 章 で 選 抜 し た EC389Rif r 株 を 供 試 し た 。 前 章 で は EC389Rif r を 1 頭 あ た り 4.3×10 4 CFU を 経 口 接 種 す る と 全 頭 で 下 痢 を 発 現 し 、 糞 便 中 か ら も 安 定 し て EC389Rif r が 検 出 さ れ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 接 種 菌 株 の 調 整 は 前 章 と 同 様 に 実 施 し た 。 す な わ ち 、 EC389Rif r を SCD 寒 天 培 地 で 培 養 し 、 発 育 し て き た コ ロ ニ ー を Minca ISO vitalex 寒 天 培 地 ( BBL Microbiology Systems Cookeysville, Md) に 継 代 、 塗 抹 し 、 37℃ で 一 晩 培 養 し た 。 そ の 後 、 Minca ISO vitalex に 発 育 し て き た コ ロ ニ ー を 掻 き 取 り 生 理 食 塩 水 に 懸 濁 し 、生 理 食 塩 水 に 菌 濃 度 を 調 整 し た 後 に 接 種 菌 液 と し 71 て供試した。 供 試 飼 料:陽 性 対 照 区 お よ び 陰 性 対 照 区 に は 機 能 性 飼 料 原 料 や 抗 菌 性 飼 料 添 加 物 を 含 ま な い 試 験 用 代 用 乳 ( SPF-LAC) を 供 試 し た 。 2%LA 区 で は 試 験 用 代 用 乳 に 乳 酸 を 2%添 加 し 、 1%LA 区 で は 試 験 用 代 用 乳 に 乳 酸 を 1% 添 加 し て 給 与 し た 。各 区 で は そ れ ぞ れ の 飼 料 を 作 出 当 日 か ら 試 験 終 了 ま で 給 与 し た。 感 染 試 験 : 供 試 豚 を 4 区 に 分 け 、 2%LA 区 ( n=5)、 1%LA 区 ( n=5)、 陽 性 対 照 区 ( n=5) お よ び 陰 性 対 照 区 ( n=3) に そ れ ぞ れ の 飼 料 を 作 出 日 か ら 給 与 し た 。 4 日 齢 時 に 2%LA 区 、 1%LA 区 お よ び 陽 性 対 照 区 で は EC389Rif r 株 を 1 頭 あ た り 5.1×10 3 CFU 経 口 接 種 し た 。 観 察 期 間 中 は 臨 床 症 状 の 観 察 を 毎 日 行 い 、糞 便 性 状 の ス コ ア 化 お よ び 糞 便 の 採 取 を 随 時 実 施 し た 。期 間 中 に 著 し い 脱 水 症 状 や 沈 鬱 が 認 め ら れ た 際 に は 、 ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル を 用 い た 安 楽 殺 を 施 し た 。接 種 後 7 日 目 に は 耐 過 豚 全 頭 の剖検を実施し、腸管内容物を採取した。 糞便性状のスコア化:糞便性状は随時スコア化して記録された。すなわち、 正 常 便 を ス コ ア 0、 軟 便 を ス コ ア 1、 下 痢 便 を ス コ ア 2 お よ び 水 様 便 を ス コ ア 3 とした。 糞 便 中 お よ び 消 化 管 内 容 物 中 の E. coli 389Rif r 数 の 測 定:観 察 期 間 中 の 糞 便 の 採 取 は 各 個 体 か ら 直 接 行 っ た 。 糞 便 は 採 取 後 す ぐ に EC389Rif r 数 の 測 定 を 行 っ た 。 菌 数 測 定 で は 糞 便 1g を PBS で 10 倍 段 階 希 釈 し 、 適 切 な 希 釈 段 階 の 糞 便 希 釈 液 を 100μ g/mL リ フ ァ ン ピ シ ン 含 有 DHL( RFDHL) に 塗 抹 し 、 37℃ で 24 時 間 培 養 後 に 発 育 し た 後 に 発 育 し た コ ロ ニ ー 数 を 計 測 し た 。 各 種 臓 器 に お け る E. coli 389Rif r の 分 離:剖 検 時 に は 肺 、肝 臓 、腎 臓 、心 臓 、 脾 臓 お よ び 扁 桃 を 採 取 し た 。観 察 期 間 中 に 安 楽 殺 を 施 し た 豚 か ら は 併 せ て 血 液 も 採 取 し た 。採 取 し た 血 液 以 外 の 臓 器 は 表 面 を 火 炎 滅 菌 し た 後 に 中 央 を 切 72 断 し 、そ の 割 面 を RFDHL 寒 天 培 地 に 接 種 し 37℃ 、24 時 間 培 養 後 の コ ロ ニ ー の 発 育 の 有 無 で 判 定 を 行 っ た 。 血 液 は 直 接 RFDHL 寒 天 培 地 に 塗 抹 し 、 37℃ 、 24 時 間 培 養 後 の コ ロ ニ ー の 有 無 で 判 定 を 行 っ た 。 消 化 管 内 容 物 の pH の 測 定 : 剖 検 時 に は 胃 、十 二 指 腸 、空 腸 、回 腸 、盲 腸 お よ び 結 腸 を 採 取 し た 。 採 取 後 の 各 部 位 の 内 容 物 は イ オ ン 交 換 水 で 10 倍 に 希 釈 し 、 希 釈 さ れ た 各 検 体 の pH を 測 定 し た 。 【結果】 臨床症状:陽性対照区では接種後 3 日目までに 5 頭中 3 頭が安楽殺され、 残 り の 2 頭 で も 4 日 目 以 降 で は 水 溶 性 下 痢 が 観 察 さ れ た( 図 21)。1%LA 区 で は 接 種 後 3 日 目 に 5 頭 中 1 頭 が 安 楽 殺 さ れ た 。 1%LA 区 の 残 り の 4 頭 で も糞便性状の悪化は観察され、2 頭で水溶性下痢、1 頭で下痢、1 頭で軟便 が 観 察 さ れ た 。一 方 、2%LA 区 で は 全 頭 が 生 存 耐 過 し 、糞 便 性 状 の 悪 化 も 下 痢および軟便がそれぞれ 1 および 2 回観察されるにとどまった。 陰 性 対 照 区 で は 接 種 後 3 日 目 を ピ ー ク に 軟 便 が 観 察 さ れ た が 、試 験 期 間 を 通じて下痢は観察されなかった。 糞 便 中 の EC389Rif r 数 の 推 移:糞 便 中 の EC389Rif r 数 が ピ ー ク の 10 1 0 CFU/g 程 度 ま で 増 加 し た の は 、陽 性 対 照 区 で は 接 種 後 2 日 目 、1%LA 区 お よ び 2%LA 区 で は 接 種 後 3 日 目 と な っ た ( 図 22 )。 接 種 後 3 日 目 以 降 は 全 区 と も 10 1 0 CFU/g 程 度 の EC389Rif r が 試 験 終 了 ま で 継 続 し て 検 出 さ れ た 。 剖 検 時 腸 管 内 容 物 中 の EC389Rif r 数:胃 で は 陽 性 対 照 区 で は 4.1×10 6 CFU/g の EC389Rif r 数 が 認 め ら れ 、2%LA 区 で は 全 頭 が 検 出 限 界 以 下 と な り 、両 者 の 間 で 有 意 差 が 認 め ら れ た( 図 23)。ま た 、胃 よ り 下 部 の 消 化 管 各 部 位 で も 2%LA 区 の 方 が 、1%LA 区 お よ び 陽 性 対 照 区 よ り 少 な い EC389Rif r 数 を 示 し て お り 、 十 二 指 腸 で は 陽 性 対 照 区 と 2%LA 区 間 で 、 空 腸 で は 陽 性 対 照 区 と 2%LA 区 お よ び 1%LA 区 で そ れ ぞ れ 有 意 差 が 認 め ら れ た 。盲 腸 、結 腸 お よ び 73 直 腸 で の EC389Rif r 数 は 陽 性 対 照 区 お よ び 1%LA 区 で 2×10 9 CFU/g 程 度 を 示 し た 。一 方 、2%LA 区 で は 2×10 8 CFU/g 程 度 を 示 し 、陽 性 対 照 区 と 2%区 間で結腸および直腸内容物中で有意差が示された。 各 種 臓 器 に お け る EC389Rif r の 分 離 : 各 区 の 耐 過 豚 で は 殆 ど 全 て の 豚 の 臓 器 か ら EC389Rif r は 分 離 さ れ な か っ た (表 7)。 陽 性 対 照 区 の 耐 過 豚 で 肝 臓 、 腎 臓 お よ び 扁 桃 か ら そ れ ぞ れ 1 検 体 で EC389Rif r が 分 離 さ れ た が 、 そ れ ら は全て同一豚に由来していた。 一 方 、 安 楽 殺 豚 で は 肺 、 腎 臓 、 心 臓 、 脾 臓 お よ び 扁 桃 か ら EC389Rif r が 分 離 さ れ 、 4 頭 中 2 頭 で は 血 液 か ら も EC389Rif r が 検 出 さ れ た 。 剖 検 時 消 化 管 内 容 物 の pH: 各 区 の pH に 差 は 認 め ら れ ず 、 各 区 の 平 均 pH は 胃 で は 3.6 か ら 3.9 で 、十 二 指 腸 か ら 回 腸 に お け る 小 腸 で は 6.1 か ら 6.4、 盲 腸 か ら 直 腸 に お け る 大 腸 で は 6.6 か ら 7.5 を 示 し た ( 図 24)。 各 区 間 で 有 意差は認められなかった。 74 75 安楽殺 3 2 1 0 安楽殺 3 2 1 0 安楽殺 3 2 1 0 2 ●● 接種後日数 3 ●●● ● ● ●●● 4 ●●● ●● ●●● 5 ●● ● ●● ●●● ● ●● ● ● ●●●● ● 6 ●● ● ●● ●●● ●● ● ● ● ●●●●● EC389Rif r 株 接 種 時 の 糞 便 性 状 の 推 移 1 0 図 21 ●●● ● ● ● ●● ●● ●● ●● ● ● ●●● ● ● ● ● ●●●●● ●● ● ●●●● ● ● ●●●● ● ●● ●●●●● ●●●●● ●●● 陰性対照 ●●●●● 陽性対照 ●●●●● 1% LA 安楽殺 2% LA 3 2 1 ●●●●● 0 糞便性状スコアは 0 が正常便、1 が軟便 2 が下痢便および 3 が水様性下痢を示す。 各区の糞便性状スコアの推移と剖検頭数を示す。表中の●が供試豚 1 頭を示す。 糞便スコアと安楽殺豚の頭数 EC389Rifr数 (Log CFU/g) 12 10 8 6 a 4 2 b 0 0 1 2 3 4 5 接種後日数 図 22 EC389Rif r 接 種 時 の EC389Rif r 数 の 推 移 ■ が 2%LA 区 、 ▲ が 1%LA 区 、 ● が 陽 性 対 照 区 お よ ◇ が 陰 性 対 照 区 を 示 す 。 a、 b 異 符 号 間 で 有 意 差 あ り ( p <0.05) 76 10 a a (Log CFU/g) 8 EC389Rifr数 9 4 b a a 7 a b b 6 a b b b 5 3 2 1 0 b 胃 十二指腸 図 23 空腸 回腸 盲腸 結腸 直腸 消 化 管 各 部 位 に お け る EC389Rif r 数 バ ー は 左 か ら 青 色 が 2%LA 区 、 赤 色 が 1%LA 区 お よ び 黒 色 が 陽 性 対 照 区 を そ れぞれ示す。 a、 b 異 符 号 間 で 有 意 差 あ り ( p <0.05) 77 78 肺 0/5 0/4 1/2 0/3 1/14 0/1 0/3 0/4 肝臓 0/5 0/4 1/2 0/3 1/14 0/1 2/3 2/4 腎臓 0/5 0/4 0/2 0/3 0/14 0/1 1/3 1/4 心臓 0/5 0/4 0/2 0/3 0/14 0/1 1/3 1/4 脾臓 0/5 0/4 1/2 0/3 1/14 1/1 1/3 2/4 扁桃 臓 器 、 組 織 お よ び 血 清 か ら の EC389Rif r 分 離 率 2%LA 0/5 1%LA 0/4 陽性対照 0/2 陰性対照 0/3 小計 0/14 安楽殺豚 1%LA 0/1 陽性対照 1/3 小計 1/4 耐過豚 表7 0/1 2/3 2/4 NT NT NT NT 血清 8 7 pH 6 5 4 3 2 1 0 胃 十二指腸 図 24 空腸 回腸 盲腸 結腸 直腸 消 化 管 各 部 位 に お け る pH バ ー は 左 か ら 青 色 が 2%LA 区 、赤 色 が 1%LA 区 、黒 色 が 陽 性 対 照 区 お よ び グ レーが陰性対照区をそれぞれ示す。 79 【考察】 本 章 で は 、第 四 章「 豚 大 腸 菌 感 染 系 の 確 立 」で 確 立 し た 豚 大 腸 菌 感 染 系 を 用 い て 、2%お よ び 1%乳 酸 添 加 飼 料 の 下 痢 症 緩 和 に 対 す る 評 価 を 行 っ た 。そ の 結 果 、 1%乳 酸 添 加 飼 料 で は ETEC 感 染 に よ る 糞 便 性 状 の 悪 化 が 遅 延 し 、 2%乳 酸 添 加 飼 料 で は 糞 便 性 状 が 悪 化 せ ず 、 剖 検 時 の 消 化 管 各 部 位 の ETEC 数 も 減 少 し て い た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 2%乳 酸 添 加 飼 料 が ETEC 対 策 に 有 効 で あ る こ と が 示 唆 さ れ る と 共 に 、第 四 章 で 確 立 し た 豚 大 腸 菌 感 染 系 の 抗 菌 剤代替評価への有用性が示された。 本 試 験 は 第 四 章 で 確 立 し た 大 腸 菌 感 染 系 を 用 い て 実 施 し た が 、陽 性 対 照 区 で は 第 四 章 と 同 様 に ETEC 接 種 翌 日 に は 糞 便 性 状 の 悪 化 と 、 糞 便 中 へ の ETEC の 排 泄 が 認 め ら れ た 。さ ら に 、接 種 後 2 日 目 に は 糞 便 中 へ の 排 菌 数 が ほ ぼ ピ ー ク に 到 達 し た が 、こ れ は 感 染 後 数 日 で 糞 便 中 へ の 排 泄 が ほ ぼ ピ ー ク に 達 し た 第 四 章 の 陽 性 対 照 区 と 同 様 で あ る 。ま た 、剖 検 時 の 消 化 管 各 部 位 の ETEC 数 は 盲 腸 、結 腸 お よ び 直 腸 で は 第 四 章 と 同 様 に ほ ぼ 一 定 の 菌 数 を 示 し て い た が 回 腸 よ り 上 部 の 消 化 管 で は 、第 四 章 の 1.接 種 菌 株 の 検 討 と 同 様 に 十 二 指 腸 、 空 腸 お よ び 回 腸 で も 比 較 的 高 い ETEC 数 が 測 定 さ れ た 。 一 方 、 第 四 章 の 2.接 種 菌 数 の 検 討 で は 盲 腸 よ り 上 部 の 消 化 管 で は ETEC 数 が 減 少 し て い た 。こ れ は 第 四 章 の 2.接 種 菌 数 の 検 討 で は 剖 検 時 に 臨 床 症 状 が 回 復 していたためと考えられる。 本 試 験 で は 乳 酸 の 添 加 濃 度 を 2%と 1%の 2 段 階 に 設 定 し 、 乳 酸 の 添 加 濃 度 に つ い て も 検 討 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 乳 酸 1%添 加 で は 糞 便 性 状 の 悪 化 が 遅 延 し 、 乳 酸 2%添 加 で は 糞 便 性 状 の 悪 化 が 認 め ら れ な か っ た 。 こ の こ と か ら 、乳 酸 添 加 濃 度 が 高 い 方 が 糞 便 性 状 の 悪 化 を 抑 制 す る 効 果 が 強 い こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、 消 化 管 各 部 位 の 菌 数 も 乳 酸 2%添 加 の 方 が 乳 酸 1%添 加 よ り も 少 な い 菌 数 で 推 移 し 、特 に 上 部 消 化 管 で は 大 幅 な 減 少 が 認 め ら れ 、消 化 管 で の ETEC の 増 殖 を 抑 制 す る 効 果 も 乳 酸 添 加 濃 度 が 高 い 方 が 強 い こ と が 示 唆 さ れ た 。 ETEC 感 染 の 発 症 時 に は 上 部 消 化 管 で ETEC が 増 殖 し て い る こ と が 知 ら れ て お り [89]、 乳 酸 2%添 加 に は 消 化 管 で の ETEC の 増 殖 を 抑 制 したために糞便性状が悪化しなかったとものと考えられる。 80 一 方 、 糞 便 中 に 排 泄 さ れ る ETEC 数 は 乳 酸 2%添 加 と 乳 酸 1%添 加 で 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 こ れ は 剖 検 時 に 直 腸 で 乳 酸 2%添 加 と 1%添 加 で ほ ぼ 同 程度の菌数を示していたことと一致する。 乳 酸 の 殺 菌 作 用 は 周 囲 の pH が 4.0 で は 発 揮 さ れ る が 、 4.4 で は 発 揮 さ れ な い と 報 告 さ れ て お り [60]、 本 研 究 に お け る 剖 検 時 の pH か ら 、 胃 で は 殺 菌 作 用 が 期 待 で き る が 、 十 二 指 腸 よ り 下 部 の 消 化 管 で は pH6.0 以 上 で あ る た め 、 乳 酸 の 殺 菌 作 用 は 胃 で 発 揮 さ れ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 Li ら も 胃 、 十 二 指 腸 、 回 腸 の pH を そ れ ぞ れ 3.27、 5.75、 6.94 と 報 告 し て い る [100]。 今 回 の 研 究 で は 、 胃 お よ び 腸 管 の pH に 乳 酸 の 影 響 は 認 め ら れ な か っ た 。 2%乳 酸 添 加 飼 料 が ETEC に よ る 糞 便 性 状 の 悪 化 を 軽 減 で き た こ と の 理 由 の 一 つ と し て 、乳 酸 の 添 加 濃 度 が 高 い 2%の 方 が 胃 で 殺 菌 さ れ る ETEC が 多 か っ た ためと考えられる。 一 方 、 第 三 章 で 実 施 し た Salmonella Typhimurium 感 染 系 を 用 い た 乳 酸 添 加 飼 料 の 評 価 で は 、 2.8%乳 酸 添 加 飼 料 が 糞 便 中 の S . Typhimurium 数 を 著 し く 低 下 さ せ る こ と が わ か っ た が 、 本 章 で も 2%乳 酸 添 加 飼 料 区 で は 盲 腸 以 下 の 大 腸 で は ETEC 数 は 減 少 さ せ た が 、S. Typhimuirum で 観 察 さ れ た 程 の 著 し い ETEC 数 の 低 下 は 認 め ら れ な か っ た 。 こ の 異 な る 結 果 は 、 病 原 体 や 供 試 豚 の 影 響 と 考 え ら れ る が 、詳 細 に つ い て は 今 後 の 更 な る 検 討 が 必 要 で ある。 【小括】 第 四 章 で 確 立 さ れ た 、豚 大 腸 菌 感 染 系 を 用 い て 乳 酸 添 加 飼 料 の 評 価 を 実 施 し た 。そ の 結 果 、2%添 加 飼 料 を 給 与 し た 群 で は 、糞 便 中 へ 排 泄 さ れ る ETEC 数 は 低 下 し な か っ た が 糞 便 性 状 の 悪 化 が 抑 制 さ れ 、接 種 後 7 日 目 に 実 施 し た 剖 検 で は 2%乳 酸 添 加 飼 料 し た 区 の 小 腸 上 部 で の ETEC 数 が 低 下 し て い た 。 こ れ ら の こ と か ら 乳 酸 を 2%添 加 す る こ と で 豚 大 腸 菌 症 の 発 現 を 抑 制 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。ま た 、本 研 究 で 確 立 し た 豚 大 腸 菌 感 染 系 が 、抗 菌 剤 代 替 物 の評価に応用できることが示唆された。 81 第六章 総括 82 本研究では抗菌剤に依存しないサルモネラおよび大腸菌感染症対策の確 立 に 不 可 欠 な S . Typhimurium( ST) お よ び 毒 素 原 性 大 腸 菌 ( ETEC) 感 染 系を豚において確立し、その有用性を乳酸添加飼料で検証した。その結果、 乳 酸 添 加 飼 料 が 豚 ST 感 染 系 お よ び 豚 ETEC 感 染 系 に お い て そ の 抑 制 効 果 が 示 さ れ た 。こ の こ と か ら 、本 研 究 で 確 立 し た 感 染 系 の 有 用 性 が 検 証 で き 、ま た、乳酸添加飼料が抗菌剤代替物質として活用できることが示唆された。 具 体 的 に は 第 二 章 で は 、 豚 を 用 い た ST 感 染 系 の 確 立 を 試 み 、 供 試 し た ST116Rif r 株 を 10 9 CFU/頭 程 度 経 口 感 染 さ せ る と 下 痢 や 著 し い 脱 水 症 状 を 示 し 、10 7 CFU/頭 程 度 経 口 感 染 さ せ る と 下 痢 や 軟 便 を 、ま た 10 5 CFU/頭 程 度 感 染 さ せ る と 軟 便 程 度 の 糞 便 性 状 の 悪 化 を 示 す こ と が 示 唆 さ れ た 。一 方 、感 染 菌 数 が 10 4 CFU/頭 で も 糞 便 中 か ら は 安 定 し て ST116Rif r が 検 出 さ れ た 。本 試 験 で は 糞 便 性 状 に よ り 糞 便 に 含 ま れ る ST116Rif r 数 が 異 な る こ と も 示 唆 さ れ 、今 後 の 抗 菌 剤 代 替 物 質 の 評 価 試 験 で は 臨 床 症 状 の 観 察 と 糞 便 中 の 菌 数 を 測 定 す る こ と で 、臨 床 症 状 を 抑 え る 効 果 と 、豚 群 内 で の 感 染 拡 大 を 防 止 で きるかを考察できる結果を得られると考えられた。 第 三 章 で は 、 第 二 章 で 確 立 し た 豚 ST 感 染 系 を 用 い て 乳 酸 2.8%添 加 飼 料 の 評 価 を 行 っ た 。そ の 結 果 、臨 床 症 状 を 伴 う サ ル モ ネ ラ 症 を 再 現 し た 実 験 感 染 系 で は 2.8%乳 酸 添 加 飼 料 が 糞 便 性 状 の 悪 化 を 抑 制 し 、 糞 便 中 へ の サ ル モ ネ ラ 排 菌 数 も 減 少 さ せ る こ と が 明 ら か と な っ た 。ま た 、不 顕 性 の サ ル モ ネ ラ 感染を再現した実験感染系でも糞便中へのサルモネラ排菌数を減少させる こ と が 明 ら か と な っ た 。こ れ ら の 結 果 か ら 、豚 ST 感 染 系 が 確 立 さ れ 、抗 菌 剤代替物質の評価に応用できることが示唆された。 第 四 章 で は 、 安 定 し た ETEC 感 染 系 を 確 立 す る た め に 、 CDCD 豚 を 用 い て 豚 大 腸 菌 感 染 系 の 確 立 を 試 み 、EC389Rif r を 1 頭 あ た り 10 4 CFU 経 口 接 種 す る こ と で 、全 頭 で 下 痢 が 発 現 し 、糞 便 中 か ら も 安 定 し た 排 菌 が 認 め ら れ た 。 し か し 、 ETEC 非 接 種 の 対 照 群 で も 糞 便 性 状 の 悪 化 が 認 め ら れ た こ と 、 14 日 間 の 観 察 期 間 で は ETEC 接 種 の 陽 性 対 照 区 で も 糞 便 性 状 が 回 復 傾 向 に あ る こ と か ら 、観 察 期 間 を 試 験 用 代 用 乳 の 給 与 期 間 で あ る 7 日 間 程 度 に 設 定 す ることが望ましいと考えられた。 第 五 章 で は 、第 四 章 で 確 立 さ れ た 、豚 大 腸 菌 感 染 系 を 用 い て 乳 酸 添 加 飼 料 83 の 評 価 を 実 施 し た 。 そ の 結 果 、 2.0%乳 酸 添 加 飼 料 を 給 与 し た 区 で は 、 糞 便 中 へ 排 泄 さ れ る ETEC 数 は 低 下 し な か っ た が 糞 便 性 状 の 悪 化 が 抑 制 さ れ 、 接 種 後 7 日 目 に 実 施 し た 剖 検 で は 2%乳 酸 添 加 飼 料 し た 区 の 小 腸 上 部 で の ETEC 数 が 低 下 し て い た 。 こ れ ら の こ と か ら 乳 酸 を 2%添 加 す る こ と で 豚 大 腸 菌 症 の 発 現 を 抑 制 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。ま た 、本 研 究 で 確 立 し た 豚 大 腸 菌感染系が、抗菌剤代替物の評価に応用できることが示唆された。 2013 年 10 月 か ら 我 が 国 で も 大 流 行 し 、ア ジ ア 各 国 お よ び 米 国 で も 同 様 に 猛 威 を 振 る っ て い る て い る 豚 流 行 性 下 痢 は 、原 因 病 原 体 が ウ イ ル ス と 本 研 究 と は 異 な る も の の 、的 確 な 生 物 学 的 製 剤 が な く 、ワ ク チ ン 製 造 も 追 い つ か な い 状 況 下 で 、 そ の 発 生 件 数 も 急 激 に 増 加 し 蔓 延 し 続 け て い る [101]。 こ の 様 な流行性疾病の予防には、日頃からの家畜の健全育成が重要なカギとなる。 本 研 究 に よ っ て 得 ら れ た 知 見 は 、薬 剤 に 依 存 し な い 健 全 畜 産 の 技 術 向 上 に つ な が り 、安 全・安 心 な 畜 産 食 品 の 持 続 的 供 給 か ら ヒ ト の 健 康 生 活 の 向 上 に 貢 献するものと期待される。 84 論文目録 主論文 Tsuyoshi Tanaka*, Yasuo Imai, Naosuke Kumagae, Takashi Sasaki, Narutoshi Ochiai, Katsuyoshi Uruno, Haruki Kitazawa, Tadao Saito and Shizuo Sato (2014) Quantitative Microbiological Evaluation of Salmonella Typhimurium shed in Diarrhea, Loose, and Normal Stools of Infected Pigs. Open Journal of Veterinary Medicine 4(4), 58-66 (査 読 有 ) Tsuyoshi Tanaka*, Yasuo Imai, Naosuke Kumagae, Takashi Sasaki, Narutoshi Ochiai, Haruki Kitazawa and Shizuo Sato Establishment of ETEC experimental infection model of CDCD pigs and evaluate the effect of lactic acid supplemented feed. Open Journal of Animal Science (投 稿 予 定 ) その他の公表論文 田 中 剛 志 *, 北澤春樹 (2013) 冬場の呼吸器病に打ち勝つ 月 号 :17-20 (査 読 無 ) 85 養豚の友 11 参考文献 1 . Aarestrup, Frank Møller. (1999). Association between the consumption of antimicrobial agents in animal husbandry and the occurrence of resistant bacteria among food animals. International journal of antimicrobial agents 12.4. 279-285. 2.Bywater, R. J. (2004). Veterinary use of antimicrobials and emergence of resistance in zoonotic and sentinel bacteria in the EU. Journal of Veterinary medicine, Series B, 51(8‐ 9), 361-363. 3.Hsueh, P. R., Teng, L. J., Tseng, S. P., Chang, C. F., Wan, J. H., Yan, J. J.,Lee, C. M., Chuang, Y. C., Huang, W. K., Yang, D., Shyr, J. M., Yu, K. W., Wang, L. S., Lu, J. J., Ko, W. C., Wu, J. J., Chang, F. Y., Lau, Y. L., Liu, Y. C., Liu, C. Y. Ho, S. W. and Luh, K. T. (2004). Ciprofloxacin-resistant Salmonella enterica Typhimurium and Choleraesuis from pigs to humans, Taiwan. Emerging infectious diseases, 10(1), 60-68. 4. 最 新 デ ー タ 動物用抗菌剤マニュアル 第 2 版 動物用抗菌剤研究会編 interzoo 185-199 ル 動 物 用 抗 菌 剤 を め ぐ る 国 際 動 向 ” 5.川 嶌 健 司 (2008) ぐ デ ン マ ー ク で の 抗 菌 性 飼 料 添 加 物 禁 止 後 の 現 状 と 取 り 組 み ” All About Swine, 32. 22-25 6. DANMAP (2013) ““ 013)2-25Swine,止 後 の 現 状 と 取 り 組 み ” seng, S. P., Cha 7. Takahashi T. Asai T., Kojima A, harada K., Ishihara K., Morioka A., Kijima M. and Tamura Y. "Present situation of national surveillance of antimicrobial resistance in bacteria isolated from farm animals in Japan and correspondence to the issue." Kansenshogaku zasshi. The Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases 80.3 (2006): 185-195. 86 8. Asai, T., Kojima, A., Harada, K., Ishihara, K., Takahashi, T., and Tamura, Y. (2005). Correlation between the usage volume of veterinary therapeutic antimicrobials and resistance in Escherichia coli isolated from the feces of food-producing animals in Japan. Japanese journal of infectious diseases, 58(6), 369. 9. 深 沢 茂 樹 、 深 沢 巨 樹 .“ 抗 生 物 質 の 汎 用 と 抗 生 物 質 不 使 用 食 品 の 展 望 .生 城 西 国 際大学紀要 21.8. (2013),17-28 10.金 山 紀 久 、仙 北 谷 康 、窪 田 さ と 子 、樋 口 昭 則 、中 川 隆( 2007)抗 菌 剤 無 添 加 飼 料 に よ る 養 豚 経 営 の 現 段 階 、 農 業 経 営 研 究 、 45( 1)、 51-55 11.農 林 水 産 省 動物薬医薬品検査所 ( 2012) 動 物 用 医 薬 品 等 販 売 高 年 報( 別 冊) 12. 金 田 正 彦 、 岡 田 宗 典 、 鷺 谷 敏 一 、 佐 々 木 隆 志 (2009) PCV2 ワ ク チ ン が 農 場 の 病 原 体 浸 潤 動 向 に 与 え た 影 響 、 豚 病 研 究 会 報 、 55、 13-15 13. Jiffer J. Zimmerman, Locke A. Karriker, Alejandro Ramirez, Kent J. Schwartz and regory W. Stevenson (2012), Salmonella, Diseases of Swine, 10th Edition, 739-754. 14. Jiffer J. Zimmerman, Locke A. Karriker, Alejandro Ramirez, Kent J. Schwartz and regory W. Stevenson (2012), Escherichia coli infedtions, Diseases of Swine, 10th Edition, 639-674. 15. C. Sakano, Y. Morita, K. Goto, Y. Yokota, H. Annaka, M. Fujita, S. Kobatake, T. Ishioka, T. Hoshino, S. Boonmar, S. Pulsrikarn, A. Nishina, K. Kozawa, S. Yamamoto and H. Kimura (2011), “Prevalence and Genotype of Salmonella Choleraesuis in Gunma Prefecture, Japan,” Thai Journal of Veterinary Medicine, Vol. 41, No. 3, 321-326. 87 16. Asai, T., Otagiri, Y., Osumi, T., Namimatsu, T., Hirai, H., & Sato, S. (2002). Isolation of Salmonella from diarrheic feces of pigs. The Journal of veterinary medical science/the Japanese Society of Veterinary Science, 64(2), 159-160. 17.Steinbach, G., & Hartung, M. (1999). [Attempt to estimate the share of human Salmonella infections, which are attributable to Salmonella originating from swine]. Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift, 112(8), 296-300. 18.Nielsen, B., Alban, L., Stege, H., Sørensen, L. L., Møgelmose, V., Bagger, J., ... & Baggesen, D. L. (2000). A new Salmonella surveillance and control programme in Danish pig herds and slaughterhouses. Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift, 114(9-10), 323-326 19.Dahl, J., Wingstrand, A., Nielsen, B., & Baggesen, D. L. (1997). Elimination of Salmonella typhimurium infection by the strategic movement of pigs. Veterinary record, 140(26), 679-681. 20.Kure, K. (2007). Field Experience of Eradication of Salmonella Typhimurium in Swine Farrow to Finish Farms in Japan Proc, Jpn. Pig Vet Soc 51, 19-24 21 . Esaki, H., Morioka, A., Ishihara, K., Kojima, A., Shiroki, S., Tamura, Y., & Takahashi, T. (2004). Antimicrobial susceptibility of Salmonella isolated from cattle, swine and poultry (2001–2002): report from the Japanese Veterinary Antimicrobial Resistance Monitoring Program. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 53(2), 266-270. 22. Katsuda, K., Kohmoto, M., Kawashima, K., & Tsunemitsu, H. (2006). Frequency of enteropathogen detection in suckling and weaned pigs with diarrhea in Japan. Journal of veterinary diagnostic investigation, 18(4), 350-354. 88 23 . Harada, K., Asai, T., Kojima, A., Sameshima, T., & Takahashi, T. (2007). Contribution of Multi‐ Antimicrobial Resistance to the Population of Antimicrobial Resistant Escherichia coli Isolated from Apparently Healthy Pigs in Japan. Microbiology and immunology, 51(5), 493-499. 24 . Vondruskova, H., Slamova, R., Trckova, M., Zraly, Z., & Pavlik, I. (2010). Alternatives to antibiotic growth promoters in prevention of diarrhoea in weaned piglets: a review. Veterinarni Medicina, 55(5), 199-224. 25. 財 団 法 人 畜 産 生 物 科 学 安 全 研 究 所 ( 平 成 15 年 ) 抗 菌 剤 非 依 存 型 畜 産 の ガ イ ド ライン〔農畜産業振興事業団指定助成事業 農林水産省生産振興総合対策事業〕 26. Jacela, J. Y., DeRouchey, J. M., Tokach, M. D., Goodband, R. D., Nelssen, J. L., Renter, D. G., & Dritz, S. S. (2013). Feed additives for swine: Fact sheets–prebiotics and probiotics, and phytogenics. 27. Jacela, J. Y., DeRouchey, J. M., Tokach, M. D., Goodband, R. D., Nelssen, J. L., Renter, D. G., & Dritz, S. S. (2013). Feed additives for swine: Fact sheets – acidifiers and antibiotics 28 . 厚 生 労 働 省 、 平 成 13 年 、 保 健 機 能 食 品 制 度 の 創 設 に 伴 う 特 定 保 健 用 食 品 の 取 り扱い等について 29. Kirsi H. Partanen and Zdzislaw Mroz, 1999, Organic acids for performance enhancement in pig diets, Nutrition research Reviews, 12, 117-145 30. Jorgensen、L. 2002, Weaner feed that reduces Salmonella: the effects of the form ot the feed and of addition of lactic acid on the prevalence of Salmonella, Lawsonia, gastro-intestinal health, and productivity. Danish Pig Production, Report. no. 543. 89 31.Tsiloyiannis, V. K., Kyriakis, S. C., Vlemmas, J., & Sarris, K. (2001). The effect of organic acids on the control of porcine post-weaning diarrhoea. Research in veterinary science, 70(3), 287-293. 32.財 団 法 人 畜産技術協会 年度食品安全確保総合調査 平 成 22 年 内閣府食品安全委員会事務局 平 成 21 食品により媒介される感染症等に関する文献調査報 告書 33. 厚 生 労 働 省 34.厚 生 労 働 省 食中毒事件一覧速報 平 成 24 年 平 成 23 年 度 食 品 の 食 中 毒 菌 汚 染 実 態 調 査 の 結 果 に つ いて 35. Österberg, J., Lewerin, S. S., & Wallgren, P. (2010). Research Direct and indirect transmission of four Salmonella enterica serotypes in pigs. 36.Rostagno, M. H., Eicher, S. D., & Lay Jr, D. C. (2011). Immunological, physiological, and behavioral effects of Salmonella enterica carriage and shedding in experimentally infected finishing pigs. Foodborne pathogens and disease, 8(5), 623-630. 37.Hurd, H. S., Gailey, J. K., McKean, J. D., & Rostagno, M. H. (2001). Rapid infection in market-weight swine following exposure to a Salmonella Typhimurium-contaminated environment. American journal of veterinary research, 62(8), 1194-1197. 38. Osterberg, J., & Wallgren, P. (2008). Effects of a challenge dose of Salmonella Typhimurium or Salmonella Yoruba on the patterns of excretion and antibody responses of pigs. The Veterinary Record, 162(18), 580-586. 39. Tanaka T, imai Y, Kumagae N and Sato S. ( 2010) The effect of feeding lactic acid to Salmonella Typhimuirum experimentally infected swine. Journal of Veterinary Medicine, 90 72 (7), 827-831. 40. Asten, A. J., & Dijk, J. E. (2005). Distribution of “classic” virulence factors among Salmonella spp. FEMS Immunology & Medical Microbiology, 44(3), 251-259. 41. Namimatsu T, Asai T, Osumi T, Imai Y, and Sato S. (2006) Prevalence of the virulence plasmid in Salmonella Typhimuirum isolates from pigs. Journal of Veterinary Medical Science, 68, 187-188. 42. Loynachan, A. T., & Harris, D. L. (2005). Dose determination for acute Salmonella infection in pigs. Applied and environmental microbiology, 71(5), 2753-2755. 43. Boyen, F., Pasmans, F., Van Immerseel, F., Donné, E., Morgan, E., Ducatelle, R., & Haesebrouck, F. (2009). Porcine in vitro and in vivo models to assess the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium for pigs. Laboratory animals, 43(1), 46-52. 44. Proux, K., Cariolet, R., Fravalo, P., Houdayer, C., Keranflech, A., & Madec, F. (2001). Contamination of pigs by nose-to-nose contact or airborne transmission of Salmonella Typhimurium. Veterinary research, 32(6), 591-600. 45. Pires, A. F., Funk, J. A., Lim, A., & Bolin, S. R. (2013). Enumeration of Salmonella in Feces of Naturally Infected Pigs. Foodborne pathogens and disease, 10(11), 933-937. 46.Fedorka-Cray, P. J., Whipp, S. C., Isaacson, R. E., Nord, N., & Lager, K. (1994). Transmission of Salmonella typhimurium to swine. Veterinary microbiology, 41(4), 333-344. 47.Boughton, C., Egan, J., Kelly, G., Markey, B., & Leonard, N. (2007). Rapid infection of pigs following exposure to environments contaminated with different levels of Salmonella Typhimurium. Foodborne pathogens and disease, 4(1), 33-40. 91 48. Kishima, M., Uchida, I., Namimatsu, T., Osumi, T., Takahashi, S., Tanaka, K., ... & Yamamoto, K. (2008). Nationwide surveillance of Salmonella in the faeces of pigs in Japan. Zoonoses and public health, 55(3), 139-144. 49.Asai, T., Esaki, H., Kojima, A., Ishihara, K., Tamura, Y., & Takahashi, T. (2006). Antimicrobial resistance in Salmonella isolates from apparently healthy food-producing animal from 2000 to 2003: the first stage of Japanese veterinary antimicrobial resistance monitoring (JVARM). The Journal of veterinary medical science/the Japanese Society of Veterinary Science, 68(8), 881-884. 50. Esaki, H., Morioka, A., Kojima, A., Ishihara, K., Asai, T., Tamura, Y., ... & Takahashi, T. (2004). Epidemiological Characterization of Salmonella Typhimurium DT104 Prevalent among Food‐ Producing Animals in the Japanese Veterinary Antimicrobial Resistance Monitoring Program (1999–2001). Microbiology and immunology, 48(7), 553-556. 51. Kawagoe K., Mine H., Asai T., Kojima A., Ishihara K., hsarada K., Ozawa M., Hidemasa I., Watanabe H., Honda E., Takahashi T. and Sameshima T., (2007), Changes of multi-drug resistance pattern in Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium isolated from food-producing animais in japan, Journal of veterinary medical science, 69, 1211-1213. 52.Malorny, B., Schroeter, A., & Helmuth, R. (1999). Incidence of quinolone resistance over the period 1986 to 1998 in veterinary Salmonella isolates from Germany. Antimicrobial agents and Chemotherapy, 43(9), 2278-2282. 53. Delsol, A. A., Woodward, M. J., & Roe, J. M. (2004). Effect of a 5 day enrofloxacin treatment on Salmonella enterica serotype Typhimurium DT104 in the pig. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 53(2), 396-398. 92 54. Wales, A. D., Cook, A. J. C., & Davies, R. H. (2011). Producing Salmonella-free pigs: a review focusing on interventions at weaning. Veterinary Record, 168(10), 267-276. 55. Hurd, H. S., Gailey, J. K., McKean, J. D., & Rostagno, M. H. (2000). Experimental rapid infection in market swine following exposure to a Salmonella contaminated environment. Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift, 114(9-10), 382-384. 56. Casey, P. G., Gardiner, G. E., Casey, G., Bradshaw, B., Lawlor, P. G., Lynch, P. B., ... & Hill, C. (2007). A five-strain probiotic combination reduces pathogen shedding and alleviates disease signs in pigs challenged with Salmonella enterica serovar Typhimurium. Applied and Environmental Microbiology, 73(6), 1858-1863. 57. Lee, M. H., Kwon, H., Kwon, D. Y., Park, H., Sohn, D. H., Kim, Y. C., ... & Lee, J. H. (2006). Antibacterial activity of medicinal herb extracts against Salmonella. International journal of food microbiology, 111(3), 270-275. 58.van Winsen, R. L., Lipman, L. J. A., Biesterveld, S., Urlings, B. A. P., Snijders, J., & van Knapen, F. (2001). Mechanism of Salmonella reduction in fermented pig feed. Journal of the Science of Food and Agriculture, 81(3), 342-346. 59.Tanaka, T., Imai, Y., Kumagae, N., Sasaki, T., Ochiai, N., Uruno, K,. Sato, S. (2014). Quantitative Microbiological Evaluation of Salmonella Typhimurium Shed in Diarrhea, Loose, and Normal Stools of Infected Pigs. Open Journal of Veterinary Medicine, 2014. 60. Jung, Y. S., & Beuchat, L. R. (2000). Sensitivity of multidrug-resistant Salmonella typhimurium DT104 to organic acids and thermal inactivation in liquid egg products. Food Microbiology, 17(1), 63-71. 93 61. Risley, C. R., Kornegay, E. T., Lindemann, M. D., Wood, C. M., & Eigel, W. N. (1992). Effect of feeding organic acids on selected intestinal content measurements at varying times postweaning in pigs. Journal of Animal Science, 70(1), 196-206. 62 . Ushida, K., Ushida, K., & Ushida, K. (2002). 13 C-NMR Studies on Lactate Metabolism in a Porcine Gut Microbial Ecosystem. Microbial ecology in health and disease, 14(4), 242-247. 63. Van Immerseel, F., Russell, J. B., Flythe, M. D., Gantois, I., Timbermont, L., Pasmans, F. & Ducatelle, R. (2006). The use of organic acids to combat Salmonella in poultry: a mechanistic explanation of the efficacy. Avian Pathology, 35(3), 182-188. 64.Callaway, T. R., Morrow, J. L., Edrington, T. S., Genovese, K. J., Dowd, S., Carroll, J. & Nisbet, D. J. (2006). Social stress increases fecal shedding of Salmonella typhimurium by early weaned piglets. Current issues in intestinal microbiology, 7(2), 65-72. 65. Wada, Y., Nakaoka, Y., Kondo, H., Nakazawa, M., & Kubo, M. (1996). Dual infection with attaching and effacing< i> Escherichia coli</i> and enterotoxigenic< i> Escherichia coli</i> in post-weaning pigs. Journal of comparative pathology, 114(1), 93-99. 66. 永 井 英 貴 ( 20119 説 12 日本で使用されている動物用ワクチン 豚用ワクチンの概 豚 大 腸 菌 性 下 痢 症 ワ ク チ ン( 不 活 化 ワ ク チ ン )及 び ク ロ ス ト リ ジ ウ ム・パ ー フ リ ン ゲ ン ス .感 染 症 ワ ク チ ン( 混 合 不 活 化 ワ ク チ ン ) 、日 本 獣 医 学 会 誌 、64、 194-197 67. Sueyoshi, M. (2006), edema disease with diarrkea of piglets (Enterotoxaemia by Eschetichia coli of piglets), Proceedings of Japan Pig Veterinary Society, 48, 7-13 94 68. Uemura, R., Sueyoshi, M., Nagayoshi, M., & Nagatomo, H. (2003). Antimicrobial Susceptibilities of Shiga Toxin‐ Producing Escherichia coli Isolates from Pigs with Edema Disease in Japan. Microbiology and immunology, 47(1), 57-61. 69. Mathew, A. G., Saxton, A. M., Upchurch, W. G., & Chattin, S. E. (1999). Multiple Antibiotic Resistance Patterns ofEscherichia coli Isolates from Swine Farms. Applied and environmental microbiology, 65(6), 2770-2772. 70. Tsiloyiannis, V. K., Kyriakis, S. C., Vlemmas, J., & Sarris, K. (2001). The effect of organic acids on the control of post-weaning oedema disease of piglets. Research in veterinary science, 70(3), 281-285. 71. Krause, D. O., Bhandari, S. K., House, J. D., & Nyachoti, C. M. (2010). Response of nursery pigs to a synbiotic preparation of starch and an anti-Escherichia coli K88 probiotic. Applied and environmental microbiology, 76(24), 8192-8200. 72. Imberechts, H., Deprez, P., Van Driessche, E., & Pohl, P. (1997). Chicken egg yolk antibodies against F18ab fimbriae of Escherichia coli inhibit shedding of F18 positive E. coli by experimentally infected pigs. Veterinary microbiology, 54(3), 329-341. 73. Yokoyama, H., Hashi, T., Umeda, K., Icatlo Jr, F. C., Kuroki, M., Ikemori, Y., & Kodama, Y. (1997). Effect of oral egg antibody in experimental F18+ Escherichia coli infection in weaned pigs. The Journal of veterinary medical science/the Japanese Society of Veterinary Science, 59(10), 917-921. 74.Sargeant, H. R., McDowall, K. J., Miller, H. M., & Shaw, M. A. (2010). Dietary zinc oxide affects the expression of genes associated with inflammation: Transcriptome analysis in piglets challenged with ETEC immunopathology, 137(1), 120-129. 95 K88. Veterinary immunology and 75 . Kyriakis, S. C., Tsiloyiannis, V. K., Vlemmas, J., Sarris, K., Tsinas, A. C., Alexopoulos, C., & Jansegers, L. (1999). The effect of probiotic LSP 122 on the control of post-weaning diarrhoea syndrome of piglets. Research in veterinary science, 67(3), 223-228. 76.Sarmiento, J. I., Casey, T. A., & Moon, H. W. (1988). Postweaning diarrhea in swine: experimental model of enterotoxigenic Escherichia coli infection. American journal of veterinary research, 49(7), 1154-1159. 77. Tsukahara, T., Nakanishi, N., Nakayama, K., Matsubara, N., & Ushida, K. (2005). Experimental infection of enterotoxemic Escherichia coli associated with porcine edema disease and its pathologic characteristics in the intestine. The Journal of veterinary medical science/the Japanese Society of Veterinary Science, 67(11), 1167-1171. 78. Li, X. Q., Zhu, Y. H., Zhang, H. F., Yue, Y., Cai, Z. X., Lu, Q. P., ... & Wang, J. F. (2012). Risks associated with high-dose Lactobacillus rhamnosus in an Escherichia coli model of piglet diarrhoea: intestinal microbiota and immune imbalances. PloS one, 7(7), e40666. 79.Choi, C., & Chae, C. (1999). Genotypic prevalence of F4 variants (ab, ac, and ad) in< i> Escherichia coli</i> isolated from diarrheic piglets in Korea. Veterinary microbiology, 67(4), 307-310. 80. Johnson, W. M., Pollard, D. R., Lior, H., Tyler, S. D., & Rozee, K. R. (1990). Differentiation of genes coding for Escherichia coli verotoxin 2 and the verotoxin associated with porcine edema disease (VTe) by the polymerase chain reaction. Journal of clinical microbiology, 28(10), 2351-2353. 96 81. Wray, C., Piercy, D. W. T., Carroll, P. J., & Cooley, W. A. (1993). Experimental infection of neonatal pigs with CNF toxin-producing strains of< i> Escherichia coli</i>. Research in veterinary science, 54(3), 290-298. . 82. Jensen M L. Cilieborg, M. S., Ostergaard. M. V., Bering S. B.,Oregnsen C. B., and sanglid P. T. (2012) Escherichia coli challenge in newborn pigs. Journal of Animal Science, 90, 43-45 83 . Mead, G. C. (2000). Prospects for ‘competitive exclusion’treatment to control salmonellas and other foodborne pathogens in poultry. The Veterinary Journal, 159(2), 111-123. 84.Jensen, M. L., Cilieborg, M. S., Østergaard, M. V., Bering, S. B., Jørgensen, C. B., & Sangild, P. T. (2012). Escherichia coli pchallenge in newborn igs. Journal of animal science, 90(Supplement 4), 43-45. 85. Staley, T. E., Corley, L. D., & Jones, E. W. (1970). Early pathogenesis of colitis in neonatal pigs monocontaminated withEscherichia coli. The American journal of digestive diseases, 15(10), 923-935. 86. Bhandari, S. K., Xu, B., Nyachoti, C. M., Giesting, D. W., & Krause, D. O. (2008). Evaluation of alternatives to antibiotics using an Escherichia coli K88+ model of piglet diarrhea: Effects on gut microbial ecology. Journal of animal science, 86(4), 836-847. 87. 光 岡 知 足 、( 1994)、 第 5 章 ビフィズス菌を中心とする腸内フローラの生態、 ビ フ ィ ズ ス 菌 の 研 究 、 158-220 88.乳 酸 菌 研 究 集 談 会 編 、 ( 1996)、Ⅶ 生 体 に お け る 乳 酸 菌 の エ コ ロ ジ ー 、乳 酸 菌 の 科 学 と 技 術 、 287-903 97 89. Staley, T. E., Jones, E. W., & Corley, L. D. (1969). Attachment and penetration of Escherichia coli into intestinal epithelium of the ileum in newborn pigs. The American journal of pathology, 56(3), 371. 90. Ellis-Versen, J., & Van Winden, S. (2008). Control of E-coli O157 (VTEC) by applied management practices. CATTLE PRACTICE, 16, 54-54. 91. Dowd, S. E., Callaway, T. R., & Morrow-Tesch, J. (2007). Handling may cause increased shedding of Escherichia coli and total coliforms in pigs. Foodborne pathogens and disease, 4(1), 99-102. 92. 渡 邉 章 子 ( 2013) 管 内 養 豚 場 で 発 生 し た 豚 の 大 腸 菌 症 対 策 平 成 24 年 度 全 国 家畜保健衛生業績発表会講演要旨 93. Sato, T., Okubo, T., Usui, M., Yokota, S. I., Izumiyama, S., & Tamura, Y. (2014). Association of Veterinary Third-Generation Cephalosporin Use with the Risk of Emergence of Extended-Spectrum-Cephalosporin Resistance in Escherichia coli from Dairy Cattle in Japan. PloS one, 9(4), e96101. 94 . Zúñiga, A., Yokoyama, H., Albicker‐ Rippinger, P., Eggenberger, E., & Bertschinger, H. U. (1997). Reduced intestinal colonisation with F18‐ positive enterotoxigenic Escherichia coli in weaned pigs fed chicken egg antibody against the fimbriae. FEMS Immunology & Medical Microbiology, 18(3), 153-161. 95. Wellock, I. J., Fortomaris, P. D., Houdijk, J. G. M., & Kyriazakis, I. (2008). Effects of dietary protein supply, weaning age and experimental enterotoxigenic Escherichia coli infection on newly weaned pigs: health. 96. Erik, K., & Knudsen, B. (2001). Development of antibiotic resistance and options to replace antimicrobials in animal diets. Proceedings of the Nutrition Society, 60(03), 98 291-299. 97.Sargeant, H. R., McDowall, K. J., Miller, H. M., & Shaw, M. A. (2010). Dietary zinc oxide affects the expression of genes associated with inflammation: Transcriptome analysis in piglets challenged with ETEC K88. Veterinary immunology and immunopathology, 137(1), 120-129. 98. Cole, D. J., Beal, R. M., & Luscombe, J. R. (1968). The effect on performance and bacterial flora of lactic acid, propionic acid, calcium propionate and calcium acrylate in the drinking water of weaned pigs. Veterinary Record, 83(18), 459-464. 99. Thomlinson, J. R., & Lawrence, T. L. (1981). Dietary manipulation of gastric pH in the prophylaxis of enteric disease in weaned pigs: Some field observations. Veterinary Record, 109(6), 120-122. 100. Li, Z., Yi, G., Yin, J., Sun, P., Li, D., & Knight, C. (2008). Effects of organic acids on growth performance, gastrointestinal pH, intestinal microbial populations and immune responses of weaned pigs. ASIAN AUSTRALASIAN JOURNAL OF ANIMAL SCIENCES, 21(2), 252. 101. 末 吉 益 雄 ( 2014) , 2014 年 パ ン デ ミ ッ ク と 化 し た 豚 流 行 性 下 痢 ( PED) 、 家 畜 診 療 、 61( 7) 、 395-406. 99 謝辞 本稿を終えるにあたり、終始懇切なるご指導、ご鞭撻を賜り、かつ本研究の 発表の機会を賜りました東北大学大学院 動物資源化学分野 准教授 農学研究科 生物産業創成科学専攻 北澤春樹先生、並びにご助言を賜りました同分野 教授の齋藤忠夫先生に謹んで感謝の意を表します。 本研究を遂行するにあたり、副査として細部にわたって数々の御助言、ご指 導を賜りました東北大学大学院農学研究科 健康学講座 栄養学分野教授 応用生命科学専攻 駒井 生物産業創成科学専攻 食品機能 三千夫先生、東北大学大学院農学研究科 動物機能科学講座 機能形態学分野 教授 麻生久先生に 深く感謝致します。 また、本研究の機会を与えていただきました全国農業協同組合連合会 衛生研究所長 落合成年 ならびに同研究所元所長 様、ならびに同研究所 前所長 家畜 佐々木隆志博士、 柴田勲博士に深く感謝いたします。 本研究を遂行するにあたり、多大なご協力をいただきました、全国農業協同 組合連合会 家畜衛生研究所 佐藤静夫博士、今井康雄博士並びに同研究所の 皆様、全農ビジネスサポート筑波支店佐倉営業所の皆様に感謝いたします。 100
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