遺伝子組換え技術による酵母の育種技術に関する研究ーエレクトロボレーション法による凝集性酵母の育種一化学食品部江口良寿食品技術研究室昨年度検討したエレクトロポレーション法による酵母実験室株及び実用酵母に凝集性遺伝子である凡01の導入を試みた.実験室株酵母のSacchωomyC郎CereⅥ'siaeAH22株では凝集性を示す形質転換株が得られ,エレクトロポレーション法により10k如を超えるサイズの遺伝子でも形質転換が起こること,および遺伝子発現が正常に行われることが確そ忍された.しかしながら,清酒酵母の協会7号酵母及び協会9号酵母では凝集性を示す形質転換株が得られず,エレクトロポレーション法による形質転換条件は菌株間の相違が大きいことが示唆された.そのため,エレクトロポレーション法による実用酵母ヘの形質転換においてはその菌株ごとにそれぞれの項目にっいての条件を詳細に検討する必要があると考えられた 1.はじめに酵母をはじめとする発酵微生物の育種・改良は従来から行なわれてきた突然変異誘導法をはじめとし,細胞融合法(プロトプラスト融合法),遺伝子組換え技術等によって様々な二ーズに対応することが可能となってきている.また,これらバイオテクノロジーを応用した発酵微生物の育種・改良技術では,発酵微生物が従来持っていなかった形質を付与できるため,より広範囲な発酵微生物の改良が可能である.特に,遺伝子組換え技術を利用した育種技件を検討し,従来法であるアルカリ金属法に比較し 20から50倍の形質転換効率で形質転換株を得ることができた6).そこで本年度は,この決定した形質転換条件において,効率のよい凝集性酵母の育種が可能であるかの検討を行ったので報告する 2.実験方法 2.1 菌株およびプラスミドDNA EscherichiacohJMI09はYEP13および平成 8年度に報告した方法乃により構築した凝集性キメラプラスミ術は,本来発酵微生物が持っている有用な形質を傷ドのPYEFL01 (図 1), PYIGFL01 (図2)の増幅つけることなく新たな形質を付与できるため,そのに用い,増幅したプラスミドDNAはアルカリSDS法によって抽出し,塩化セシウム平衡密度勾配遠心法応用は拡大傾向にあるこれまで酵母細胞ヘの形質転換は,プロトプラスト法,ポリエチレングリコール法,チオール化合物によって精製して実験に用いた.このYEP13および法およびアルカリ金属法によって行われてきた.・のしかしながら,いずれの形質転換法もその操作性や PYEFL01は酵母・大腸菌のシャトルベクターであり, PⅥGFLONよ酵母染色体組込型ベクターである.これらのプラスミドはいずれも酵母の遺伝子マーカーに形質転換効率に関して,これまで満足のいく方法は LEU2遺伝子を有している報告されていない一方,動物細胞ヘのタンパク質分子の導入法とし実験室株酵母であるSaccharomycescerevisiaeAH22 てRiemanら.'5)にょって開発されたエレクトロポレーおよび清酒酵母の協会7号酵母,協会9号酵母は凝集性遺伝子の宿主として用いたシヨン法は,植物,細菌および酵母細胞など細胞の 2.2培地および培養条件種類にかかわりなく,細胞内ヘの物質導入が可能であることから,近年これらの細胞の形質転換法が開たΞ.coliJMI09はLB培地(1%バクトトリプトン, 発されてきている.また,エレクトロポレーション 0.5%酵母エキス,1%NacD に50μg/m1のアンピシリ法による形質転換は,迅速に効率よく形質転換株を得られるという特徴を持っている本研究では昨年度,遺伝子組換え技術による効率的な酵母の育種技術の開発を目的とし,酵母実験室株ヘのエレクトロポレーション法による形質転換条 YEP13およびPYEFL01, PYIGFL01を形質転換しンを添加して,37でで振とう培養した S.cereⅥ'S始eAH22および協会7号酵母,協会9号酵母はYPD培地(1%酵母エキス,2%ペプトン,2% グルコース)で前培養し,これを新しいYPD培地に接種してOD660が1.0になるまで30でで振とう培養を ECO Rl am HI ECO RI ECO RI Ct BヨmHI 1゛ 1゛ bιUU EとO RI ら ECO RI ^ PYEFLOIF .イ、 ιY;ユUJ 、" "て、も .. PYEFLOIR 153kbp 153kbp 1゛ 1゛ E R1 气毎が1, Amp Bヨm l Xh01 SaU 3AI G @ ECO RI-ー、 Xh01 LEUユ @ ECO RI-ーブ Sa11 Sa11 ? ? QEマ PYIGRFLOIF Q6マ PYIGFFLOIF Sa11 ECO RI Xh01 EUユ＼ Amp Sa11 ECO RI SaU 3AI R1 PYEFL01の制限酵素地図図1 Xh01 E Pstl Pstl ,、 ECO RI ECO RI Pst l SaU 3AI P5t l SaU 3AI Sa11 EC0 1 Xh01 SaU 3AI Xh01 EUユ SaU 3AI G 信1 Sa11 Q8て ? ? Pstl 七 ECO RI ECO RI Gマノ@ PYIGRFLOIR Pstl / Xh01 EU2 Sa11 Q8マ PY{GFFLOIR Sa11 ECO RI Xh01 ,ノ'＼ ECORI /,'" Pstl EC。R{ saU3AI SaU 3AI 図2 PYIGFL01の制限酵素地図行った.また,酵母実験室株の形質転換体の選択にはが1.0になるまで30でで振とう培養を行った.培養後 SD、hiS 培地(0.67%Yeast Nitrogen Base w/O Amin0 その 1.5m1をエッペンドルフチューブにとり,これを Asid,50μg/m1ヒスチジン,2%グルコース)を用い 2,ooorpm,2分間の遠心分離を行い菌体を集菌し,これをTE緩衝液にて2回洗浄した.洗浄した菌体に連結反応後フェノール・クロロホルム処理して精製した. 23凝集性キメラプラスミドの酵母菌体ヘの導入酵母菌体ヘの凝集性キメラプラスミドの導入は昨たプラスミド溶液と15川のTE緩衝液を添加し,30゜C 年度の研究報告書で報告した条件')で行った(図D.で10分間DNAの吸着を行った.これを,島津製作所すなわち,酵母実験室株,協会7号,9号酵母及び醤製同心円状チャンバーFTC・02(電極問lmm)の電油主発酵酵母をYPD培地で一晩振とう培養し,これ極間に充填し,4乃V,5回の印加を行った.印加30 を新たなYPD培地にν50容添加し,吸光度.(OD660)分後,この反応液全量をSD・hiS培地(実験室株)ま 2 酵母(SヨCcharomycescereviS始e AH22) 抑制している遺伝子が存在し,これが新たに導入し YPD培地に30でにて一晩振とう培養たFι01の発現をも抑制していることを示しており, 30てにて振とう培養(OD660=1.0) S.cereⅥS始eAH22株を用いて凝集性酵母を育種する場合はこの制御(抑制)遺伝子を破壊する必要があると考えられた. 1.5m1の培養液 3.2清酒酵母ヘのFι01の形質転換遠心分離(2,000印m,30秒) ,、_ TE緩衝液に懸濁構築したキメラプラスミドは実用酵母で機能でき 3回る遺伝子マーカーを持たないため,協会7号及び9 15μ1のTE緩衝液に懸濁(ピペッティング) 号酵母での形質転換は染色体組込み型のみを行い, 凝集性をその指標として形質転換体の選抜を行った. 100 50ongのDNAを添加 30で,20分間インキュベート印加(4乃V/mm,1msec,5回) しかしながら,協会7号,9号酵母ではいずれも形質転換体力ゞ得られず, Fι01の発現は確認されなかっ 30て,10分問インキュベートた.しかしながら,平成8年度に行った形質転換実験 1.om1のTE緩衝液を添加(ピペッティング) においては凝集活性は実験室株酵母と比較して非常に弱いものの,いずれの株においても形質転換体が菌体懸濁液 0.1m1をスプレッド得られ, Fι01が発現することを確認している.その 30で,2 3日間インキュベートため,エレクトロポレーション法によって形質転換体が得られなかったことは,遺伝子そのものが菌体形質転換体コロニー内に導入されていないことが示唆された.これは,実用株である協会7号,9号酵母では実験室株のS CeルⅥS始.AH22株と細胞外膜構造に大きな相違があ図3 エレクトロポレーション法における酵母の形質転換操作リ,そのために電気エネルギーの伝達の相違が細胞膜破壊の効率に大きく影響し,うまく細胞膜破壊が起きなかった可能性が高い.また,細胞外膜の構成成分等によりDNA分子が細胞表層ヘ吸着できていないたはYPD培地(清酒酵母)に添加し,30でで振とう培養を行った.菌体生育後,培養液を5分間静置し, 浮遊している菌体を除去後新たな培地を添加し,さらに30でで振とう培養を行った.この操作を5回(実験室株)から9回q青酒酵母)繰り返し,凝集性になっ可能性もあるた酵母を観察した口 PYEFL01* O PYIGFFL01* . PYIGRFL01* 2.4凝集活性の測定形質転換株の凝集活性は,平成5年度研究報告書に記載した方法に従った 2.0 合忠09 3.結果及び考察 3.1酵母実験室株ヘの凡01の形質転換 Fι01と酵母ベクターとの連結反応後のキメラプラ 1.0 盤沢劃スミドを直接酵母実験室株ヘ形質転換することによリ,平成8年度に行った形質転換実験と同様にプラスミド型,染色体組込み型の両方で凝集性を有する形質転換体が得られ,エレクトロポレーション法によって15kbPものサイズのDNAでも問題なく形質転 0.5 換できることがわかった.これらの形質転換株のうちプラスミド型で得られた形質転換体は,ほぼKZ6f 0 60 120 180 静置時問(秒) と同程度の凝集活性を示したが,染色体組込み型で得られた形質転換体は若干その凝集活性が弱くなっ図4 SaccharomycescerevisiaeAH22株ており(図4),これも前回の実験と同様であった.こ形質転換体の凝集速度 *プラスミドのFι01の向きは不明のことは,宿主のS、cereviS始eAH22はFι01の発現を 3 そのため,エレクトロポレーション法による実用参考文献酵母ヘの形質転換においてはその菌株ごとにそれぞ D 秋山裕一(監修)"酵母のニューバイオテクノロれの項目についての条件を詳細に検討する必要があると老えられた. ジー"医学出版センター(1990) 2) A.H.Rose & J.S.Harrison, The yeastS 2,165 (1987) 3) zimmennann, U., G. pilwat, and F. Riemann. prepara・ 4.おわりに tion of erythrocyte ghosts by dielectric breakdown of the 昨年度検討したエレクトロポレーション法による Fι01の導入を試みた.実験室株酵母のSaccharomyces Ce11 membrane. Biochim. Biophys. Acta 375:209-219 (1町5) 4) vienken, J., E. Jeltsh, andu. zimmermann. pene杠ation CereⅥSiaeAH22株では凝集性を示す形質転換株が得ら and entrapment oflarge particles in erythroCヌes by electri・れ,エレクトロポレーション法により10kbPを超える Cal breakdown techniques. cytobi010gy 17:182-196 (1町8) 酵母実験室株及び実用酵母に凝集性遺伝子であるサイズの遺伝子でも形質転換が起こること,および遺伝子発現が正常に行われることが確認された.しかしながら,清酒酵母の協会7号酵母及び協会9号 Hofschneider. Gene transfer into mouse lyoma ce11S by 酵母では凝集性を示す形質転換株が得られず,エレクトロポレーション法による形質転換条件は菌株間 electroporauon 加 high electriC 負elds. EMBoj.1:841-845 (1982) の相違が大きいことが示唆された.そのため,エレクトロポレーション法による実用酵母ヘの形質転換においてはその菌株ごとにそれぞれの項目についての 6)江口良寿,小金丸和義,増田照雄,坂田宗章,加 5) Neumann, E., M. schaefer・Ridder, Y. warlg, and p. H 藤富民雄"佐賀県工業技術センター平成Ⅱ年度研究報告書" P.1 (1999) フ)江口良寿,小金丸和義,増田照雄,坂田宗章"佐賀県工業技術センター平成8年度研究報告書" P.39 条件を詳細に検討する必要があると考えられた. (1996) 4