イムノケミストリー社 アポトーシス研究 蛍光プローブ製品 アプリケーションガイド CONTENTS FLIVO™ ・・・・・・・・・・・・ 2 FLICA™ ・・・・・・・・・・・・ 4 Magic Red™・・・・・・・・・・ 6 MitoPT ™・・・・・・・・・・・・ 7 FLISP™・・・・・・・・・・・・・ 9 コリンエステラーゼ検出キット・・・ 10 Do you need a bet ter way to assess neurodegeneration? 細胞毒性検出キット・・・・・ 10 その他試薬・・・・・・・・・・ 12 FLIVO TM 生きたままのモデル動物でアポトーシスを検出！ 腫瘍細胞への抗癌剤の効果を生体レベルで検証できます。 FLIVO™とは？ FLIVO™は細胞浸透性の蛍光プローブ（緑、赤）で、生きたままのモデル動物でアポトーシスを定量解析できる画期的な試薬です。 動物に FLIVO™を経静脈投与し体内循環させると、FLIVO™は活性化したカスパーゼ酵素にのみ共有結合し、アポトーシスを起こした 細胞のみが蛍光を発します。これを、イメージングシステムで解析、また採取したサンプルを顕微鏡観察したりフローサイトメトリー 解析、またはプレートリーダー等で解析することができます。生きたままの動物を用いた解析は、細胞研究、特に腫瘍生物学や増殖 研究において非常に重要です。FLIVO™は、化学療法の有効性を評価するための理想的な試薬です。 作用機構 FLIVO™は細胞浸透性の試薬で、細胞内外に拡散し体中を循環します。細胞内に活性型カスパーゼが存在すると FLIVO™が不可逆的 に共有結合し、細胞内で緑色または赤色の蛍光シグナルを保持します。自然な動物内の血液循環により非結合の試薬は細胞外へ拡散 します。FLIVO™は約一時間で循環により除去されます。 使用例 適用サンプル 顕微鏡（組織切片） 静脈注射により、マウス、ラット、ニワトリ、スズメなど全 ての動物の研究にお使いいただけます（ご使用の動物の大きさ、 組織種類に最適の試薬量を初めにご検討ください）。 使用例：腫瘍組織、脾臓細胞、骨髄、脳、眼の組織のカスパー ゼ活性検出 15-60 分間還流 サンプル採取 ご注意：本品は研究用試薬です。人や動物の医療用、臨床診断 用には使用できません｡ イメージングシステム（生体） フローサイトメトリー（細胞） 特長 ● 生きた動物の使用 マウスモデル全体におけるアポトーシスを追跡可能 ● 簡易的な操作 経静脈に投与するだけ（溶解や浸透促進処理不要） 簡単プロトコール ● 迅速 アッセイ時間は 15-60 分 ● 信頼性が高い 活性型カスパーゼを有する細胞だけが発光 ● 特異的 プロカスパーゼや不活性カスパーゼの干渉なし ● 高感度 非常に低いレベルのアポトーシスも検出可能 ● 高い精度 ↓ FLIVO™を 50 μl DMSO で溶解 ↓ 付属のバッファーを diH2O 45 ml で希釈 ↓ 更に FLIVO™を希釈後のバッファー 550μl で希釈 ↓ 調製液 100μl を静脈内に注射 ↓ 15-60 分間循環 ↓ 蛍光顕微鏡を用いて生きた腫瘍を観察 ↓ 直接観察できない場合は組織を摘出 ↓ 必要に応じ、ヘキストや抗体で更に染色 アポトーシス細胞だけをラベルし、ネクローシスや正常組織 ↓ 必要に応じ、細胞を固定または包埋 は染色しない ↓ 蛍光顕微鏡、またはフローサイトメーターで解析 ● 直接的 活性型カスパーゼが FLIVO™と共有結合 ● 安全性 ラジオアイソトープの代わりに蛍光プローブを使用 ● 定量的 蛍光顕微鏡、動物全体のイメージングシステム、蛍光プレー トリーダーまたはフローサイトメトリーで動物を解析可能 2 図 1：FLIVO™６テスト FLIVO™ 感度 in vivo アポトーシス FLIVO™を使った細胞死の観察では、正常細胞とアポトーシス細胞を明確に FAM-FLIVO™によるカスパーゼ陽性神経細胞の 識別できた。このデータは、VA Hospital & University of Michigan の Thomas ラベリング（品番 981）により、 コント Morrow 博士による生きた動物の脳を使った糖尿病の研究で、Ann Arbor が行っ たコントロール（図 3）と第 8 週の糖尿病（STZ）ラット（図２）との神経変 ロール（図 7）と求心路遮断されたトリの脳（図 性についての評価である。摘出の 30 分前に green FAM-FLIVO™ ８）の核大細胞部（NM）のアポトーシスによる apoptosis detection reagent（品番 981）を静脈から直接注射し、生きた状態 顕著な細胞死の差を示す。 でカスパーゼ陽性のアポトーシス神経細胞をラベルした。摘出後、凍結した 実験には生後 5 日のニワトリを用い、内耳蝸牛 20μm の中脳水道周囲灰白質（PAG）の全神経細胞をニッスル染色法で赤色 摘出の 5.5 時間後に FAM-FLIVO™を注射した。3 蛍光に対比染色した。Green FAM-FLIVO™とニッスルレッドで二重染色された ５分後に脳を固定、還流、包埋した。コントロー アポトーシス神経細胞を図２に示した。このモデルでは糖尿病動物（図２の緑 ルでは蝸牛は摘出しなかった。コントロール（図 色）においてコントロール（図 3 の緑ではない部分）よりも高い、脳のカスパー ゼ活性が見られる。このデータは、2006 年に開催の Society for Neuroscience ７の NM）は、染色のバックグラウンドが低く、 図７ コントロールのニワトリ脳 FAM-FLIVO™はすべての細胞の形状を一様に現し で発表されたものである（poster #443.15/O10）。 た。実験では（図 8）、求心路遮断 NM のすべて タイトル：Find out if the neurons are dying in vivo: use FLIVO™ to assess に近い聴覚神経が FAM-FLIVO™によって明るく染 neuronal cell 色された。蝸牛を摘出した 6 時間後の NM のす べての神経のカスパーゼ活性が、FAM-FLIVO™に より示された。内耳の聴覚に関る蝸牛の刺激が なくなると、脳幹から第 2 の聴覚神経の指示で NM におけるアポトーシスを高レベルで促す。 (Ms. Yuan Wang, University of Washington) 図２ 糖尿病ラットの脳 図８ 実験のニワトリ脳 図３ コントロールラットの脳 正確性 信頼性 ラット脳室下細胞を 鳴禽の季節的挙動に自然の神経細胞死が関っていることを FAM-FLIVO™( 品番 FAM-FLIVO™（品番 981） 981) を用いてアポトーシスを評価することで確認した論文（ Mr.Chris Thompson で at the University of Washington）からのデータ。Thompson は、スタウロスポリ ラベリングし たところ、アポトーシス ン ( 品番 6212，アポトーシスを引き起こすプロテインキナーゼ阻害薬 ) を雌のイ が明確に観察された。カ エスズメの前脳に注射し、約 20 時間後、FAM-FLIVO™を頚静脈に注射した。30 分 スパーゼ陽性細胞は緑色 後、屠殺し、ヘパリン溶液と 4% パラホルムア ルデヒドで潅流した。固定 48 時間後ゼラチン 蛍光で観察される（図５， ６）。FAM-FLIVO™は、 で包埋した。さらに 48 時間、脳を 10% の NBF 図 5 脳質壁 直接生きたラットの脳質 と 20% のスクロース溶液で固定、抗凍結処理 に注射（図 4）、組織を した。 取り出し観察した。脳室 40μm 脳切片を凍結ミクロトーム上で作り、 壁の細胞はほとんど、ア ProLong antifade mountant にセットした。カ ポトーシスを起こしてい スパーゼ活性のある神経細胞は緑色蛍光を発す ない（図 5）一方で、剥 る。図 9 は 100 倍に拡大したアポトーシス神経 離細胞の多くがアポトー 細胞を示す。 図９ 100 倍に拡大したアポ シスを起こした（図６）。 トーシス神経細胞 （Ms. Peggy Law, University of Toronto） 図４ 灰色が路と側脳質 図６ アポトーシス細胞 Immunochemistry Technologies, LLC 品名 メーカー略号：IMT 検出波長（Ex/Em) 品番 包装 希望販売価格 Apoptosis FLIVO™ Kit (Green) 492 nm/ 520 nm 980 6 Test \ 29,000 981 24Test \ 78,000 Apoptosis FLIVO™ Kit (Red) 565 nm/ 600 nm 982 6 Test \ 29,000 983 24Test \ 80,000 コスモ・バイオ㈱ HP で FLIVO™と FLICA™の FAQ がご覧いただけます！ http://www.cosmobio.co.jp/support/faq/IMT̲faq̲20071126.asp#2 1 バイアルで動物 何匹分の実験がで 他の標識を一緒に行う ことができますか？ きますか？ 凍結細胞で使用 またはʼ FLIVO FAQʼ でサイト内検索 → できますか？ 3 FLICA TM 生細胞中のカスパーゼ活性を検出し、 アポトーシスとネクローシスを判別 FLICA™ とは？ 培養細胞や組織中のアポトーシスをカスパーゼ活性を介して定量化す る蛍光プローブです。FLICA™は細胞浸透性であるため細胞を溶解または 透過性処理をする必要がなく、その結果、細胞を壊さずに実験を進める 特長 ことができます。また、細胞毒性がないため、生細胞中のアポトーシス ● 簡単操作 検出が可能です。細胞内に活性型カスパーゼが存在すると、FLICA™が共 直接細胞培養液に試薬を加え、培養・洗浄で測定 有結合し、細胞内で緑色または赤色の蛍光シグナルを発します。プロカ が可能。 スパーゼや不活性型のカスパーゼの影響はありません。 ● 迅速 カスパーゼはリン脂質の代謝回転や DNA 断片化の前に放出されるた 試薬を加えてから 15 分で反応開始（推奨培養時間 め、Annexin V 検出や TUNEL 法より早い段階のアポトーシスを検出する は 1 〜 4 時間）。 ことができます。 ● 正確 生細胞中のアポトーシスを検出。 カスパーゼ前駆体や不活性型酵素からの干渉なし。 ● 信頼性 適用サンプル 活性型カスパーゼのみが蛍光発光。 FLICA™はヒト、サル、ニワトリ、マウス、ラット、 ショウジョウバエ、酵母、及びゾウリムシからの懸 濁細胞、接着細胞、薄層組織切片、及び凍結切片で ご利用いただけます。 特異的カスパーゼの定量 % Apoptotic Cells 簡単プロトコール ↓ FLICA™を 50 μl DMSO で溶解 ↓ 洗浄バッファーを diH2O で 1:10 に希釈 ↓ 更に FLICA™を PBS 200μl で希 Control 釈 ↓ FLICA™ 10μl をサンプルに加え る（〜 300μl 培養溶液） TNF-α CHX 50 μg/mL 50 μg/mL 図 2: U973 細胞における活性型 Caspase 9 ↓ 1-4 時間インキュベーション FLICA™キットはアポトーシスの細胞内プロセスを活性型カスパーゼを測定することで 定量することができる。Annexin V のようにフォスファチジルセリンを検出するといった ↓ 培養液を取り除く 副反応を検出する代わりに直接的な測定ができる。FLICA™を特異的カスパーゼの検出に使 ↓ 細胞を洗浄： 用。U937 細胞を擬似薬、TNF-α、あるいはシクロヘキシミド（CHX）で処理した。 洗浄バッファーを加えて遠心 FAM-FLICA™ Caspase 9 kit（品番 913）を用いた結果、CHX 処理細胞は 50％がアポトー シスを起こしたが、TNF-α処理細胞は擬似薬処理細胞とほぼ同様の結果を示した。 （2 回）、あるいは新たに培養液 を加え 1 時間インキュベーショ ン ↓ 必要に応じ、ヘキストや PI、 7-ADD、抗体で染色 ↓ 必要に応じ、細胞を固定または 包埋 ↓ 蛍光顕微鏡、プレートリーダー、 図１：FLICA™キット 4 ネクローシスとアポトーシスの判別 ネクローシスとアポトーシスを区別するには緑色の FAM-FLICA™を使用 してください。アポトーシス細胞を緑色で蛍光ラベルし、次にネクローシ またはフローサイトメーターで ス細胞を PI（キット構成品）または 7-AAD を加え、赤色に着色します。 解析 DNA ラベル用に、Hoechst33342 が全ての FLICA™キットに含まれています。 FLICA™ 1 サンプルにおける４の細胞死集団 構成内容 ● 基質ペプチド FLICA™キットでどのように細胞を識別できるかを示した。それらは、アポトーシス ( 図 4、 5) か、壊死 ( 図 6) か、正常 ( 図 7) かに分かれる。FLICA™は、アポトーシスの初期 ( 図 4) か後期 ( 図 （FAM-XXX-FMK：緑）、（SR-XXX-FMK：赤） 5) かも判別する。他のどんな分析評価もこのようにはできないため、FLICA™はアポトーシス を評価するために最も正確な高感度法といえる。この実験で FAM-FLICA™は、初代ラット海 ● 10× 洗浄バッファー 馬神経の細胞死を評価する目的に使用した。 ● 固定液 実験にはＳＤラットの第一世代子孫を用い た。海馬は、PND の 0 週雄子犬由来海馬神 ● PI (Propidium Iodide)（Green Fluorescence Kit (FAM) のみ） 経の初代培養を用いた。細胞は 1 カバーガ ● Hoechst 33342 ラスあたり 30 万個で、25mm のポリリジ ンコーティングされたカバーガラスを用い た。細胞は 4 日〜 8 日間培養した。これら にアポトーシスを誘発する試薬を加え、次 波長 に green poly caspases reagent ( 品番 92)、 Hoechst、およびヨウ化プロピジウム ( キッ トに含まれる ) を加え、初期アポトーシス のラベルとした。 ● FAM（緑色）は 492 nm で励起し、520 nm の蛍光を発します。 図 3：初代ラット海馬神経のアポトーシス細胞と壊死細胞 ● SR（赤色）は 565 nm で励起し、600 nm の蛍光を発します。 それらにはカスパーゼ活性があるので、初 期アポトーシスにおける細胞は FAM-FLICA™ で緑色蛍光を発し、ヘキストの青があると DNA の有効性が確認できる ( 図 3)。これら 接着性神経細胞での利用 の膜が損なわれ、後期アポトーシス細胞は、 FAM-FLICA™の緑、ヘキストの青、ヨウ化 プロピジウムの赤を発する ( 図 5)。 壊死細胞は、透過性膜のためヨウ化プロピ 図 4：初期アポトーシス細 胞は青色と緑色に発光する 図 12：FAM-FLICA™により、過酸化水素 (H₂O₂) に 図 6：壊死細胞は赤色に発 色する さらした後、１つの神経芽腫細胞の中にカスパー ゼ活性が認められたことが明らかとなった。この実 ジウム ( 図 6) で赤を発する。壊死細胞には 験では、６ウェルのプレートに蒔かれた 20 万のマ まったくカスパーゼ活性は見られない。正 ウス N2a 細胞を 20 時間、50μM H₂O₂ にさらした。 常細胞はヘキスト ( 図 7) の青を発する。図 FAM-FLICA™( 緑、品番 92) はカスパーゼ活性を緑 3 は合成して作成した全てのイメージ 色蛍光で、DNA を青で標識するために Hoechst を (Z.Kahraman Akozer 博士、メリーランド、 ボルチモアの大学 )。 添加した。アポトーシスはこの細胞の中で引き起こ 図 5：後期アポトーシス細胞は 青色と緑色、赤色に発光する 図 7：正常細胞は青色に発 光する 接着性神経細胞での利用 図 13：2 つの非アポトーシス細胞と、FAM-FLICA™の標識で緑色蛍光を発する１ つのアポトーシスオリゴデンドロサイトを明確に 非アポトーシス細胞と SR-FLICA™( 品番 917) を使用することでアポトーシス神経細胞を容易に 区別できる。24 時間 ( 図 11)、4 時間 ( 図 10)、40 分間 ( 図 9) 後に 200 M のカイニン酸にさらし、 SR-FLICA™をカスパーゼ陽性細胞を赤く標識するために加え 1 時間放置した。カイニン酸にさ らさなかったコントロール細胞 ( 図 8) は、ほとんどカスパーゼ活性を示さなかった。SR-FLICA™ は、カイニン酸へさらすことが低温保存の初代ラット皮質神経細胞 ( 星状細胞フィーダー層で 14 日間で生育する ) でアポトーシスを引き起こし、継続的な暴露が、より多くのカスパーゼ活 性を引き起こす事を明らかにした。(Dr. Babbin Tinner, QBM Cell Sciences, Ottawa). 区別した図。この実験では、ラットのオリゴデン ドロサイトをヌンク社製の 4 ウェルプレートで培 養し、アポトーシスを引き起こす可能性のある薬 剤にさらした。FAM-FLICA™( 緑、品番 92) は、カ スパーゼ陽性細胞を緑色に、全細胞の DNA を標識 するために Hoechst ( 青 ) を添加した。オリゴデン ドロサイトの 1 つがカスパーゼ活性を示したため、 この薬剤はアポトーシスの強力な誘発剤ではな かったことが確認された。 (Mr. Brandon 図 8：コントロール 図 9：40 分 図 10：4 時間 図 12：神経芽細胞腫 され、緑色で示された。(Mr. Joe Schowalter, University of Minnesota). Miller, Ohio State 図 13：オリゴデンドロサイト University). 図 11：24 時間 ■ FLICA™ Immunochemistry Technologies, LLC 品名 メーカー略号：IMT 基質ペプチド 品番 包装 希望販売価格 緑 FAM-VAD-FMK 91 25 Test \ 26,000 緑 FAM-YVAD-FMK 97 25 Test \ 26,000 FAM FLICA™ Caspase 2 Assay Kit 緑 FAM-VDVAD-FMK 918 25 Test \ 26,000 FAM FLICA™ Caspase 3 & 7 Assay Kit 緑 FAM-DEVD-FMK 93 25 Test \ 26,000 FAM FLICA™ Caspase 6 Assay Kit 緑 FAM-VEID-FMK 95 25 Test \ 26,000 FAM FLICA™ Caspase 8 Assay Kit 緑 FAM-LETD-FMK 99 25 Test \ 26,000 FAM FLICA™ Caspase 9 Assay Kit 緑 FAM-LEHD-FMK 912 25 Test \ 26,000 FAM FLICA™ Caspase 10 Assay Kit 緑 FAM-AEVD-FMK 922 25 Test \ 26,000 FAM FLICA™ Caspase 13 Assay Kit 緑 FAM-LEED-FMK 929 25 Test \ 26,000 SR FLICA™ Poly Caspases Assay Kit 赤 SR-VAD-FMK 916 25 Test \ 29,000 SR FLICA™ Caspase 3 & 7 Assay Kit 赤 SR-DEVD-FMK 931 25 Test \ 29,000 SR FLICA™ Caspase 9 Assay Kit 赤 SR-LEHD-FMK 960 25 Test \ 29,000 FAM FLICA™ Poly Caspases Assay Kit FAM FLICA™ Caspase 1 Assay Kit 品名 色 5 Magic Red TM リアルタイムでカスパーゼやカテプシンの活性を検出 培養細胞のアポトーシスの可視化に Magic Red™ とは？ 培養細胞中のカスパーゼやカテプシンの活性を測定するキットです。こ 特長 れらのユニークなキットでは、抗体を使わずに活性を持った酵素のみをター ゲットにした細胞浸透性プローブを用います。特異的な基質ペプチド配列 は赤色蛍光の Magic Red™（クリスタルバイオレット）と結合しており、各 簡単 培地に添加するだけ。 迅速 15 分以内に反応は始まります。数時間で 蛍光を観察することができます。 活性酵素（カスパーゼ 3 と 7 もしくはカテプシン B、K、L）に切断される 高感度 ポジティブ、ネガティブを簡単に見分け られます。 ことで赤色蛍光を発します。プロテアーゼ活性が向上すると、より多くの 高い汎用性 基質が切断されます。増加する赤色蛍光のシグナルを観察することで、プ 細胞透過性があり、前処理は必要ありま せん。 ロテアーゼの活性を経時的モニタリングすることができます（図 1-3）。 高品質 蛍光プレートリーダーや蛍光顕微鏡で解 析できます。 使用目的 カテプシンの基質である Magic Red™を用いることで細胞中のカ テプシン活性レベルを解析することができます。これらのユニーク カスパーゼ活性をリアルタイムで観察 な細胞透過性カテプシン検出試薬 Magic Red™は活性化したカテプ シン B、Ｋ、L に特異的な基質ペプチド（RR,LR,FR）と結合していま す（図 8,9,10 参照） 。リソソーム内小胞のカテプシン活性も基質が 切断されることで赤色蛍光を観察することができます。Magic Red™ を用いることで細胞集団内の長時間にわたる相対的なカテプシン活 図 1：1 時間 図 3：13 時間 図 2：9 時間 性を観察することができます。培養細胞の培地に Magic Red™を添 1×10 個のラット繊維芽細胞を 12 ウェルプレートに播種し、後日観察し 加するだけで測定が可能です。培地に Magic Red™を添加すると細 カスパーゼの活性、アポトーシスが進むにつれて、赤色蛍光はより明るく 胞膜を透過します（透過処理は必要ありません）。Magic Red™は活 性型プロテアーゼに切断されることで、Magic Red™蛍光は細胞内に 4 た。カスパーゼ 3&7 MR-(DEVD)2(Cat#935) を添加し、16 時間観察した。 なっている。動画は web でご覧いただけます。 www.immunochemistry.com/MagicRed.htm (Dr.Martin Purschke 提供 ) 留まり、多くの場合リソソーム内に凝集します（図 2-5）。カテプシ ンはリソソームに由来しますが、カスパーゼは異なります。蛍光顕 微鏡を用いた細胞観察や黒色マイクロプレートを用いた蛍光プレー MCF-7 乳がん細胞のカスパーゼ活性 カンプトテシン処理をした MCF-7 乳がん細胞を トリーダーを用いた全蛍光測定でプロテアーゼの活性を確認できま Magic Red™-(DEVD)₂ と Hoechst33342 での二重 す。 加え 37℃、24 時間でインキュベーションし、10 染色。MCF-7 細胞に 0.15 μM カンプトテシンを μM MR-(DEVD)2 を加え、37℃、30 分間染色した。 Magic Red™は 540-590 nm で励起し、610 nm の蛍光を発します。 また励起波長を調整することで蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダー、 フローサイトメーターで検出することができます。 その後 PBS にて 2 度洗浄し、染色体染色のため 図 4：MCF-７乳がん細胞の カスパーゼ活性 に 1 μg/mL Hoechst33342 を加えた（10 分以上 反応）。ニコン社製多波長フィルター付き FXA シ ステムを使用。 Hoechst 染色：UV 検出、MR-(DEVD)2：緑色光検出、アポトーシス細胞はオレ ンジ色にリソソームが染まり、核は弱い青色に染まり、非アポトーシス細胞の 簡単プロトコール 核は強い青色に染まり、リソソームは染まらない、もしくは弱く染まる。 ↓Magic Red™を 50 μl もしくは 200 μl の DMSO に溶解する ↓Magic Red™と水を 1:5 の割合で希釈する ↓細胞培養液 300 μl あたりに Magic Red™10 μl 加える FLICA™と Magic Red™ FAM-VAD-FMK( 品番 92) と MR- ↓遮光してインキュベーションする (DEVD)2（品番 936）を用いた ↓Magic Red™添加して 15 分以内に反応が開始する MCF-7 乳がん細胞の二重蛍光染 色。緑色蛍光は FAM-VAD-FMK ↓必要に応じて別の染色（DAPI、Hoechst、抗体）を行う インヒビタープローブの局在を ↓必要に応じて固定する ↓蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーで測定する 示しており、すべてのカスパー 図 5：MCF-7 乳がん細胞のカスパーゼ活性 全カスパーゼ活性は緑色（左） カスパーゼ 7 は赤色（右） ゼ活性を表している（左）。赤 色蛍光はカスパーゼ 7 により切 断された後、リソソームに局在 する MR-(DEVD)₂ プローブを示 している（右）。Magic Red™は 切断後、リソソーム内に凝集。 6 Magic Red™ ポジティブ VS. ネガティブ 図 6. MR-(DEVD)2 で標識した THP-1 アポトーシス細胞。 （品 番 935） 図 7 アポトーシスを起こしていない細胞の蛍光図です。 （白黒の DIC イメージ）Magic Red™を用いることでポジ ティブ（アポトーシス）、ネガティブ（アポトーシスの起 図 6：カスパーゼ活性があるため赤色蛍光 を示したアポトーシス細胞 こっていない）を明確に見分けることができる。 （Dr.Brian Lee, ICT 提供） カテプシン K カテプシン B 図8 図 7：アポトーシスを起こしていない細胞； 赤色蛍光がないためカスパーゼ活性がないこ とが分かる カテプシン B 活性を持つ THP-1 細胞を MR-(RR)2 （品番 937）で染色した。赤色蛍光はリソソーム内に凝集し ている。（Dr.Brian Lee, ICT 提供） カテプシン L 図 10 カテプシン L 活性を持つ Jurkat 細胞を MR(FR)2（品番 941）で染色した。赤色蛍光はリソソーム 図 9 カテプシン K 活性を持つ HP-1 細胞を MR-(LR)2 （品番 939）で染色した。（Dr.Brian Lee, ICT 提供） 内に凝集している。（Dr.Brian Lee, ICT 提供） ■ アポトーシス＆カスパーゼ Immunochemistry Technologies, LLC メーカー略号：IMT 基質ペプチド 品番 包装＊ 希望小売価格 MR-(DEVD)2 935 25 Test \ 25,000 936 100 Test \ 62,000 基質ペプチド 品番 包装＊ 希望小売価格 Magic Red™ Cathepsin B Assay Kit MR-(RR)2 937 25 Test \ 25,000 938 100 Test \ 62,000 Magic Red™ Cathepsin K Assay Kit MR-(LR)2 939 25 Test 940 100 Test \ 62,000 Magic Red™ Cathepsin L Assay Kit MR-(FR)2 941 25 Test 942 100 Test \ 62,000 品名 Magic Red™ Caspases 3 & 7 Assay Kit ■ カテプシン Immunochemistry Technologies, LLC 品名 MitoPT TM メーカー略号：IMT \ 25,000 \ 25,000 ミトコンドリア透過性移行検出キット 抗体を使わずにアポトーシス細胞を簡単に検出 MitoPT™は通常のミトコンドリアを赤く染め、アポトーシスをおこしている細胞のミトコンドリアを緑に染めることでアポトーシ ス細胞、非アポトーシス細胞を検出することができるミトコンドリア膜透過型検出キットです。ミトコンドリア膜の透過性遷移 （Permeability transition : PT) はアポトーシス開始の初期段階の指標となります。この現象はミトコンドリア膜の内外に生じる電気 化学的勾配の崩壊と定義付けられ、膜電位の変化によって測定できます。 MitoPT™-JC1 キット 一般的に JC-1 として知られている陽イオン性蛍光色素をベー スとしています。培養細胞に添加するだけで MitoPT™-JC1 は簡単に細胞膜を透過し、 特長 簡単 健常な細胞はオレンジ／赤色の蛍光 健常なミトコンドリア内に凝集し、赤色蛍光を示します（８ページ 図 9）。ミトコ 迅速 ンドリア膜電位の崩壊中には、MitoPT™-JC1 は細胞中に拡散します。一度拡散する 正確 で検出できます。 MitoPT™-TMRE / MitoPT™ キット 汎用性 細胞透過性があるので、前処理が不要 フローサイトメーター、蛍光プレー トリーダー、蛍光顕微鏡で観察でき 新製品の MitoPT™-TMRE、MitoPT™-TMRM は陽 （TMRE、TMRM）を用いています。アポトーシスの起こっていない正常な細胞では 死んでいく細胞はオレンジ／赤色の 高い精度 ポジティブ、ネガティブを容易に判別 定量的 イオン性で親油性のテトラメチルローダミンのエチルエステル、メチルエステル インキュベーション時間は 15-20 分 蛍光が減少する と MitoPT™-JC1 は一量体構造をとり、緑色蛍光を示します。この蛍光はフローサイ トメーター（８ページ 図 7）、蛍光プレートリーダー（８ページ 図 8）、蛍光顕微鏡 培地に加えるだけ る 経済的 安価な価格 MitoPT™-TMRE、-TMRM 色素は正電荷になり、負電荷のミトコンドリア内に蓄積さ れます。アポトーシス細胞の膜電位が崩壊したミトコンドリアの場合、 次ページへつづく 7 MitoPT™の続き 電位差測定色素の MitoPT™-TMRE、-TMRM はミトコンドリア内に蓄積されるこ となく細胞質へ拡散していきます。このように拡散が起こると細胞全体の蛍光は 急激に減少し、オレンジ色蛍光をモニタリングすることで容易に検出することが 可能です（図 5,7） 。正常な膜電位勾配のミトコンドリアを持つ健常な細胞では アポトーシス細胞よりも電位差色素の濃縮されていきます。これらの蛍光の差に よって容易に区別することができます。細胞内の蛍光はフローサイトメーター、 蛍光プレートリーダー、蛍光顕微鏡で検出できます。MitoPT™-TMRE、-TMRM は 488 nm のレーザーを照射することで 549 nm、548 nm で蛍光を発します。 簡単プロトコール ↓MitoPT™を DMSO に溶かす ↓アッセイバッファーを 1:10 の割合に水で 希釈する ↓MitoPT™を PBS で希釈する ↓MitoPT™を加える（細胞を 300 μl 以内の 容量に分注する） ↓15 分から 1 時間インキュベーションする ↓培地を取り除く ↓wash バッファーで 2 度洗浄し、新しい培 地を加え、1 時間インキュベーションする MitoPT™-JC1 ↓必要に応じて別の染色（Hoechst、抗体） 図3 MitoPT™ -JC1 を用い ↓必要に応じて固定する 皮がん）に対する抗がん剤 ↓蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダー、フロー の細胞毒性を測定した。細 胞は 25cm の T 型フラス 2 コントロール 48 時間後 処理 24 時間後 処理 48 時間後 処理 72 時間後 を行う て A431 細胞（ヒト扁平上 サイトメトリーで測定する コ内で RPMI 培地を用いて 5×106 個 /ml まで培養した。コントロールとは別に薬剤の IC50 濃度にて細胞を処理した。24 時間、48 時間、 72 時間で細胞を tripsinized し計測した。1×106 個ずつ分注し、MitoPT™ -JC1 で標識をした。細胞を 37 度で 1 時間インキュベートした、その後洗浄を行った。コントロールと比較して処理した細胞では蛍光強度が低 下していた。オリンパス社製 CKX41 を用いて撮影した。（Beatriz Zayas, Ph.D., Universidad Metropolitana） フローサイトメトリー分析 MitoPT™-TMRM MitoPT™-TMRE helthy helthy 図４ 図６ ネガティブコントロール アポトーシス誘導 図８ フローサイトメーターを用いて MitoPT™-JC1（品番 911）で標識をした細胞を解析した。アポトーシス測定は赤色 蛍光の量で測定している。健常なミトコンドリアを持つ細胞 内では MitoPT™の赤色蛍光は凝集しており、R2 領域に検出さ dying 図５ dying 図７ Jurkat 細胞をアポトーシス誘導を起こすスタウロスポニンの存在下、非存在下で培養し、 TMRE、 （左）、TMRM（右）で染色した。細胞観察にはニコン社製 ECLIPSE E800 を用いた。 励起フィルターには 510-560 nm のフィルターを用い、蛍光フィルターには 570-620 nm を用いた。アポトーシス細胞のミトコンドリアではオレンジ／赤色蛍光が減少している。 蛍光プレートリーダー解析 アポトーシス コントロール 誘導 色蛍光を示す。赤色蛍光の減少している細胞は R3 領域に検出 される。Jurkat 細胞ではこの図ではそれぞれ 4 時間 DMSO（ネ ガティブコントロール）とスタウロスポニン（アポトーシス 誘導）に処理した後、15 分間 MitoPT™で標識した例を示す。 MitoPT™-JC1 図９ 蛍光プレートリーダーを用いて健常な細 胞とアポトーシス細胞の赤色蛍光を測定した。 この図ではそれぞれ 4 時間 DMSO（ネガティ ブコントロール）とスタウロスポニン（アポトー シス誘導）に処理した後、15 分間 MitoPT™（品 ネガティブ れる。アポトーシスが起こり膜電位勾配の崩壊したミトコン ドリアでは細胞内に MitoPT™が拡散し、単量体に変換され緑 で染色し、蛍光顕微鏡で観察した。（励起 490 nm、蛍光 510 nm）健常な細胞（左 2 つ） はミトコンドリア内に赤色蛍光が凝集して います。アポトーシスが起こり、膜電位勾 配の崩壊を起こしている細胞では細胞中に 蛍光が拡散している。単量体となった蛍光 は緑色を示している。（右 3 つ）。 番 911）で標識した例を示している。アポトー シスによるミトコンドリア膜電位勾配の崩壊に よって Jurkat 細胞での蛍光強度は 167RFU か ら 82RFU、51% 減少した。 ■ Mito PT™ Immunochemistry Technologies, LLC 品名 品番 MitoPT™-100, Mitochondrial Membrane Permeability Transition Detection Kit -400, Mitochondrial Membrane Permeability Transition Detection Kit 924 包装 100 Test 911 400 Test 9102 100 Test 9103 500 Test ご照会 9104 100 Test 9105 500 Test ご照会 MitoPT™ TMRE red fluorescence MitoPT™ TMRM red fluorescence 8 dying healthy 図 10 Jurkat 細胞を MitoPT™-JC1（#924） メーカー略号：IMT 希望小売価格 \ 27,000 \ 53,000 \27,000 \ 27,000 FLISP TM セリンプロテアーゼ活性の検出 FLISP™ を培養細胞に使用 FLISP™ とは？ FLISP™ 試薬（Fluorescent Labeled Inhibitors of Serine Protease）は細胞透過性の蛍光阻害プローブで、培養細胞中のセリンプロテアー ゼ活性の定量に利用されます。標的となる基質ペプチドが赤色（SR-101）あるいは緑色（FAM）蛍光に結合しています。基質ペプチ ドが FFCK のキットはフェニルアラニン（Phe）をターゲットとするキモトリプシン様セリンプロテアーゼの検出に、基質ペプチドが FLCK のキットはロイシン （Leu）をターゲットとするセリンプロテアーゼの検出にお使いいただけます。また、FLISP™ および FLICA™ キットを用いて 2 重染色を行うことができます（図 1）。緑色 FLISP™ 試薬は Ex=490 nm、Em>520 nm、赤色 FLISP™ 試薬は Ex=560 nm、 Em>600 nm の特性を持ちます。これ らのシグナルを、蛍光顕微鏡、プレー トリーダー、あるいはフローサイト FLISP™と FLICA™の二重染色同時使用 メーターで検出します。FLISP™ をご ン様プロテアーゼ活性の検出が容易 に行うことができます。 Serine Proteases 利用いただくことで、キモトリプシ Caspases 図 1. HL-60 細胞懸濁液を camptothecin で 37℃、3 時間処理し、アポトーシスを誘導させた。細胞を緑色セリン プロテアーゼ検出キット（品番 945）および赤色カスパーゼ検出キット（品番 917）で 37℃、1 時間処理し、レーザー スキャンサイトメーターで解析した。 緑色蛍光：セリンプロテアーゼ活性 赤色蛍光：アポトーシス vs カスパーゼ活性 黄色：双方の重ね合わせ （データ提供：Dr. Z. Darzynkiewicz, Brander Cancer Institute, New York Medical College, NY.） ■ FAM-FLISP™ Immunochemistry Technologies, LLC 品名 FAM-Phe-DAP FLISP™ Assay Kit 色 基質ペプチド 緑 FFDAP FAM-Phe-CMK FLISP™ Assay Kit 緑 FFCK FAM-Spacer-Phe-CMK FLISP™ Assay Kit 緑 FSFCK FAM-Leu-DAP FLISP™ Assay Kit 緑 FLDAP FAM-Leu-CMK FLISP™ Assay Kit 緑 FLCK FAM-Spacer-Leu-CMK FLISP™ Assay Kit 緑 FSLCK 品番 包装 984 25 Test \ 25,000 985 100 Test \ 72,000 945 25 Test \ 25,000 946 100 Test \ 72,000 963 25 Test \ 25,000 964 100 Test \ 72,000 967 25 Test \ 25,000 968 100 Test \ 72,000 949 25 Test \ 25,000 950 100 Test \ 72,000 965 25 Test \ 25,000 966 100 Test \ 72,000 ■ SR101-FLISP™ Immunochemistry Technologies, LLC 品名 SR-101-Phe-CMK FLISP™ Assay Kit SR-101-Leu-CMK FLISP™ Assay Kit 色 基質ペプチド 品番 赤 SFCK 赤 SLCK メーカー略号：IMT 希望販売価格 メーカー略号：IMT 包装 希望販売価格 951 25 Test \ 26,000 952 100 Test \ 73,000 955 25 Test \ 26,000 956 100 Test \ 73,000 9 PH-F コリンエステラーゼの検出 活性型コリンエステラーゼを含む細胞を Ph-F で標識 Ph-F とは？ コリンエステラーゼアッセイキットでは、生きたままの無傷な細胞中の活性型コリンエステラーゼ酵素を直接定量し、局在性を観 察することができます。細胞を溶解させたり可溶化させたりする必要はありません。このキットは ELISA 法ではなく、また抗体も使 用しません。その代わりに、本キットではフィゾスチグミン（physostigmine）という、結合すると緑色の蛍光を発するコリンエステ ラーゼ阻害剤を用いています。当社のフィゾスチグミン蛍光試薬（Ph-F）は細胞透過性であるので、細胞の溶解や、膜透過処理を行 う必要はありません。またキットでは抗体も使用しないため、不活性型や前駆型のコリンエステラーゼを検出することはありません。 活性型のコリンエステラーゼを持つ細胞のみが蛍光を発します。 操作は簡単で、細胞を培養し、培地に試薬を加えてインキュベーションし、細胞を洗浄するだけです。もし活性型アセチルコリンエ ステラーゼが存在すれば、それが Ph-F 試薬に結合し、細胞内に留まり緑色の蛍光を発します。蛍光顕微鏡やプレートリーダー、フロー サイトメーターで解析します。緑色の Ph-F 試薬は Ex=490 nm、Em>520 nm の特性を持っています。 コリンエステラーゼ コリンエステラーゼ 図 1. アポトーシスを誘発した 図 2. Jurkat 細胞におけるさまざまな 発現 肉接合部におけるコリ （A） 細胞内 DNA (A) DAPI （B) Ph-F （C) SR-VAD-FMK C57 マウス横隔 膜筋組織中の神経 - 筋 ンエステラーゼ /Ph-F （B） コリンエステラーゼ の局在 （C） カスパーゼ活性 横隔膜筋を切り出し、 Jurkat 細胞を 20 μM の Ph-F（図 断片を 20 μM の Ph-F の（B））あるいは 10 μM の SR-VAD-FMK（図の（C））で 1 時間処理し、1 μg/mL の DAPI で対比染色 を服務 PBS 中で 1 時 した（図の（A））。細胞をそれぞれ UV で（A）、青色入射光イルミネーターで（B）、緑色入射光イルミネー 間インキュベーション ターで（C）観察。細胞 #1 には活性型コリンエステラーゼがみられたが、カスパーゼ活性は見られず、 した。その後筋肉を洗 また DNA も観察されなかった。細胞 #2 と #3 では、コリンエステラーゼ、カスパーゼ活性、細胞内 浄し、PBS で 20 分間すすぎ、スライドグラスに貼り付け、カバー DNA いずれも観察された。（データ提供：X. Huang, Brander Cancer Inst., NY Medical College, NY） スリップで覆い蛍光顕微鏡で観察した。 Immunochemistry Technologies, LLC 品名 Cholinesterase Detection Kit メーカー略号：IMT 検出試薬 品番 包装 希望販売価格 Ph-F 973 25 Test \ 26,000 974 100 Test \ 73,000 Ph-F: Physostigmine-Fluorescein 細胞毒性検出キット Cr を用いずに細胞毒性を定量 アポトーシス細胞およびネクローシス細胞を標識 51 細胞毒性とは？ 細胞溶解活性は、細胞内の病原体やがん細胞を除去するために重要なプロセス です。このプロセスはナチュラルキラー（NK）や白血球のようなさまざまな免疫 エフェクター機構を介して容易に行われますが、これらはまた標的細胞内にアポ トーシスを誘導するとも言われています。イムノケミストリー社では、簡単で信 頼性のある迅速な細胞毒性アッセイキットを 2 種類開発しました。ひとつは壊死 し膜障害をうけた細胞を測定するキット（ベーシックキット）で、もうひとつは さらにアポトーシスとネクローシスを判別できるキット（トータルキット）です。 簡単 試薬を培地に加え細胞を洗浄するだ け細胞溶解不要 安全 51 Cr 放射性同位体は不使用 正確 アポトーシス細胞とネクローシス細 胞を分離 これらのキットでは細胞毒性を直接測定します。LDH や ATP を遊離させるような 迅速 細胞溶解活性をダイレクトに測定 関節測定法とは異なり、細胞を溶解させる必要はありません。また当社のアッセ 酵素遊離を待つ時間は不要 イキットは放射性元素を用いませんので、 Cr アッセイなどと比較しても安価で 51 安全に実験が行えます。 10 特長 細胞毒性検出キット 測定原理 ＜ベーシックキット＞ ベーシックキットには 2 種類の蛍光試薬が含まれます。１つは緑色の膜染色（CFSE）で、標的細胞すべてを緑色に染色することで、 エフェクター細胞を標的細胞から分離するために用います。もう１つは赤色の細胞生死を判別する染色試薬（7-AAD）で、膜障害を 受けた細胞の DNA と結合することで、細胞溶解活性による死細胞を測定します。このベーシックキットでは、標的細胞をまず初め に CFSE により膜を緑色で標識し、染色されていないエフェクター細胞を加えてインキュベーションします。次に 7-AAD を加え、 全ての死細胞を赤色に染色します。これをフローサイトメーターを用いて解析します（図 2）。1 本の試験チューブで、生標的細胞（緑 色）と壊死標的細胞（緑および赤色）の 2 つの標的細胞の部分母集団を同定できます。細胞毒性率（％）は壊死標的細胞数をカウン トし生標的細胞数で割ることで算出されます。 測定原理 ＜トータルキット＞ ベーシックキットと同様に、トータルキッ トには CFSE および 7-AAD が含まれます。また、 トータルキットにはオレンジ / 赤色の SR-FLICA™ 試薬である SR-VAD-FMK も含まれ ます。この試薬では活性型カスパーゼ酵素の 検出を介してアポトーシスを測定できます。 このトータルキットを使用して、まず CFSE で トータルキットを用いた 4 集団の定量 図１ 簡単：試薬 を培地に加 えるだけ トータルキットを用 いて 4 つの集団を識 別（図 3 参照）＊ ・ ネクローシス ・ 後期アポトーシス ・ 初期アポトーシス ・ 生細胞 フローサイ トメーター で解析 未染色細胞 CFSE を加 エフェク え、細胞を ター細胞 洗浄（エフェ を添加 クター細胞 を用いない 場合はこの ステップ不 要） SR-FLICA™ を添加 （ベーシッ クキット ではこの ステップ 不要） 7-AAD を添加 ＊ ベーシックキットではネ クローシスと生細胞の 2 集団（図 2） 細胞全体を緑色で標識し、次に染色されてい ないエフェクター細胞を加えてインキュベーションします。その後細胞を SR-FLICA™ で標識してアポトーシス細胞を同定します。 最後に細胞を 7-AAD 試薬で染色し、ネクローシス細胞を同定します。7-AAD による染色は FL3 において赤色に発光し、アポトーシ ス細胞は SR−FLICA™ により FL2 においてオレンジ色に発光します ので、以下の 4 つの標的細胞の部分母集団を 1 本の試験チューブで 容易に識別することができます（図 2、3）。 ベーシックキットの結果 図 2. １）生標的細胞（緑色） 細胞毒性試験例（ベーシックキット） 2 種類のキットを用いて標的細胞を緑色に ２）アポトーシス初期の標的細胞（緑およびオレンジ / 赤） 染色し、全集団を R2+R1 でカウント。エフェ ３）アポトーシス後期の標的細胞（緑、赤およびオレンジ / 赤） 死標的細胞は赤色に染色され、Y 軸側にシ クター細胞を赤色の生死染色液を加えると、 フトし（R2）生標的細胞と区別される（R1）。 ４）壊死標的細胞（緑および赤色） （生エフェクター細胞は R4、死エフェクター トータルキットはまた特定の細胞集団における薬剤や治療薬、放 射線治療などの細胞溶解効果を評価する目的でもご使用いただけま 細胞は R3）トータルキットを用いる場合 R1 と R2 を更に解析してアポトーシス細胞 FL1 GREEN CFSE を識別（図 3）。 す。これらの試験にはエフェクター細胞を使用しませんので、標的 細胞を膜染色する必要はありません。細胞を薬剤添加あるいは放射 トータルキットの結果 線処理といったお好みの実験条件にさらすだけです。アポトーシス 図 3. 細胞毒性試験例（トー タルキット） 図 2 の R1 および R2 からゲー ティングし、FL3 における生 死判別染色 vs FL2 におけるア ポトーシス染色のプロットを 作製。この試験により PI 染色 や他のアッセイでは検出する ことのできない 7-AAD-VAD+ 細胞集団が Q2 にあることが 示された。 を検出するために SR-FLICA™ で染色し、その後ネクローシスの検出 に 7-AAD を加えます。 15 mW、488 nm アルゴン励起レーザーと適切な サンプルを解析するには フィルターを搭載したフローサイトメーターでサンプルを解析します。 CFSE 緑色染色：Ex=488 nm（FL1） 7-AAD 生死細胞染色：Ex=488 nm（FL3） SR-FLICA™ カスパーゼ検出染色：Ex=488 nm（FL2） ■ 細胞毒性検出キット Immunochemistry Technologies, LLC 品名 Basic Cytotoxicity Test, red and green detection kit 970 Total Cytotoxicity Test, red and green detection kit 972 メーカー略号：IMT 品番 包装 希望小売価格 969 125 Test \ 43,000 250 Test \ 72,000 971 125 Test 250 Test \ 91,000 \ 56,000 11 その他細胞死関連試薬 ■ 染色試薬＆一般試薬 Immunochemistry Technologies, LLC 品名 7-AAD Acridine Orange 品名 メーカー略号：IMT 品番 包装 希望販売価格 6163 125 Test ご照会 6130 0.5 ml ご照会 CFSE 6162 250 Test ご照会 DAPI 6244 10 mg ご照会 Hoechst33342 639 1 ml ご照会 Propidium Iodide 638 1 ml ご照会 10X PBS 6157 100 ml ご照会 6158 500 ml ご照会 6159 ■ アポトーシス誘導試薬 1L ご照会 Immunochemistry Technologies, LLC 品名 Camptothecin メーカー略号：IMT 品番 包装 希望販売価格 6208 25 mg ご照会 6209 100 mg ご照会 6210 250 mg ご照会 Granzyme B 6211 5000 U ご照会 Staurosporine 6212 1 mg ご照会 TNF-Alpha 6213 100 μg ご照会 TNF-Beta 6214 20 μg ご照会 TRAIL（APO2L） 6215 ■ ヒト組換えカスパーゼ 品名 Caspase 1 Caspase 2 品名 100 μg ご照会 Immunochemistry Technologies, LLC メーカー略号：IMT 基質ペプチド 品番 包装 希望販売価格 YVAD 6192 5000 U ご照会 LEHD 6193 5000 U ご照会 Caspase 3 DEVD 6194 5000 U ご照会 Caspase 4 LEHD 6195 5000 U ご照会 Caspase 5 LEHD 6196 5000 U ご照会 Caspase 6 VEID 6197 5000 U ご照会 Caspase 7 DEVD 6198 5000 U ご照会 Caspase 8 IETD 6199 5000 U ご照会 Caspase 9 LEHD 6200 5000 U ご照会 Caspase 10 IETD 6201 5000 U ご照会 由来 品番 包装 希望販売価格 ヒト肝臓 6202 25 μg ご照会 ヒト肝臓 6203 25 μg ご照会 Cathepsin G ヒト好中球 6204 100 μg ご照会 Cathepsin H ヒト肝臓 6205 25 μg ご照会 Cathepsin L ヒト肝臓 6206 25 μg ご照会 ----- 6207 100 μg ご照会 ■ ヒト精製カテプシン＆関連タンパク質分解酵素 品名 Cathepsin B Cathepsin D 品名 Neutrophil（Leukocyte）Elastase Immunochemistry Technologies, LLC ● 希望販売価格 ･･･「希望販売価格」は参考であり、販売店様からの販売価格ではございません。 記載の希望販売価格は２００9 年 6 月１日現在の希望販売価格です。 予告なしに改定される場合がありますので、ご注文の際にご確認下さい。消費税は含まれておりません。 ● 使 用 範 囲 ･･･ 記載の商品は全て、「研究用試薬」です。 人や動物の医療用・臨床診断用・食品用等としては使用しないよう、十分ご注意ください。 メーカー略号：IMT
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