日薬理誌(Fo伽織α""αcol.〃":.)140.19∼23(2012) ; 玲言二 I シナプス入力のリアルタイムイメージング小林千晃，高橋直矢，池谷裕二要約：脳は多様な情報を柔軟に処理することで多彩な不十分である．機能を発揮している．これまでに，個体レベルから単とともに，従来のアプローチだけでは脳の多様性を説今回，我々は新たに開発した大規模な画像法によって，単一ニューロンのシナプス活動を多数のスパイン (注：興奮性シナプスの後部に存在する突起構造）から同時に記録することに成功した．その結果，神経回路がシナプスレベルで精密に編み込まれていることを明することは不十分であることもわかってきた．神経明らかにし(1).脳機能の多様性の根源に迫ることが回路を構成するニューロンは，互いにシナプスを介しできた．本稿では，樹状突起によるシナプス入力の統て結合することで情報を伝達している．近年，樹状突合処理能力について，我々の発見に至るこれまでの研起に存在する多数のシナプスを通じて，単一のニューロンでも高度な情報処理を行うことが可能であること究の歴史について説明するとともに，今回我々の開発した大規模スパインカルシウム画像法の応用の可能性が示唆されている．たとえば，ニューロンは，シナプに触れる．一細胞レベルに至る多くの研究がなされ，脳の機能の多様性がどう生じているのかという疑問が徐々に解消されてきた．しかし，こうした研究成果が蓄積されるス活動の時空間パターンを非線形に積算することで，情報のフィルタリングや論理演算を行なっている．ま 1．樹状突起スパインた，シナプス可塑性を通じて積極的に神経回路網を書ニューロンには通常，軸索と樹状突起という2種類き換えることで，より効率的に情報の多様性と安定性を実現している．したがって，シナプス活動を詳細にの神経線維が存在している．樹状突起上には，単一ニューロンあたり数千から数万に及ぶスパインと呼ばれ観察することは，ニューロンの作動原理を解明するうる後シナプス構造が存在し，上流のニューロンの活動えで必須である．今回，我々は，機能的スパインカルをシナプス入力として受け取っている．スパインはシウム画像法の開発により，ニューロンの‘情報処理を 100年以上前から存在が知られていおり(2),その多様シナプスレベルで解明することができるようになった．な形態も明らかとなっていた（図1)．しかし，スパイ本稿では，同実験手技の開発に至る経緯とともに，今ンは直径が1マイクロメーターにも満たない微細な突起構造であり，電気生理学のように記録電極を刺入し後の展望についてもふれる．はじめにてそこでのシナプス活動を記録することはきわめて困した脳の機能を十分には説明できていないまた多く難である．近年，そうした実験的な制約を解消する手段として，神経活動への光学的なアプローチが注目を浴びている．二光子レーザー顕微鏡やカルシウム蛍光プローブ，電位感受性色素が開発・改良され，スパインの形態とその機能的役割が序々に明らかとなってきの難治性中枢神経系疾患において，シナプスに器質的ている(3)．脳は多様な情報を精密に処理するとともに，多様な機能を発揮できる．しかし，従来行われてきた個体レベル，神経回路レベル，細胞レベルの研究では，こうな異常が明らかになっているにも関わらず，その構造が微小であるため，機能異常や治療法の解明はいまだキーワード：ニューロン，シナプス，樹状突起，スパイン，イメージング東京大学大学院薬学系研究科薬品作用学教室（〒113-0033東京都文京区本郷7-3-1) E-mail:[email protected]・ac.jp原稿受領日:2012年4月20日，依頼原稿 T i t l e : R e a l t i m e i m a g i n g o f s y n a p t i c i n p u t s . A u t h o r : C h i a k i K o b a y a s h i , N a o y a T a k a h a s h i , Y u j i I k e g a y a 20 小林千晃・高橋直矢，池谷裕二ことが報告されている(7,8)．すなわち，シナプス入力の時空間構造そのものがその統合過程，さらにはニューロンの出力発火を決定する重要な要因となりうる ( 9 ) ． 3．従来の樹状突起研究ニューロンが，より効率的に活動電位を発生させるには，樹状突起が電位感受性のチャネルや受容体を介して，シナプス入力を超加算的に統合することが必要である(10).しかしながら，樹状突起スパイクなどの，樹状突起がもつシナプス入力の統合機能に関する研究の多くは，樹状突起を電気的に刺激することや，グルタミン酸アンケージングなどを用いた人工的なシナプ図1錐体細胞樹状突起の蛍光画像錐体細胞樹状突起には複数のスパインが存在する．様々な形態のスパイン（矢印）が存在することがわかる．ス入力を惹起することで行われることが一般的であった．そのため，ニューロンが潜在的にシナプス入力を多様に処理する能力をもつことは示されてきたものの， 2．シナプス入力を統合する場としての樹状突起シナプス入力は樹状突起において統合され，細胞体内在する神経活動の中でニューロンが実際にどのような時空間特性のシナプス入力を受容しているのかについてはほとんどわかっていない．へと伝播される．近年，入力の統合過程において，樹状突起が動的な特性を示すことが明らかとなってきてー入力と分散入力の二つのモデルが想定される（図2)．いる．樹状突起を静的な伝導体ケーブルと捉えた場合，クラスター入力は，上述した樹状突起スパイクを発生シナプス入力は，興奮性シナプス入力と抑制性シナプさせる条件を満たしており，非線形演算が可能である．ス入力の総和として樹状突起上で加算され，ケーブルその一方で，分散入力では，樹状突起スパイクの発生特性により指数関数的に減衰しながら，細胞体へ届くと考えられる．しかしながら，樹状突起には，電位感受性NaチャネルやCaチャネル,NMDA受容体などの電位感受性のコンダクタンスが分布しており，細胞体に届く電気信号は，興奮性シナプス入力と抑制性シナプス入力の単純な総和とはならない(4)．たとえ同じ入力数であっても，時間や空間的に異なる複数のシナプス入力は，異なる加算過程を経て，異なる電位変は期待できない．本来，樹状突起の非線形演算は，こ化を生じる(5)．さらに高度な相互作用の例は，樹状突起スパイクでシナプス入力の時空間構造を考える上で，クラスタうした実際のニューロンで生じうるシナプス入力の時空間構造に関して議論されるべきであるはずが，技術的な制約によりアプローチできず，シナプス入力の時空間特性について明確な解答は得られていなかった． 4．シナプス活動イメージング生理活動下におけるシナプス入力の時空間特性についてはほとんどわかっていない(11)．この主たる理由は，これまでの実験手法の限界に因るところが大きい．ある(6)．樹状突起スパイクは，樹状突起の限局した従来，ニューロンのシナプス活動を記録する際には，領域が，集中してシナプス入力を受けることで，電位細胞体からのパッチクランプ記録が汎用されてきた．感受性チャネル等が活性化して局所で生じる活動電位同手法では細胞体にガラス電極を刺入し，シナプス活である．樹状突起スパイクによって入力が超加算的と動を電気信号として記録する．しかしながら，この場なるため，通常のシナプス入力と比べ，より効率的に合，シナプス活動の時系列パターンを計測できるもの細胞体を脱分極させることができる．の，どの樹状突起，あるいはどのスパインが入力を受こうした複雑な加算機構の存在により，ニューロンけたのかを知ることは不可能である．つまり，電気生は非線形演算子として働くことができる．また，グル理学的な記録では空間解像度が不足している．そこで，タミン酸アンケージング法や電気生理学的手法を用いシナプス入力の空間構造を知るために，多数のスパイて人工的にシナプス入力を惹起した場合，シナプス入ンより同時に活動を計測する画像法開発が求められて力の加算様式が，樹状突起の形態，各種イオンチャネいた．ルおよび受容体の発現パターンにより様々に変化するシナプス入力時には，スパインにおいてNMDA受 ■■■総説シナプス入力のリアルタイムイメージングクラスター入力モデル分散入力モデル上遼ニューロン集団1 上流ニューロン築団1 ンン上流 21 上滝図2こつのシナプス入力モデルプレシナプス細胞集団からの入力が，特定の樹状突起に集中するクラスター入力モデル（左）か．樹状突起全体に分散する分散入力モデル（右）の二つの可能性がある．クラスター入力モデルではシナプス入力が集中するため．樹状突起スパイクを起こすことが可能である．（文献1より許可を得て改変）容体を介して一過的にカルシウムが流入するため，カに異なる3つの特長を持つ．すなわち，①広域の視野ルシウム蛍光指示薬によって可視化しうることが，から高速で映像を連続取得できる，②退色が遅い，③ Yusteらによって1995年に示された(12).したがって，光毒性が低い，である．このような特長は，スパインこの蛍光変化を一斉に画像化することによって，シナのように微細な構造物から長時間安定してイメージンプス入力の時空間構造を明らかにできるはずである．グを行うのに適していると考えた．まず我々は.CAS スパインは微小な構造であるために，シナプス活動に錐体細胞からホールセル記録を行い，カルシウム蛍光応じた蛍光指示薬の蛍光強度変化が微量である．従来指示薬を導入し（図3a),同顕微鏡を用いてカルシウはこれを検出することは困難であったが，同年にム活動を記録したところ，広い視野から高い時空間解 CCD(chargecoupleddevice)カメラと優れたカルシ像度でイメージングできることがわかった（図3c.d) ウム蛍光センサーを用いることで，十分なSN比をシ (15)．そして，さらに実験条件の最適化を図ることで，グナルとして捉えることができることが報告された 100個以上のスパインから同時にシナプス活動を観察 (13)．近年では共焦点レーザー顕微鏡の技術が発達し，することに成功した（図3e).また，イメージング後スライス標本の深部に励起レーザーを散乱を防ぎつつに樹状突起の形態を3次元的に構築することで，記録照射し，様々な領域からスパインを可視化できるようされたスパインの空間配置を正確に把握することがでになった．そうした技術の進歩の一方で，レーザーにきる（図3b).これにより，「どの」スパインが，「いよる光毒性や色素の退色の問題が新たに浮き彫りになつ｣，「どこで」入力を受けたのかという，シナプス活った．この問題を解消したのが，二光子レーザー顕微動の時空間特性を捉えることが可能になった（図3)．鏡である(3)．二光子レーザー顕微鏡は，その特徴により，光毒性と色素の退色を抑え，標本を非侵襲的に観察できるとともに，高い空間解像度を有する．また， 5．クラスター入力樹状突起が動的な演算子として働くには，樹状突起共焦点顕微鏡よりもさらに深部にまでレーザーが届くスパイクなどのように，入力を非線形に統合する必要という利点を併せ持つため,invivoにおけるシナプスがある(5,16).一方，樹状突起スパイクを発生させる活動を捉えることもできるようになった(14)．ただ，には，これまで述べてきたように，樹状突起のある特こうした手法で得られるスパインの活動情報は，せい定の領域に対し，まとまった入力（クラスター入力）ぜい数個程度のスパインであり，さらに時間分解能もが必要である（図2)(17)．近年，樹状突起の演算能力十分ではないため，シナプス入力の時空間構造を明らに関して多く研究がなされているが，クラスター入力かにすることは不可能であった．が実際の神経回路で生じているのかという疑問の解決では，どうすればシナプス入力の時空間特性を観察には至っていない．することができるだろうか．我々はニポウ板型共焦点シナプス入力がクラスター化している可能性についレーザー顕微鏡の特徴に着目した(15)．この顕微鏡はては，可塑性の研究からも支持される(10,18)．シナ微弱なレーザーを多数用いることで高速に映像を得るプス可塑性の代表的な型であるLTP(longterm 仕組みで，従来型の共焦点レーザー顕微鏡とは本質的 potentiation)は，シナプス結合強度を増強し，シナプ 22 小林千晃，高橋直矢，池谷裕二 C OS 0．3s ARF ” y i 2低m dｽパｲﾝ#29 3s 50% 4 " 1 0 110 １ｅ” 共焦点面転入やて× 1 0 20 40 60 80 100 120(s) 図3大規模スパインイメージング法によるシナプス活動の観察 (a)イメージングされたCA3錐体細胞．パッチクランプ記録によりカルシウム蛍光指示薬Fluo-5Fを負荷した．(b)三次元橘築された樹状突起形態．aの四角枠の部位に相当する.(c)スパインの自発劇なカルシウム活動の時系列変化bの白枠の部位に相当する．(d)スパインのカルシウム蛍光トレース.(e)bに示す137個のスパインの活動パターンを表すラスタープロット．各点が個々のカルシウムイベントを示す．スを介した情報伝達が効率よく行えるよう変更する機情報伝達を行っているかどうかの決定的な証拠はいま構である．近年，ロPを示したスパインに近接したスだ得られていない．パインで皿Pがより誘導されやすくなることが示されている．ある特定のスパインで皿Pが誘導されると， 6．大規模スパインカルシウム画像法タグタンパク質によって付近のスパインがラベル化さ上記で述べたように，近接したスパインは局所的なれる．そのタグタンパク質の存在が，周囲のスパイン可塑性機構を通じてクラスターを形成し，シナプス入のロP誘導を容易にすると考えられる(18)．また，力は樹状突起上で時空間的に集中すると考えられる． GTPaseの一種であるRasは,LTPによって特定のスその結果，樹状突起スパイクに代表される超加算的なパインで活性化されると，周囲のスパインヘと拡散し，シナプス入力の演算が可能になると想定される（図2)．皿Pが誘導されやすくなることもわかっている(19). 今回，我々は大規模スパインカルシウム画像法を用いさらに，樹状突起スパイクの一種であるNMDA受容ることで，同期したシナプス入力が樹状突起上の特定体を介したNMDAスパイクは，カルシウム流入を伴の領域のスパインに集中することを明らかにした（図いながら局所的に樹状突起を伝播する．その結果， 4a)(1)．クラスター入力のサイズは8マイクロメート NMDAスパイクの発生した特定の樹状突起において，ル以内で統計学的に有意であった．クラスター入力はカルシウム濃度がより上昇し,LTP誘導シグナルは賦電気刺激による人工的なシナプス入力の惹起では生じ活化されやすくなる(10).以上の機構により，皿Pはなかった（図4b)．さらに,NMDA受容体を慢性的に空間的に近接したスパイン集団で発生することが想定遮断した神経回路（図4c)や，未成熟な神経回路（図される．これらの研究から，樹状突起の局所で皿Pが 4d)においても観察されなかったことから，シナプス発生し，スパインのクラスター化を加速しているとい入力のクラスター化はNMDA受容体に依存した神経う仮説が，いよいよ現実味を帯びてきたわけである回路網の発達によって獲得されるものと考えられる． (図2)．だが，ニューロンがクラスター入力を介した最近,invivoで運動学習によって特定のスパインが ■■■総説 23 シナプス入力のリアルタイムイメージング鰭発活動３０重︶掛漣８４０ａ︵誤﹀掛鯉 b 01020304050600102030405060 同期したスパイン間の距離(Mm) 同期したスパイン間の距離(urn) ︵誤︶掛鯉 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 同期したスパイン間の距離(urn) ８４０︵ま︶掛鯉８４０ C 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 同期したスパイン間の距離(urn) 図4シナプス入力のクラスター化スパインがあるスパインと1叩ms以内に同期入力を受ける確率を縦軸に．同期入力を受けたスパイン間の距離を横軸に示した.(a)自発活動下におけるシナプス入力.(b)放線状層を刺激によって誘発したシナプス入力．チヤンスレベルを灰色線で、その95%信頼区間を灰色域で示した．自発活動下では距離の近いスパイン同士が同期しやすいことがわかる.(c)NMDA受容体阻害薬存在下で．組織培養した場合，シナプス入力はクラスター化しない.(d)未成熟回路では，シナプス入力のクラスター化は見られない.(文献1より許可を得て改変）反復的に活性化されると，そのスパインを中心としたか．シナプス画像法の医薬分野への応用は大きな可能局所に新たなスパインが形成されるという研究結果が ‘性を秘めている．発表されている(20)．我々の発見に加えて，こうした文献発見は，樹状突起の非線形演算を行うとする仮説とよく一致している． 1 ) T a k a h a s h i N , e t a l . S c i e n c e . 2 0 1 2 : 3 3 5 : 3 5 3 3 5 6 . 2)YusteR.Neuron､2011:71:772-781. 7．大規模スパインカルシウム画像法の応用 3 ) D e n k W , e t a l . C u r O p i n N e u r o b i o l . 1 9 9 6 ; 6 : 3 7 2 3 7 8 . 4)TakahashiN,etal.ProcNatlAcadSciUSA.2010;107:1024410249. 多くの難治性中枢神経系疾患において，シナプスに器質的な異常が認められている．たとえば，アルツハイマー病，ダウン症，統合失調症などの中枢神経系の機能障害に起因する病態において，シナプス数の減少が報告されている(21-23)．こうした変化はシナプス活動の時空間パターンにも大きく影響すると推測される．各種の神経疾患モデルを対象にスパイン画像法を用いれば，シナプス活動レベルでの病理解析が可能である．また神経疾患に対する既存薬の中には，神経伝達物質量の調節などシナプス機能に作用すると期待されるものが多いこれら薬物のシナプス活動に与える影響を精査すれば，薬の有効性を再評価でき，新たな創薬ターゲットの開拓にもつながるのではないだろう 5 ) H a u s s e r M , e t a l . C u r O p i n N e u r o b i o l . 2 0 0 3 ; 1 3 : 3 7 2 3 8 3 . 6 ) L a r k u m M E , e t a l . S c i e n c e . 2 0 0 9 ; 3 2 5 : 7 5 6 7 6 0 . 7 ) H a u s s e r M , e t a l . S c i e n c e . 2 0 0 0 ; 2 9 0 : 7 3 9 7 4 4 . 8 ) L o n d o n M , e t a l . A n n u R e v N e u r o s c i . 2 0 0 5 ; 2 8 : 5 0 3 5 3 2 . 9 ) P o i r a z i P , e t a l . N e u r o n . 2 0 0 3 ; 3 7 : 9 8 9 9 9 9 . 1 0 ) L a r k u m M E , e t a l . C u r O p i n N e u r o b i o l . 2 0 0 8 ; 1 8 : 3 2 1 3 3 1 . 1 1 ) J i a H , e t a l . N a t u r e ､ 2 0 1 0 ; 4 6 4 : 1 3 0 7 1 3 1 2 . 1 2 ) Y u s t e R , e t a l . N a t u r e . 1 9 9 5 ; 3 7 5 : 6 8 2 6 8 4 . 1 3 ) S e g a l M . J N e u r o s c i M e t h o d s . 1 9 9 5 ; 5 9 : 2 5 2 9 . 1 4 ) S v o b o d a K , e t a l . S c i e n c e . 1 9 9 6 ; 2 7 2 : 7 1 6 7 1 9 . 1 5 ) T a k a h a s h i N , e t a l . N e u r o s c i R e s ､ 2 0 0 7 ; 5 8 : 2 1 9 2 2 5 . 1 6 ) M a g e e J C . N a t R e v N e u r o s c i . 2 0 0 0 ; 1 : 1 8 1 1 9 0 . 17)SilverRA.NatRevNeurosci.2010;11:474-489. 1 8 ) G o v i n d a r a i a n A , e t a l . N a t R e v N e u r o s c i . 2 0 0 6 ; 7 : 5 7 5 5 8 3 . 1 9 ) H a r v e y C D , e t a l . S c i e n c e . 2 0 0 8 ; 3 2 1 : 1 3 6 1 4 0 . 2 0 ) M i n F , e t a l . N a t u r e . 2 0 1 2 ; 4 8 3 : 9 2 9 5 . 2 1 ) S t e p h e n W S , e t a l . N e u r o b i o l A g i n g ､ 2 0 0 6 ; 2 7 : 1 3 7 2 1 3 8 4 . 2 2 ) L e i s A , e t a l . A r c h G e n P s y c h i a t r y . 2 0 0 0 ; 5 7 : 6 5 7 3 . 2 3 ) F e r r e r I , e t a l . A c t a N e u r o p a t h o l . 1 9 9 0 ; 7 9 : 6 8 0 6 8 5 .