天然ゴムの高純度化に関する高専・技大共同研究長岡技術科学大学 ○河原成元東京工業高等専門学校山本祥正，石井宏幸１．はじめにタンパク質を天然ゴムから完全に除去することは，天然ゴムを原料とする医用材料や衛生材料の製造および有機材料の創製において最重要課題となっている．これは，尿素やタンパク質分解酵素等のタンパク質変性剤を用いることにより実現できると考えられるが，ゴム粒子表面に存在する脂質を除去することによりさらに効果的にタンパク質を除去できると考えられる．これまで，タンパク質分解酵素を用いる天然ゴムの精製技術および尿素を用いる天然ゴムの精製技術が実用化および実用化に向けた検討が行われてきた．これにより，タンパク質は天然ゴムからほぼ完全に除去できるようになり，製造における迅速化および高効率化が図られた．しかしながら，現在，さらに効果的かつ効率的にタンパク質を除去する技術の開発が望まれている．本研究では，天然ゴムからタンパク質を効果的かつ効率的に除去することを目的とし，尿素および極性溶媒を用いてタンパク質を完全に除去する試みを行った．必須であった．さらに，分解されたタンパク質の一部は，疎水性相互作用部位が露出することによって水中で不安定になるため，洗浄を行っても天然ゴムからタンパク質を完全に取り除くことは困難であった．そこで，天然ゴムから迅速かつ高効率にタンパク質を取り除くために，タンパク質の変性剤として尿素を用いる天然ゴムの脱タンパク質化を試みた．尿素を用いた天然ゴムの脱タンパク質化法を図１に示す．天然ゴムラテックスに，界面活性剤および尿素を加え，室温の開放系でタンパク質を除去した後，遠心分離機を用いてラテックスをゴム分と漿液に分離した．ゴム分は回収後，界面活性剤水溶液に再分散してから遠心分離機を用いてラテックスをゴム分と漿液に再度分離した．この操作によって，ゴム粒子からタンパク質およびそのフラグメントを漿液とともに取り除き，精製天然ゴムを得た．尿素と界面活性剤を用いて脱タンパク質化した天然ゴムラテックスの窒素含有率の処理時間依存性を図２に示す．尿素を用いた脱タンパク化では，窒素含有率は約 10 分間で急激に減少し，処理時間が長く２．実験天然ゴムラテックスには，市販の高アンモニア天然ゴム（HANR）ラテックスを用いた．HANR ラテックスに尿素，ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）および極性溶媒を加えて数分間インキュベーションしてから遠心分離を行うことにより天然ゴムの精製を行った．精製天然ゴムの窒素含有率および脂肪酸エステル含有率は Kjeldahl 法および FT-IR 測定によりそれぞれ求めた．アレルギータンパク質量は Bio-Rad DC protein assay により測定した．３．結果と考察３．１脱タンパク質化天然ゴムの脱タンパク質化は 1930 年代から主にタンパク質分解酵素を用いて行われてきた．この脱タンパク質化では，酵素反応によってタンパク質を分解するため，最適温度に管理された設備を用いてラテックスを長時間インキュベーションすることが図１天然ゴムの脱タンパク質化プロセス【連絡先】〒940-2188 新潟県長岡市上富岡長 1603-1 長岡技術科学大学物質・材料系河原成元 TEL:0258-47-9301 FAX:0258-47-9300 e-mail：[email protected] 【キーワード】地域連携、共同研究、天然ゴムゲンタンパク質量（2.9 μg/ml）の約 1/3 であった．図２尿素と界面活性剤を用いて脱タンパク質化した天然ゴムラテックスの窒素含有率図３尿素と界面活性剤を用いて脱タンパク質化した新鮮天然ゴムラテックスの窒素含有率なるとさらに減少した．これは，ゴム粒子に吸着しているタンパク質の多くが尿素と相互作用することによって変性され，迅速に漿液へ移動したことを示唆していると考えられる．タンパク質分解酵素を用いる脱タンパク質化では，タンパク質を除去するのに長時間（マレーシアゴム研究所では 72 時間）のインキュベーションが必要であることを考慮すると，尿素を用いる脱タンパク質化技術は天然ゴムからタンパク質を取り除くのに有効な方法であるといえる．さらに，パラゴムの樹から採取した直後の新鮮天然ゴムラテックスに尿素を加えて脱タンパク質化を行った．図３に示すように窒素含有率は約 10 分間で 0.005 w/w％に減少し，処理時間が 2 時間で 0.004 w/w％になった．この脱タンパク質化天然ゴムラテックスに含まれるアレルゲンタンパク量は 1 μg/ml であり，タンパク質分解酵素を用いて調製された脱タンパク質化天然ゴムラテックスに含まれるアレル３．２タンパク質フリー表１に原料である HANR および精製天然ゴムの窒素含有率を示す．未処理の HANR の窒素含有率は 0.279 wt%，尿素と SDS を加えてから遠心分離を２回行った脱タンパク質化天然ゴムの窒素含有率は 0.021 wt%であり，これまでに報告されている値とほぼ同程度であった．一方，尿素，SDS およびアセトンを加えてから遠心分離を２回行った精製天然ゴムの窒素含有率は 0.000 wt%であり，タンパク質は完全に除去されていることが明らかとなった．Bio-Rad DC protein assay によりアレルギータンパク質量を求めたところ，HANR では 115.2 μg/ml であったのに対し，尿素，SDS およびアセトンを用いて精製した天然ゴムでは 0.0 μg/ml であった．また，HANR の FT-IR -1 スペクトルには 3280 cm に吸収帯が示されたが，尿素，SDS およびアセトンを用いて精製した天然ゴムのスペクトルには何の吸収帯も示されなかった．図４に天然ゴム（HANR）およびタンパク質を完全に除去した天然ゴム（PFNR）の透過型電子顕微鏡（TEM）イメージを示す．リンタングステン酸で染色された黒いタンパク質の相はナノマトリックスを形成した（図４(a)）が，このナノマトリックスはタンパク質を除去することにより消失した（図４(b)）以上の結果から，尿素，SDS およびアセトンを用いることにより，天然ゴムからタンパク質を完全に除去できることが明らかとなった．表１天然ゴムの窒素含有率試料 HANR HANR + Urea + SDS HANR + Urea + SDS + Acetone（PFNR）窒素含有率 (wt%) 0.279 0.021 0.000 図４天然ゴムの透過型電子顕微鏡観察（TEM）写真：(a)HANR、 (b) PFNR.