JP 2005-253476 A 2005.9.22 (57)【 要 約 】 【課題】本発明は、植物繊維性廃棄物の分解をきわめて高効率に行ないうる酵素を分泌す る新規な微生物を提供することを目的とする。さらに本発明は、当該微生物およびその産 生酵素を用いる植物繊維、たとえば植物繊維性廃棄物、の分解方法を提供することを目的 とする。 【解決手段】水田土壌等から、各種植物繊維性に対し強力な分解能を発揮する新規セルロ モナス属微生物Ｋ３２Ａ株を分離・採取した。当該微生物の菌体、菌体培養液またはそれ らから分離された多糖類分解酵素をセルロース、稲ワラ等の植物繊維性廃棄物に作用させ ることにより、高効率でこれを分解処理することができる。 【選択図】なし 10 (2) JP 2005-253476 A 2005.9.22 【特許請求の範囲】 【請求項１】 次の理化学的性質を有する繊維性多糖類分解酵素 （１）作用：セルロース、キシロース、プルラン等の繊維質に作用し、これらを可溶化、 分解する。 （２）基質特異性：カルボキシメチルセルロース、アモルファスセルロース、結晶性セル ロース、キシラン、キチンによく作用する。 （３）至適ｐＨ：ｐＨ４∼１１で優れた多糖類分解能を有する。カルボキシメチルセルロ ース分解活性の至適ｐＨは、ｐＨ６∼９である。 （４）至適温度：２０∼６０℃で強いカルボキシメチルセルロース分解活性を示し、カル 10 ボキシメチルセルロース分解活性の至適温度は５０℃である。 （５）酵素組成：９個の酵素の混合物である。 （６）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した推定分子量は約１ ３０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約７３ｋＤａ、約６５ｋＤ ａ、約６２ｋＤａ、約５３ｋＤａおよび約４５ｋＤａである。 【請求項２】 セルロモナス属微生物Ｋ３２Ａ株が産生する多糖類分解酵素であることを特徴とする請求 項１記載の繊維性多糖類分解酵素。 【発明の詳細な説明】 【技術分野】 20 【０００１】 本 発 明 は 、 セ ル ロ モ ナ ス （ Cellulomonas） 属 に 属 す る 新 規 微 生 物 Ｋ ３ ２ Ａ 株 、 お よ び 同 微生物が産生する繊維性多糖類分解酵素に関する。また本発明は、同微生物の菌体、菌体 培養液、菌体もしくは菌体培養液の処理物またはそれらから分離した繊維性多糖類分解酵 素を用いる植物繊維分解方法に関する。 【背景技術】 【０００２】 農作物の収穫後の植物体などの植物繊維性廃棄物は、従来、おもに焼却などにより処分 されている。しかしながら、植物繊維性廃棄物を焼却処分することについては、種々問題 点が指摘されている。たとえば、コメの生産における稲ワラや籾殻は収穫後には不用物と 30 なり、コンバインなどで細かく裁断したのちに焼却処分されてきたが、焼却の際の噴煙な どによる公害が生じており、社会問題として焼却処分の禁止などが検討されている。 【０００３】 植物繊維性廃棄物の焼却処分にかわる処分方法として、植物繊維性廃棄物を分解するこ とができるセルラーゼなどの多糖類分解酵素やセルラーゼ産生菌などの微生物の利用によ る処理方法が注目されている。しかしながら、既存のセルラーゼなどの多糖類分解酵素お よびそれら産生微生物では、植物繊維性廃棄物の分解能力が低く、所期の目的を達成する にはきわめて不充分であった。 【発明の開示】 【発明が解決しようとする課題】 40 【０００４】 植物繊維性廃棄物を難分解性の構造にしているのが、セルロースおよびヘミセルロース である。植物繊維性廃棄物を処理して有効に利用するためには、第一段階としてセルロー スおよび／またはヘミセルロースを部分的にでも加水分解することが必要となる。セルロ ースおよび／またはヘミセルロースを加水分解する方法としては、高濃度の酸による方法 と酵素による方法があるが、田畑における分解方法としては酵素処理が望ましい。 【０００５】 本発明は、セルロース、ヘミセルロースおよびキシロース等に対し強力な分解能を有す る多糖類分解酵素を産生する新規な微生物、および同微生物が産生する繊維性多糖類分解 酵素を提供することを目的とする。さらに本発明は、同微生物、その培養液または同微生 50 (3) JP 2005-253476 A 2005.9.22 物産生多糖類分解酵素を用いる植物繊維、たとえば植物繊維性廃棄物、の分解方法を提供 することを目的とする。 【課題を解決するための手段】 【０００６】 本発明にかかる微生物は、新潟県の水田土壌から分離されたセルロモナス属に属する新 規微生物であり、当該微生物は植物繊維、たとえば植物繊維性廃棄物、に対し強力な分解 能を示す酵素を産生するという産業上優れた有用性を有することを見出し、本発明を完成 するにいたった。 【０００７】 本発明にかかる当該セルロモナス属微生物の菌学的性質は、次に示すとおりである。 10 【０００８】 Ａ．形態的特徴 （１）グラム染色：陽性 （２）形態：培養初期においては、０．３∼０．５μｍ×２∼３μｍ内外の小さな桿菌で あるが、培養期間が長くなるにつれて、分枝したり、球状の形態をとる多形性桿菌である 。 （３）内生胞子：陰性 （４）運動性：有 （５）鞭毛の着生状態：極鞭毛 【０００９】 20 Ｂ．各種培地における生育状態 （１）普通寒天培地：小さい凸状のスムースコロニーを形成。３日間以上の培養で黄色の 色素を産生する。 （２）ペプトン・トリプトン・酵母エキス・グルコース寒天培地（ＰＴＹＧ寒天培地（Ａ ＴＣＣ Ｍｅｄｉｕｍ ＃４６４）であり、組成は培地１０００ｍＬあたりペプトン５ｇ 、トリプトン５ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース５ｇ、寒天１５ｇである。）：盛り上が り厚いコロニーを形成。 【００１０】 Ｃ．生理的性質 （１）最適発育温度：３５∼４０℃ 30 （２）最適発育ｐＨ：６．８∼７．２ （３）普通寒天培地６５℃での発育：６５℃２４時間では発育せず。 （４）基質の利用性 １．α−シクロデキストリン ：利用できず ２．β−シクロデキストリン ：利用 ３．デキストリン ：利用 ４．グリコーゲン ：利用 ５．イヌリン ：利用できず ６．マンナン ：利用できず ７．ツイーン４０ ：利用できず 40 ８．ツイーン８０ ：利用できず ９．Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン ：利用できず 10． Ｎ − ア セ チ ル − Ｄ − マ ン ノ サ ミ ン ： 利 用 で き ず 11． ア ミ グ ダ リ ン ： 利 用 12． Ｌ − ア ラ ビ ノ ー ス ： 利 用 13． Ｄ − ア ラ ビ ト ー ル ： 利 用 で き ず 14． ア ル ブ チ ン ： 利 用 15． セ ロ ビ オ ー ス ： 利 用 16． Ｄ − フ ル ク ト ー ス ： 利 用 17． Ｌ − フ コ ー ス ： 利 用 50 (4) JP 2005-253476 A 2005.9.22 18． Ｄ − ガ ラ ク ト ー ス ： 利 用 19． Ｄ − ガ ラ ク ツ ロ ン 酸 ： 利 用 で き ず 20． ゲ ン チ オ ビ オ ー ス ： 利 用 21． Ｄ − グ ル コ ン 酸 ： 利 用 で き ず 22． α − Ｄ − グ ル コ ー ス ： 利 用 23． ｍ − イ ノ シ ト ー ル ： 利 用 で き ず 24． α − Ｄ − ラ ク ト ー ス ： 利 用 25． ラ ク ツ ロ ー ス ： 利 用 26． マ ル ト ー ス ： 利 用 27． マ ル ト ト リ オ ー ス ： 利 用 10 28． Ｄ − マ ン ニ ト ー ル ： 利 用 で き ず 29． Ｄ − マ ン ノ ー ス ： 利 用 で き ず 30． Ｄ − メ レ ジ ト ー ス ： 利 用 で き ず 31． Ｄ − メ リ ビ オ ー ス ： 利 用 32． α − メ チ ル − Ｄ − ガ ラ ク ト シ ド ： 利 用 33． β − メ チ ル − Ｄ − ガ ラ ク ト シ ド ： 利 用 34． ３ − メ チ ル グ ル コ ー ス ： 利 用 35． α − メ チ ル − Ｄ − グ ル コ シ ド ： 利 用 36． β − メ チ ル − Ｄ − グ ル コ シ ド ： 利 用 37． α − メ チ ル − Ｄ − マ ン ノ シ ド ： 利 用 で き ず 20 38． パ ラ チ ノ ー ス ： 利 用 39． Ｄ − プ シ コ ー ス ： 利 用 40． Ｄ − ラ フ ィ ノ ー ス ： 利 用 で き ず 41． Ｌ − ラ ム ノ ー ス ： 利 用 で き ず 42． Ｄ − リ ボ ー ス ： 利 用 43． サ リ シ ン ： 利 用 44． セ ド ヘ プ ツ ロ サ ン ： 利 用 で き ず 45． Ｄ − ソ ル ビ ト ー ル ： 利 用 46． ス タ キ オ ー ス ： 利 用 で き ず 47． ス ク ロ ー ス ： 利 用 30 48． Ｄ − タ ガ ト ー ス ： 利 用 で き ず 49． Ｄ − ト レ ハ ロ ー ス ： 利 用 50． ツ ラ ノ ー ス ： 利 用 51． キ シ リ ト ー ル ： 利 用 で き ず 52． Ｄ − キ シ ロ ー ス ： 利 用 53． 酢 酸 ： 利 用 54． α − ヒ ド ロ キ シ 酪 酸 ： 利 用 で き ず 55． β − ヒ ド ロ キ シ 酪 酸 ： 利 用 で き ず 56． γ − ヒ ド ロ キ シ 酪 酸 ： 利 用 で き ず 57． ｐ − ヒ ド ロ キ シ フ ェ ニ ル 酢 酸 ： 利 用 で き ず 40 58． α − ケ ト グ ル タ ル 酸 ： 利 用 で き ず 59． α − ケ ト 吉 草 酸 ： 利 用 で き ず 60． ラ ク ト ア ミ ド ： 利 用 で き ず 61． Ｄ − 乳 酸 メ チ ル エ ス テ ル ： 利 用 で き ず 62． Ｌ − 乳 酸 ： 利 用 で き ず 63． Ｄ − リ ン ゴ 酸 ： 利 用 で き ず 64． Ｌ − リ ン ゴ 酸 ： 利 用 で き ず 65． ピ ル ビ ン 酸 メ チ ル ： 利 用 66． コ ハ ク 酸 モ ノ メ チ ル ： 利 用 で き ず 67． プ ロ ピ オ ン 酸 ： 利 用 で き ず 50 (5) JP 2005-253476 A 2005.9.22 68． ピ ル ビ ン 酸 ： 利 用 69． ス ク シ ン ア ミ ド 酸 ： 利 用 で き ず 70． コ ハ ク 酸 ： 利 用 で き ず 71． Ｎ − ア セ チ ル − Ｌ − グ ル タ ミ ン 酸 ： 利 用 72． ア ラ ニ ン ア ミ ド ： 利 用 で き ず 73． Ｄ − ア ラ ニ ン ： 利 用 で き ず 74． Ｌ − ア ラ ニ ン ： 利 用 で き ず 75． Ｌ − ア ラ ニ ル グ リ シ ン ： 利 用 で き ず 76． Ｌ − ア ス パ ラ ギ ン ： 利 用 で き ず 77． Ｌ − グ ル タ ミ ン 酸 ： 利 用 で き ず 10 78． グ リ シ ル − Ｌ − グ ル タ ミ ン 酸 ： 利 用 で き ず 79． Ｌ − ピ ロ グ ル タ ミ ン 酸 ： 利 用 で き ず 80． Ｌ − セ リ ン ： 利 用 で き ず 81． プ ト レ ッ シ ン ： 利 用 で き ず 82． ２ ， ３ − ブ タ ン ジ オ ー ル ： 利 用 で き ず 83． グ リ セ ロ ー ル ： 利 用 84． ア デ ノ シ ン ： 利 用 85． ２ ’ − デ オ キ シ ア デ ノ シ ン ： 利 用 86． イ ノ シ ン ： 利 用 87． チ ミ ジ ン ： 利 用 20 88． ウ リ ジ ン ： 利 用 89． ア デ ノ シ ン − ５ ’ − 一 リ ン 酸 ： 利 用 90． チ ミ ジ ン − ５ ’ − 一 リ ン 酸 ： 利 用 91． ウ リ ジ ン − ５ ’ − 一 リ ン 酸 ： 利 用 92． フ ル ク ト ー ス − ６ − リ ン 酸 ： 利 用 で き ず 93． グ ル コ ー ス − １ − リ ン 酸 ： 利 用 で き ず 94． グ ル コ ー ス − ６ − リ ン 酸 ： 利 用 で き ず 95． Ｄ − Ｌ − α − グ リ セ ロ ー ル リ ン 酸 ： 利 用 で き ず （５）ゼラチンの液化：液化する。 （６）デンプンの加水分解：分解する。 30 （７）セルラーゼの生成：生成 （８）キシラーゼの生成：生成 （９）メチルカルビノールアセチル反応（ＶＰ反応）：陰性 （ 10） ク リ ス テ ン ゼ ン の ク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 培 地 （ チ ト ラ ー テ 培 地 ） に お け る 硫 化 水 素 の 産生：陰性 （ 11） イ ン ド ー ル の 生 成 ： 陰 性 （ 12） 硝 酸 塩 還 元 ： 還 元 （ 13） 尿 素 の 分 解 ： 分 解 せ ず 。 （ 14） 酸 素 要 求 性 ： 通 性 嫌 気 性 （ 15） カ タ ラ ー ゼ の 生 成 ： 生 成 40 （ 16） オ キ シ タ ー ゼ の 生 成 ： 生 成 （ 17） Ｄ Ｎ エ ー ス （ DNase） の 生 成 ： 陰 性 【００１１】 Ｄ．遺伝的性質 ＤＮＡのＧＣ含量（モル％）：７７．５∼７８．５％（Ｔｍ） 【００１２】 本発明にかかる当該微生物は、水田畑土壌、森林土壌、倒木腐朽部を採取し、これを滅 菌した界面活性剤添加生理的食塩水に懸濁し、この懸濁液を、カルボキシメチルセルロー スを添加した普通寒天培地に塗布後２５∼３０℃で培養し、カルボキシメチルセルロース を加水分解せしめるコロニーを、ハロー形成の有無により判断し、ハロー形成の認められ 50 (6) JP 2005-253476 A 2005.9.22 たコロニーを選抜して分離することができる。また分離された当該微生物の単離・精製は 、たとえばさらに必要に応じて、結晶性セルロース（商品名：Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ−１０ １、旭化成工業（株）製）をリン酸処理して得られたアモルファスセルロースを添加した 培地で同様に選抜し、さらに結晶性セルロース（同上）を添加した培地で同様に選抜し、 最後にキシランを添加した培地で同様に選抜するなど、４段階の選抜工程を経て、容易に 実施することができる。 【００１３】 本 微 生 物 の 性 質 を バ ー ジ ー の シ ス テ マ チ ッ ク バ ク テ リ オ ロ ジ ー ２ 巻 （ Bergey's Man ual of Systematic Bacteriology Vol.2） を 参 考 に 検 索 す る と 、 前 記 Ａ ． 形 態 的 特 徴 お よ びＣ．生理的特徴からグラム陽性、セルラーゼ産生であると判断された。市販の基質利用 10 性に基づいた微生物同定システム（微生物検索同定バイオログシステム、バイオログ社製 ） を 用 い た 評 価 で は 、 ジ ョ ネ シ ア デ ニ ト リ フ ィ カ ン ス （ Jonesia denitrificans） が 最 も近縁であると考えられた。図１に前記同定システムにより作成した基質利用性に基づく 系統樹を示す。しかしながら、ＤＮＡのＧＣ含量は、ジョネシア デニトリフィカンスは ４０％程度であるのに対して、本微生物は既知のセルロモナス属のＧＣ含量７１−７６％ （Ｔｍ）をわずかに上回る７７．５−７８．５％（Ｔｍ）であり、明らかにジョネシア デニトリフィカンスとは異なる。 【００１４】 一方、１６Ｓ ｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列の相同性比較を基にした系統樹（図２） においては、本微生物は明らかにセルロモナス属に属する。そして、近縁菌としてはセル ロ モ ナ ス フ ラ ビ ゲ ナ （ Cellulomonas flavigena） 、 セ ル ロ モ ナ ス ゲ リ ダ （ C. gelida ） 、 セ ル ロ モ ナ ス フ ィ ミ （ C. fimi） な ど が 存 在 す る 。 し か し な が ら 、 運 動 性 の 有 無 、 Ｄ−リボース、Ｄ−グルコン酸などの各種基質利用性の点でセルロモナス フラビゲナと は異なり、また同様にラクトースの利用の点でセルロモナス ゲリダおよびセルロモナス フィミとも明らかに異なる。表１に１６Ｓ ｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列の相同性比 較を基にした系統樹（図２）により最も近縁であることが明らかになったセルロモナス フラビゲナと本微生物の基質利用性の違いを示す。 【００１５】 20 (7) JP 2005-253476 A 2005.9.22 【表１】 10 20 【００１６】 このように、１６Ｓ ｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列の相同性では、いずれのセルロモ ナス属の既知の種とも一致せず、また、ＤＮＡのＧＣ含量においては報告されているセル ロモナス属のどの種よりも高い含有量（７７．５−７８．５％）を示す。しかしながら、 電子顕微鏡による鞭毛の着生状態の観察からは（図３）、セルロモナス属に一般的な極鞭 毛であることが認められ、本微生物はセルロモナス属微生物の一種であると考えられる。 なお、図３において、１は本発明のセルロモナス属微生物を、２は鞭毛を示す。 30 【００１７】 以上の点から、本微生物はセルロモナス属の微生物ではあるものの、既記載のセルロモ ナス属のいずれかの種に分類することが適当ではないと考えられる。これらのことから、 本 発 明 者 は 、 本 微 生 物 を 新 規 微 生 物 と 認 定 し 、 セ ル ロ モ ナ ス 属 微 生 物 Ｋ ３ ２ Ａ 株 （ Cellul omonas sp. K32A） と 命 名 し た 。 本微生物は国際寄託機関である通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９９ 年６月２５日に国際寄託されており、その菌受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−６７６６である 。 【発明の効果】 【００１８】 40 本発明によれば、植物繊維を難分解性にしているセルロース、ヘミセルロースおよびキ シラン等に対し強い分解能を有する繊維性多糖類分解酵素を産生する新規な微生物、なら びに同微生物が産生する繊維性多糖類分解酵素を提供することができる。また当該微生物 およびその産生酵素は室温または室温付近において植物繊維に対し強力な分解能を有する ため、植物繊維性廃棄物を輸送することなく、分解処理することができる。 【００１９】 さらに当該微生物またはその産生酵素を用いることにより、稲ワラ、籾殻、麦ワラ、バ ッカス（サトウキビの絞り粕、とうもろこしの芯）、芋のつる、落葉などの植物繊維性廃 棄物などを強力に分解することも可能となり、農業に関する分野にとどまらず、現在社会 で大量に消費・廃棄されている植物繊維物質を効率よく分解処理することができる。 50 (8) JP 2005-253476 A 2005.9.22 【００２０】 その上、これらの分解処理物は、単糖、または二単糖・三単糖その他のオリゴ糖などで あるため、糖原料として再利用することもできる。 【発明を実施するための最良の形態】 【００２１】 本発明によれば、当該微生物は、通常この技術分野で用いられる培地および培養条件下 で培養することができる。炭素源としては、濾紙、セルロース粉末などの各種繊維質原料 を、窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどのアン モニウム塩、硝酸塩およびペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、コーングルーテ ンミール、綿実油、脱脂大豆などの有機物を用いることができる。その他微量の無機金属 10 類、ビタミン類、成長促進因子、たとえばチアミン、ビオチンを含む酵母エキスなどを添 加してもよい。これらの培地成分は本微生物の生育を阻害しない濃度であればよく、炭素 源は通常０．０２５∼０．５重量％用いるのが適当である。窒素源は通常０．０５∼１重 量％用いるのが適当である。培地は通常ｐＨ６．５∼８．５、好ましくはｐＨ６．８∼７ ．５、さらに好ましくはｐＨ７．０∼７．２に調整し、滅菌して使用する。培養温度の範 囲は本微生物が生育し得る温度であればよく、通常２０∼４０℃が適当である。本微生物 を液体培養するばあいは、振とう培養または通気撹拌培養するのが好ましい。培養時間は 種々の培養条件によって異なるが、振とう培養または通気撹拌培養のばあいは１∼５日間 、好ましくは２∼３日間が適当である。 【００２２】 20 得られた培養液は、所望により、遠心分離または濾過することにより、粗酵素溶液を得 ることができる。当該粗酵素溶液は、さらに所望とあれば、ウルトラフィルトレーション による濃縮または硫安塩析法、溶媒沈殿法、透析法などの公知の方法を適用して粗酵素粉 末としてもよい。 【００２３】 またさらに、当該培養液、粗酵素溶液および粗酵素は、イオン交換クロマトグラフィー による吸着および溶出、分子量の差によるゲル濾過法等一般的酵素精製法を適宜選択、組 み合わせて精製することもできる。前記培養液、粗酵素溶液または精製酵素として得られ る本発明の繊維性多糖類分解酵素はセルロースのみではなく、農業上の稲ワラ、麦ワラな どの植物繊維性廃棄物を分解し、さらに、これまで分解が難しいとされた籾殻なども分解 30 する強力なセルラーゼおよびキシラーゼを分泌するという特徴を有する。また、植物に含 まれるヘミセルロースの本体であるキシロースやプルランをも分解し、これらの酵素が同 時に働くことにより天然の多糖類を容易に分解することができるという特徴も有する。さ らに当該多糖類分解酵素は、酵素活性の最適ｐＨは中性域であるが、ｐＨ６∼１０の間で 活性の８０％以上を維持し、温度に関しては、６５℃まで活性を維持する。 【００２４】 本微生物は、その産生酵素、とくにセルラーゼの作用により、セルロースをたとえばセ ロビオースにまで分解し、また稲ワラを基質として用いた場合にも、たとえば二単糖を生 成させることができる。すなわち、本微生物を用いれば、従来産業廃棄物とされてきた植 物繊維性廃棄物から単糖、または二単糖・三単糖その他のオリゴ糖を生産することができ 40 る。 【００２５】 当該繊維性多糖類分解酵素の理化学的性質をより具体的に示すと、次のとおりである。 （１）作用：セルロース、キシロース、プルラン等の繊維質に作用し、これらを可溶化、 分解する。 （２）基質特異性：カルボキシメチルセルロース、アモルファスセルロース、結晶性セル ロース、キシラン、キチンによく作用する。 （３）至適ｐＨ：ｐＨ４∼１１で優れた多糖類分解能を有する。カルボキシメチルセルロ ース分解活性の至適ｐＨは、ｐＨ６∼９である。 （４）至適温度：２０℃∼６０℃で強いカルボキシメチルセルロース分解活性を示し、カ 50 (9) JP 2005-253476 A 2005.9.22 ルボキシメチルセルロース分解活性の至適温度は５０℃である。 （５）酵素組成：９個の酵素の混合物である。本発明の前記培養液または粗酵素溶液をＳ ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分画したところ、図６に示すとおり、Ｃｂｐ Ａ、ＣｂｐＢ、ＣｂｐＣ、ＣｂｐＤ、ＣｂｐＥ、ＣｂｐＦ、ＣｂｐＧ、ＣｂｐＨ、Ｃｂｐ Ｉ の ９ 個 の 画 分 を 与 え た 。 こ こ で Ｃ ｂ ｐ は 、 セ ル ロ ー ス 結 合 タ ン パ ク 質 （ cellulose bind ing protein） を 意 味 し て い る 。 ま た こ れ ら 各 画 分 の エ ン ド グ カ ナ ー ゼ 、 エ ク ソ グ ル カ ナ ーゼおよびキシラナーゼ活性は表５記載のとおりである。 【００２６】 さらに、分画された９個の酵素は、アミノ末端に次に示すアミノ酸配列を有する。アミ ノ 酸 配 列 の 決 定 は 、 ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル か ら 各 画 分 を 採 取 し 、 公 知 の 方 法 （ Matudaira.P. 10 、 １ ９ ８ ７ 年 、 J.Biol.Chem. 第 ２ ６ ２ 号 、 １ ０ ０ ３ ５ 頁 ∼ １ ０ ０ ３ ８ 頁 ） で 、 ア ミ ノ 酸 分 析 装 置 （ 商 品 名 ： Procise ４ ９ ２ gas-phase sequencer、 パ ー キ ン − エ ル マ ー 社 （ Perk in-Elmer） 製 ） に よ り 分 析 し た 。 そ の 結 果 を 表 ２ に 示 す 。 【００２７】 【表２】 20 30 【００２８】 （６）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した推定分子量は、Ｃｂ ｐＡ １３０ｋＤａ、ＣｂｐＢ １００ｋＤａ、ＣｂｐＣ ９０ｋＤａ、ＣｂｐＤ ８０ ｋＤａ、ＣｂｐＥ ７３ｋＤａ、ＣｂｐＦ ６５ｋＤａ、ＣｂｐＧ ６２ｋＤａ、Ｃｂｐ Ｈ ５３ｋＤａ、ＣｂｐＩ ４５ｋＤａである。 【００２９】 本発明によれば、植物繊維の分解反応は、前記培養によって得た微生物の菌体、菌体培 40 養液またはそれらの処理物、あるいは菌体もしくは菌体培養液から分離した繊維性多糖類 分解酵素に基質となる植物繊維を作用させて実施することができる。当該分解反応におい て、菌体の処理物としては、たとえば洗浄菌体、乾燥菌体、菌体磨砕物、菌体の自己消化 物、超音波処理物、菌体抽出物等をいずれも使用でき、また培養処理液としては、遠心分 離、濾過または共沈等の慣用手段によって培養液から菌体細胞壁などの不溶物を除去した もの、ないしそれらの濃縮液をいずれも使用することができる。菌体もしくは菌体培養液 から分離された繊維性多糖類分解酵素は、通常、前記９種の混合物のまま用いるのが好ま しく、また所望とあれば、９種の酵素混合物のうち任意の組合せからなる酵素混合物とし て用いてもよい。一方、当該分解反応に際し、基質としては、植物繊維を主な構成成分と するものであればとくに限定されることはなく、幅広く使用することができる。このよう 50 (10) JP 2005-253476 A 2005.9.22 な基質の具体例としては、稲作や小麦生産、とうもろこし、サトウキビ等の穀物、豆類、 芋類の生産において排出される植物繊維性廃棄物、たとえば稲ワラ、籾殻、麦ワラ、バッ カス（サトウキビの絞り粕、トウモロコシの芯）、芋のつる等、さらには落葉を挙げるこ とができる。また、現在大量に消費されている紙、板紙および紙製品、またはパルプ、ビ スコース、木材、木粉、綿毛等を基質として用いることもできる。当該分解反応の反応条 件は、たとえば酵素の使用量、基質の種類に応じて適宜選択すれば良く、溶媒としては、 通常、水、含水アルコール等を用いるのが好ましい。 【００３０】 当該分解反応は、ｐＨ約６∼約９で実施することができる。また反応温度にとくに制約 はなく、一般的には室温、たとえば約２５℃∼約３０℃で好適に実施することができる。 10 【実施例】 【００３１】 本発明を以下に実施例をあげて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの ではない。 【００３２】 実施例１ 前培養には５０ｍＬのＬ−Ｂｒｏｔｈ（酵母エキス ５ｇ／Ｌ、ペプトン １０ｇ／Ｌ 、塩化ナトリウム ５ｇ／Ｌ）を用いた。該前培養培地にＫ３２Ａ株のシングルコロニー を 接 種 し 、 旋 回 振 と う 機 （ 商 品 名 ： Ｇ １ ０ Gyrotory shaker、 ニ ュ ー ブ ラ ン ス ウ ィ ッ ク サ イ エ ン テ ィ フ ィ ッ ク 社 （ New Brunswick scientific） 製 ） に て ３ ７ ℃ で 一 晩 か け て 振 と う 20 培養（２５０ｒｐｍ、振幅１０ｍｍ）することにより、前培養液を得る。本培養の培地に は、０．０５％アビセル（商品名）を添加した１／５ＰＴＹ培地（酵母エキス１ｇ／Ｌ、 トリプトン １ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム １ｇ／Ｌ）２５０ｍＬを用いた。該本培養培地 に前培養液を１％接種して、基質のアビセルが消失するまで３７℃で振とう培養（２５０ ｒｐｍ、振幅１０ｍｍ）する（約７２時間）。培養終了後、遠心分離（６０００ｒｐｍ、 １０分間）して培養上清を得る。培養上清をろ過滅菌し、硫安を加えて８０％飽和硫安と し上清中のタンパク質を沈殿させた。沈殿したタンパク質を５０ｍＭ モルホリンプロパ ンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、１０ｍＭ ＣａＣｌ2および１ｍＭ ＮａＮ3の緩衝液に溶解 透析し、これを粗酵素溶液とした。調製した粗酵素溶液中のタンパク質濃度は２ｍｇ／ｍ Ｌであった。 30 【００３３】 実施例２ 実施例１と同様にして粗酵素溶液を得る。該粗酵素溶液に含まれる多糖類分解酵素の酵 素活性のｐＨ依存性の測定は、５０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液、５０ｍＭリン酸緩衝液 または５０ｍＭトリス塩酸緩衝液を用いて３７℃で行なった。基質として０．１ｇのカル ボキシメチルセルロースを用い、粗酵素溶液１０ｍＬ（タンパク質濃度５μｇ／ｍＬ）と ３０分間反応させ、還元糖の産生量を測定した。その結果、図４に示すとおり、少なくと もｐＨ４∼１１の範囲で明らかな活性が認められ、最適ｐＨは６∼９であった。 【００３４】 実施例３ 40 実施例１と同様にして粗酵素溶液を得る。該粗酵素溶液に含まれる多糖類分解酵素の酵 素活性の温度依存性は、１０ｍＬの粗酵素溶液（タンパク質濃度５μｇ／ｍＬ）、基質と して０．１ｇのカルボキシメチルセルロースを用い、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸−クエ ン酸緩衝液またはｐＨ１０の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液を用いて、２０℃∼７０℃で３０ 分間反応させ、還元糖の産生量を測定した。その結果、図５に示すとおり、２０℃∼６０ ℃にわたって明らかな活性が認められ、最適温度は５０℃であった。 【００３５】 実施例４ 実施例１と同様にして粗酵素溶液を得る。５０ｍＭ モルホリンプロパンスルホン酸（ ＭＯＰＳ）緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＮａＮ3および１％の 50 (11) JP 2005-253476 A 2005.9.22 基質からなる１０ｍＬの反応溶液を調製する。この反応溶液を３０℃でプレインキュベー ションした後、１００μｇの粗酵素を加え、３７℃で３０分間反応を行なった。反応終了 後、１ｍＬのサンプルを採取し、遠心（１５０００×ｇ、５分間）して不溶物を除き、３ ，５−ジニトロサリチル酸法により上清の還元糖の産生量を測定した。結果を表３に示す 。なお、スタンダードはグルコースを用いた。 【００３６】 【表３】 10 20 30 【００３７】 実施例５ 実施例１と同様にして粗酵素溶液を得る。５０ｍＭ モルホリンプロパンスルホン酸（ ＭＯＰＳ）緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＮａＮ3および１％の 基質からなる１０ｍＬの反応溶液を調製する。この反応溶液を３０℃でプレインキュベー ションした後、１００μｇの粗酵素を加え、３７℃で反応を開始した。反応開始後、１５ 分間毎に１ｍＬのサンプルを採取し、遠心（１５０００×ｇ、５分間）して不溶物を除き 、３，５−ジニトロサリチル酸法により上清の還元糖の産生量を測定した。結果を表４に 示す。なお、スタンダードはグルコースを用いた。 【００３８】 40 (12) JP 2005-253476 A 2005.9.22 【表４】 10 【００３９】 実施例６ 20 実施例１と同様にして粗酵素溶液を得る。該粗酵素溶液にアビセル（商品名）を１ｇ加 え、氷温で１０分間結合させる。ついで、遠心（４５００×ｇ、５分間）で沈殿物を集め 、これに５ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌ添加５０ｍＭリン酸−１２ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ７． ０を加え撹拌し、再度遠心操作を行なう。次に５ｍＬの５０ｍＭリン酸−１２ｍＭクエン 酸緩衝液ｐＨ７．０を加えて撹拌遠心を２回実施し、最後に５ｍＬの滅菌水で同様に洗浄 を１回行なう。セルラーゼが結合したアビセル（商品名）に２ｍＬのエチレングリコール を加え、結合した画分を溶出し、この画分をバインディングフラクションとした。このバ インディングフラクションを８％のゲルを用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動により展開し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によって展開されたタン パク質を検出した。 30 【００４０】 その結果、当該粗酵素溶液に含まれる多糖類分解酵素は、図６に示すとおり、ＣｂｐＡ 、ＣｂｐＢ、ＣｂｐＣ、ＣｂｐＤ、ＣｂｐＥ、ＣｂｐＦ、ＣｂｐＧ、ＣｂｐＨおよびＣｂ ｐＩからなる９個のバンドとして検出された。 【００４１】 さらに、各タンパク質の定性を行なった。各バンドを採取し、それぞれのエンドグルカ ナ ー ゼ 活 性 お よ び キ シ ラ ナ ー ゼ 活 性 を 従 来 法 （ Walfgang. H. １ ９ ８ ７ 年 、 Anatical Bioc hem.、 第 １ ６ ４ 号 、 ７ ２ 頁 ∼ ７ ７ 頁 ） に よ り 測 定 し た 。 エ ン ド グ ル カ ナ ー ゼ 活 性 の 測 定 に は基質としてカルボキシメチルセルロースを用い、キシラナーゼ活性の測定には基質とし てＯｓｔ−ｓｐｅｌｔキシランを用いた。またエクソグルカナーゼ活性は、基質を含まな いＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した後、前記の従来法にしたがってＳ ＤＳを除いた。ついで、これに蛍光基質である４−メチルウンベリフェリルｄ−セルロバ イ オ サ イ ド （ 4-methylumbelliferyl d-cellobioside） を 作 用 さ せ 、 ブ ラ ッ ク ラ イ ト （ ３ ６０ｎｍ）で観察し、蛍光が観察されたタンパク質バンドをエクソグルカナーゼ活性あり と判断した。これらの結果を表５に示す。 【００４２】 40 (13) JP 2005-253476 A 2005.9.22 【表５】 10 20 【００４３】 実施例７ 実施例１にしたがって粗酵素溶液を調製した。粗酵素溶液５ｍＬ中に基質として１ｇの 稲ワラまたは籾殻を加え、指定の温度で７２時間および１週間反応させた。反応終了後に 遠心（３５００ｒｐｍ、２０００×ｇで１５分間）し、得られた沈殿物に滅菌水を加えて 遠心機（商品名：ＫＮ−７０、クボタ製）で遠心（３５００ｒｐｍ、１５分間）すること により３回洗浄し、凍結乾燥後に沈殿物の重量を天秤で測定した。反応後の重量を初期重 量から引いた重量が初期重量に占める百分率を除去率とした。この結果を表６および表７ に示す。 【００４４】 30 【表６】 【００４５】 40 (14) JP 2005-253476 A 2005.9.22 【表７】 10 【００４６】 実施例８ １０ｍＭ ＣａＣｌ2および１ｍＭ ＮａＮ3を含んだ５０ｍＭ モルホリンプロパンス ルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液（ｐＨ ７．０）に基質として籾殻を１％加えたもの５０ｍ Ｌに、Ｋ３２Ａ株の粗酵素溶液をタンパク質量として１ｍｇ加え、５０℃で２４時間保温 した。保温後、遠心分離し、沈殿画分を凍結乾燥して、乾燥重量を対照群（粗酵素溶液を 加えなかったもの）と比較した。その結果、粗酵素溶液を加えたものは対照群に比較しそ の重量が３０−３２％減少していた。また、目視により遠心分離前の溶液を観察すると、 籾殻が一部溶解していることが観察された。 20 【図面の簡単な説明】 【００４７】 【図１】セルロモナス属微生物Ｋ３２Ａ株の基質利用性に基づき、バイオログ社データベ ースを用いて作成した系統樹を示す図である。 【図２】セルロモナス属微生物Ｋ３２Ａ株の１６Ｓ ｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列の相 同性比較に基づき、ＢＬＡＳＴ（データベース）を用いて作成した系統樹を示す図である 。 【図３】セルロモナス属微生物Ｋ３２Ａ株の鞭毛の着生状態（倍率：１万倍）を示す図で ある。 【図４】セルロモナス属微生物Ｋ３２Ａ株産生セルラーゼ活性のｐＨ依存性を示すグラフ 30 である。 【図５】セルロモナス属微生物Ｋ３２Ａ株産生セルラーゼ活性の温度依存性を示すグラフ である。 【図６】Ｋ３２Ａ産生多糖類分解酵素とアビセルとの結合実験を示す図である。 【符号の説明】 【００４８】 １ セルロモナス属微生物Ｋ３２Ａ株 ２ 鞭毛 【配列表フリーテキスト】 【００４９】 配列番号１：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列 配列番号２：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列 配列番号３：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列 配列番号４：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列 配列番号５：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列 配列番号６：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列 配列番号７：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列 配列番号８：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列 配列番号９：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列 40 (15) 【図１】 【図２】 【図３】 【図４】 JP 2005-253476 A 2005.9.22 (16) 【図５】 【配列表】 2005253476000001.app 【図６】 JP 2005-253476 A 2005.9.22
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