JP 3602844 B2 2004.12.15
(57) 【 特 許 請 求 の 範 囲 】
【請求項１】
ワクシニアウイルスゲノムの非必須領域である、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ
、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ、およびＩ４Ｌが不活化または欠失されて弱毒化されたワク
シニアウイルスを含む組換えワクシニアウイルス。
【請求項２】
ワクシニアウイルスゲノムの非必須領域である、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、
Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域、および巨大サブユニットリボヌ
クレオチドレダクターゼの読取り枠が欠失されて弱毒化されたワクシニアウイルスを含む
組換えワクシニアウイルス。
10
【請求項３】
前記ワクシニアウイルスゲノムの非必須領域中に、非ワクシニア源からの外因性ＤＮＡを
さらに含むことを特徴とする請求項１または２記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４】
前記ワクシニアウイルスが、ワクシニアコペンハーゲン株であることを特徴とする請求項
１から３何れか１項記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項５】
前記非必須領域が、毒性因子をコードする読取り枠の挿入不活化により不活化されること
を特徴とする請求項１記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項６】
20
(2)
JP 3602844 B2 2004.12.15
前記弱毒化されたワクシニアウイルスがｖＰ８６６であることを特徴とする請求項１記載
の組換えワクシニアウイルス。
【請求項７】
前記弱毒化されたワクシニアウイルスがＮＹＶＡＣであることを特徴とする請求項１記載
の組換えワクシニアウイルス。
【請求項８】
前記非ワクシニア源が、狂犬病ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱病
ウイルス、デング熱ウイルス、麻疹ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、エプスタインバーウ
イルス、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマヘ
ルペスウイルス、ウシへルペスウイルス、ウシウイルス性下痢性ウイルス、ヒトサイトメ
10
ガロウイルス、イヌパルボウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ネコ白血病ウイルス
、ネコヘルペスウイルス、ハンターンウイルス、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、鳥類インフルエンザ
ウイルス、ムンプスウイルスおよびニューカッスル病ウイルスからなる群より選択される
ことを特徴とする請求項３記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項９】
前記非ワクシニア源が狂犬病ウイルスであるところの、ｖＰ８７９またはｖＰ９９９であ
ることを特徴とする請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１０】
前記非ワクシニア源がＢ型肝炎ウイルスであるところの、ｖＰ８９６、ｖＰ８９７、ｖＰ
８９１、ｖＰ９３２、ｖＰ９７５、ｖＰ９３０、ｖＰ９１９またはｖＰ９４１であること
20
を特徴とする請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１１】
前記非ワクシニア源からの外因性ＤＮＡが、日本脳炎ウイルスタンパク質のＣのＣ末端１
５アミノ酸、ＰｒｅＭおよびＥをコードすることを特徴とする請求項８記載の組換えワク
シニアウイルス。
【請求項１２】
前記非ワクシニア源からの外因性ＤＮＡが、日本脳炎ウイルスタンパク質のＮＳ１および
ＮＳ２Ａをさらにコードすることを特徴とする請求項１１記載の組換えワクシニアウイル
ス。
【請求項１３】
30
前記非ワクシニア源からの外因性ＤＮＡが、日本脳炎ウイルスタンパク質のＣの残りの配
列をさらにコードすることを特徴とする請求項１２記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１４】
ｖＰ９２３であることを特徴とする請求項１１記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１５】
ｖＰ９０８であることを特徴とする請求項１２記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１６】
前記非ワクシニア源からの外因性ＤＮＡが、日本脳炎ウイルスタンパク質のＥのＣ末端３
０アミノ酸、ＮＳ１およびＮＳ２Ａをコードすることを特徴とする請求項８記載の組換え
ワクシニアウイルス。
40
【請求項１７】
前記非ワクシニア源からの外因性ＤＮＡが、日本脳炎ウイルスタンパク質のＮＳ２Ｂをさ
らにコードすることを特徴とする請求項１６記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１８】
前記非ワクシニア源が日本脳炎ウイルスであるところの、ｖＰ９０８またはｖＰ９２３で
あることを特徴とする請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１９】
前記非ワクシニア源からの外来ＤＮＡが、黄熱病ウイルスタンパク質のＰｒｅＭのＮ末端
に先行する２１アミノ酸シグナル配列、ＰｒｅＭ、Ｅ、ＮＳ１およびＮＳ２Ａをコードす
ることを特徴とする請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
50
(3)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【請求項２０】
前記非ワクシニア源が黄熱病ウイルスであるところの、ｖＰ９９７またはｖＰ９８４であ
ることを特徴とする請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項２１】
前記非ワクシニア源が麻疹ウイルスであるところの、ｖＰ９１３またはｖＰ９９７である
ことを特徴とする請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項２２】
前記非ワクシニア源が仮性狂犬病ウイルスであるところの、ｖＰ８８１、ｖＰ８８３、ｖ
Ｐ９００、ｖＰ９１２、ｖＰ９２５、ｖＰ９１５またはｖＰ９１６であることを特徴とす
る請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
10
【請求項２３】
前記非ワクシニア源がエプスタインバーウイルスであるところの、ｖＰ９４１またはｖＰ
９４４であることを特徴とする請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項２４】
前記非ワクシニア源が単純ヘルペスウイルスであるところのｖＰ９１４であることを特徴
とする請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項２５】
前記非ワクシニア源がヒト免疫不全ウイルスであるところの、ｖＰ９１１、ｖＰ９２１、
ｖＰ８７８、ｖＰ９３９、ｖＰ９４０、ｖＰ９２０、ｖＰ９２２、ｖＰ１００８、ｖＰ１
００４、ｖＰ１０２０、ｖＰ１０７８、ｖＰ９９４、ｖＰ１０３６、ｖＰ１０３５、ｖＰ
20
９６９、ｖＰ９８９、ｖＰ９９１、ｖＰ９９０、ｖＰ９７０、ｖＰ９７３、ｖＰ９７１、
ｖＰ９７９、ｖＰ９７８、ｖＰ９８８、ｖＰ１００９、ｖＰ１０６２、ｖＰ１０６１、ｖ
Ｐ１０６０、ｖＰ１０８４、ｖＰ１０４５、ｖＰ１０４７またはｖＰ１０４４であること
を特徴とする請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項２６】
前記非ワクシニア源がサル免疫不全ウイルスであるところの、ｖＰ８７３、ｖＰ９４８、
ｖＰ９４３、ｖＰ９４２、ｖＰ９５２、ｖＰ１０４２、ｖＰ１０７１またはｖＰ１０５０
であることを特徴とする請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項２７】
前記非ワクシニア源がウマヘルペスウイルスであるところの、ｖＰ１０４３、ｖＰ１０２
30
５またはｖＰ９５６であることを特徴とする請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項２８】
前記非ワクシニア源がウシヘルペスウイルスであるところの、ｖＰ１０５１、ｖＰ１０７
４、ｖＰ１０７３、ｖＰ１０８３、ｖＰ１０８７、ｖＰ１０７９であることを特徴とする
請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項２９】
前記非ワクシニア源がウシウイルス性下痢性ウイルスであるところの、ｖＰ９７２、ｖＰ
１０１７またはｖＰ１０９７であることを特徴とする請求項８記載の組換えワクシニアウ
イルス。
【請求項３０】
40
前記非ワクシニア源がヒトサイトメガロウイルスであるところのｖＰ１００１であること
を特徴とする請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３１】
前記非ワクシニア源がイヌパルボウイルスであるところの、ｖＰ９９８またはｖＰ９９９
であることを特徴とする請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３２】
前記非ワクシニア源がウマインフルエンザウイルスであるところの、ｖＰ９６１またはｖ
Ｐ１０６３であることを特徴とする請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３３】
前記非ワクシニア源がネコ白血病ウイルスであるｖＰ１０１１であることを特徴とする請
50
(4)
JP 3602844 B2 2004.12.15
求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３４】
前記非ワクシニア源がハンターンウイルスであるところの、ｖＰ８８２、ｖＰ９５０また
はｖＰ９５１であることを特徴とする請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３５】
前記非ワクシニア源がＣ．ｔｅｔａｎｉであるところのｖＰ１０７５であることを特徴と
する請求項８記載の組換えワクシニアウイルス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
10
この出願は、１９９１年 ３月 ７日に出願した出願番号第０７／６６６，０５６号の一
部継続出願である、１９９１年 ６月１１日に出願した出願番号第０７／７１３，９６７
号のさらなる一部継続出願であり、その出願の両方をここに参照文献として含む。また、
米国特許継続出願である、１９９１年 ６月１４日に出願した出願番号第７１５，９２１
号、１９９１年 ７月２６日に出願した出願番号第７３６，２５４ 号、１９９１年１
０月２２日に出願した出願番号第７７６，８６７ 号、および１９９２年 １月１３日に
出願した出願番号第８２０，０７７ 号についても言及し、これら全てをここに参照文献
として含む。
【０００２】
産業上の利用分野
20
本発明は改変ポックスウイルス、およびその産生方法、並びにその使用方法に関するもの
である。さらに詳しくは、本発明は、様々な病原体に対して防御する安全免疫運搬体とし
て使用する異種遺伝子の挿入と発現のための改良ベクターに関するものである。
【０００３】
この出願においていくつかの刊行物を参照する。請求の範囲の直前で明細書の後に、また
は刊行物と記載されているところに、これらの参照文献を完全に列挙する；これら刊行物
のそれぞれをここに参照文献として含む。これらの刊行物は、本発明が属する従来技術に
関する。
【０００４】
発 明 の 背 景
30
ワクシニアウイルスおよびさらに近年の他のポックスウイルスは、異種遺伝子の挿入と発
現に用いられている。異種遺伝子の生感染ポックスウイルスへの挿入の基礎技術は、供与
体プラスミド中の異種遺伝子要素を側腹に有するポックスＤＮＡ配列と救助（ｒｅｓｃｕ
ｉｎｇ）ポックスウイルス中に存在する相同配列との間の組換えを含む（ピッチーニら、
１９８７）。
【０００５】
具体的には、組換えポックスウイルスは従来技術において知られ、米国特許第４，７６９
，３３０ 号、第４，７７２，８４８ 号、および第４，６０３，１１２ 号、並びに１
９９０年 ６月１４日に出願された継続出願第０７／５３７，８８２号に記載されたワク
シニアウイルスの合成組換え体の産生方法と類似した２工程で構築され、これらの開示を
40
ここに参照文献として含む。この点において、１９９０年 ６月１４日に出願された米国
特許継続出願第５３７，８９０ 号についても言及し、ここに参照文献として含む。
【０００６】
第一に、ウイルス、特に非ポックス源からの読取り枠に挿入されるＤＮＡ遺伝子配列は、
ポックスウイルスのＤＮＡ部分に相同なＤＮＡが挿入されるＥ．ｃｏｌｉプラスミド構成
中に配される。それとは別に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列は、プロモーターに繋げられ
る。プロモーター遺伝子連結は、非必須座を含有するポックスＤＮＡの領域を側腹に有す
るＤＮＡ配列と相同なＤＮＡにより両端の側腹にあるように、プラスミド構築体中に位置
せしめられる。生成したプラスミド構築体を次いでＥ．ｃｏｌｉ細菌において増殖により
増幅させ（クレウェル、１９７２）、単離する（クレウェルら、１９６９；マニアチスら
50
(5)
JP 3602844 B2 2004.12.15
、１９８２）。
【０００７】
第二に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離プラスミドを、培養細胞、例えば鶏
胚繊維芽細胞中にポックスウイルスとともにトランスフェクションせしめる。プラスミド
中の相同ポックスＤＮＡとウイルスのゲノムとの間の組換えにより、ゲノムの非必須領域
中の異種ＤＮＡ配列の存在により改変されたポックスウイルスが得られる。「異種」ＤＮ
Ａという用語は、外因性のＤＮＡ、特に非ポックス源からのＤＮＡを示し、これは、外因
性ＤＮＡが配されるゲノムにより通常は産生されない遺伝子産生物をコードする。
【０００８】
遺伝子組換えは一般的に、ＤＮＡの２つの鎖の間の相同切片の交換である。あるウイルス
10
においてはＲＮＡがＤＮＡを置換する。核酸の相同切片は、ヌクレオチド塩基の同一配列
を有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の切片である。
【０００９】
遺伝子組換えは、感染宿主細胞内の新たなウイルスゲノムの複製中または製造中に自然に
行なわれる。それゆえ、ウイルス遺伝子間の遺伝子組換えは、２つ以上の異なるウイルス
または他の遺伝子構造に共感染せしめられる宿主細胞中に生じるウイルス複製周期中で行
なわれる。第１のゲノムからのＤＮＡの切片は、ＤＮＡが第１のウイルスゲノムの切片と
相同である第２の共感染ウイルスのゲノムの切片を交換可能に構築する際に用いられる。
【００１０】
しかしながら、組換えはまた、完全には相同ではない異なるゲノム中のＤＮＡの切片間に
20
も行なわれる。そのような切片の１つが、例えば、相同ＤＮＡの部分中に挿入される抗原
決定因子をコードする遺伝子または遺伝子マーカーの第１の切片内の存在を除いた別のゲ
ノムの切片と相同な第１のゲノムからのものである場合、組換えがまた行なわれ、次いで
その組換えの産生物は組換えウイルスゲノム中の遺伝子または遺伝子マーカーの存在によ
り検知できる。
【００１１】
改変感染ウイルスによる挿入ＤＮＡ遺伝子配列の一連の発現には２つの条件が必要である
。第１に、改変ウイルスが生存可能であるように、挿入はウイルスの非必須領域中で行な
わなければならない。挿入ＤＮＡの発現の第２の条件は、挿入ＤＮＡに対して適切な関係
二にあるプロモーターの存在である。プロモーターは発現されるＤＮＡは配列から上流に
30
位置するように配されなければならない。
【００１２】
ワクシニアウイルスは、１９８０年に天然痘の世界規模での撲滅となった天然痘に対する
免疫にうまく用いられた。その歴史において、多くのワクシニアの菌株が生じた。これら
の異なる菌株は、変化する免疫抗原性を示し、潜在的な複雑さとともに変化する程度に関
係し、その最も重大なのは、ワクチン後の脳炎と全身性痘疱である（ベーベハニ、１９８
３）。
【００１３】
天然痘の撲滅に関して、異種遺伝子を発現する遺伝子操作したベクターという、ワクシニ
アの新たな役割が重要となった。非常に多くの非相同抗原をコードする遺伝子は、ワクシ
40
ニア中に発現され、しばしば対応病原による抗原投与に対する防御免疫となってきた（タ
ータグリアら、１９９０ａに記載されている）。
【００１４】
ワクシニアベクターの遺伝子の背景は、発現された異種免疫原の防御効果に影響すること
が示されている。例えば、ワクシニアウイルスのイエスワクチン菌株内のエプステインバ
ーウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ３４０の発現は、ＥＢＶウイルス誘発リンパ種に対するコット
ントップタマリンス（ｃｏｔｔｏｎｔｏｐ ｔａｍａｒｉｎｓ）を防御せず、一方ワクシ
ニアウイルスのＷＲ研究所菌株中の同一の遺伝子の発現は防御性であった（モルガンら、
１９８８）。
【００１５】
50
(6)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ワクシニアウイルスベースの組換えワクチン候補の効能と安全性との間の優れたバランス
が特に重要である。組換えウイルスは、ワクチン接種した動物中で棒業免疫応答を引き出
すが、いかなる著しい病原特性も欠如するように免疫原を提供しなければならない。それ
ゆえ、ベクター菌株の弱毒化は技術の現在の状態では非常に望ましい進歩である。
【００１６】
組織培養におけるウイルス増殖に非必須であり、その欠損または不活性化が様々な動物系
における毒性を低減する多くのワクシニア遺伝子が同定されている。
【００１７】
ワクシニアウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子が、地図作成され（フ
ルビーら、１９８２）、配列せしめられている（フルビーら、１９８３；ウィアーら、１
10
９８３）。チミジンキナーゼ遺伝子の不活性化または完全な欠損は、組織培養中の様々な
細胞中のワクシニアウイルスの増殖を妨げない。ＴＫ
− ワクシニアウイルスはまた、様
々な経路により様々な宿主中の接種部位で生体内複製を行なうことができる。
【００１８】
２型単純ヘルペスウイルスに関して、モルモットのＴＫ
＋ − ウイルスの腟内接種は、ＴＫ
ウイルスを接種したよりも、脊髄中で著しく低いウイルス力価となったことが示され
た（スタンベリーら、１９８５）。生体外でＴＫ活性をコードしたヘルペスウイルスは、
活性で代謝している細胞におけるウイルスの増殖には重要ではないが、静止状態の細胞中
のウイルスの増殖には必要であったことが説明されている（ジェイミーソンら、１９７４
）。
20
【００１９】
ＴＫ
− ワクシニアの弱毒化が、大脳内経路と腹腔内経路により接種したマウス中に示さ
れた（ブラーら、１９８５）。ＷＲ神経毒性研究所菌株とイエスワクチン菌株の両者に関
して弱毒化が観察された。皮内経路により接種したマウス中で、ＴＫ
アは、親のＴＫ
＋ − 組換えワクシニ
ワクシニアウイルスと比較して等量の抗ワクシニア中和抗体を産生し
、この試験系において、ＴＫ機能の損失によりワクシニアウイルスベクターの免疫抗原性
を著しくは減少しないことを示した。マウスにＴＫ
− とＴＫ
＋ 組換えワクシニアウイ
ルス（ＷＲ菌株）を鼻腔内接種することに続いて、脳を含む、他の位置へのウイルスの内
転移はそれほど著しくは発見されなかった（テイラーら、１９９１ａ）。
【００２０】
30
ヌクレオチドの代謝に関わる別の酵素は、リボヌクレオチドレダクターゼである。巨大サ
ブユニットをコードする遺伝子の欠損により単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）中のウイル
ス性にコードしたリボヌクレオチドレダクターゼ活性の損失は、生体外の細胞の分裂にお
けるＤＮＡ合成とウイルスの増殖には効果がないことが示され、ウイルスの血清欠乏細胞
での増殖能力を著しく損なった（ゴールドスタインら、１９８８）。眼の急性ＨＳＶ感染
と三又神経節内の再活性化可能潜伏感染のマウスモデルを使用した場合、野生型ＨＳＶに
より示された毒性と比較して、リボヌクレオチドレダクターゼの巨大サブユニットの欠損
したＨＳＶに関して、毒性が減少したことが示された（ジェイコブソンら、１９８９）。
【００２１】
リボヌクレオチドレダクターゼの小さなサブユニット（スラボーグら、１９８８）と巨大
40
ユニット（シュミットら、１９８８）の両方は、ワクシニアウイルス中で同定される。ワ
クシニアウイルスのＷＲ菌株中のリボヌクレオチドレダクターゼの巨大サブユニットの挿
入不活性化により、マウスの頭蓋内接種により測定されたようなウイルスの弱毒化となる
（チャイルドら、１９９０）。
【００２２】
ワクシニアウイルス血球凝集素遺伝子（ＨＡ）を遺伝子地図作成し、配列した（シダ、１
９８６）。ワクシニア憂いするのＨＡ遺伝子は、組織培養中の増殖に非必須である（イチ
ハシら、１９７１）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子を不活性化することにより、頭蓋
内経路により接種した家ウサギ中の神経毒性を減少せしめ、皮内接種の部位での家ウサギ
の病巣をより小さくする（シダら、１９８８）。ＷＲ菌株中の異種遺伝子の挿入（シダら
50
(7)
JP 3602844 B2 2004.12.15
、１９８７）、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン菌株（グオら、１９８９）とリスタ
ー菌株（シダら、１９８８）の誘導にＨＡ座を用いた。異種遺伝子を発現する組換えＨＡ
− ワクシニアウイルスは、免疫抗原性であり（グオら、１９８９；イタムラら、１９９
０；シダら、１９８８；シダら、１９８７）、関連病原による抗原投与に対して防御性で
ある（グオら、１９８９；シダら、１９８７）ことが示された。
【００２３】
牛痘（ブリントンレッド菌株）は、鶏の卵の絨毛尿膜上に赤い（出血性）痘疹を生じる。
牛痘ゲノム内の自発的な欠損により、白色痘疹を生じる変異体を産生する（ピカップら、
１９８４）。出血性機能（ｕ）は、初期遺伝子によりコードされた３８ｋＤａタンパク質
まで遺伝子地図を作成した（ピカップら、１９８６）。セリンプロテアーゼ抑制因子に対
10
して相同性を有するこの遺伝子は、牛痘に対する宿主炎症反応を抑制することが示され（
パランボら、１９８９）、血液凝固の抑制因子である。
【００２４】
ｕ遺伝子はワクシニアウイルスのＷＲ菌株中に存在する（コトワルら、１９８９ｂ）。ｕ
領域が異種遺伝子の挿入により不活性化せしめられたＷＲワクシニアウイルス組換え体を
接種したマウスは、ｕ遺伝子が完全である同様の組換えワクシニアウイルスを接種したマ
ウスと比較して、異種遺伝子産生物に対して高い水準で抗体を産生する（ゾーら、１９９
０）。ｕ領域はワクシニアウイルスのコペンハーゲン菌株中に欠損可欠形状で存在する（
ゲーベルら、１９９０ａ、ｂに報告されている用語法による読取り枠Ｂ１３とＢ１４）。
【００２５】
20
牛痘ウイルスは、細胞質Ａ型封入体（ＡＴＩ）中の感染細胞内に制限される（カトウら、
１９５９）。ＡＴＩの機能は、動物から動物への内転移中の牛痘ウイルスビリオンの防御
であると考えられる（バーゴインら、１９７１）。牛痘ゲノムのＡＴＩ領域は、ＡＴＩボ
ディのマトリックスを形成する１６０ｋＤａタンパク質をコードする（フナハシら、１９
８８；パテルら、１９８７）。ゲノム中に相同領域を含有するけれどもワクシニアウイル
スは一般的にＡＴＩを産生しない。ワクシニアのＷＲ菌株において、ゲノムのＡＴＯ領域
は９４ｋＤａタンパク質として翻訳される（パテルら、１９８８）。ワクシニアウイルス
のコンハーゲン菌株において、ＡＴＩ領域に対応するＤＮＡ配列のほとんどは欠損し、Ａ
ＴＩ領域から上流の配列と融合した領域の残りの３′末端は読取り枠（ＯＲＦ）Ａ２６Ｌ
を形成する（ゴーベルら、１９９０ａ、ｂ）。
30
【００２６】
様々な自発的で（アルテンバーガーら、１９８９；ドリリアンら、１９８１；ライら、１
９８９；モスら、１９８１；パエズら、１９８５；パニカリら、１９８１）操作された（
パーカスら、１９９１；パーカスら、１９９１；パーカスら、１９８６）欠損がワクシニ
アウイルスゲノムの左末端に近くに報告されている。１０ｋｂ自発欠損したワクシニアウ
イルスのＷＲ菌株（モスら、１９８１；パニカリら、１９８１）が、マウスの頭蓋内接種
により弱毒化されたことが示された（ブラーら、１９８５）。この欠損は後に１７の潜在
的なＯＲＦを含むことが示された（コトワルら、１９８８ｂ）。欠損領域内の特異的遺伝
子は、ビロキンＮ１Ｌおよび３５ｋＤａタンパク質を含有する（ゲーベルら、１９９０ａ
、ｂに報告された用語法によるＣ３Ｌ）。Ｎ１Ｌの挿入不活性化は、通常のマウスと裸の
40
マウスの両方の頭蓋内接種により毒性を低減せしめる（コトワルら、１９８９ａ）。３５
ｋＤａタンパク質は、Ｎ１Ｌのようにワクシニアウイルス感染細胞の培地中に分泌される
。このタンパク質は、補体対照タンパク質、特に補体４Ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）の
類に対する相同性を含有する（コトワルら、１９８８ａ）。細胞Ｃ４ｂｐのように、ワク
シニア３５ｋＤａタンパク質は補体の４番目の成分と結合し、典型的な補体カスケードを
抑制する（コトワルら、１９９０）。それゆえ、ワクシニア３５ｋＤａタンパク質は、ウ
イルスが宿主防御機構を避けるのを助けるのに巻き込まれると思われる。
【００２７】
ワクシニアゲノムの左末端は、宿主域遺伝子、Ｋ１Ｌ（ギラードら、１９８６）およびＣ
７Ｌ（パーカスら、１９９０）と同定された２つの遺伝子を含有する。これらの遺伝子の
50
(8)
JP 3602844 B2 2004.12.15
両方を欠損すると、ワクシニアウイルスの様々なヒト細胞株において増殖する能力を低減
せしめる（パーカスら、１９９０）。
【００２８】
鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）は、ポックスウイルス類のアビポックス属の基本型ウイルスであ
る。ウイルスは、弱毒化ワクチンの使用により１９２０年台から良好に制御されているか
きんの経済的に重要な病気を生じる。アビポックスウイルスの複製は、アビアン種に制限
されており（マチュース、１９８２ｂ）、人類を含む非アビアン種における生産的な感染
を生じるウイルスの文献には報告されていない。この宿主制限は、ウイルスの他の種への
伝染に対する固有の安全バリアを提供し、かきんにおけるワクチンベクターとしてＦＰＶ
を使用して魅力的な提案とする。
10
【００２９】
ＦＰＶは好ましくはかきん病原からの抗原を発現するベクターとして用いられている。毒
性アビアンインフルエンザウイルスの血球凝集素タンパク質はＦＰＶ組換え体中で発現さ
れた（テイラーら、１９８８ａ）。組換え体の鶏と七面鳥への接種後、相同または非相同
毒性インフルエンザウイルス抗原投与のいずれかに対して防御的である免疫応答が誘発さ
れた（テイラーら、１９８８ａ）。ニューカッスル病ウイルスの表面糖タンパク質を発現
するＦＰＶ組換え体もまた発達せしめられた（テイラーら、１９９０；エドバウアーら、
１９９０）。
【００３０】
弱毒化ベクターワクチンの使用は、多くの潜在的な長所を示す。ワクチンは製造するのに
20
高価ではなく、多くのかきん病原は潜在的には１つのベクター中に含まれる。免疫原は、
液性および細胞性免疫応答が引き起こせるような確実な方法で免疫システムに提供される
。病気剤は複製していないので、ワクチン接種の側面効果は最小限であり、病気剤の環境
への連続的な再導入は除かれる。
【００３１】
安全性が高められた新たなワクチン菌株を提供することが現在の技術状態よりも非常に望
ましい進歩であることが理解できる。例えば、ウイルスによる遺伝子の発現からのより安
全なワクチンまたはより安全な産生物を提供するためである。
【００３２】
発 明 の 目 的
30
それゆえ本発明の目的は、安全性が高められた改変組換えウイルスを提供することにあり
、さらにそのような組換えウイルスを製造する方法を提供することにある。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、既知の組換えポックスウイルスワクチンと比較して安全性の水
準が高められた組換えポックスウイルスワクチンを提供することにある。
【００３４】
さらに本発明の目的は、宿主中に遺伝子産生物を発現する改変ベクターであって、宿主中
で毒性が弱毒化されるように改変されているベクターを提供することにある。
【００３５】
本発明のもう一つの目的は、安全性の水準が高められた改変ベクターまたは改変組換えウ
40
イルスを用いて生体外培養細胞において遺伝子産生物を発現する方法を提供することにあ
る。本発明のこれらと他の目的並びに利点は、以下の検討後には容易に明確となる。
【００３６】
発 明 の 記 載
本発明は、組換えウイルスの毒性が弱毒化され、安全性が高められるようにウイルスコー
ド遺伝子機能が不活性化された改変組換えウイルスに関するものである。この機能は、非
必須であっても、または毒性に関連であってもよい。ウイルスは好ましくは、ポックスウ
イルス、特に鶏痘ウイルスおよびカナリヤポックスウイルスのようなアビポックスウイル
スまたはワクシニアウイルスである。
【００３７】
50
(9)
JP 3602844 B2 2004.12.15
本発明は、ワクチン接種した宿主動物中に免疫応答を誘発するワクチンに関し、このワク
チンは組換えウイルスが毒性が弱毒化され、安全性が高められるように非必須ウイルスコ
ード遺伝子機能が不活性化された改変組換えウイルスおよび担体を含む。本発明によるワ
クチンに用いられるウイルスは好ましくは、ポックスウイルス、特に鶏痘ウイルスおよび
カナリヤポックスウイルスのようなアビポックスウイルスまたはワクシニアウイルスであ
る。
【００３８】
本発明は、組換えウイルスの毒性が弱毒化され安全性が高められるように非必須ウイルス
コード遺伝子機能が不活性化された改変組換えウイルスを含有する免疫原組成物に関する
ものである。改変組換えウイルスは、ウイルスゲノムの非必須領域内に、病原から誘導さ
10
れた抗原タンパク質をコードする非相同ＤＮＡ配列を含有する。このとき組成物は、宿主
に施された場合、病原によりコードされたタンパク質に特異的な免疫応答を誘発できる。
【００３９】
さらに本発明は、毒性が弱毒化され安全性が高められた改変組換えウイルスを細胞中に導
入することにより生体外培養細胞において遺伝子産生物を発現する方法に関するものであ
る。
【００４０】
さらに本発明は、ウイルスの毒性が弱毒化されるように非必須ウイルスコード遺伝子機能
が不活性化された改変組換えウイルスに関し、この改変組換えウイルスはさらに、ウイル
スゲノムの非必須領域中に非相同源からのＤＮＡを含有する。特に、遺伝子機能は、毒性
20
因子をコードする読取り枠を欠損せしめることにより、または宿主制限ウイルスを自然に
用いることにより不活性化せしめられる。本発明により用いられるウイルスは、好ましく
は、ポックスウイルス、特に鶏痘ウイルスおよびカナリヤポックスウイルスのようなアビ
ポックスウイルスまたはワクシニアウイルスである。好ましくは、その読取り枠は、Ｊ２
Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ、およびＩ４Ｌからなる
群より選択される（ゲーベルら、１９９０ａ、ｂに報告された用語法による）。この点に
関して、読取り枠は、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集
素遺伝子、宿主域遺伝子領域または巨大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼか
らなる。
【００４１】
30
図面の簡単な説明
以下の詳細な記載は、実施例として与えられたものであり、本発明を記載した特定の実施
態様に制限するものではなく、添付した図面とともに理解されよう。
【００４２】
第１図は、チミジンキナーゼ遺伝子の欠損したプラスミドｐＳＤ４６０の構築方法と組換
えワクシニアウイルスｖＰ４１０の産生方法を模式的に示すものである。
【００４３】
第２図は、出血性領域の欠損したプラスミドｐＳＤ４８６の構築方法と組換えワクシニア
ウイルスｖＰ５５３の産生方法を模式的に示すものである。
【００４４】
40
第３図は、ＡＴＩ領域の欠損したプラスミドｐＳＤ４９４Δの構築方法と組換えワクシニ
アウイルスｖＰ６１８の産生方法を模式的に示すものである。
【００４５】
第４図は、血球凝集素の欠損したプラスミドｐＳＤ４６７の構築方法と組換えワクシニア
ウイルスｖＰ７２３の産生方法を模式的に示すものである。
【００４６】
第５図は、遺伝子クラスター［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］の欠損したプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δ
の構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ８０４の産生方法を模式的に示すものである
。
【００４７】
50
(10)
JP 3602844 B2 2004.12.15
第６図は、巨大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼの欠損したプラスミドｐＳ
Ｄ５４８の構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ８８６（ＮＹＶＡＣ）の産生方法を
模式的に示すものである。
【００４８】
第７図は、狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子をＴＫ欠損座中に挿入したプラスミドｐＲＷ８４
２の構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ８７９の産生方法を模式的に示すものであ
る。
【００４９】
第８図は、ＥＢＶトリプル１プラスミド中に挿入されたＥＢＶコード領域の遺伝子地図で
ある。
10
【００５０】
第９図は、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１４）を有する改変合成ワクシニアウイル
スＨ６初期／晩期プロモーターおよび合成ｓｐｓＡｇ遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号
２１３）を示すものである。
【００５１】
第１０図は、組換えワクシニアウイルスｖＰ８５６の構築方法を模式的に示すものである
。
【００５２】
第１１図は、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１６）を有するｕプロモーター／ｌｐｓ
Ａｇ遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号２１５）を示すものである。
20
【００５３】
第１２図は、組換えワクシニアウイルスｖＰ８９６の構築方法を模式的に示すものである
。
【００５４】
第１３図は、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１７）を有するＩ３Ｌプロモーター／Ｓ
１２／コア遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号８７）を示すものである。
【００５５】
第１４図は、組換えワクシニアウイルスｖＰ９１９の構築方法を模式的に示すものである
。
【００５６】
30
第１５図は、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１９）を有するＥＰＶ４２ｋＤａプロモ
ーター／ｌｐｓＡｇ遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号２１８）を示すものである。
【００５７】
第１６図は、Ｃ５ ＯＲＦを含有するカナリヤポックスＰｖｕＩＩ断片のＤＮＡ配列（配
列認識番号２１７）を示すものである。
【００５８】
第１７図は、組換えカナリヤポックスウイルスｖＣＰ６５（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）の構築方
法を模式的に示すものである。
【００５９】
第１８図は、ワクシニアウイルスｖＰ５５５、ｖＰ８２５、ｖＰ９０８、ｖＰ９２３、ｖ
40
Ｐ８５７およびｖＰ８６４に挿入されるＪＥＶコード領域の模式図である。
【００６０】
第１９図は、ワクシニアウイルスｖＰ７６６、ｖＰ７６４、ｖＰ８６９、ｖＰ７２９およ
びｖＰ７２５に挿入されるＹＦコード領域の模式図である。
【００６１】
第２０図は、ワクシニアウイルスｖＰ８６７、ｖＰ９６２およびｖＰ９５５に挿入される
ＤＥＮコード領域の模式図である。
【００６２】
第２１図は、Ｆ８ ＯＲＦを含有するＴＲＯＶＡＣ ＤＮＡの３６６１塩基対断片のヌク
レオチド配列（配列認識番号２２１）を示すものである。
50
(11)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【００６３】
第２２図は、Ｆ７ ＯＲＦを含有するＴＲＯＶＡＣ ＤＮＡの２３５６塩基対断片のＤＮ
Ａ配列（配列認識番号２２２）を示すものである。
【００６４】
第２３図は、ＥＩＶ ＨＡ（Ａ１／プラハ／５６）のヌクレオチド配列（配列認識番号２
７９）を示すものである。
【００６５】
第２４図は、ＥＩＶ ＨＡ（Ａ２／フォンテンブルー／７９）のヌクレオチド配列（配列
認識番号２８４）を示すものである。
【００６６】
10
第２５図は、ＥＩＶ ＨＡ（Ａ２／サフォーク／８９）のヌクレオチド配列（配列認識番
号３００）を示すものである。
【００６７】
第２６図は、ＦｅＬＶ−Ｂエンベロープ遺伝子のヌクレオチド配列（配列認識番号３１０
）を示すものである。
【００６８】
第２７図は、ＦｅＬＶ−Ａｑａｑおよび部分的ｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列（配列認
識番号３２４）を示すものである。
【００６９】
第２８図は、ＦＨＶ−１ＣＯ菌株ｇＳホモログ遺伝子のヌクレオチド配列（配列認識番号
20
２９０）を示すものである。
【００７０】
第２９図は、ｐＵＲＦ３により表されるコンセンサスＦヌクレオチド配列（おたふくかぜ
）（配列認識番号３７０）を示すものである。
【００７１】
第３０図は、ｐＵＨＮ５により表されるコンセンサスＨＮヌクレオチド配列（おたふくか
ぜ）（配列認識番号３７１）を示すものである。
【００７２】
第３１図は、ワクシニアウイルスまたはカナリヤポックスウイルスベクター（ＮＹＶＡＣ
、ＡＬＶＡＣ）もしくはＨＩＶ ＩＩＩ Ｂ ｅｎｖを発現するワクシニアウイルスまた
30
はカナリヤポックスウイルス（ｖＰ９１１、ｖＤＰ１１２）で免疫した、マウスの脾臓細
胞の細胞傷害性応答を示すものである。
【００７３】
第３２図は、細胞傷害性Ｔリンパ球細胞表面抗原Ｔｈｙ１．２およびＬｙｔ２．２に対す
る抗体に対してのｖＣＰ１１２で免疫したマウスの脾臓からの細胞傷害性作動体細胞の感
度を示すものである。
【００７４】
第３３図は、ｇｐ１２０のＨＩＶ ＩＩＩ Ｂ超可変Ｖ３ループのであって、ＨＩＶ Ｍ
ＮまたはＳＦ２のＶ３ループのではない細胞傷害性Ｔリンパ球抗原受容体の特異性を示す
ものである。
40
【００７５】
第３４図は、ベクター（ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ）またはワクシニアウイルス組換え体ｖ
Ｐ９１１またはＨＩＶ−１ ｅｎｖを発現するカナリヤポックス組換え体ｖＣＰ１２で免
疫したマウスのＨＩＶ ＩＩＩ Ｂ ｇｐ１２０に対する抗体応答を示すものである（逆
三角は、２回目の接種を施した時間を示す）。
【００７６】
第３５図は、狂犬病中和抗体力価（ＲＦＦＩＴ、ＩＵ／ｍｌ）のグラフであって、同一の
ワクチンまたは交互のワクチンで事前に免疫した志願者にＨＤＣおよびｖＣＰ６５を追加
抗原投与した効果（１０
５ ． ５ ＴＣＩＤ５０）を示すものである（ワクチンは０、２８
および１８０日目に与え、抗体力価は０、７、２８、３５、５６、１７３、１８７および
50
(12)
JP 3602844 B2 2004.12.15
２０８日に測定した）。
【００７７】
第３６図は、ｖＰ９０８、ｖＰ５５５、ｖＰ９２３およびｖＰ８２９中に含有せしめられ
たＪＥＶ ｃＤＮＡ配列を示すものである。
【００７８】
第３７図は、０日と２８日にｖＰ９０８、ｖＰ９２３、ｖＰ８６６およびＰＢＳで免疫し
たブタに観察されたＮＥＵＴおよびＨＡＩ活性を示すものである（矢印は接種の日を示す
）。
【００７９】
第３８図は、ＰＢＳ、ｖＰ８６６、ｖＰ９０８またはｖＰ９２３で免疫し、ＪＥＶのＢ−
10
２３５８／８４菌株で抗原投与した各群の個々のブタに検出したウイルス血症の時間の経
過を示すものである。
【００８０】
第３９図は、ＮＹＶＡＣを産生するのに欠損したＯＲＦを模式的に示したものである。
【００８１】
発明の詳細な説明
新たなワクシニアワクチン菌株、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）を開発するために、ワクシニ
アウイルスのコペンハーゲンワクチン菌株を、既知のまたは潜在的な毒性因子をコードす
るゲノムの６つの非必須領域を欠損せしめることにより改変した。この配列欠損は以下に
詳細に示す。ワクシニア制限断片、読取り枠およびヌクレオチド位置の全ての名称は、ゲ
20
ーベルら、１９９０ａ、ｂに報告された用語法に基づくものである。
【００８２】
欠損座はまた、異種遺伝子の挿入の受容体座として作成された。
【００８３】
ＮＹＶＡＣ中の欠損領域を以下に示す。また、短縮型および欠損領域の読取り枠の名称（
ゲーベルら、１９９０ａ、ｂ）並びに下記に特性される全ての欠損を含むワクシニア組換
え体（ｖＰ）の名称も記載する：
（１） チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖＰ４１０；
（２） 出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３；
（３） Ａ型封入体領域（ＡＴＩ；Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８；
30
（４） 血球凝集素遺伝子（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）ｖＰ７２３；
（５） 宿主域遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）ｖＰ８０４；
（６） 巨大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼ（Ｉ４Ｌ）ｖＰ８６６（ＮＹ
ＶＡＣ）。
【００８４】
ＤＮＡクローニングおよび合成
プラスミドを構築し、スクリーニングして、標準方法により増殖せしめた（マニアチスら
、１９８２；パーカスら、１９８５；ピッチーニら、１９８７）。制限エンドグルカナー
ゼを、ＭＤ、ゲセルスバーグ、ベセスダリサーチラボラトリーズ；ＭＡ、ビバーリー、ニ
ューイングランドバイオラボ；およびＩＮ、インディアナポリス、ベーリンガーマンハイ
40
ムバイオケミカルスから得た。Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片を、ベーリンガ
ーマンハイムバイオケミカルスから得た。ＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼおよびファー
ジＴ４ ＤＮＡリガーゼをニューイングランドバイオラボから得た。様々な供給者により
明示された試薬を用いた。
【００８５】
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを、前述のようにバイオサーチ８７５０または応用
バイオシステム３８０Ｂ
ＤＮＡシンセサイザーで調製した（パーカスら、１９８９）。前述したように（グオら、
１９８９）シーケナーゼを用いて（タボアら、１９８７）、ジデオキシ鎖終了法（サンガ
ーら、１９７７）によりＤＮＡ塩基配列決定を行なった。自動パーキンエルマーセタスＤ
50
(13)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ＮＡサーマルサイクラー中で、注文合成オリゴヌクレオチドプライマーとジェネアンプＤ
ＮＡ増幅試薬キット（ＣＴ、ノルウォーク、パーキンエルマーセタス）を用いて、配列確
認のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅（エンゲルケら、１９８８
）を行なった。制限エンドヌクレアーゼ切断および続いてのＢＡＬ−１３エキソヌクレア
ーゼによる制限切断並びに合成オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発（マンデッキ、
１９８６）によりプラスミドから過剰のＤＮＡ配列を欠損せしめた。
【００８６】
細胞、ウイルス、およびトランスフェクション
ワクシニアウイルスのコペンハーゲン菌株の培養の起源と条件は以前に記載した（グオら
、１９８９）。ニトロセルロースフィルターの現場での雑種形成、組換え、およびＢ−ガ
10
ラクトシダーゼ活性のスクリーニングによる組換えウイルスの産生は以前に記載している
（パニカリら、１９８２；パーカスら、１９８９）。
【００８７】
説明のために示した以下の実施例により、本発明および多くの利点がよりよく理解される
であろう。
【００８８】
実施例１−チミジンキナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）の欠損したプラスミドｐＳＤ４６０の構築
ここで第１図を参照する。プラスミドｐＳＤ４０６はｐＵＣ８中にクローンされたワクシ
ニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｊ（位置８３３５９−８８３７７）を含有している。ｐＳＤ４０６
をＨｉｎｄＩＩＩとＰｖｕＩＩで切断し、ｐＵＣ８中にクローンされたＨｉｎｄＩＩＩ 20
Ｊの左側からの１．７ｋｂ断片をＨｉｎｄ／ＳｍａＩで切断し、ｐＳＤ４４７を形成した
。ｐＳＤ４４７はＪ２Ｒの完全な遺伝子を含有している（位置８３８５５−８４３８５）
。開始コドンはＮｌａＩＩＩ部位内に含有され、終止コドンはＳｓｐＩ部位内に含有され
る。第１図の矢印により転写の方向を示す。
【００８９】
左側フランキングアームを得るために、０．８ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片を
ｐＳＤ４４７から単離し、次いでＮｌａＩＩＩで切断し、０．５ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ／Ｎ
ｌａＩＩＩ断片を単離した。アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４３／ＭＰ
ＳＹＮ４４（配列認識番号１／配列認識番号２）
【化１】
30
をＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ１８ベクタープラスミド中で０．５ｋｂ
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片と連結し、プラスミドｐＳＤ４４９を産生した。
【００９０】
ワクシニア右側フランキングアームとｐＵＣベクター配列を含有する制限断片を得るため
に、ワクシニア配列内のＳｓｐＩ（部分的）とｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＨｉｎｄＩ
ＩＩでｐＳＤ４４７を切断し、２．９ｋｂベクター断片を単離した。このベクター断片を
アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４５／ＭＰＳＹＮ４６（配列認識番号３
／配列認識番号４）
【化２】
40
(14)
JP 3602844 B2 2004.12.15
と連結し、ｐＳＤ４５９を産生した。
【００９１】
左側と右側フランキングアームを１つのプラスミド中に結合させるために、０．５ｋｂ 10
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ断片をｐＳＤ４４９から単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで
切断したｐＳＤ４５９ベクタープラスミドと連結し、プラスミドｐＳＤ４６０を産生した
。ｐＳＤ４６０は、野生型親ワクシニアウイルスコペンハーゲン菌株ＶＣ−２との組換え
の供与体プラスミドとして用いた。テンプレートととしてのＭＰＳＹＮ４５（配列認識番
号３）とプライマーとしての相補的２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４７（配列
認識番号５）（５′ＴＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣ３′）を用いたプライマ
ー延長により
３ ２
Ｐ標識プローブを合成した。組換えウイルスｖＰ４１０をプラークハイ
ブリダイゼーションにより同定した。
【００９２】
実施例２−出血性領域の欠損したプラスミドｐＳＤ４８６の構築（Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４）
20
ここで第２図を参照する。プラスミドｐＳＤ４１９はｐＵＣ８中にクローンされたワクシ
ニアＳａｌＩ Ｇ（位置１６０，７４４−１７３，３５１）を含有している。ｐＳＤ４２
２はｐＵＣ８中にクローンされた、右側への隣接ワクシニアＳａｌＩ断片、ＳａｌＩ Ｊ
（位置１７３，３５１−１８２，７４６）を含有している。出血性領域、ｕ、Ｂ１３Ｒ−
Ｂ１４Ｒ（位置１７２，５４９−１７３，５５２）の欠損したプラスミドを構築するため
に、左側フランキングアームの供給源としてｐＳＤ４１９を用い、右側フランキングアー
ムの供給源としてｐＳＤ４２２を用いた。ｕ領域の転写方向を第２図の矢印で示す。
【００９３】
ｐＳＤ４１９からの不必要な配列を除去するために、ＮｃｏＩ／ＳｍａＩによりｐＳＤ４
１９の切断によりＮｃｏＩ部位（位置１７２，２５３）の左側までの配列を除去し、続い
30
てＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片によるブラントエンド並びに連結を行ないプ
ラスミドｐＳＤ４７６を産生した。Ｂ１４Ｒの終止コドンでのＨｐａＩでのｐＳＤ４２２
の切断と右側の０．３ｋｂのＮｒｕＩでの切断によりワクシニア右側フランキングアーム
を得た。この０．３ｋｂ断片を単離して、ｐＳＤ４７６から単離した３．４ｋｂ Ｈｉｎ
ｃＩＩベクター断片と連結し、プラスミドｐＳＤ４７７を産生した。ｐＳＤ４７７のワク
シニアｕ領域の部分的な欠損位置を三角形により示す。ＣｌａＩ／ＨｐａＩでの切断によ
り、ｐＳＤ４７７中の残りのＢ１３Ｒコード配列を除去し、生成したベクター断片をアニ
ールした合成オリゴヌクレオチドＳＤ２２ｍｅｒ／ＳＤ２０ｍｅｒ（配列認識番号６／配
列認識番号７）
【化３】
40
と連結し、ｐＳＤ４７９を産生した。ｐＳＤ４７９は開始コドン（下線）と続いてＢａｍ
ＨＩ部位を含有している。ｕプロモーターの制御下でＢ１３−Ｂ１４（ｕ）欠損座中にＥ
．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼを配するために、ベータガラクトシダーゼを含有する
３．２ｋｂ ＢａｍＨＩ断片をｐＳＤ４７９のＢａｍＨＩ部位中に挿入し、ｐＳＤ４７９
ＢＧを生成した。ｐＳＤ４７９ＢＧは、ワクシニアウイルスｖＰ４１０による組換えの供
与体プラスミドとして用いた。組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３を、色素基体Ｘ−ｇ
ａｌの存在下でブループラークとして単離した。ｖＰ５３３において、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４
50
(15)
JP 3602844 B2 2004.12.15
Ｒ領域は欠損しており、ベータガラクトシダーゼにより置換されている。
【００９４】
ｖＰ５３３からベータガラクトシダーゼ配列を除去するために、ポリリンカー領域を含有
するがｕ欠損接合部には開始コドンを含有しないｐＳＤ４７７の誘導体、プラスミドｐＳ
Ｄ４８６を用いた。最初に上述したｐＳＤ４７７からのＣｌａＩ／ＨｐａＩベクター断片
をアニールした合成オリゴヌクレオチドＳＤ４２ｍｅｒ／ＳＤ４０ｍｅｒ（配列認識番号
８／配列認識番号９）
【化４】
10
と連結し、プラスミドｐＳＤ４７８を産生した。次に、ｐＳＤ４７８をＥｃｏＲＩでの切
断によりｐＵＣ／ワクシニア接合でのＥｃｏＲＩ部位を破壊し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリ
メラーゼのクレノウ断片でのブラントエンド並びに連結を行ないプラスミドｐＳＤ４７８
Ｅ
− を産生した。ｐＳＤ４７８Ｅ
− をＢａｍＨＩとＨｐａＩで切断し、アニールした
合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５／ＨＥＭ６（配列認識番号１０／配列認識番号１１）
【化５】
20
と連結し、プラスミドｐＳＤ４８６を産生した。ｐＳＤ４８６を、組換えワクシニアウイ
ルスｖＰ５３３との組換えのための供与体プラスミドとして用い、ｖＰ５５３を産生し、
これをＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。
【００９５】
実施例３−ＡＴＩ領域（Ａ２６Ｌ）の欠損したプラスミドｐＭＰ４９４Δの構築ここで第
３図を参照する。ｐＳＤ４１４はｐＵＣ８中にクローニングされたＳａｌＩ Ｂを含有し
ている。Ａ２６Ｌ領域の左側の不必要なＤＮＡ配列を除去するために、ｐＳＤ４１４を、
ワクシニア配列内のＸｂａＩ（位置１７３，０７９）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部で
30
のＨｉｎｄＩＩＩで切断し、次いでＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片でブラント
エンドして連結し、プラスミドｐＳＤ４８３を産生した。Ａ２６Ｌ領域の右側の不必要な
ＤＮＡ配列を除去するために、ｐＳＤ４８３をＥｃｏＲＩ（位置１４０，６６５およびｐ
ＵＣ／ワクシニア接合部）で切断して連結し、プラスミドｐＳＤ４８４を形成した。Ａ２
６Ｌコード領域を除去するために、Ａ２６Ｌ ＯＲＦからや上流のＮｄｅＩ（部分的）（
位置１３９，００４）およびＡ２６Ｌ ＯＲＦのやや下流のＨｐａＩ（位置１３７，８８
９）で切断した。５．２ｋｂベクター断片を単離して、アニールした合成オリゴヌクレオ
チドＡＴＩ３／ＡＴＩ４（配列認識番号１２／配列認識番号１３）
【化６】
40
と連結し、Ａ２６Ｌから上流の領域を再構築し、上記したようにＡ２６Ｌ ＯＲＦを、制
限部位ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩを含有する短いポリリンカー領域と置換し
た。生成したプラスミドをｐＳＤ４８５と称した。ｐＳＤ４８５のポリリンカー領域中の
ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位は特有ではないので、ＢｇｌＩＩ（位置１４０，１３６
50
(16)
JP 3602844 B2 2004.12.15
）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＥｃｏＲＩで切断により望ましくないＢｇｌＩＩ
およびＥｃｏＲＩ部位をプラスミドｐＳＤ４８３（上述）から除去し、続いてＥ．ｃｏｌ
ｉポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンド並びに連結した。産生したプラスミドを
ｐＳＤ４８９と称した。Ａ２６Ｌ ＯＲＦを含有するｐＳＤ４８９からの１．８ｋｂ Ｃ
ｌａＩ（位置１３７，１９８）／ＥｃｏＲＶ（位置１３９，０４８）断片を、ｐＳＤ４８
５からの対応０．７ｋｂポリリンカー含有ＣｌａＩ／ＥｃｏＲＶ断片と置換してｐＳＤ４
９２を産生した。ｐＳＤ４９２のポリリンカー領域中のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位
は特有である。
【００９６】
ワクシニア１１ｋＤａプロモーターの制御下で（バートレットら、１９８５；パーカスら
10
、１９９０）Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（シャピラら、１９８３）を含
有する３．３ｋｂ ＢｇｌＩＩカセットをｐＳＤ４９２のＢｇｌＩＩ部位に挿入し、ｐＳ
Ｄ４９３ＫＢＧを形成した。プラスミドｐＳＤ４９３ＫＢＧは救助（ｒｅｓｃｕｉｎｇ）
ウイルスｖＰ５５３との組換えに用いた。Ａ２６Ｌ欠損領域中にベータガラクトシダーゼ
を含有する組換えワクシニアウイルス、ｖＰ５８１を、Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラ
ークとして単離した。
【００９７】
ワクシニア組換えウイルスｖＰ５８１からのベータガラクトシダーゼを除去したプラスミ
ドを産生するために、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ１７７（配列認識番号１４）
【化７】
20
を用いた突然変異誘発（マンデッキ、１９８６）によりプラスミドｐＳＤ４９２のポリリ
ンカー領域を欠損した。産生したプラスミド、ｐＭＰ４９４Δにおいて、完全なＡ２６Ｌ
ＯＲＦを含有し、位置［１３７，８８９−１３８，９３７］を包含するワクシニアＤＮ
Ａは欠損している。ｐＭＰ４９４Δとワクシニア組換え体、ｖＰ５８１を含有するベータ
ガラクトシダーゼとの間の組換えによりワクシニア欠損変異体ｖＰ６１８を産生し、これ
はＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。
【００９８】
実施例４−血球凝集素遺伝子（Ａ５６Ｒ）の欠損したプラスミドｐＳＤ４６７の構築
30
ここで第４図を参照する。ワクシニアＳａｌＩ Ｇ制限断片（位置１６０，７４４−１７
３，３５１）はＨｉｎｄＩＩＩ Ａ／Ｂ接合部（位置１６２，５３９）と交差している。
ｐＳＤ４１９はｐＵＣ８中にクローニングされたワクシニアＳａｌＩ Ｇを含有している
。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写方向を第４図に矢印で示す。ｐＳＤ４１９をワクシニ
ア配列内とｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ Ｂから誘導したワクシニア配列を除去し、続いて連結した。産生したプラスミ
ドｐＳＤ４５６は、左側の０．４ｋｂのワクシニア配列と右側の０．４ｋｂのワクシニア
配列を側腹に有するＨＡ遺伝子、Ａ５６Ｒを含有している。ｐＳＤ４５６を、Ａ５６Ｒコ
ード配列から上流のＲｓａＩ（部分的；位置１６１，０９０）、および遺伝子の末端近く
のＥａｑＩ（位置１６２，９５４）で切断することによりＡ５６Ｒコード配列を除去した
。ｐＳＤ４５６からの３．６ｋｂ ＲｓａＩ／ＥａｑＩベクター断片を単離し、アニール
した合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９（配列認識番号１５）、ＭＰＳＹＮ６２（配
列認識番号１６）、ＭＰＳＹＮ６０（配列認識番号１７）、およびＭＰＳＹＮ６１（配列
認識番号１８）
【化８】
40
(17)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
と連結し、Ａ５６Ｒ ＯＲＦから上流のＤＮＡ配列を再構築し、上記のごとく示したよう
にＡ５６Ｒ ＯＲＦをポリリランカー領域で置換した。産生したプラスミドはｐＳＤ４６
６である。ｐＳＤ４６６中のワクシニア欠損は、位置［１６１，１８５−１６２，０５３
］を包含する。ｐＳＤ４６６中の欠損部位を第４図に三角形で示す。
【００９９】
ワクシニア１１ｋＤａプロモーターの制御下で（バートレットら、１９８５；グオら、１
９８９）Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（シャピラら、１９８３）を含有す
る３．２ｋｂ ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ（部分的）カセットを、ｐＳＤ４６６のＢｇｌＩ
20
Ｉ部位に挿入し、ｐＳＤ４６６ＫＢＧを形成した。プラスミドｐＳＤ４６６ＫＢＧは、救
助ウイルスｖＰ６１８との組換えに用いた。Ａ５６Ｒ欠損中にベーカダラクトシダーゼを
含有する組換えワクシニアウイルス、ｖＰ７０８を、Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラー
クとして単離した。
【０１００】
供与体プラスミドｐＳＤ４６７を用いてベータガラクトシダーゼ配列をｖＰ７０８から欠
損した。ｐＳＤ４６６をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＧＩで切断することにより、ｐＵＣ／ワクシ
ニア接合部からＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ部位を除去し、続いてＥ．ｃｏｌ
ｉポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドし、連結したことを除いては、ｐＳＤ４
６７はｐＳＤ４６６と同一である。ｖＰ７０８とｐＳＤ４６７との間の組換えにより、組
30
換えワクシニア欠損変異体、ｖＰ７２３を産生し、これはＸ−ｇａｌの存在下で透明プラ
ークとし単離した。
【０１０１】
実施例５−読取り枠［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］の欠損したプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構築
ここで第５図を参照する。ｐＭＰＣＳＫ１Δの構築に、以下のワクシニアクローンを用い
た。ｐＳＤ４２０はｐＵＣ８中にクローニングされたＳａｌＩ Ｈである。ｐＳＤ４３５
はｐＵＣ１８中にクローニングされたＫｐｎＩ Ｆである。ｐＳＤ４３５をＳｐｈＩで切
断し、再連結し、ｐＳＤ４５１を形成した。ｐＳＤ４５１において、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ
中のＳｐｈＩ部位（位置２７，４１６）の左側のＤＮＡ配列を除去する（パーカスら、１
９９０）。ｐＳＤ４０９はｐＵＣ８中にクローニングされたＨｉｎｄＩＩＩ Ｍである。
【０１０２】
ワクシニアからの［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］遺伝子クラスターの欠損した基体を提供するために
、Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼを以下のようにワクシニアＭ２Ｌ欠損座（グオら
、１９９０）中に最初に挿入した。ｐＳＤ４０９のＢｇｌＩＩ部位を除去するために、ワ
クシニア配列のＢｇｌＩＩ（位置２８，２１２）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＢ
ａｍＨＩで切断し、次いで連結し、プラスミドｐＭＰ４０９Ｂを形成した。ｐＭＰ４０９
Ｂを特有ＳｐｈＩ部位（位置２７，４１６）で切断した。合成オリゴヌクレオチドＭＰＳ
ＹＮ８２（配列認識番号１９）
【化９】
40
(18)
JP 3602844 B2 2004.12.15
を用いた突然変異誘発（グオら、１９９０；マンデッキ、１９８６）によりＭ２Ｌコード
配列を除去した。産生したプラスミド、ｐＭＰ４０９Ｄは、上記のようにＭ２Ｌ欠損座中
に挿入された特有ＢｇｌＩＩ部位を含有した。１１ｋＤａプロモーターの制御下で（バー
トレットら、１９８５）Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（シャピラら、１９
８３）を含有する３．２ｋｂ ＢａｍＨＩ（部分的）／ＢｇｌＩＩカセットをＢｇｌＩＩ
で切断したｐＭＰ４０９Ｄ中に挿入した。産生したプラスミドｐＭＰ４０９ＤＢＧ（グオ
ら、１９９０）を救助ワクシニアウイルスｖＰ７２３により組換えの供与体プラスミドと
10
して用いた。Ｍ２Ｌ欠損座中に挿入されたベータガラクトシダーゼを含有する組換えワク
シニアウイルス、ｖＰ７８４を、Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。
【０１０３】
ワクシニア遺伝子［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］の欠損したプラスミドを、ＳｍａＩ、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断したｐＵＣ８中に組み入れ、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片でブラン
トエンドした。ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｃ配列からなる左側フランキングアームを、
ｐＳＤ４２０をＸｂａＩ（位置１８，６２８）で切断することにより得て、Ｅ．ｃｏｌｉ
ポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドしてＢｇｌＩＩ（位置１９，７０６）で切
断した。ｐＳＤ４５１をＢｇｌＩＩ（位置２９，０６２）とＥｃｏＲＶ（位置２９，７７
８）で切断することにより、ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ配列からなる右側フランキン
20
グアームを得た。産生したプラスミド、ｐＭＰ５８１ＣＫは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｃ中のＢ
ｇｌＩＩ部位（位置１９，７０６）とＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ中のＢｇｌＩＩ部位（位置２９
，０６２）の間のワクシニア配列が欠損している。プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫ中のワク
シニア配列の欠損部位を第５図に三角形で示す。
【０１０４】
ワクシニア欠損接合部の過剰のＤＮＡを除去するために、プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫを
ワクシニア配列内のＮｃｏＩ部位（位置１８，８１１；１９，６５５）で切断し、Ｂａｌ
−３１エキソクレアーゼで処理し、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２３３（配列認識
番号２０）
【化１０】
30
を用いて突然変異誘発（マンデッキ、１９８６）を行なった。産生したプラスミド、ｐＭ
ＰＣＳＫ１Δは、１２ワクシニア読取り枠［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を包含する、ワクシニア配
列位置１８，８０５−２９，１０８が欠損している。ｐＭＰＣＳＫ１Δとワクシニア組換
え体、ｖＰ７８４を含有するベーダラクトシダーゼとの間の組換えによりワクシニア欠損
変異体、ｖＰ８０４が産生し、これはＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した
。
【０１０５】
実施例６−巨大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼ（Ｉ４Ｌ）の欠損したプラ
40
スミドｐＳＤ５４８の構築
ここで第６図を参照する。プラスミドｐＳＤ４０５は、ｐＵＣ８中にクローンされたワク
シニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｉ（位置６３，８７５−７０，３６７）を含有している。ｐＳＤ
４０５をワクシニア配列（位置６７，９３３）内のＥｃｏＲＶおよびｐＵＣ／ワクシニア
接合部でのＳｍａＩで切断し、連結し、プラスミドｐＳＤ５１８を形成した。ｐＳＤ５１
８は、ｐＳＤ５４８の構築に用いる全てのワクシニア制限断片の供給源として用いた。
【０１０６】
ワクシニアＩ４Ｌ遺伝子は、位置６７，３７１−６５，０５９に亘り延びる。Ｉ４Ｌの転
写方向を第６図の矢印で示した。Ｉ４Ｌコード配列の部分が欠損したベクタープラスミド
断片を得るために、ｐＳＤ５１８をＢａｍＨＩ（位置６５，３８１）とＨｐａＩ（位置６
50
(19)
JP 3602844 B2 2004.12.15
７，００１）で切断し、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエン
ドした。この４．８ｋｂベクター断片を、ワクシニア１１ｋＤａプロモーターの制御下で
（バートレット、１９８５；パーカスら、１９９０）Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダー
ゼ遺伝子（シャピラら、１９８３）を含有する３．２ｋｂ ＳｍａＩカセットと連結し、
プラスミドｐＳＤ５２４ＫＢＧを産生した。ｐＳＤ５２４ＫＢＧは、ワクシニアウイルス
ｖＰ８０４との組換えの供与体プラスミドとして用いた。Ｉ４Ｌ遺伝子の部分的欠損中に
ベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルス、ｖＰ８５５を、Ｘ−ｇａ
ｌの存在下でブループラークとして単離した。
【０１０７】
ｖＰ８５５からのＩ４Ｌ ＯＲＦの残りとベータガラクトシダーゼを欠損するために、欠
10
損プラスミドｐＳＤ５４８を構築した。以下に示すように左側と右側のワクシニアフラン
キングアームをｐＵＣ８中で別々に組み立て、これを第６図に模式的に示した。
【０１０８】
左側ワクシニアフランキングアームを受け入れるベクタープラスミドを構築するために、
ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド５１
８Ａ１／５１８Ａ２（配列認識番号２１／配列認識番号２２）
【化１１】
20
と連結し、プラスミドｐＳＤ５３１を形成した。ｐＳＤ５３１をＲｓａＩ（部分的）とＢ
ａｍＨＩで切断し、２．７ｋｂベクター断片を単離した。ｐＳＤ５１８をＢｇｌＩＩ（位
置６４，４５９）／ＲｓａＩ（位置６４，９９４）で切断し、０．５ｋｂ断片を単離した
。２つの断片をともに連結し、ｐＳＤ５３７を形成した。このｐＳＤ５３７はＩ４Ｌコー
ド配列の左側の完全なワクシニアフランキングアームを含有する。
【０１０９】
30
右側のワクシニアフランキングアームを受け入れるベクタープラスミドを構築するために
、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド５
１８Ｂ１／５１８Ｂ２（配列認識番号２３／配列認識番号２４）
【化１２】
40
と連結し、プラスミドｐＳＤ５３２を形成した。ｐＳＤ５３２をＲｓａＩ（部分的）／Ｅ
ｃｏＲＩで切断し、２．７ｋｂベクター断片を単離した。ｐＳＤ５１８を、ワクシニア配
列内のＲｓａＩ（位置６７，４３６）およびワクシニア／ｐＵＣ接合部のＥｃｏＲＩで切
断し、０．６ｋｂ断片を単離した。２つの断片をともに連結し、ｐＳＤ５３８を形成した
。このｐＳＤ５３８はＩ４Ｌコード配列の右側の完全なワクシニアフランキングアームを
含有する。
【０１１０】
ｐＳＤ５３８からの０．６ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片として右側ワクシニアフラ
ンキングアームを単離して、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで切断したｐＳＤ５３７ベクタープ
50
(20)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ラスミド中に連結した。産生したプラスミド、ｐＳＤ５３９において、Ｉ４Ｌ ＯＲＦ（
位置６５，０４７−６７，３８６）は、全てｐＵＣバックグラウンドにおいて左側の０．
６ｋｂのワクシニアＤＮＡと右側に０．６ｋｂのワクシニアＤＮＡを側腹に有するポリリ
ンカー領域により置換される。ワクシニア配列内の欠損部位を第６図に三角形で示す。ｐ
ＳＤ５３９のｐＵＣ誘導部分中のベータガラクトシダーゼ配列と組換えワクシニアウイル
スｖＰ８５５内のベータガラクトシダーゼ配列との潜在的な組換えを避けるために、ワク
シニアＩ４Ｌ欠損カセットをｐＳＤ５３９から、全てのベータガラクトシダーゼ配列が除
去されポリリンカー領域と置換されたｐＵＣ誘導体である、ｐＲＣ１１中にトランスフェ
クションした（コリナスら、１９９０）。ｐＳＤ５３９をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断し
、１．２ｋｂ断片を単離した。この断片をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断したｐＲＣ１１（
10
２．３５ｋｂ）中に連結し、ｐＳＤ５４８を形成した。ｐＳＤ５４８とワクシニア組換え
体、ｖＰ８５５を含有するベータガラクトシダーゼとの間の組換えにより、ワクシニア欠
損変異体ｖＰ８６６を産生し、これはＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した
。
【０１１１】
組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６からのＤＮＡを、制限切断と、続いてアガロースゲ
ルでの電気泳動により分析した。制限模様は予期した通りであった。テンプレートとして
のｖＰ８６６と上述した６つの欠損座を側腹に有するプライマーを用いたポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）（エンゲルケら、１９８８）により、予期したサイズのＤＮＡ断片が産
生された。欠損接合部の区域辺りのＰＣＲ産生断片の配列分析により、接合部が予期した
20
ものであることが確認された。上述したような６つの作成した欠損を含有する組換えワク
シニアウイルスｖＰ８６６はワクシニアワクチン菌株「ＮＹＶＡＣ」と称した。
【０１１２】
実施例７−狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子のＮＹＶＡＣへの挿入
ワクシニアＨ６プロモーター（テイラーら、１９８８ａ、ｂ）の制御下で遺伝子コード狂
犬病糖タンパク質ＧをＴＫ欠損プラスミドｐＳＤ５１３中に挿入した。ｐＳＤ５１３は、
ポリリンカー領域の存在を除いてはプラスミドｐＳＤ４６０（第１図）と同一である。
【０１１３】
ここで第７図を参照する。ｐＳＤ４６０をＳｍａＩで切断し、プラスミドベクターをアニ
ールした合成オリゴヌクレオチドＶＱ１Ａ／ＶＱ１Ｂ（配列認識番号２５／配列認識番号
30
２６）
【化１３】
と連結することによりポリリンカー領域を挿入し、ベクタープラスミドｐＳＤ５１３を形
成した。ｐＳＤ５１３をＳｍａＩで切断し、ワクシニアＨ６プロモーターの制御下で狂犬
病糖タンパク質Ｇ遺伝子をコードする遺伝子を含有するＳｍａＩ末端１．８ｋｂカセット
と連結した（テイラーら、１９８８ａ、ｂ）。産生したプラスミドをｐＲＷ８４２と称す
40
る。ｐＲＷ８４２を、ＮＹＶＡＣ救助ウイルス（ｖＰ８６６）との組換えの供与体プラス
ミドとして用いた。狂犬病糖タンパク質Ｇコード配列に対する
３ ２
Ｐ標識ＤＮＡプローブ
を用いてプラークハイブリダイゼーションにより同定した。
【０１１４】
本発明の改変組換えウイルスは、組換えワクチンベクターとしての利点を提供する。ベク
ターの毒性が弱毒化したことにより、ワクチン接種した個体のワクチン接種により手に負
えない（ｒｕｎａｗａｙ）感染の可能な機会が減少し、またワクチン接種した個体からワ
クチン接種していない個体への伝染または環境の汚染が減少する。
【０１１５】
改変組換えウイルスはまた好ましくは、細胞中の遺伝子産生物をコードし発現する異種Ｄ
50
(21)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ＮＡを有する改変組換えウイルスを細胞中に導入することにより、生体外で培養した細胞
中に遺伝子産生物を発現する方法に用いられる。
【０１１６】
実施例８−ニューカッスル病ウイルスの血球凝集素ノイラミニターゼ糖タンパク質と融合
を発現するＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶの構築
毒性ＮＤＶ菌株テキサスのＦおよびＨＮ遺伝子の両方を発現する鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）
ベクターを構築した。産生した組換え体はＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶと称した。ＴＲＯＶＡＣ
−ＮＤＶは組換えウイルスに感染したアビアン細胞中の確実に処理したＮＤＶ糖タンパク
質を発現し、生後１日のひなに接種することにより続いての毒性ＮＤＶ抗原投与に対して
防御を与える。
10
【０１１７】
細胞およびウイルス
ＮＤＶのテキサス菌株は短潜伏期性菌株である。ＦおよびＨＮ遺伝子のｃＤＮＡクローン
の調製は前に記載してある（テイラーら、１９９０；エドバウアーら、１９９０）。ＦＰ
Ｖ選定ＦＰ−１の菌株は前に記載してある（テイラーら、１９８８ａ）。生後１日のひな
のワクチン接種に有用なのは弱毒化ワクチン菌株である。親ウイルス菌株デュベッティは
、鶏からの鶏痘かさぶたとしてフランスで得られた。ふ化鶏卵での約５０連続の継代接種
と続いての鶏繊維芽細胞での約２５回の継代接種によりウイルスは弱毒化された。ウイル
スに４連続のプラーク精製を施した。１つのプラーク単離体をさらに初代ＣＥＦ細胞中で
増幅し、ＴＲＯＶＡＣと称する同種菌を作成した。ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶを産生する生体
20
内組換え試験に用いられる同種ウイルスに、プラーク単離体からの初代ＣＥＦ細胞中で１
２回継代接種を施した。
【０１１８】
ＮＤＶ−Ｆのカセットの構築
Ｆタンパク質コード配列の５′末端からの２２ヌクレオチド以外の全てを含有する１．８
ｋｂｐ ＢａｍＨＩ断片をｐＮＤＶ８１（テイラーら、１９９０）から切除し、ｐＵＣ１
８のＢａｍＨＩ部位で挿入し、ｐＣＥ１３を形成した。ｐＣＥ１３をＳａｌＩで切断し、
付着末端をＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で充填し、ＨｉｎｄＩＩＩ
で切断することにより、上述したワクシニアウイルスＨ６プロモーター（テイラーら、１
９８８ａ、ｂ；グオら、１９８９；パーカスら、１９８９）をｐＣＥ１３中に挿入した。
30
Ｈ６プロモーター配列を含有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＣＥ１３中に挿入
し、ｐＣＥ３８を形成した。ｐＣＥ３８をＫｐｎＩとＮｒｕＩで切断し、アニールしキナ
ーゼした（ｋｉｎａｓｅｄ）オリゴヌクレオチドＣＥ７５（配列認識番号２７）とＣＥ７
６（配列認識番号２８）を挿入することにより完全な５′末端を産生し、ｐＣＥ４７を産
生した。
【０１１９】
【化１４】
40
ＮＤＶ−Ｆの３′末端から非コード配列を除去するために、ｐＣＥ１３からのＳｍａＩか
らＰｓｔＩ断片をｐＵＣ１８のＳｍａＩとＰｓｔＩ部位に挿入し、ｐＣＥ２３を形成した
。ｐＣＥ２３のＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、エキソクレアーゼＩＩＩ、ＳＩヌクレアーゼおよ
びＥｃｏＲＩでの配列切断により、非コード配列を除去した。次いで、アニールし、キナ
ーゼしたオリゴヌクレオチドＣＥ４２（配列認識番号２９）およびＣＥ４２（配列認識番
号３０）を挿入し、ｐＣＥ２９を形成した。
【０１２０】
50
(22)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【化１５】
次いで、ｐＣＥ２９からのＰｓｔＩ−ＳａｃＩ断片をｐＣＥ２０のＰｓｔＩとＳａｃＩ部
位にクローニングすることにより、ＮＤＶ−Ｆ配列の３′末端を、すでにＮＤＶ−Ｆの５
′末端を含有するプラスミドｐＣＥ２０に挿入し、ｐＣＥ３２を形成した。ｐＣＥ２０の
産生は以前にテイラーら、１９９０に記載されている。
【０１２１】
ｐＣＥ４７中に含有されるＮＤＶ−Ｆ ５′配列とＨ６プロモーターをｐＣＥ３２中に含
10
有される３′ＮＤＶ−Ｆ配列と配列させるために、ｐＣＥ４７のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐｓｔ
Ｉ断片を、ｐＣＥ３２のＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩ部位に挿入し、ｐＣＥ４９を形成
した。次いで、ｐＣＥ４９からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｒｕＩ断片まをｐＪＣＡ００２のＨ
ｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩ部位（上述）中にクローニングすることにより、Ｈ６プロモート
したＮＤＶ−Ｆ配列を脱ＯＲＦした（ｄｅ−ＯＲＦｅｄ）Ｆ８座に転移せしめ、ｐＣＥ５
４を形成した。ｐＣＥ５４をＳａｃＩで、部分的にＢａｍＨＩで切断し、アニールしキナ
ーゼしたオリゴヌクレオチドＣＥ１６６（配列認識番号３１）およびＣＥ１６７（配列認
識番号３２）を挿入することにより、転写終止シグナルをｐＣＥ５４に挿入し、ｐＣＥ５
８を産生した。
【０１２２】
20
【化１６】
テンプレートとしてのｐＣＥ５４およびプライマーとしてのオリゴヌクレオチドＣＥ１８
２（配列認識番号３３）とＣＥ１８３（配列認識番号３４）によるポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）を用いることにより、ＮＤＶ−Ｆの完全３′末端を得た。
【０１２３】
【化１７】
30
ＰＣＲ断片をＰｖｕＩＩとＨｐａＩＩで切断し、ＨｐａＩと部分的にＰｖｕＩＩで切断し
たｐＣＥ５８中にクローニングした。産生したプラスミドをｐＣＥ６４と称した。完全Ｈ
６プロモーターとｐＣＥ６４からのＦコード配列を含有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断
片を、ｐＲＷ８４６のＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｐａＩ部位にクローニングすることにより
、翻訳終止シグナルを挿入し、ＮＤＶ−Ｆの最終カセットであるｐＣＥ７１を産生した。
プラスミドｐＲＷ８４６は実質的にプラスミドｐＪＣＡ００２（以下に記載）と等しいが
、Ｈ６プロモーターおよび転写ならびに翻訳終止シグナルを含有する。ｐＲＷ８４６をＨ
ｉｎｄＩＩＩとＨｐａＩで切断することによりＨ６プロモーターを除去するが、終止シグ
40
ナルは完全に残す。
【０１２４】
ＮＤＶ−ＨＮのカセットの構築
プラスミドｐＲＷ８０２の構築はエドバウアーら、１９９０に記載している。このプラス
ミドはｐＵＣ９ベクター中にワクシニアウイルスＨ６プロモーターの３′末端に連結した
ＮＤＶ−ＨＮ配列を含有している。ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの５′末端を包
含するＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、ｐＲＷ８０２のＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏ
ＲＶ部位に挿入し、ｐＲＷ８３０を形成した。アニールしキナーゼしたオリゴヌクレオチ
ドＣＥ１６２（配列認識番号３５）およびＣＥ１６３（配列認識番号３６）をｐＲＷ８３
０のＥｃｏＲＩ部位中に挿入することによりＮＤＶ−ＨＮの３′末端を得て、ＮＤＶ−Ｈ
50
(23)
JP 3602844 B2 2004.12.15
Ｎの最終カセットであるｐＣＥ５９を形成した。
【０１２５】
【化１８】
10
ＦＰＶ挿入ベクターの構築
プラスミドｐＲＷ７３１−１５はゲノムＤＮＡからクローニングされた１０ｋｂ Ｐｖｕ
ＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片を含有している。３６６０ｂｐ ＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片の両
鎖についてヌクレオチド配列を決定した。ここにＦ８として示した読取り枠の制限を決定
した。プラスミドｐＲＷ７６１は２４３０ｂｐ ＥｃｏＲＶ断片を含有するｐＲＷ７３１
−１５のサブクローンである。Ｆ８ ＯＲＦはｐＲＷ７６１中のＸｂａＩ部位とＳｓｐＩ
部位との間に完全に含まれた。ＴＲＯＶＡＣとの組換えに関してゲノムＤＮＡがＦ８ Ｏ
ＲＦを除去する挿入プラスミドを産生するために、以下の工程を行なった。プラスミドｐ
ＲＷ７６１をＸｂａＩで完全に切断し、ＳｓｐＩで部分的に切断した。３７００ｂｐ Ｘ
20
ｂａＩ−ＳｓｐＩ帯をゲルから単離して、アニールした二重鎖オリゴヌクレオチドＪＣＡ
０１７（配列認識番号３７）およびＪＣＡ０１８（配列認識番号３８）と連結した。
【０１２６】
【化１９】
30
この連結により産生したプラスミドをｐＪＣＡ００２と称した。
【０１２７】
ＮＤＶ ＦとＨＮの二重挿入ベクターの構築
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼが充填されたｐＣＥ５９からのＨｉｎｄＩＩＩ断片を
ｐＣＥ７１のＨｐａＩ部位にクローニングすることにより、Ｈ６プロモートしたＮＤＶ−
ＨＮ配列をＨ６プロモートしたＮＤＶ−Ｆカセットに挿入し、ｐＣＥ８０を形成した。プ
ラスミドｐＣＥ８０をＮｄｅＩで完全に切断し、ＢｇｌＩＩで部分的に切断して、Ｈ６プ
ロモーターによりドライブされＦ８フランキングアームに連結したＮＤＶ ＦおよびＨＮ
40
遺伝子を含有するＮｅｅＩ−ＢｇｌＩＩ４７６０ｂｐ断片を産生した。ｐＲＷ７３１−１
５からの４９００ｂｐ ＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩ断片をｐＢＳＳＫ＋のＳｍａＩおよび
ＨｉｎｄＩＩ部位に挿入することによりプラスミドｐＪＣＡ０２１を得た。次いでプラス
ミドｐＪＣＡ０２１をＮｄｅＩとＢｇｋＩＩで切断し、ｐＣＥ８０の４７６０ｂｐＮｄｅ
Ｉ−ＢｇｌＩＩ断片に連結し、ｐＪＣＡ０２４を形成した。それゆえ、プラスミドｐＪＣ
Ａ０２４はＦＰＶフランキングアーム間に隣接する３′末端と反対の配向で挿入されたＮ
ＤＶ−ＦおよびＨＮ遺伝子を含有している。両方の遺伝子をワクシニアウイルスＨ６プロ
モーターに連結する。ＮＤＶ−Ｆ配列に隣接した右側フランキングアームは２３５０ｂｐ
のＦＰＶ配列からなる。ＮＤＶ−ＨＮ配列に隣接した左側フランキングアームは１７００
ｂｐのＦＰＶ配列からなる。
50
(24)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０１２８】
ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶの発達
前述したリン酸カルシウム沈殿法を用いてＴＲＯＶＡＣ感染初代ＣＥＦ細胞中にプラスミ
ドｐＪＣＡ０２４をトランスフェクションした（パニカリら、１９８２；ピッチーニら、
１９８７）。特異的ＮＤＶ−ＦおよびＨＮ放射線標識プローブに関するハイブリダイゼー
ションに基づいて陽性プラークを選択し、これらのプラークに、純粋な固体群となるまで
５回のプラーク精製を行なった。１つの典型的なプラークを増幅せしめ、産生したＴＲＯ
ＶＡＣ組換え体をＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ（ｖＦＰ９６）と称した。
【０１２９】
蛍光抗体法
10
多クローン性抗ＮＤＶ血清と、単特異的試薬として、ＮＤＶ−ＦまたはＮＤＶ−ＨＮを発
現するワクシニアウイルス組換え体に対して家ウサギ中で産生された血清を用いて、間接
蛍光免疫法を記載したように行なった（テイラーら、１９９０）。
【０１３０】
免疫沈降
ＣＮ、ストース、ＳＰＡＦＡＳ社から得た多クローン性抗ＮＤＶ血清を用いて記載したよ
うに免疫沈降反応を行なった。
【０１３１】
株ウイルスを現場でのプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングしてＦ８ ＯＲＦが欠損していることを確認した。サザンブロットハイブリダイゼーションにより、
20
ＮＤＶ遺伝子のＴＲＯＶＡＣゲノム中への正確な挿入とＦ８
ＯＲＦの欠損もまた確認した。
【０１３２】
ＮＤＶ感染細胞において、Ｆ糖タンパク質を、カルボキシル末端に近い疎水性膜貫通領域
により膜中に固定し、これは前駆体、Ｆ０ の、２つのジスルフィド連結ポリペプチドＦ
１ およびＦ２ への翻訳後切断を必要とする。Ｆ０の切断は、所定のＮＤＶ菌株の病原
性を決定するのに重要であり（ホンマおよびオーウチ、１９７３；ナガイら、１９７６；
ナガイら、１９８０）、切断部位でのアミノ酸配列はそれゆえウイルスの毒性を決定する
のに重要である。ＦＰＶ中に挿入され、組換え体ｖＦＰ２９を形成するＮＤＶ−Ｆ配列中
の切断部位でのアミノ酸は、毒性ＮＤＶ菌株（チャクバーら、１９８６；エスピオンら、
30
１９８７；リーら、１９８８；マックギネスおよびモリソン、１９８６；トヤダら、１９
８７）に必要条件であることが分かった配列に一致する配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ（配列認識番号３９）（テイラーら、１９９０）。ＮＤＶの毒性菌株に感染
した細胞中に合成されたＨＮ糖タンパク質は７４ｋＤａの未切断糖タンパク質である。ア
ルスターおよびクイーンズランドのようなきわめて無毒性の菌株は、活性化に切断を必要
とするＨＮ前駆体（ＨＮｏ）をコードする（ガーテンら、１９８０）。
【０１３３】
ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ中のＦおよびＨＮ遺伝子の発現を分析して、遺伝子産生物が自発的
に処理され存在することを確認した。多クローン性抗ＮＤＶ鶏血清を用いた間接蛍光抗体
法により、免疫半の失せてタンパク質が感染細胞表面に存在したことが確認できた。両方
40
のタンパク質が血漿膜上に存在することを確定するために、ＦまたはＨＮ糖タンパク質の
いずれかを発現するワクシニア組換え体に対する単特異的家ウサギ血清を産生した。これ
らの血清を用いた間接蛍光抗体法により、両方のタンパク質が表面に存在することを確認
した。
【０１３４】
親および組換えウイルスに感染したＣＥＦ細胞の（
３ ５
Ｓ）メチオニン標識溶解産物を用
いて免疫沈降実験を行なった。Ｆ１ とＦ２ の糖溶解産物形状のみかけの分子量の予測
値はそれぞれ５４．７と１０．３ｋＤａである（チャンバースら、１９８６）。多クロー
ン性抗ＮＤＶ血清を用いた免疫沈降実験において、適切なサイズの融合特異的産生物をＮ
ＤＶ−Ｆ単一組換え体ｖＦＰ２９（テイラーら、１９９０）およびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ
50
(25)
JP 3602844 B2 2004.12.15
二重組換え体ｖＦＰ９６から欠損せしめた。また適切なサイズのＨＮ糖タンパク質を、Ｎ
ＤＶ−ＨＮタンパク質組換え体ＶＦＰ−４７（エドバウアーら、１９９０）およびＴＲＯ
ＶＡＣ−ＮＤＶから欠損せしめた。どのＮＤＶ特異的産生物も、未感染および親ＴＲＯＶ
ＡＣ感染ＣＥＦ細胞から欠損されなかった。
【０１３５】
ＣＥＦ細胞において、ＦおよびＨＮ糖タンパク質は、ＮＤＶ免疫血清により認識される感
染細胞表面に適切に存在する。免疫沈降分析により、Ｆ０ タンパク質が毒性菌株中に必
要とされるＦ１ およびＦ２ 成分に関して確実に切断せしめられることが示された。同
様に、ＨＮ糖タンパク質も組換え体ＴＲＯＶＡ−ＮＤＶに感染したＣＥＦ細胞中で確実に
処理された。
10
【０１３６】
以前の報告によると（テイラーら、１９９０；エドバウアーら、１９９０；ボースネルら
、１９９０ａ、ｂ、ｃ；オガワら、１９９０）、ＨＮまたはＦのいずれかのみの発現はＮ
ＤＶ抗原投与に対する防御免疫を誘発するのに十分であることが分かっている。しかしな
がら、他のパラミクソウイルスへの作業により、両方のタンパク質への抗体には十分な防
御免疫を必要とすることが示されている。Ｆ糖タンパク質に対してではなくＨＮ糖タンパ
ク質に対する抗体の存在下で組織培養中にＳＶ５ウイルスが拡散することが示されている
（マーツら、１９８０）。加えて、死菌麻疹ウイルスワクチンを伴うワクチンの失敗は、
融合成分の不活性化によるものであることが示唆されている（ノルビーら、１９７５）。
両方のＮＤＶ糖タンパク質がウイルス中和抗体（アベリーら、１９７９）を誘発すること
20
が示され、両方の糖タンパク質が個々に鶏痘ベクター中に発現される場合に防御免疫応答
を誘発することができるので、最も有効なＮＤＶワクチンは両方の糖タンパク質を発現す
べきである。
【０１３７】
実施例９−ＮＹＶＡＣ−ＭＶ組換え発現麻疹融合および血球凝集素糖タンパク質の構築
麻疹ウイルスＭＶ（エドモンストン菌株）のＨＡおよびＦタンパク質をコードする配列の
ｃＤＮＡコピーをＮＹＶＡＣ中に挿入してＮＹＶＡＣ−ＭＶと称する二重組換え体を産生
した。この組換え体は、感染細胞の表面上に両方の糖タンパク質を確実に発現した。免疫
沈降分析は、両方のＦおよびＨＮ糖タンパク質の正確な加工を示した。この組換え体はま
た融合細胞の形成も誘発することが示された。
30
【０１３８】
細胞およびウイルス
ＮＹＶＡＣ−ＭＶの産生に使用した救助ウイルスは、ＮＹＶＡＣと称するワクシニアウイ
ルスの改変コペンハーゲン菌株であった。全てのウイルスを増殖せしめ、ベロ細胞単層に
おいて滴定した。
【０１３９】
プラスミドの構築
プラスミドｐＳＰＭ２ＬＨＡ（テイラーら、１９９１ｃ）は、前述したワクシニアウイル
スＨ６プロモーター（テイラーら、１９８８ａ、ｂ；グオら、１９８９；パーカスら、１
９８９）と正確なＡＧ対ＡＴＧの配置に連結された完全な麻疹ＨＡ遺伝子を含有している
40
。３′側の２６ｂｐを欠如したＨＡ遺伝子と正確なＡＴＧ：ＡＴＧ配置に融合したＨ６プ
ロモーターの３′側の２４ｂｐを含有する１．８ｋｐｂ ＥｃｏＲＶ／ＳｍａＩ断片をｐ
ＳＰＭ２ＬＨＡから単離した。この断片を、ｐＳＰＭＨＨＡ１１の１．８ｋｂｐ Ｅｃｏ
ＲＶ／ＳｍａＩ断片（テイラーら、１９９１ｃ）を置換するのに用い、ｐＲＷ８０３を産
生した。プラスミドｐＲＷ８０３は、完全麻疹ＨＡ遺伝子に正確に連結した完全Ｈ６プロ
モーターを含有している。
【０１４０】
麻疹ＨＡ遺伝子に関する以前の構築を確認するに当たって、コドン１８（ＣＣＣ）の配列
を公表した配列と比較して欠損せしめた（アルハチブら、１９８６）。オリゴヌクレオチ
ドＲＷ１１７（配列認識番号４０）
50
(26)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【化２０】
を用いたクンケル法（クンケル、１９８５）によりＣＣＣ配列をオリゴヌクレオチド突然
変異誘発で置換した。一本鎖テンプレートを、ｐＩＢＩ２５中のｐＲＷ８０３からのＨ６
／ＨＡカセットを含有するプラスミドｐＲＷ８１９から誘導した（ＣＴ、ニューヘブン、
インターナショナルバイオテクノロジー社）。コドン１８でのプロリン残留物をコードす
る挿入された（ＣＣＣ）を含有する突然変異誘発したプラスミドをｐＲＷ８２０と称した
。ｐＲＷ８２０のＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位の間の配列を、ヌクレオチド配列分
10
析により確認した。ＨｉｎｄＩＩＩ部位はＨ６プロモーターの５′へりに位置し、一方Ｘ
ｂａＩ部位はＨＡ遺伝子の開始コドンから２３０ｂｐ下流に位置する。ＸｂａＩ（上述）
から下流のＨＡコード配列を含有し、終止コドンを含むｐＲＷ８０３からの１．６ｋｂｐ
ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ断片を用い、等量のｐＲＷ８２０の断片を置換してｐＲＷ８３７
を産生した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、２ｍＭ ｃＮＴＰの存在下でＥ
．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いたブラントエンドを行ない、ｐＳ
Ｄ５１３のＳｍａＩ部位に挿入することによりｐＲＷ８３７内に含有された突然変異誘発
した発現カセットを誘導し、ｐＲＷ８４３を産生した。ポリリンカー配列を添加すること
によりプラスミドｐＳＤ４６０からプラスミドｐＳＤ５１３を誘導した。プラスミドｐＳ
Ｄ４６０は、ワクシニアウイルスからのチミジンキナーゼ遺伝子を欠損できるように誘導
20
した。
【０１４１】
ＨＡ挿入プラスミド中に麻疹ウイルスＦ遺伝子を挿入するために、ｐＳＰＨＭＦ７におい
て操作を行なった。プラスミドｐＳＤＨＭＦ７（テイラーら、１９９１ｃ）は、以前に記
載したワクシニアウイルスＨ６プロモーターに近位の麻疹Ｆ遺伝子３′を含有している。
ＡＴＧ配置のための完全なＡＴＧを達成し、プロモーターの３′末端と麻疹ウイルスＦ遺
伝子のＡＴＧとの間の介在配列を除去するために、オリゴヌクレオチドＳＰＭＡＤ（配列
認識番号４１）
【化２１】
30
を用いてオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を行なった。産生したプラスミドをｐＳ
ＰＭＦ７５Ｍ２０と称した。
【０１４２】
Ｈ６プロモーターと正確なＡＴＧ：ＡＴＧ配置に連結した麻疹Ｆ遺伝子を含有するプラス
ミドｐＳＤＭＦ７５Ｍ２０をＮｒｕＩおよびＥａｇＩで切断した。Ｈ６プロモーターの３
′側の２７ｂｐと完全な融合遺伝子を含有する、産生した１．７ｋｂｐ平滑末端断片を単
離し、ＮｒｕＩとＸｂａＩで切断し、平滑末端とした中間プラスミドｐＲＷ８２３に挿入
した。産生したプラスミドｐＲＷ８４１は、ｐＩＢＩ２５プラスミドベクター中の麻疹Ｆ
40
遺伝子に連結したＨ６プロモーターを含有している（ＣＴ、ニューハブン、インターナシ
ョナルバイオテクノロジー社）。ＳｍａＩで切断することにより、Ｈ６／麻疹Ｆカセット
をｐＲＷ８４１から切除して産生した１．８ｋｂ断片をｐＲＷ８４３（麻疹ＨＡ遺伝子を
含有する）に挿入した。プラスミドｐＲＷ８４３を、最初にＮｏｔＩで切断し、２ｍＭｃ
ＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で平滑末端とした。
それゆえ、産生したプラスミド、ｐＲＷ８５７は、尾対尾の配置に連結した麻疹ウイルス
ＦおよびＨＡ遺伝子を含有する。両方の遺伝子はワクシニアウイルスＨ６プロモーターに
連結している。
【０１４３】
ＮＹＶＡＣ−ＭＶの開発
50
(27)
JP 3602844 B2 2004.12.15
前述したリン酸カルシウム沈殿法（パニカリら、１９８２；ピッチーニら、１９８７）を
用いて、プラスミドｐＲＷ８５７をＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞にトランスフェクションした
。特異的ＭＶ ＦおよびＨＡ放射線標識プローブに関して現場でのプラークハイブリダイ
ゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な固体群となるまで、６回のプラーク
精製を行なった。１つの代表的なプラークを増幅し、産生した組換え体をＮＹＶＡＣ−Ｍ
Ｖと称した（ｖＰ９１３）。
【０１４４】
蛍光抗体法
前述したように間接蛍光抗体法を行なった（テイラーら、１９９０）。使用した単特異的
試薬は、家ウサギに麻疹ＦまたはＨＡ遺伝子のいずれかを発現するカナリヤポックス組換
10
え体を接種することにより産生した血清であった。
【０１４５】
免疫沈降
モルモット抗麻疹血清（ＭＤ、ウォーカースビル、ウィタッカーＭ．Ａ．バイオプロダク
ツ）を用いて前述したように免疫沈降反応を行なった。
【０１４６】
細胞融合実験
６０ｍｍのディッシュ中のベロ細胞単層に、細胞当たり１ｐｆｕの多重度で親または組換
えウイルスを接種した。３７℃で１時間の吸収後、接種物を除去し、培地を上に載せ、デ
ィッシュを３７℃で一晩接種した。２０時間後の感染で、ディッシュを試験した。
20
【０１４７】
麻疹ＦおよびＨＡ遺伝子の両方の発現産生物が感染細胞表面上に存在することを確定する
ために、麻疹ＦまたはＨＡ遺伝子のいずれかを発現するカナリヤポックス組換え体に対し
て家ウサギ中に産生した単特異的血清を用いて間接蛍光抗体法を行なった。その結果によ
り、両方の単特異的血清に関して強い表面蛍光によって示されたように、ＦおよびＨＡ遺
伝子産生物の両方が感染細胞表面上に発現されたことが分かった。親ＮＹＶＡＣ菌株を接
種した細胞のいずれの細胞にもバックグラウンドの染色はなく、また単特異的血清をＨＡ
またはＦ遺伝子のいずれかを発現するワクシニア単一組換え体に対して試験した場合にも
交差反応染色は見られなかった。
【０１４８】
30
ＮＹＶＡＣ−ＭＶにより発現されたタンパク質が、麻疹ウイルス特異的血清と免疫活性で
あり、感染細胞中で確実に加工されたことを確定するために、免疫沈降分析を行なった。
ベロ細胞単層を、
３ ５
Ｓメチオニンの存在下で親または組換えウイルスの１０ｐｆｕ／細
胞の多重度で接種した。免疫沈降分析は、約７６ｋＤａのＨＡ糖タンパク質およびそれぞ
れ分子量が４４ｋＤａおよび３３ｋＤａの切断融合産生物Ｆ１ とＦ２ を示した。麻疹
特異的産生物は、未感染細胞または親ＭＹＶＡＣウイルスに感染したベロ細胞中には全く
検出されなかった。
【０１４９】
ＭＶ細胞病理学の特性は、周辺の感染または未感染細胞と感染細胞の融合と続いての融合
細胞の中心への核の移動により生じた融合細胞の形成である（ノービーら、１９８２）。
40
これはパラミクソウルイスに関して、ＨＡ特異的ウイルス中和抗体の存在により生じ得る
ウイルスの拡散の重要な方法であることが示された（マーツら、１９８０）。ワクシニア
ウイルス中で発現されたＭＶタンパク質が機能的に活性であることを確定するために、ベ
ロ細胞単層にＭＹＶＡＣとＮＹＶＡＣ−ＭＶを接種し、細胞病理効果を観察した。強い細
胞融合活性が、感染から約１８時間後にＮＹＶＡＣ−ＭＶ感染ベロ細胞中で明確であった
。親ＮＹＶＡＣに感染した細胞中には細胞融合活性は見られなかった。
【０１５０】
実施例１０−仮性狂犬病の糖タンパク質を発現するＭＹＶＡＣ組換え体の構築
ＰＲＶ ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、およびｇｐ５０糖タンパク質を、個々または組合せのい
ずれかで発現するワクシニアウイルス組換え体が有効なワクチン候補であること、すなわ
50
(28)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ち、生ＰＲＶの毒性抗原投与からブタを防御することが示された。ＭＹＶＡＣベクターが
培養ブタ細胞中で生産的に複製できないこと、および既知の潜在的な毒性遺伝子の欠損に
よるベクター固有の安全性を考慮して、ＰＲＶ ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、およびｇｐ５０
を単体または様々な組合せで含有するＮＹＶＡＣベースの組換え体を産生した。これらの
組換え体は、ブタに安全であり、環境への伝染を減少または著しく制限したＰＲＶに対し
て効果的なワクチン候補を提供するために産生した。
【０１５１】
ウイルスおよび細胞
ＮＹＶＡＣの操作と分子クローニングを標準技術により行なった（ピッチーニら、１９８
７；マニアチスら、１９８２）。ＮＹＶＡＣおよびＭＹＶＡＣベースの組換え体の培養は
10
以前に記載した（ピッチーニら、１９８７）。
【０１５２】
ＰＲＶ ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、およびｇｐ５０遺伝子のクローニング
ＰＲＶの増殖、ＰＲＶゲノムＤＮＡの抽出、およびＰＲＶ ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、およ
びｇｐ５０遺伝子の同定は以前に記載した。
【０１５３】
仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）遺伝子のＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）へのクローニングおよ
び発現
ヒトおよびブタ宿主域遺伝子（Ｃ７ＬおよびＫ１Ｌ）を法含有する領域が欠如したＮＹＶ
ＡＣ欠損変異体、ｖＰ８６６は、ＰＲＶ遺伝子を挿入するのに用いたベースベクターであ
20
った。このベクターはまた、ワクシニアウイルスｔｋ遺伝子、血球凝集素遺伝子、出血性
遺伝子、リボヌクレオチドレダクターゼ（巨大サブユニット）遺伝子、およびＡ型封入体
遺伝子が欠如している。重要なことは、ｖＰ８６６は、ヒトまたはブタ肝臓（ＬＬＣ−Ｐ
Ｋ１）細胞については少しも効果的には複製しない。単純ヘルペスウイルスｇＢ（ロビン
ソンら、１９８７）、ｇＣ（ロビンソンら、１９８６ｂ）、およびｇＤ（ワッソンおよび
ワッソン、１９８４）にそれぞれ相同なＰＲＶ遺伝子ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、およびｇｐ
５０を下記に概略示したようにｖＰ８６６に挿入した。
【０１５４】
ＰＲＶ ｇｐＩＩ遺伝子をｖＰ８６６の血球凝集素座に挿入
ＰＲＶ ｇｐＩＩ遺伝子をコードするＤＮＡ配列はＰＲＶゲノムのＢｍａＨＩ断片にある
30
（メッテンライターら、１９８６）。
【０１５５】
ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位に挿入されたＰＲＶ ＢａｍＨＩ断片１を含有する、ｐＰ
Ｒ９．２５と称するプラスミドをＮｃｏＩで切断した。産生した制限断片を９．８％のア
ガロースゲルで分画し、ジェネクリーン（ＣＡ、ラジョラ、バイオ１０１社）を用いて６
．２ｋｂ ＮｃｏＩ ＤＮＡ断片を精製し、続いてＣｉＡＰで処理したｐＢＲ３２８（Ｉ
Ｎ、インディアナポリス、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルス）のＮｃｏＩ部位に
挿入した。精製したプラスミド、ｐＰＲ２．１５をＳｐｈＩで切断し、アガロースゲルで
分画した。２．７ｋｂと１．８ｋｂ断片を精製して、ｐＵＣ１８のＳｐｈＩ部位に挿入し
、ｐＰＲ１およびｐＰＲ２をそれぞれ産生した。
40
【０１５６】
ｐＰＲ１からの１０６０ｂｐ ＰＲＶ ＳｐｈＩ／ＮｈｅＩ断片をアガロースゲルから単
離して、アニールしたオリゴヌクレオチドＭＲＳＹＮ１（配列認識番号４２）
【化２２】
およびＭＲＳＹＮ２（配列認識番号４３）
【化２３】
50
(29)
JP 3602844 B2 2004.12.15
によりｐＩＢＩ２５のＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩ部位に挿入し、ｐＰＲ６を産生した。ｐＰＲ
６をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩで切断した。ＡｐａＩ部位は、ＰＲＶ ｇｐＩＩのＡ
ＴＧ開始コドンから３２ｂｐ下流に位置する。この３９２０ｂｐ断片をアニールしたオリ
ゴヌクレオチドＭＲＳＹＮ３（配列認識番号４４）
【化２４】
およびＭＲＳＹＮ４（配列認識番号４５）
10
【化２５】
と連結し、ｐＰＲ９を産生した。これらのアニールしたオリゴヌクレオチドは、ＥｃｏＲ
Ｖ部位からＡＴＧを通じてＰＲＶ ｇｐＩＩコード配列に続くワクシニアウイルスＨ６プ
ロモーターを特定するＤＮＡ配列を提供する。プラスミドｐＰＲ９をＢａｍＨＩとＮｈｅ
Ｉで切断し、子牛の腸のアルカリ性ホスファターゼ（ＣｉＡＰ）で処理し、アニールした
オリゴヌクレオチドＭＲＳＹＮ７（配列認識番号４６）
【化２６】
20
およびＭＲＳＹＮ８（配列認識番号４７）
【化２７】
並びにｐＰＲ１から得た１６４０ｂｐ ＳｐｈＩ／ＮｈｅＩ断片と連結し、プラスミドｐ
ＰＲ１２を産生した。
【０１５７】
ｐＰＲ２からの１０３０ｂｐ ＨｉｎｄＩＩ／ＳｐｈＩ断片をアガロースゲルから単離し
、ＨｉｎｃＩＩ／ＳｐｈＩ ｐＵＣ１８ベクターに挿入した。産生したプラスミド、ｐＰ
30
Ｒ１０をＨｉｎｄＩＩＩとＮａｅＩで切断し、ＣｉＡＰで処理した。ＮａｅＩ部位は終止
コドン（ＴＡＧ）の４４ｂｐ上流である。アニールしたオリゴヌクレオチドＭＲＳＹＮ９
（配列認識番号４８）
【化２８】
およびＭＲＳＹＮ１０（配列認識番号４９）
40
【化２９】
をｐＰＲ１０からの３７２０ｂｐ ＮａｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片と連結し、プラスミド
ｐＰＲ１１を産生した。ｐＰＲ２からの７７０ｂｐ ＳｐｈＩ／ＨｉｎｃＩＩ断片をアガ
ロースゲルから精製し、ＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩリン酸化リンカーＭＲＳＹＮ７（配列認識
番号４６）およびＭＲＳＹＮ８（配列認識番号４７）を用いてＣｉＡＰ処理したｐＰＲ１
１のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｃＩＩ部位に挿入し、ｐＰＲ１３を産生した。ＥｃｏＲＩおよび
50
(30)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ＳｐｈＩで切断したプラスミドｐＰＲ１２を、ＭＲＳＹＮ１９（配列認識番号５０）
【化３０】
およびＭＲＳＹＮ２０（配列認識番号５１）
【化３１】
を用いてｐＰＲ１３からの９９０ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩ断片と連結し、プラス
ミドｐＰＲ１５を産生した。プラスミド、ｐＰＲ１５をＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＶで切
10
断し、２７８０ｂｐ断片を産生した。この断片を、ＸｍａＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで切断
したｐＴＰ１５（グオら、１９８９）に挿入し、ｐＰＲ１８を産生した。ｐＰＲ１８にお
いて、ｐＲＶｇｐＩＩをＨＡ欠損プラスミド中のワクシニアウイルスＨ６プロモーターと
連結する。救助ウイルスとしてｖＰ８６６による生体外組換え実験にｐＰＲ１８を用いて
ｖＰ８８１を産生した。
【０１５８】
ＰＲＶ ｇｐＩＩＩ遺伝子をＮＹＶＡＣのＴＫ座に挿入
ＰＲＶ ｇｐＩＩＩ遺伝子をコードする配列がＰＲＶゲノムのＢａｍＨＩ２および９断片
に遺伝子地図を作成する（ロビンスら、１９８６ｂ）。プラスミドｐＰＲ９．９およびｐ
ＰＲ７．３５は、それぞれｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位に挿入されるＰＲＶ ＢａｍＨ
20
Ｉ断片２および９を含有する。ＰＲＶ ｇｐＩＩＩ遺伝子の５′末端を含有するＳｐｈＩ
／ＢａｍＨＩ断片をｐＰＲ９．９から単離した。ｇｐＩＩＩ遺伝子の残りを含有するＮｃ
ｏＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＰＲ７．３５から単離した。完全なＰＲＶ ｇｐＩＩＩ遺伝子
は、これら２つの断片をｐＩＢＩ２５に連結することにより組み立て、ｐＰＲ１７を産生
した。
【０１５９】
ＰＲＶ ｇｐＩＩＩ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｂ領域に位置する初期ワクシニアウイル
ス出血性プロモーターの制御下で発現されるように操作した（ゲーベルら、１９９０ａ、
ｂ）。部位定方向突然変異誘発を用いて、ＰＲＶ ｇｐＩＩＩ中の配列ＣＧＣ（塩基１９
２−１９４）をＡＴＧに変化せしめることによりＮｓｉＩ部位を導入し、配列ＧＴＣＡＣ
30
ＧＴをＴＴＣＴＡＧＡ（塩基１６３２−１６３８）に変化せしめることによりＸｂａＩ部
位を導入した。突然変異誘発反応を行なうために、ヘルパーファージＲ４０８（ＣＡ、ラ
ジョラ、ストラタジェネ）を用いることにより一本鎖ＤＮＡをプラスミドｐＰＲ１７から
産生した。ＭＲＳＹＮ５（配列認識番号５２）
【化３２】
およびＭＲＳＹＮ６（配列認識番号５３）
【化３３】
40
並びにＥ．ｃｏｌｉ ｄｕｒ
− ｕｎｇ
− 菌株ＣＪ２３６（ＣＴ、ニューハブン、バ
イオテクノロジー社）を用いて部位定方向突然変異誘発を行なった。クンケルの実験記録
（１９８５）にしたがって突然変異誘発を行なった。これらの突然変異誘発により、プラ
スミドｐＰＲ２８が産生した。
【０１６０】
プラスミドｐＰＲ２８をＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断して、マング豆ヌクレアーゼで処
理した。１４４０ｂｐ断片を精製して、マング豆ヌクレアーゼと子牛腸あるか理性ホスフ
ァターゼで処理し多後にｐＳＤ４７８ＶＣで切断したＢｇｌＩＩ／ＨｐａＩに挿入した。
産生したプラスミドをｐＰＲ２４と称した。
50
(31)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０１６１】
プラスミドｐＰＲ２４をＳｎａＢ１とＤｒａＩで切断し、ｕプロモーターとＰＲＶ ｇｐ
ＩＩＩ遺伝子をが有する１５００ｂｐ平滑末端断片を離生した。この断片をｐＳＤ５１３
ＶＣで切断したＳｍａＩに連結し、ｐＰＲＶＩＩＩＶＣＴＫを産生した。救助ウイルスと
してのｖＰ８６６およびｐＰＲＶＩＩＩＶＣＴＫに関して、生体外組換え実験を行なって
ｖＰ８８３を産生した。ｖＰ８８３において、ゲノムに関して、１２０ｂｐワクシニアｕ
プロモーター要素の制御下で右から左の方向に挿入したＰＲＶ ｇｐＩＩＩ遺伝子により
ワクシニアｔｋコード配列を置き換えた。
【０１６２】
ＰＲＶ ｇｐ５０遺伝子をＮＹＶＡＣのＡＴＩ座へ挿入
10
ＰＲＶ糖タンパク質ｇｐ５０の遺伝子をコードするＤＮＡはＰＲＶゲノムのＢａｍＨＩ断
片７に位置している（ペトロフスキスら、１９８６ａ、ｂ）。プラスミドｐＰＲ７．１は
ｐＢＲ３２２のＢａｎＨＩ部位に挿入されたＰＲＶ ＢａｍＨＩ断片７を含有している。
完全なｇｐ５０遺伝子を含有するｐＰＲ７．１のＳｔｕＩ／ＮｄｅＩサブ断片はｐＩＢＩ
２５にサブクローニングされてプラスミド＃８５６を産生した。
【０１６３】
初期／中間ワクシニアプロモーター、Ｉ３Ｌの制御下でＰＲＶ ｇｐ５０のコード配列を
配した（シュミットおよびスタネンベルグ、１９８８；ボスおよびスタネンベルグ、１９
８８）。このプロモーター要素は、以前にワクシニア組換え体中の異種遺伝子を発現する
のに用いた（パーカスら、１９８５；バッチャーら、１９８９）。合成オリゴヌクレオチ
20
ドＰ５０ＰＰＢＡＭ（配列認識番号５４）
【化３４】
およびＰ５０ＰＰＡＴＧ（配列認識番号５５）
【化３５】
並びにテンプレートとしてのコペンハーゲンＨｉｎｄＩＩＩ Ｉ領域のサブクローンであ
るｐＭＰＩＶＣを用いてＰＣＲ（ササキら、１９８８）により、Ｉ３Ｌ読取り枠から上流
30
のプロモーター配列に対応するＤＮＡ（シュミットおよびスタネンベルグ、１９８８）を
誘導した。産生した１２６ｂｐ断片をＢａｍＨＩで切断し、プロモーター配列の５′末端
でのＢａｍＨＩ付着末端を産生した。３′末端は平滑末端のままであった。
【０１６４】
ＰＲＶ ｇｐ５０コード領域をプラスミド＃８５６から切除した。プラスミド＃８５６を
、ＡＴＧから７ｂｐ上流を切断し、３′懸垂となるＮｓｉＩで最初に切断した。３′懸垂
を、２ｍＭ ｄＮＴＰの存在下でＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした。産生した
ＤＮＡを部分的にＢｇｌＩＩで切断し、ＰＲＶ ｇｐ５０遺伝子を含有する１．３ｋｂブ
ラント／ＢｇｌＩＩ断片を単離した。
【０１６５】
40
１２６ｂｐ Ｉ３Ｌプロモーター断片（ＢａｍＨＩ／ブラント）および１．３ｋｂ ｇｐ
５０遺伝子含有断片（ブラント／ＢｇｌＩＩ）をＢａｍＨＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ（Ｃ
Ａ、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結した。産生したプラスミドをｐＢＳＰＲＶ５０Ｉ
３と称した。ＰＲＶ ｇｐ５０遺伝子に連結したＩ３Ｌプロモーターを含有する発現カセ
ットをＢａｍＨＩ／部分的ＳｍａＩ切断により切除した。Ｉ３Ｌプロモーター／ＰＲＶ ｇｐ５０遺伝子を含有する１．４ｋｂ断片を単離して、２ｍＭ ｄＮＴＰの存在下でＥ．
ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。
【０１６６】
Ｉ３Ｌプロモーター／ＰＲＶ ｇｐ５０遺伝子を含有する１．４ｋｂ平滑末端断片をＡＴ
Ｉ挿入プラスミドｐＳＤ５４１に挿入した。ＡＴＩ領域のフランキングアームを、テンプ
50
(32)
JP 3602844 B2 2004.12.15
レートとしてのコペンハーゲンＨｉｎｄＩＩＩ Ａ領域のサブクローンを用いたＰＣＲに
より産生した。オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２６７（配列認識番号５６）
【化３６】
およびＭＰＳＹＮ２６８（配列認識番号５７）
【化３７】
10
を用いてＡＴＩ欠損の右側に４２０ｂｐワクシニアアームを誘導した。合成オリゴヌクレ
オチドＭＰＳＹＮ２６９（配列認識番号５８）
【化３８】
およびＭＰＳＹＮ２７０（配列認識番号５９）
【化３９】
20
を用いて欠損の左側に４２０ｂｐワクシニアアームを誘導した。左右のアームＰＣＲによ
りともに融合して、ＢｇｌＩＩ、ＳｍａＩ、およびＸｈｏＩの制限部位を特定するポリリ
ンカー領域により分離した。ＰＣＲ産生断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断し
て付着末端を産生し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ８に連結してｐ
ＳＤ５４１を産生した。
【０１６７】
Ｉ３Ｌ／ＰＲＶ ｇｐ５０遺伝子を含有するｐＳＤ５４１プラスミドをｐＡＴＩｇｐ５０
と称した。このプラスミドを生体外組換え実験に用いてｖＰ９００を産生した。ｖＰ９０
30
０はＡＴＩ遺伝子の位置にＰＲＶ ｇｐ５０遺伝子を含有している。
【０１６８】
ＮＹＶＡＣ内の二重および三重ＰＲＶ組換え体の産生
生体外組換え実験を行なって、多重ＰＲＶ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣベース組換え体を
産生した。供与体プラスミド、ｐＡＴＩＰ５０を用いた生体外組換え実験を、ｖＰ８８１
、ｖＰ８８３、およびｖＰ９１５に行なって、それぞれｖＰ９１２、ｖＰ９１６、および
ｖＰ９２５を産生した（表１）。実験は救助ウイルスとしてのｖＰ８８３およびプラスミ
ドｐＰＲ１８に関して行なってｖＰ９１５を産生した（表１）。
【０１６９】
ＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体感染細胞からの免疫沈降
40
ベロ細胞について、細胞当たり１０ｐｆｕのｍ．ｏ．ｉ．で、個々の組換えウイルス、Ｎ
ＹＶＡＣ親ウイルスを感染せしめるか、または疑似（ｍｏｃｋ）感染せしめた。１時間の
吸収期間の後、接種物を除去して、感染細胞に
３ ５
Ｓメチオニン（２０ｕＣｉ／ｍｌ）を
含有するメチオニン不含有培地を添加した。全ての試料を感染８時間後に収集した。ヒツ
ジ抗ｇｐＩＩ血清で分析した試料に関して、遠心分離により細胞を収集し、ＲＩＰＡ緩衝
液（１％ＮＰ−４０、１％Ｎａ−デオキシクロレート、０．１％ＳＤＳ、０．０１Ｍメチ
オニン、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ２−メルカプト−エタノール、１ｍ／ｍｌ ＢＳＡ
、および１００ｕ／ｍｌアプロチニン）で分離した。ヒツジ抗ｇｐＩＩＩで分析した試料
およびｇｐ５０に特異的な単クローンを１Ｘ緩衝液Ａ（１％ＮＰ４０、１０ｍＭトリス（
ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０％Ｎａアジド、０．２
50
(33)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ｍｇ／ｍｌＰＭＳＦ）中に溶解せしめた。全ての血清をｖＰ８６６感染ベロ細胞で前吸着
し、全ての溶解産物を通常の血清（ヒツジまたはマウス）および第２抗体に連結したタン
パク質Ａセファロースで前吸着した。
【０１７０】
感染細胞からの溶解産物を、ヒツジ抗ｇｐＩＩ血清を用いたＰＲＶ ｇｐＩＩ発現に関し
て分析した。この第１抗血清を、家ウサギ抗ヒツジＩｇＧ（ベーリンガーマンハイム）に
接合したタンパク質Ａセファロースと共にインキュベートした。４℃での一晩のインキュ
ベート後、試料を１×ＲＩＰＡ緩衝液で４回、ＬｉＣｌ−尿素（０．２Ｍ ＬｉＣｌ、２
Ｍ尿素、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）で２回洗浄した。マイクロ遠心分離により沈殿物
を収集した。２Ｘラエムリの緩衝液（１２５ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、４％（ＳＤＳ）
10
、２０％グリセロール、１０％ ２−メルカプト−エタノール）を添加し、５分間沸騰せ
しめることにより、免疫複合体から沈殿したタンパク質を分離した。タンパク質を１０％
のドレイファスゲルシステム（ドレイフィスら、１９８４）で分画し、固定し、フルオロ
グラフィーのために１Ｍ Ｎａ−サリチル酸塩で処理した。
【０１７１】
ヒツジ抗ｇｐＩＩ血清を用いたＰＲＶ ｇｐＩＩ発現に関して溶解産物を分析した。この
第１抗血清を家ウサギ抗ヒツジＩｇＧに接合したタンパク質Ａセファロース（ベーリンガ
ーマンハイム）と共にインキュベートした。４℃での一晩のインキュベート後、試料を１
Ｘ緩衝液Ａで４回、ＬｉＣｌ−尿素緩衝液で２回洗浄した。沈殿物を処理し、上述したよ
うにフルオログラフィーにより分析した。
20
【０１７２】
溶解産物を、単クローン性抗体、２２Ｍ４（フランス、リヨン、ローンメリオクスにより
供給された）を用いたＰＲＶ ｇｐ５０発現に関して分析した。この第１抗体を、山羊抗
マウスＩｇＧおよびＩｇＭ（ベーリンガーマンハイム）に接合したタンパク質Ａセファロ
ースと共にインキュベートした。沈殿物を回収し、上述したようにＰＲＶ ｇｐＩＩＩ免
疫沈降に関して分析した。
【０１７３】
ＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体に感染した細胞中のＰＲＶ糖タンパク質の発現
ＰＲＶ ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、およびｇｐ５０産生物は、ＰＲＶ感染細胞中の膜構造に
関連した典型的な糖タンパク質である。抗ｇｐＩＩ、抗ｇｐＩＩＩおよび抗ｇｐ５０特異
30
的体クローン性抗体および続いてのフルオロセイン接合ヒツジ抗マウスＩｇＧを用いて、
組み得たい感染ベロ細胞の表面上のＰＲＶ糖タンパク質発現を分析した。ｇｐＩＩ、ｇｐ
ＩＩＩ、またはｇｐ５０の表面発現はいずれも、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ（ｖＰ８
６６）親ウイルスに感染した細胞の表面には検知できなかった。ＰＲＶ ｇｐＩＩ発現が
ｖＰ８８１、ｖＰ９１２、およびｖＰ９２５感染細胞の表面に観察された。ＰＲＶ ｇｐ
ＩＩＩ表面発現が、ｖＰ８８３、ｖＰ９１５、ｖＰ９１６、およびｖＰ９２５感染細胞中
に観察された。ＰＲＶ ｇｐ５０表面発現が、ｖＰ９００、ｖＰ９１２、ｖＰ９１６、お
よびｖＰ９２５感染細胞中に観察された。要約すると、特定のＰＲＶ糖タンパク質の表面
発現は、適切なＰＲＶ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体に感染した細胞中の
みに検知可能であった。
40
【０１７４】
ＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体に感染した細胞からのＰＲＶ糖タンパク質の免疫沈降
ＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体に感染したベロ細胞中の発現ＰＲＶ ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ
、およびｇｐ５０糖タンパク質の確実性を免疫沈降により分析した。ＰＲＶ ｇｐＩＩ遺
伝子産生物は、ＰＲＶ感染細胞中でコードされた主要糖タンパク質の１つである。熟成タ
ンパク質は、ジスルヒド結合により連結した糖タンパク質の複合体からなる（ハンペルら
、１９８４；ルーカスら、１９８５）。還元条件下で、３つの種がこの複合体から分解し
た。これら３つの種（ＩＩａ−ｃ）は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて、それ
ぞれ１２０ｋＤａ、７４−６７ｋＤａ、および５８ｋＤａの適切なサイズで移動した（ハ
ンプルら、１９８４）。
50
(34)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０１７５】
抗ＰＲＶｇｐＩＩ特異的血清を用いた免疫沈降分析において、どのＰＲＶ特異的タンパク
質種も、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）親細胞に感染した細胞からは沈殿
しなかった。ＰＲＶ ｇｐＩＩもまた、ＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体ｖＰ９１６、ｖＰ８
８３、およびｖＰ９００を含有する非ｇｐＩＩに感染した細胞中では検知できなかった。
ＰＲＶ ｇｐＩＩがＰＲＶ ｇｐＩＩ遺伝子をハーバーする全てのＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組
換え体中で発現されたことが明確である。これらはｖＰ９２５、ｖＰ９１２、ｖＰ９１５
、およびｖＰ８８１である。組換え体を含有するＰＲＶ ｇｐＩＩに感染したベロ細胞か
らの溶解産物は、適切な発現に調和し、ｇｐＩＩをｇｐＩＩａ（１２０ｋＤａ）、ｇｐＩ
Ｉｂ（７４−６７ｋＤａ）、およびｇＩＩｃ（５８ｋＤａ）に加工するタンパク質種を含
10
有した。４５ｋＤａと１０ｋＤａの２つの追加のタンパク質種を抗ｇｐＩＩ血清により特
異的に沈殿せしめた。これらのタンパク質種は、組換え感染細胞中の晩期にＰＲＶ ｇｐ
ＩＩの変型のタンパク質分解工程により現れるように思われる。
【０１７６】
ＰＲＶ ｇｐＩＩＩ産生物は、もう１つの主要ＰＲＶ糖タンパク質である。ｇｐＩＩＩは
、９２ｋＤａの明確な分子量で移動する他のウイルスタンパク質とは複合体をなさない単
量体単位として存在する（ハンプルら、１９８４；ロビンスら、１９８６ｂ）。ｇｐＩＩ
Ｉに特異的な抗血清を用いたＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体感染細胞からの免疫沈降分析に
おいて、抗ｇｐＩＩＩ特異的タンパク質種は、疑似感染細胞、非組換え体感染細胞、また
はｇｐＩＩＩを含有しないＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体（それぞれ、ｖＰ９１２、ｖＰ８
20
８１、およびｖＰ９００）に感染した細胞からの溶解産物中には全く存在しなかった。ｖ
Ｐ９２５、ｖＰ９１５、ｖＰ９１６，およびｖＰ８８３感染細胞からの溶解産物は全て９
２ｋＤａ ＰＲＶ ｇｐＩＩＩ遺伝子産生物を含有した。
【０１７７】
熟成ＰＲＶ ｇｐ５０遺伝子産生物は、約５０から６０ｋＤａ（ペトロフスキスら、１９
８６ａ；ワッセンら、１９８４）であり、そのほとんどはＯ連結炭化水素を含有しそうで
ある（ペトロフスキスら、１９８６ｂ）。ＰＲＶ ｇｐ５０遺伝子産生物に特異的な抗血
清を用いた、ＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体に感染した細胞の溶解産物からの免疫沈降にお
いて、ｇｐ５０は、疑似感染細胞、非組換え体感染細胞、またはｇｐ５０遺伝子を含有し
ない組換え体（それぞれ、ｖＰ９１５、ｖＰ８８１、およびｖＰ８８３）に感染した細胞
からの溶解産物中には全く存在しなかった。ＰＲＶ ｇｐ５０遺伝子を含有する組換えＮ
ＹＶＡＣウイルス（それぞれ、ｖＰ９２５、ｖＰ９１２、ｖＰ９１６、およびｖＰ９００
）に感染した細胞からの溶解産物は全て、抗ＰＲＶ ｇｐ５０血清により特異的に沈殿し
た５０−６０ｋＤａタンパク質種を発現した。
【０１７８】
【表１】
30
(35)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
実施例１１−エプステイン−バーウイルスのｇｐ３４０、ｇＢおよびｇＨ遺伝子を発現す
るＮＹＶＡＣ組換え体の構築
ＥＢＶ ｇｐ３４０、ｇＢ、およびｇＨ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣ供与体プラスミドを
構築した。この供与体プラスミドを用いて２つの組換え体、ｖＰ９４１およびｖＰ９４４
を産生した。
20
【０１７９】
制限酵素は、ベセスダリサーチラボラトリーズ社（ＭＤ、ゲイサースブルグ）、ニューイ
ングランドバイオラボ社（ＭＡ、ビバーリー）、またはベーリンガーマンハイム（ＩＮ、
インディアナポリス）から得た。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼＩクレ
ノウ断片を、ニューイングランドバイオラボ社から得た。クローニング、スクリーニング
およびプラスミド精製の少しの修飾には、標準組換えＤＮＡ技術を用いた（マニアチスら
、１９８２）。アルカリ性変性二本鎖プラスミドテンプレートに標準ジデオキソ鎖−終止
反応（サンガー、１９７７）を用いて核酸配列を確認した。Ｍ１３ｍｐ１８ファージ、ｐ
ＩＢＩ２４およびｐＩＢＩ２５プラスミドをＣＴ、インターナショナルバイオテクノロジ
ー社から得た。
30
【０１８０】
細胞株およびウイルス菌株
救助ウイルスとしてＮＹＶＡＣを用いて組換え体を産生した。５−１０％の新生子牛血清
を補給したタカのＭＥＭ培地中のベロ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）細胞（ＶＩ、マクリーン
、フローラボラトリーズ）において、全てのワクシニアウイルス株を産生した。
【０１８１】
オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発
突然変異誘発反応に用いたウラシル置換一本鎖ＤＮＡテンプレートはＣＪ２３６転換細胞
からのものであった。変異は、クンケルらの（１９８７）プロトコルを用いて行なわれた
。標準化学物質を用いて様々なオリゴヌクレオチドを合成した（ＣＡ、サンラファエル、
40
バイオリサーチ８７００；ＣＡ、フォスターシティー、アプライドバイオシステム３８０
Ｂ）。
【０１８２】
ワクシニアウイルス組換え体の構築
救助ワクシニアウイルスに感染した組織培養細胞への組換え供与体プラスミドのトランス
フェクションおよび現場でのニトロセルロースフィルター上でのハイブリダイゼーション
による組換え体の同定の工程は前述したようなものであった（パニカリら、１９８２；ピ
ッチーニら、１９８７）。
【０１８３】
ＥＢＶ遺伝子ｇｐ３４０、ｇＢ、およびｇＨのワクシニア組換え体における改変および発
50
(36)
JP 3602844 B2 2004.12.15
現
ｇｐ３４０遺伝子は、完全ＥＢＶ配列の読取り枠ＢＬＬＦ１ａに対応する（ベアーら、１
９８４）。ｇｐ２２０遺伝子は、内部スプライシングイベント（読取り枠ＢＬＬＦ１ｂ）
によりｇｐ３４０ ｍＲＮＡから由来する。ｇｐ３４０およびｇｐ２２０遺伝子を、Ｄｒ
．ペリコーデット（Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ ｓｕｒ ｌｅ Ｃａｎｃ
ｅｒ−ＩＲＳＧ，７ ｒｕｅ Ｇｕｙ Ｍｏｃｑｕｅｔ，９４８０２ Ｖｉｌｌｅｊｕｉ
ｆ，Ｆｒａｎｃｅ ）により提供されたｃＤＮＡクローン（それぞれ、プラスミドｐＭＬ
Ｐｇｐ３４０、ｐＭＬＰｇｐ２２０）から単離した。
【０１８４】
ｐＭＬＰｇｐ２２０の２１００ｂｐ ＸｍａＩ／ＣｌａＩ断片をＸｍａＩ／ＣｌａＩ Ｍ
10
１３ ｍｐ１８に挿入し、産生したプラスミドをｍｐ１８ｇｐ２２０と称した。オリゴヌ
クレオチドＣＭ４およびＣＭ５を用いた生体外突然変異誘発により、ｇｐ２２０遺伝子の
５′および３′端を、ワクシニアＨ６プロモーターの制御下で発現に関して改変した。改
変ｇｐ２２０遺伝子を含有するプラスミドをｍｐ１８ｇｐ２２０（４＋５）と称した。Ｃ
Ｍ４（配列認識番号６０）およびＣＭ５（配列認識番号６１）のヌクレオチド組成は以下
の通りであった。
【０１８５】
【化４０】
20
ｍｐ１８ｇｐ２２０（４＋５）の２３００ｂｐ ＮａｒＩ／ＥｃｏＲＶ断片を、ＮａｒＩ
／ＥｃｏＲＶプラスミドＳＰ１３１ＮｏｔＩ中にクローニングした。ＳＰ１３１ＮｏｔＩ
は、前に定義したように完全なＨ６ワクシニアプロモーターを含有している（テイラーら
、１９８８ａ、ｂ）。産生したプラスミドをＳＤ１３１ｇｐ２２０と称した。
【０１８６】
ｐＭＬＰｇｐ３４０の２３６０ｂｐ ＳｃａＩ／ＸｈｏＩ断片を、ＳｃａＩ／ＸｈｏＩ 30
ＳＰ１３１ｇｐ２２０プラスミド中にクローニングした。産生したプラスミドをＳＰ１３
１ｇｐ３４０と称した。
【０１８７】
ＳＰ１３１ｇｐ３４０の２８００ｂｐ ＮｏｔＩ／ＮｏｔＩ断片を、ＳｍａＩ切断ワクシ
ニア供与体プラスミドｐＳＤ４８６中にクローニングした。産生したプラスミドを４８６
Ｈ６３４０と称した。ＥＢＶ ｇＢ遺伝子は、完全ＥＢＶ配列の読取り枠ＢＡＬＦ４に対
応する（ベアーら、１９８４）。３５００ｂｐ ＥｃｏＲＩ／ＸｍｎＩ断片を、ＥＢＶ ＢａｍＨＩ Ａ断片から単離して、ＨｉｎｃＩＩ／ＥｃｏＲＩプラスミドｐＩＢＩ２５中
にクローニングした。産生したプラスミドをｐ２５ｇＢと称した。
【０１８８】
生体外突然変異誘発により、オリゴヌクレオチドＥＢＶ
Ｍ５（配列認識番号６２）およびＥＢＶＭ３（配列認識番号６３）を用いて、ワクシニア
Ｈ６プロモーターの制御下でＥＢＶ ｇＢ遺伝子を発現に適用した。ＥＢＶＭ５（配列認
識番号６２）およびＥＢＶＭ３（配列認識番号６３）のヌクレオチド組成は以下の通りで
ある。
【０１８９】
【化４１】
40
(37)
JP 3602844 B2 2004.12.15
産生したプラスミドをｐ２５ｇＢ（５＋３）と称した。
【０１９０】
ｐ２５ｇｂ（５＋３）の２６００ｂｐ ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＶ／Ｅ
ｃｏＲＩ Ｓｐ１３１プラスミド中にクローニングした。産生したプラスミドをＳＰ１３
１ｇＢと称した。
10
【０１９１】
ＥＢＶ ｇＨ遺伝子は、完全ＥＢＶ配列のＢＸＬＦ２読取り枠に対応する（ベアーら、１
９８４）。完全ＢＸＬＦ２読取り枠は、２つのＢａｍＨＩ ＥＢＶ断片、ＢａｍＨＩ Ｘ
およびＢａｍＨＩ Ｔに含有される。ＥＢＶ ＢａｍＨＩ Ｔ断片の８３０ｂｐ Ｓｍａ
Ｉ／ＢａｍＨＩ断片をＳｍａＩ／ＢａｍＨＩｐＩＢＩ２４プラスミド中にクローニングす
ることにより、完全ＢＸＬＦ２読取り枠を再構築した。産生したプラスミドを２４ｇＨ５
と称した。ＥＢＸ ＢａｍＨＩ Ｘ断片の１８５０ｂｐ ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断
片を、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ２４ｇＨ５プラスミド中にクローニングした。産生
したプラスミドを２４ｇＨと称した。
【０１９２】
20
オリゴヌクレオチドＨＭ５、ＨＭ４、およびＨＭ３を用いた生体外突然変異誘発により、
ＥＢＶ ｇＨ遺伝子を改変して、ワクシニアＢ１３Ｒ出血性プロモーターの制御下で発現
した（ゲーベルら、１９９０ａ、ｂ）。オリゴヌクレオチドＨＭ４を用いて、ワクシニア
初期転写終止シグナルに対応する配列を改変した。ＨＭ５（配列認識番号６４）、ＨＭ４
（配列認識番号６５）、およびＨＭ３（配列認識番号６６）のヌクレオチド組成は以下の
通りである。
【０１９３】
【化４２】
30
改変ｇＨを含有する産生したプラスミドを２４ｇＨ（５＋４＋３）と称した。
【０１９４】
ワクシニア出血性プロモーターは、他のポックスプロモーターと比較して強力なプロモー
ターであるとは思われない。４２ｋＤａエントモポックスプロモーターの制御下でＥＢＶ
ｇＨ遺伝子を配した。これは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特異的オリゴヌクレ
オチド４２ｇＨ（配列認識番号６７）およびＢＡＭｇＨ（配列認識番号６８）並びにテン
プレートとしてのプラスミド２４ｇＨ（５＋４＋３）を用いることにより行なわれた。
40
【０１９５】
【化４３】
（最初のＡ残留物は、ｇＨコード配列の位置２９２に対応する）
ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラー（ＣＴ、ノルウォーク、パーキンエルマーセタス）中
において、９４℃で１分間、４２℃で１．５分間、および７２℃で３分間の３６サイクル
を行ない、最後に７２℃で５分間の延長工程を行なった。ＰＣＲ産生物を精製し、Ｂａｍ
50
(38)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ＨＩで切断し、２４ｇＨ（５＋４＋３）の４５５０ｂｐ ＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ断片中に
クローニングした。産生したプラスミドを２４ＢＸＬＦ２．４２Ｋと称した。
【０１９６】
ＥＢＶ ｇｐ３４０、ｇＢ、およびｇＨ遺伝子のワクシニア供与体プラスミドｐＳＤ５４
２への挿入およびｖＰ９４１とｖＰ９４４の単離
ワクシニア供与体プラスミドｐＳＤ５４２は、延長ポリリンカー領域を有するｐＳＤ４６
０の誘導体であり、異種遺伝子をワクシニアＴＫ座に組換えるのに用いる。４８６Ｈ６３
４０プラスミドの２８２０ｂｐ ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ断片を、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩ
Ｉ ｐＳＤ５４２プラスミド中にクローニングした。産生したプラスミドを５４２．３４
０と称した。
10
【０１９７】
２４ＢＸＬＦ２．４２の２１５０ｂｐ ＳｍａＩ／ＢｇｌＩＩ断片を、ＳｍａＩ／Ｂｇｌ
ＩＩ５４２．３４０プラスミド中にクローニングした。産生したプラスミドを５４２．３
４０ｇＨと称した。
【０１９８】
ＳＰ１３１ｇＢプラスミドの２７００ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、Ｂ
ｇｌＩＩ５４２．３４０ｇＨプラスミド中にクローニングした。産生したプラスミドをＥ
ＢＶトリプル１と称した。ＥＢＶトリプル１中に挿入されたＥＢＶコード領域の遺伝地図
を第８図に示す。第８図の矢印により、転写方向を示す。
【０１９９】
20
ＥＢＶトリプル１プラスミドをＮｏｔＩにより切断し、ＮＹＶＡＣまたは３つのＨＢＶ遺
伝子を含有するＮＹＶＡＣベースのワクシニア組換え体に感染したベロ細胞中にトランス
フェクションせしめた。対応する組換えワクシニアウイルスｖＰ９４４およびｖＰ９４１
を単離した。
【０２００】
実施例１２−２型単純ヘルペスウイルスのｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を発現するＮＹＶ
ＡＣ組換え体の構築
ＨＳＶ２ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスを構築した
。
【０２０１】
30
細胞およびウイルス
ＨＳＶ ２（菌株Ｇ）をベロ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）中で増殖せしめ、スクロース
勾配での遠心分離により精製した（ポウエルら、１９７５）。
【０２０２】
ワクシニアウイルス（コペンハーゲン）およびそれから誘導された組換え体を前述したよ
うにベロ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）中で増殖せしめた（パニカリら、１９８２；グオ
ら、１９８９）。
【０２０３】
ＨＳＶ２ ｇＢ遺伝子の単離
ＨＳＶ２ ｇＢ遺伝子を含有する１２ｋｂ ＢｇｌＩＩ断片を、ＨＳＶ２ゲノムＤＮＡか
40
ら単離し、ｐＳＤ４８ ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入した。産生したプラスミドを
ｐＪ４と称した。
【０２０４】
次いでｇＢ遺伝子をワクシニアウイルスのフランキングアーム間にクローニングした。こ
れは、ｐＪ４の２，７００ｂｐ ＳｓｔＩＩ−ＳａｃＩ（部分的）断片をｐＭＰ４０９Ｄ
ＶＣのＳｓｔＩＩ−ＳａｃＩ断片中にクローニングすることにより達成された（グオら、
１９８９）。これはＭ２Ｌ遺伝子を側腹に有するワクシニアウイルス配列間にｇＢ遺伝子
を配した。この操作により産生されたプラスミドをｐＧＢ１と称した。
【０２０５】
次いでインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）終止コドンをｇＢ遺伝子の３′末端に加えた。
50
(39)
JP 3602844 B2 2004.12.15
これは、オリゴヌクレオチド、ＧＢＬ３（配列認識番号６９）５′−ＣＴＡＡＴＡＧ−３
′およびＧＢＬ４（配列認識番号７０）５′−ＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＧＡＧＣＴ−３′を
ｐＧＢ１の６，３００ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ（部分的）断片中にクローニングする
ことにより達成された。この操作により産生したプラスミドをｐＧＢ２と称した。
【０２０６】
次いでワクシニアウイルスＨ６プロモーター（テイラーら、１９８８ａ；パーカスら、１
９８９）をｇＢ遺伝子の上流にクローニングした。これは、Ｈ６プロモーターを含有する
、ｐＢＬＶＨ１４の３７０ｂｐ ＢｇｌＩＩ断片（ポーテテレら、１９９１）をｐＧＢ２
のＢｇｌＩＩ中にクローニングすることにより達成された。この操作により産生したプラ
スミドをｐＧＢ３と称する。
10
【０２０７】
次いでＨ６プロモーターの開始コドンをｇＢ遺伝子の開始コドンと配列せしめた。これは
、オリゴヌクレオチド、ＧＢＬ１（配列認識番号７１）
【化４４】
およびＧＢＬ１（配列認識番号７２）
【化４５】
20
をｐＧＢ３の６，３００ｂｐ ＳｓｔＩＩ−ＥｃｏＲＶ（部分的）断片中にクローニング
することにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＧＢ５と称した。
【０２０８】
次いでＨ６プロモートしたｇＢ遺伝子を異なるワクシニアウイルス供与体プラスミド中に
クローニングした。これは、Ｈ６プロモートしたｇＢ遺伝子を含有する、ｐＧＢ５の２，
８００ｂｐ ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＳＤ５１３ＶＣＶＱのＢｇｌＩＩ部位中に
30
クローニングすることにより行なった。（ｐＳＤ５１３ＶＣＶＱは、チミジンキナーゼ（
ｔｋ）遺伝子がポリリンカー領域により置換されたワクシニアウイルスＨｉｎｄＩＩＩ Ｊ断片のサブクローンである。）これにより、Ｈ６プロモートしたｇＢ遺伝子をｔｋ遺伝
子を側腹に有するワクシニアウイルス配列間に配した。この操作により産生したプラスミ
ドをｐＧＢ６と称した。
【０２０９】
ＨＳＶ２ ｇＣ遺伝子の単離
ＨＳＶ２ ｇＣ遺伝子を含有する、２，９００ｂｐ ＳａｌＩ断片を、ＨＳＶ２ゲノムＤ
ＮＡから単離し、ｐＩＢＩ２５のＳａｌＩ部位に挿入した。産生したプラスミドをｐＧＣ
３と称した。
40
【０２１０】
次いでｇＣ遺伝子をワクシニアウイルスフランキングアーム間にクローニングした。これ
は、ｐＧＣ３の２，９００ｂｐ ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＧＣ２のＸｈｏＩ−Ｂａ
ｍＨＩ部位にクローニングすることにより達成された。Ｈ６プロモーターを含有する、ｐ
ＢＬＶＨ１４の３７０ｂｐ ＢｇｌＩＩ断片（ポーテテレら、１９９１）を、ｐＳＤ４８
６のＢｇｌＩＩ部位にクローニングすることによりｐＧＣ２を産生した（第２図）。これ
により、ｕ遺伝子を側腹に有するワクシニアウイルス配列間にｇＣ遺伝子を配した。この
操作により産生したプラスミドをｐＧＣ５と称した。
【０２１１】
次いでＨ６プロモーターの開始コドンをｇＣ遺伝子の開始コドンと配列せしめた。これは
50
(40)
JP 3602844 B2 2004.12.15
、オリゴヌクレオチド、ＧＣＬ１（配列認識番号７３）
【化４６】
およびＧＣＬ２（配列認識番号７４）
【化４７】
10
を、ｐＧＣ５の５，４００ｂｐ ＮｒｕＩ−ＳｆｉＩ断片中にクローニングすることによ
り行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＧＣ１０と称した。
【０２１２】
次いでｐＧＣ１０から、外来の３′−非コード配列を除去した。これは、ｐＧＣ１０の４
，９００ｂｐ ＳａｌＩ−ＳｍａＩ（部分的）断片が満たされたＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポ
リメラーゼＩ（クレノウ断片）を再び環状とすることにより行なわれた。この操作により
産生したプラスミドをｐＧＣ１１と称した。
【０２１３】
20
次いでさらに３′−非コード配列をｐＧＣ１１から除去した。これは、オリゴヌクレオチ
ド、ＧＣＬ３ ５′−ＣＴＡＧＧＧＣＣ−３′をｐＧＣ１１の４，９００ｂｐ ＸｂａＩ
−ＡｐａＩ（部分的）断片中にクローニングすることにより行なった。この操作により産
生したプラスミドをｐＧＣ１２と称した。
【０２１４】
ＨＳＶ２ ｇＤ遺伝子の単離
ＨＳＶ２ ｇＤ遺伝子を含有する、７．５ｋｂ ＸｂａＩ断片を、ＨＳＶ２ゲノムＤＮＡ
から単離し、ｐＩＢＩ２５のＸｂａＩ部位に挿入した。産生したプラスミドをｐＧＤ１と
称した。
【０２１５】
30
次いでｇＤ遺伝子をＨ６プロモーターの下流とワクシニアウイルスフランキングアームの
間にクローニングした。これは、ｐＧＤ１の１，５００ｂｐ ＤｒａＩ−ＰｓｔＩ断片を
ｐＴＰ１５の３，７００ｂｐ ＳｍａＩ−ＰｓｔＩ断片中にクローニングすることにより
行なった（グオら、１９８９）。これにより、ｇＤ遺伝子をＨ６プロモーターの下流とＨ
Ａ遺伝子を側腹に有するワクシニアウイルス配列間に配した。この操作により産生したプ
ラスミドをｐＧＤ２と称した。
【０２１６】
次いでＨ６プロモーターの開始コドンをｇＤ遺伝子の開始コドンと配列せしめた。これは
、オリゴヌクレオチド、ＧＤＬ１（配列認識番号７５）
【化４８】
40
およびＧＤＬ２（配列認識番号７６）
【化４９】
を、ｐＧＤ２の５，１００ｂｐ ＥｃｏＲＶ−ＡｈａＩＩ（部分的）断片中にクローニン
グすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＧＤ５と称した。
【０２１７】
次いで外来の３′−非コード配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、ＧＤＬ３（
50
(41)
JP 3602844 B2 2004.12.15
配列認識番号７７）
【化５０】
およびＧＤＬ４（配列認識番号７８）
【化５１】
10
をｐＧＤ５の４，８００ｂｐ ＮａｅＩ−ＰｓｔＩ断片中にクローニングすることにより
行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＧＤ７と称した。
【０２１８】
次いで追加の配列をＨ６プロモーターの上流に加えた。これは、ｐＧＢ６の１５０ｂｐ ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片（上記参照）をｐＧＤ７の４，８００ｂｐ ＢｇｌＩＩ−Ｅ
20
ｃｏＲＶ断片中にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラス
ミドをｐＧＤ８と称した。
【０２１９】
ＨＳＶ２ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有するワクシニアウイルス供与体プラスミド
の構築
ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有するプラスミドを構築した。これは、Ｈ６プロモートしたｇ
Ｃ遺伝子を含有する、１，８５０ｂｐ ＰｓｔＩ断片を、ｐＧＤ８のＰｓｔＩ部位にクロ
ーニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＧＣＤ１と称
した。
【０２２０】
30
次いでｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有するプラスミドを構築した。これは、Ｈ６プロ
モートしたｇＢ遺伝子を含有する、ｐＧＢ６の２，８００ｂｐ ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ
断片を、ｐＧＣＤ１の６，８００ｂｐ ＢａｍＨＩ（部分的）断片中にクローニングする
ことにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＧＢＣＤ１と称した。
【０２２１】
次いで外来のＤＮＡを除去した。これは、Ｈ６プロモートしたｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝
子を含有する、ｊｐＧＢＣＤ１の６，０００ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ（部分的
）断片が満たされたＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）を、ｐＭＰ８
３１のＳｍａＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプ
ラスミドをｐＧＢＣＤＣ１と称した。
40
【０２２２】
次いでＨ６プロモートしたｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子をワクシニアウイルスフランキン
グアーム間にクローニングした。これは、オリゴヌクレオチド、ＨＳＶＬ１（配列認識番
号７９）５′−ＴＣＧＡＴＣＴＡＧＡ−３′およびＨＳＶＬ２（配列認識番号８０）５′
−ＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡ−３′、並びにＨ６プロモートしたｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子
を含有する、ｐＧＢＣＤＣ１の５，７００ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ（部分的）
断片を、ｐＳＤ５４１の３，６００ｂｐ ＸｈｏＩ−ＢｇｌＩＩ断片中にクローニングす
ることにより行なった。これにより、Ｈ６プロモートしたｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を
、ＡＴＩ遺伝子を側腹に有するワクシニアウイルス配列間に配した。この操作により産生
されたプラスミドをｐＧＢＣＤ４と称した。
50
(42)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０２２３】
ｖＰ９１４の構築
ＨＳＶ２ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有する、ワクシニアウイルス組換え体、ｖＰ
９１４を構築した。ワクシニアウイルス組換え体を構築するのに用いた工程は以前に記載
している（パニカリら、１９８２；グオら、１９８９；グオら１９９０）。ｐＧＢＣＤ４
をｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）感染細胞中にトランスフェクションすることにより、ワクシ
ニアウイルス組換え体、ｖＰ９１４を産生した。この組換え体のＨＳＢ２遺伝子は、ワク
シニアウイルスＨ６プロモーターの転写制御下にある。
【０２２４】
ｖＰ９１４感染細胞の蛍光抗体法および免疫沈降
10
前述したように、蛍光抗体法および免疫沈降を行なった（グオら、１９８９）。ＨＳＶ２
に対する家ウサギ抗血清をダコ社（コード番号Ｂ１１６）から得た。ＨＳＶ２ ｇＢ（Ｈ
２３３）およびＨＳＶ２ ｇＤ（ＨＤ１）に対する単クローン性抗体（メイグニアら、１
９８７）を、Ｂ．メイグニア（フランス、リヨン、インスティテュートメリオクス）から
得た。
【０２２５】
ＨＳＶ２感染細胞において、ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ（他のＨＳＶ２糖タンパク質と同様に
）は細胞表面上に発現される。ＨＳＶ２ ｇＢ（Ｈ２３３）およびＨＳＶ２ ｇＤ（ＨＤ
１）に特異的な単クローン性抗体を使用した、ｖＰ９１４感染細胞に関する蛍光抗体法に
より、これらの細胞中で産生されたＨＳＶ２ ｇＢおよびｇＤ糖タンパク質はまた細胞表
20
面に発現されることが示された。
【０２２６】
ＨＳＶ２感染細胞において、ｇＢ、ｇＣおよびｇＤは、それぞれ約１１７ｋＤａ、６３ｋ
Ｄａおよび５１ｋＤａの分子量を有する（マースデンら、１９８７；マースデンら、１９
８４；ツウェイグら、１９８３）。ｖＰ９１４感染細胞のｇＢ特異的単クローン性抗体（
Ｈ２３３）による免疫沈降により、約１１７ｋＤａ、１１０ｋＤａおよび１００ｋＤａの
分子量を有する３つの主要なタンパク質、並びに他の少量のタンパク質が沈殿した。ｇＤ
特異的単クローン性抗体（ＨＤ１）による免疫沈降により、約５１ｋＤａの分子量を有す
る主要なタンパク質および約５５ｋＤａと４６ｋＤａの分子量を有する少量のタンパク質
が沈殿した。加えて、ｖＰ９１４感染細胞のＨＳＶ２に対する多クローン性抗血清による
30
免疫沈降により、ｇＣに同様の６３ｋＤａの分子量を有するタンパク質（８５ｋＤａタン
パク質と同様）およびサイズでｇＢとｇＤに対応するタンパク質が沈殿した。それゆえ、
ｖＰ９１４に感染した細胞は、ｇＢ、ｇＣおよびｇＤと同一の分子量を有するＨＳＶ２タ
ンパク質を発現するように思われた。
【０２２７】
実施例１３−Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を発現するＮＹＶＡＣ組換え体の構築
ＤＮＡクローニングおよび合成
プラスミドを構築し、スクリーニングし、標準方法により増殖せしめた（マニアチスら、
１９８２；パーカスら、１９８５；ピッチーニら、１９８７）。制限エンドヌクレアーゼ
を、ベセスダリサーチラボラトリーズ（ＭＤ、ゲイサースブルグ）、ニューイングランド
40
バイオラボ（ＭＡ、ビバーリー）、およびベーリンガーマンハイムバイオケミカルス（Ｉ
Ｎ、インディアナポリス）から得た。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼをニューイングランドバイオ
ラボから得た。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼをベセスダリサーチラボラトリーズから得
た。プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚをプロメガ（ＷＩ、マジソン）から得た。ｐＢＲ３２２中
にクローニングされたＨＢＶゲノムを含有するプラスミドｐＴＨＢＶの起源は以前に記載
されている（パオレッティら、１９８４）。
【０２２８】
合成オリゴブオキシリボヌクレオチドを、前述したようにバイオサーチ８７５０またはア
プライドバイオシステム３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーにより調製した（パーカスら、
１９８９）。前述したように（グオら、１９８９）、シーケナーゼ（タバーおよびリチャ
50
(43)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ードソン、１９８７）を用いたジデオキシ鎖終止法（サンガーら、１９７７）により、Ｄ
ＮＡ塩基配列決定を行なった。自動パーキンエルマーセタスＤＮＡサーマルサイクラー中
で注文合成オリゴヌクレオチドプライマーおよびジェネアンプＤＮＡ増幅試薬キット（Ｃ
Ｔ、ノルウォーク、パーキンエルマーセタス）を用いて、クローニングと配列確認（エン
ゲルケら、１９８８）のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅を行な
った。
【０２２９】
ウイルスおよびトランスフェクション
ワクシニアウイルスのＮＹＶＡＣ菌株およびその中間祖先、ｖＰ８０４（第５図）を用い
た。組換えウイルスの産生と加工は前述したようなものである（パニカリら、１９８２）
10
。
【０２３０】
免疫沈降
ベロ細胞を、細胞当たり１０ｐｆｕのｍ．ｏ．ｉ．で、組換えワクシニアウイルス、ＮＹ
ＶＡＣ親ウイルス（ｖＰ８６６）に感染せしめたか、または疑似感染せしめた。１時間の
吸着期間後、接種物を除去して、感染細胞に
３ ５
Ｓメチオニン（２０ｕＣｉ／ｍｌ）を含
有するメチオニン不含有培地を添加した。全ての試料を感染８時間後に収集した。試料を
、トリトンを含有する３×緩衝液Ａおよび５０ｕｌのアプロチニン（ＭＯ、セントルイス
、シグマケミカル社、＃Ａ６２７９）を含有するＤＯＣ（３％ ＮＰ−４０、３％ トリ
トン、３％ ＤＯＣ、３０ｍＭ トリスｐＨ７．４、４５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｅ
20
ＤＴＡ、０．０３％ ＮａＡｚｉｄｅ、０．６ｍｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ）中に溶解せしめた
。全ての溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに連結した通常の家ウサギ血清に対して
前浄化した。
【０２３１】
ＨＢＶコア抗原とＨＢＶ Ｓ２ペプチド（ａａ１２０−１５３）に対して生じた家ウサギ
抗血清をＲ．ニューラスから得た（ニューヨーク血液センターのリンドスレーＦキンボー
ルリサーチインスティテュート）。抗Ｓ２抗血清をｖＰ８６６感染ベロ細胞で前吸着せし
めた。電気泳動と続いてのオートラジオグラフィーのために、ＨＢＶタンパク質を、抗コ
アまたは抗Ｓ２抗血清を用いて免疫沈降を行ない、２×ラエムリ試料緩衝液（ラエムリ、
１９７０）中で再懸濁せしめた。
30
【０２３２】
血清学
家ウサギおよびモルモットに、皮内、皮下または筋肉内の経路により、２つずつ１０
８ ｐｆｕの組換えワクシニアウイルスｖＰ９１９を接種せしめた。最初の接種から６週間後
、同じ経路と接種量で家ウサギに追加抗原投与した。最初の接種から７週間後、同じ経路
と接種量でモルモットに追加抗原投与した。１２匹のマウスの群に、皮内、皮下または筋
肉内の経路により、１０
７ ｐｆｕの組換えワクシニアウイルスｖＰ９１９を接種せしめ
た。最初の接種から７週間後、同じ経路と接種量でマウスに追加抗原投与した。１週間ご
とに血清を採取した。マウスの各群から毎週採血した。ＡＵＳＡＢラジオイムノアッセイ
キット（ＩＬ、北シカゴ、アボット）を用いて全ての血清をＨＢＶ表面抗原に対する抗体
40
に関して分析した。標準技術を利用したＣＯＲＡＢコンペティティブラジオイムノアッセ
イキット（アボット）を用いてＨＢＶコア抗原に対する抗体に関して分析した。
【０２３３】
ｖＰ９１９の構築
ワクシニア組換え体ｖＰ９１９は、ＮＹＶＡＣワクシニアウイルスベクターに挿入された
Ｂ型肝炎からの３つの遺伝子を含有している。この遺伝子は、ウイルスの３つの異なった
部位に個々に挿入された。３つのＨＢＶ遺伝子は以下のタンパク質産生物をコードする：
（１）ＨＢＶ Ｍタンパク質、（ここではスモールプレＳ抗原、またはｓｐｓＡｇと称し
た）、（２）ＨＢＶ Ｌタンパク質（ここではラージプレＳ抗原、またはｌｓｐＡｇと称
した）、（３）コア抗原のアミノ末端に連結した完全なプレＳ領域（Ｓ１＋Ｓ２）からな
50
(44)
JP 3602844 B2 2004.12.15
る融合タンパク質、（ここではＳ１２／コアと称した）。
【０２３４】
ワクシニアウイルスは、単一ワクシニアゲノム中に連続して挿入された同一の非相同ＤＮ
Ａ配列の多重コピーを保持しない（パニカリら、１９８２）。ｓｐｓＡｇのコード配列は
ｌｐｓＡｇのコード配列内に含有されるので、単一ワクシニアゲノムへの両方の遺伝子の
挿入によりゲノムが不安定となると思われる。同様に、ハイブリッドＳ１２／コア遺伝子
中に存在するＳ１＋Ｓ２ ＤＮＡ領域ｌｐｓＡｇの等量のＳ１＋Ｓ２領域との組換えを経
る。潜在的な問題は２つの方法で防いだ。（１）３つの遺伝子は、必須遺伝子を含有する
ワクシニアＤＮＡの大きな領域により互いに離れたワクシニアゲノム中の３つの異なる座
に挿入した。それゆえ、ＨＢＶ遺伝子間のいかなる組換えによっても、生存可能なワクシ
10
ニア後代を産生しない不完全なワクシニアゲノムとなる。（２）ｓｐｓＡｇ遺伝子とＳ１
２／コアハイブリッド遺伝子のＳ１＋Ｓ２領域をコードするＤＮＡを、ｌｐｓＡｇをコー
ドする原生ＨＢＶ遺伝子と互いとのＤＮＡ相同性を最小限とする異なるコドンの用法で化
学的に合成した。ｌｐｓＡｇをコードする原生ＨＢＶ遺伝子とｓｐｓＡｇをコードする合
成遺伝子は、ａｙｗ亜型である；融合Ｓ１２／コア遺伝子のＳ１＋Ｓ２領域をａｄｗ２亜
型に対応するように合成した（バレンズエラら、１９７９）。
【０２３５】
ポックスウイルスプロモーターの制御下で３つのここのＨＢＶ遺伝子を含有するカセット
を、異なるワクシニア供与体プラスミド中で組み立てて続いて以下に記載するようにワク
シニアウイルスに挿入した。
20
【０２３６】
ＨＢＶ ｓｐｓＡｇをコードする遺伝子の合成型を、以下の改変によるワクシニアに好ま
しいコドンを用いて合成した。（１）ｓＡｇ（ＨＢＶ Ｓタンパク質）のアミノ酸１９か
ら２１に生じたＴ５ＮＴ初期転写終止ＴＴＴＴＴＣＴをＴＴＣＴＴＴＣに改変し、他のＴ
５ＮＴ終止シグナルを産生しないようにコドンの用法を調整した（ユエンら、１９８７）
。（２）潜在的な変型翻訳産生物を避けるために、いずれの方向にもフレームＡＴＧ開始
コドンからの産生を防ぐようにコドンの用法を調整した。合成ｓｐｓＡｇ遺伝子を、改変
ワクシニアウイルスＨ６初期／晩期プロモーターに正確に連結した（パーカスら、１９８
９）。プロモーターと遺伝子の完全な配列を第９図に示す。アミノ酸配列は、プラスミド
ｐＴＨＢＶ中に配列に基づき、これはＳ２領域の２つのアミノ酸位置：ガリバート、ａａ
30
３１ｔｈｒ；ａａ ３６ ｌｅｕ；ｐＴＨＢＶ、ａａ ３１ ａｌａ；ａａ ３６
ｐｒｏで発表されているａｙｗ配列とは異なる（ガリバートら、１９７９）。
【０２３７】
プラスミドｐＧＪ１５は、ワクシニアＡＴＩ挿入座にＨ６プロモーター／合成ｓｐｓＡｇ
遺伝子を含有している（パーカスら、１９９０）。ｐＧＥＭ−３Ｚ中の合成ｓｐｓＡｇ遺
伝子の部分を組み立て、組み立てた遺伝子を、ＡＴＩ欠損座に合成Ｈ６プロモーターを含
有するｐＳＤ４９２の誘導体である、挿入プラスミドｐＭＰ４９４Ｈに運搬することによ
りｐＧＪ１５を構築した。
【０２３８】
ここで第１０図を参照する。合成ＨＢＶ ｓｐｓＡｇを３つの部分で組み立てた。プラス
40
ミドｐＧＪ５、ｐＧＪ３、およびｐＧＪ７を、以下のようにそれぞれ相補オリゴヌクレオ
チドの６、５、および８対からそれぞれ産生した。標準化学物質により合成した相補オリ
ゴヌクレオチド対を、標準条件下で、６５℃に加熱し、アニーリンクに効果のあるように
室温までゆっくりと冷却することによりキナーゼした。各断片からなるアニールした対の
アリコートを、適切に切断したｐＧＥＭ−３Ｚ（プロメガ）と組み合わせ、標準条件下で
連結した。ＳｐｈＩおよびＸｂａＩ制限部位により制限された断片ＳＸ（黒塗りの四角で
示す）を、プラスミドｐＧＪ５を産生するそれらの酵素で切断したｐＧＥＭ−３Ｚベクタ
ープラスミドと連結した。ベクタープラスミド配列を開いた領域で示す。同様に、断片Ｘ
Ｂ（斜線）とＢＨ（横線）を、それぞれＸｂａＩとＢａｍＨＩ、またはＢａｍＨＩとＨｉ
ｎｄＩＩＩのいずれかで切断したプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ中で組み立て、プラスミドｐ
50
(45)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ＧＪ３およびｐＧＪ７を産生した。各プラスミド中の挿入の完全性を、ＤＮＡ配列の決定
により確認した。
【０２３９】
ＳＸ、ＸＢおよびＢＨ遺伝子断片を側腹に有する適切な制限酵素でプラスミドｐＧＪ５、
ｐＧＪ３およびｐＧＪ７を切断することにより合成ＨＢＶ遺伝子断片を単離し、続いてＳ
ｐｈＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＧＥＭ−３Ｚに連結し、連続ＨＢＶ合成ｓｐｓＡｇ
配列を含有するプラスミドｐＧＨ９を産生した。開始メチオニンから最初のコドンより９
ｂｐ下流のＥｃｏＲＩ部位で合成ｐｓｐＡｇに付加されたＨ６プロモーターの３′２８ｂ
ｐ（斜線）を含有するオリゴヌクレオチドＨ６ＬＩＮＫ（配列認識番号８１）
【化５２】
10
およびＨ６ＬＩＮＫ２（配列認識番号８２）
【化５３】
を、ＫｐｎＩ（ｐＧＥＭ−３Ｚから誘導された多重クローニング領域内の５′からＳｐｈ
Ｉ部位）とＥｃｏＲＩで切断したｐＧＪ９と連結し、プラスミドｐＧＪ１２を産生した。
ＮｒｕＩ／ＨｐａＩ断片をｐＧＨ１２から単離して、同様に切断したｐＭＰ４９４Ｈに連
20
結し、プラスミドｐＧＪ１５を産生した。ｐＭＰ４９４Ｈは、ＡＴＩ欠損領域にワクシニ
アＨ６プロモーターを含有するＡＴＩ挿入プラスミドである。ｐＧＪ１５は、ＡＴＩ座を
囲うワクシニア配列（点領域）によりフランクされたＨ６プロモータードリブンＨＢＶ合
成ｓｐｓＡｇ遺伝子を含有している。
【０２４０】
ワクシニア組換え体ｖＰ８０４との組換えの供与体プラスミドとしてｐＧＪ１５を用いて
組換え体ワクシニアウイルスｖＰ８５６を産生した。ｖＰ８０４は、ＴＫ、ＨＡ、ｕおよ
び［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］のＮＹＶＡＣ欠損を含有する。組換えウイルスｖＰ８５６は、ＡＴ
Ｉ領域を置換したＨＢＶ合成ｓｐｓＡｇ遺伝子を挿入した上述欠損を含有する。以下に記
載するＩ４Ｌ領域中に挿入を含有する後代ウイルス組換え体は、欠損に関してＮＹＶＡＣ
30
と等量である（ＴＫ、ＨＡ、ＡＴＩ、Ｉ４Ｌ、ｕ、［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］）。
【０２４１】
ＨＢＶ ｌｐｓＡｇをコードする遺伝子をプラスミドｐＴＨＢＶから誘導した。上述した
Ｓ２領域のアミノ酸変化に加えて、ｐＴＨＢＶは、Ｓ１領域の１つのアミノ酸位置での発
表されたａｙｗ亜型とは異なる：ガリバートら、１９７９、ａａ９０ ｓｅｒ；ｐＴＨＢ
Ｖ ａａ９０ ｔｈｒ。上述したｓＡｇ中の初期翻訳終止シグナルを、ＴＴＴＴＴＣＴか
らＴＴＣＴＴＣＴに改変した。１０５ｂｐ 牛痘ｕプロモーターの制御下で、完全なｌｐ
ｓＡｇ遺伝子を配した（ピカップら、１９８６）。ｕプロモーター／ｌｐｓＡｇ遺伝子カ
セットを第１１図に示す。
【０２４２】
40
プラスミドｐＭＰ５５０ｕｌｐｓは、ワクシニアＩ４Ｌ欠損座にｕプロモーター／ｌｐｓ
Ａｇ遺伝子を含有している。ｐＭＰ５５０ｕｌｐｓの構築を第１２図に模式的に示す。ｐ
ＭＰ５５０ｕｌｐｓ中のＩ４Ｌ欠損は、ＮＹＶＡＣ中のＩ４Ｌ欠損と等量である。
【０２４３】
ここで第１２図の（Ａ）を参照する。合成オリゴヌクレオチドプライマーＭＰＳＹＮ３２
２（配列認識番号８３）、ＭＰＳＹＮ３２３（配列認識番号８４）およびテンプレートプ
ラスミドｐＢＳｃｏｗを使用するＰＣＲにより、ＨＢＶ ｌｐｓＡｇ遺伝子の５′末端を
牛痘ｕプロモーター（矢印で示した方向）に加え、ｐＭＰｕＳ１を産生した。（黒い四角
がｕプロモーターを示し、線の四角がＨＢＶ配列を示す。）ｐＳＤ５５０は、Ｉ４Ｌ欠損
領域のワクシニア挿入プラスミドである。（三角形は欠損の部位を示し、四角はワクシニ
50
(46)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ア配列を示す。）ｕプロモーター／ＨＢＶ接合部を含有するＳｎａＢＩ／ＢａｍＨＩ断片
を単離し、ＳｍａＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＳＤ５５０に挿入して、ｐＭＰ５５０ｕを
産生した。
【０２４４】
ここで第１２図（Ｂ）を参照する。完全ＨＢＶ ｌｐｓＡｇを含有する１．１ｋｂ Ｄｒ
ａＩ断片をｐＴＨＢＶから単離し、ｐＵＣ８中に挿入し、ｐＭＰ８Ｓを形成した。翻訳開
始コドンおよび終止コドンを示す。（＊）はＴ５ＮＴ転写終止シグナルの部位を示す（ユ
エンら、１９８７）。示したようにＰＣＲ突然変異誘発により転写終止シグナルをｐＭＰ
８Ｓから除去し、ｐＭＰ８ＳＴを産生した。ｌｐｓＡｇのバルクを含有する１．１ｋｂ ＢａｍＨＩ（部分的）断片をｐＭＰ８ＳＴから単離して、ＢａｍＨＩで切断したプラスミ
10
ドｐＭＰ５５０ｕに挿入し、ｐＭＰ５５０ｕｌｐｓを産生した。ｐＭＰ５５０ｕｌｐｓは
ワクシニア組換え体ｖＰ８５６との組換えに用いて、ｖＰ８９６を産生した。合成オリゴ
ヌクレオチド配列は以下の通りである：
ＭＰＳＹＮ３２２（配列認識番号８３）
【化５４】
ＭＰＳＹＮ３２３（配列認識番号８４）
【化５５】
20
ＭＰＳＹＮ３３０（配列認識番号８５）
【化５６】
ＭＰＳＹＮ３３１（配列認識番号８６）
【化５７】
30
ＭＰＳＹＮ３２２（配列認識番号８３）のＨＢＶ開始コドンに下線を引き、ＭＰＳＹＮ３
３１（配列認識番号８６）の変異した塩基にも下線を引き、制限部位を表示した。
【０２４５】
上述したように救助ウイルスｖＰ８５６により組換えの供与体プラスミドとしてｐＭＰ５
５０ｕｌｐｓを用いて組換えウイルスｖＰ８９６を産生した。ｖＰ８９６は、ＮＹＶＡＣ
のバックグラウンド（ＴＫ、ＨＡ、ＡＴＩ、Ｉ４Ｌ、ｕ、［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］が欠損）に
ＨＢＶ ｓｐｓＡｇおよびＨＢＶ ｌｐｓＡｇの両方の遺伝子を含有している。多価ＨＢ
Ｖワクシニア組換え体との比較目的のためにＨＢＶ ｌｐｓＡｇ遺伝子のみを含有する組
換え体を産生するために、ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）との組換えにｐＭＰ５５０ｕｌｐｓ
40
を用いて、組換えウイルスｖＰ８９７を産生した。
【０２４６】
ワクシニアウイルスに挿入された３番目のＧＢＶ遺伝子は融合タンパク質をコードする。
ＨＢＶ Ｓ１およびＳ２領域を特定する合成ＤＮＡを、ＨＢＶコア抗原を特定する遺伝子
の５′末端にクローニングした。ａｄｗ亜型のＳ１＋Ｓ２領域をコードし（バレンズエラ
ら、１９７９）、ａａ位置１２のｍｅｔ（ａｙｗ亜型の位置１に等しい）により開始する
ように合成ＤＮＡを設計した（ガリバートら、１９７９）。Ｓ１＋Ｓ２の合計翻訳領域は
１６３コドンである。多価ＨＢＶワクシニア組換えウイルス中のＨＢＶ遺伝子の中で望ま
しくない分子内組換えを防ぐために、ｐＴＨＢＶ中に存在する原生ａｙｗＳ１＋Ｓ２領域
を有する合成Ｓ１＋Ｓ２領域、並びにｐＧＪ１５中の合成Ｓ２領域のＤＮＡ相同性を最小
50
(47)
JP 3602844 B2 2004.12.15
限にするためにコドンの用法を調整した。
【０２４７】
コア抗原をコードする全縁遺伝子をｐＴＨＢＶから得た。ｐＴＨＢＶによりコードされた
コア抗原のアミノ酸配列は発表されたａｙｗ配列と一致する（ガリバートら、１９７９）
。ワクシニアＩ３Ｌ初期／中間プロモーターの制御下でＳ１２／コアをコードする肝炎融
合遺伝子を配した（フォスら、１９８８；ゲーベルら、１９９０ｂ位置６４，９７３−６
５，０７４）。Ｉ３Ｌプロモーター／Ｓ１２／コア遺伝子カセットの全縁配列を第１３図
に示す（配列認識番号８７）。
【０２４８】
プラスミドｐＭＰ５４４Ｉ３Ｓ１２Ｃは、ＨＡ欠損座にＩ３Ｌプロモーター／Ｓ１＋Ｓ２
10
／コア遺伝子を含有している（グオら、１９８９）。ｐＭＰ５４４Ｉ３Ｓ１２Ｃの構築を
第１４図に模式的に示す。
【０２４９】
ここで第１４図を参照する。プラスミドｐＭＰＣＡ−Ｂは、ｐＵＣ９のＳｍａＩ部位に挿
入されたｐＴＨＢＶからの１ｋｂ ＨｈａＩ断片を含有している。ｐＭＰ９ＣＡ−Ｂは、
ＨＢＶコア抗原、並びに遺伝子の上流と下流のフランキングＨＢＶ ＤＮＡの全縁コード
配列を含有している。ｐＭＰ９ＣＡ−Ｂを、遺伝子の３′末端から３０ｂｐ上流のＢｇｌ
ＩＩ（部分的）およびＨＢＶ／ｐＵＣ接合部でのポリリンカー領域のＥｃｏＲＩで切断し
た。ＨＢＶ遺伝子のバルクを含有する３．４ｋｂベクター断片を単離し、アニールした合
成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２７５（配列認識番号８８）
20
【化５８】
およびＭＰＳＹＮ２７６（配列認識番号８９）
【化５９】
30
と連結し、ｐＭＰ９ＣＡ−Ｃを産生した。制限部位を表示し、翻訳終止コドンに下線を引
き、初期ワクシニア転写ターミネーターには上に線を引いた。
【０２５０】
ｐＭＰ９ＣＡ−Ｃは、ＨＢＶコア抗原の全縁コード配列を含有し、上述したように遺伝子
のバルクの供給源として用いた。
【０２５１】
以下に示すように、合成オリゴヌクレオチド、ＭＰＳＹＮ２９０からＭＰＳＹＮ３０８（
配列認識番号９０）−（配列認識番号９９）を用いて上述したような５つの二本鎖セクシ
ョンＡからＥにおいて合成Ｓ１＋Ｓ２領域を組み立てた。オリゴヌクレオチドは、４から
８ｂｐの付着末端とともに、４６ｍｅｒから７１ｍｅｒのサイズに亘った。セクション内
の内部位置にあるオリゴヌクレオチドの５′末端は、セクションをアニールする前にキナ
ーゼした。セクションＡからＥを構築するのに用いた合成オリゴヌクレオチドの配列を以
下に示す。コード鎖のみを示す。関連制限部位を示す。Ｓ１（セクションＡ）、Ｓ２（セ
クションＣ）およびコア（セクションＥ）の開始コドンに下線を引いた。
【０２５２】
【化６０】
40
(48)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【化６１】
10
(49)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
テンプレートとして、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｉのサブクローンである、ｐＭＰ１、およびＰＣ
Ｒプライマーとして合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ３１０（配列認識番号１００）、
ＭＰＳＹＮ３１１（配列認識番号１０１）を用いて、ワクシニアＩ３Ｌプロモーターを合
成した。制限部位を示す。
【０２５３】
【化６２】
40
(50)
JP 3602844 B2 2004.12.15
Ｉ３プロモーター／ＨＢＶ Ｓ１＋Ｓ２／コア発現カセットを上述した中間プラスミドク
ローンを用いて段階でｐＵＣ８とｐＵＣ９において組み立て、ｐＭＰ９Ｉ３Ｓ１２コアを
産生した。関連する場合のみに制限部位を示す。プラスミドｐＭＰ９Ｉ３Ｓ１２コアをＳ
10
ｍａＩで切断し、全縁プロモーター／遺伝子カセットを含有する１．２ｋｂ断片を単離し
た。ワクシニアＨＡ欠損プラスミドｐＳＤ５４４をＳｍａＩで切断し、１．２ｋｂ断片と
連結してプラスミドｐＭＰ５４４Ｉ３Ｓ１２Ｃを産生した。
【０２５４】
ｐＭＰ５４４Ｉ３Ｓ１２Ｃを、上述したワクシニア組換え体ｖＰ８９６との組換えの供与
体プラスミドとして用いて、組換えワクシニアウイルスｖＰ９１９を産生した。ｖＰ９１
９は、ＮＹＶＡＣバックグラウンド中に全て３つのＨＢＶ挿入物：ｓｐｓＡｇ、ｌｐｓＡ
ｇおよびＳ１２コア融合を含有する。ｖＰ９１９中の全てのＨＢＶ挿入物の配列は、テン
プレートとしてｖＰ９１９を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と、続いてのＰＣＲ
産生物質のジデオキシ配列決定により確認した。加えて、上述したようにｖＰ８０４との
20
組換えにおいて、ｐＭＰ５４４Ｉ３Ｓ１２Ｃを用いて、ＨＢＶ Ｓ１２／コア融合のみを
含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ８５８を産生した。また組換えワクシニアウイル
スｖＰ８５６との組換えにｐＭＰ５４４Ｉ３Ｓ１２Ｃを用いて組換えワクシニアウイルス
ｖＰ８９１を産生した。ｖＰ８９１は、２つのＨＢＶ遺伝子挿入物、ｓｐｓＡｇおよびＳ
１２／コアを含有している。
【０２５５】
ｖＰ９１９によるＨＢＶタンパク質の発現
三重ＨＢＶ組換え体により合成された様々なＨＢＶタンパク質をアッセイするために、ｖ
Ｐ９１に感染した代謝標識した溶解産物および一重と二重ＨＢＶ遺伝子挿入物を含有する
適切なワクシニア組換え体に、免疫沈降を施し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
30
と続いてのラジオオートグラフィーにより分析した。未感染細胞と、ｖＰ８６６（ＮＹＶ
ＡＣ）、ｖＰ８５６（ｓｐｓＡｇ）、ｖＰ８９６（ｓｐｓＡｇ＋ｌｐｓＡｇ）またはｖＰ
９１９（ｓｐｓＡｇ、ｌｐｓＡｇ、Ｓ１２／コア）に感染した細胞中のタンパク質を家ウ
サギ抗Ｓ２抗血清を用いて免疫沈降した。さらに未感染細胞と、ｖＰ９１９（ｓｐｓＡｇ
、ｌｐｓＡｇ、Ｓ１２／コア）、ｖＰ８５８（Ｓ１２／コア）またはｖＰ８６６（ＮＹＶ
ＡＣ）に感染した細胞中のタンパク質を家ウサギ抗コア抗血清を用いて免疫沈降した。抗
Ｓ２血清は、ｓｐｓＡｇの遺伝子を含有するワクシニア単一組換え体ｖＰ８５６からの３
３ｋＤａの主要タンパク質を沈殿せしめた。これは、ＨＢＶ ｓｐｓＡｇの単独にグリコ
シル化した形状に予期したサイズに対応する。ｓｐｓＡｇの二重にグリコシル化した形状
に予期されるサイズに対応するタンパク質３６ｋＤａは少量沈殿した。抗Ｓ２血清は、ｓ
40
ｐｓＡｇとｌｐｓＡｇの遺伝子を含有するワクシニア二重組換え体ｖＰ８９６からの同一
のタンパク質を沈殿せしめる。加えて、ｌｐｓＡｇの予期したサイズに良好に対応する（
３９ｋＤａ未グリコシル化および４２ｋＤａグリコシル化）３８と４１ｋＤａの２つの大
きなタンパク質が沈殿する。ｖＰ８５６とｖＰ８９６からの抗Ｓ２血清により沈殿した全
てのタンパク質はまた、ワクシニアＨＢＶ三重組換え体ｖＰ９１９からも沈殿する。
【０２５６】
ＨＢＶ Ｓ１２／コア融合タンパク質の予期したサイズは３８ｋＤａである。家ウサギ抗
コア抗血清は、予期したサイズのタンパク質、並びに、ＨＢＶ融合遺伝子Ｓ１２／コアを
含有するワクシニア単独組換え体である、ｖＰ８５８からの様々な小さなタンパク質を沈
殿せしめた。抗コア血清によりｖＰ８５８から沈殿した最も豊富なタンパク質は、２７ｋ
50
(51)
JP 3602844 B2 2004.12.15
Ｄａのサイズを有した。これは、融合タンパク質遺伝子が２番目の（Ｓ２）ＡＴＧまで開
始する場合に予期される翻訳産生物にサイズで対応する。ｖＰ８５８から沈殿した２９ｋ
Ｄａタンパク質は、２７ｋＤａタンパク質のグリコシル化された形状である。コアタンパ
ク質のみの翻訳産生物にサイズで対応する２０ｋＤａの小さなタンパク質もまた、少量ｖ
Ｐ８５８から沈殿した。３つのＨＢＶ遺伝子全て（ｓｐｓＡｇ、ｌｐｓＡｇおよびＳ１２
／コア融合）を含有するワクシニア組換え体ｖＰ９１９は、抗コア抗血清による免疫沈降
によりｖＰ８５８に観察された模様と同一の模様を与えた。抗コア抗血清によりｖＰ８５
８とｖＰ９１９から沈殿した２７ｋＤａおよび２９ｋＤａタンパク質もまた予期したよう
に、抗Ｓ２抗血清によりｖＰ９１９から沈殿した。
【０２５７】
10
ｖＰ９１９に対する抗体応答
ｖＰ９１９により産生されたＨＢＶタンパク質に対する血清学的応答を試験するために、
ウイルスを家ウサギ、モルモットおよびマウスに接種した。家ウサギとモルモットには皮
内、皮下および筋内経路により、１０
８ ｐｆｕで２セットの組換えワクシニアウイルス
ｖＰ９１９を接種した。最初の接種から６週間後、家ウサギに同一経路と摂取量でもう一
度追加抗原投与した。最初の接種から７週間後、モルモットに同一経路と摂取量でもう一
度追加抗原投与した。１２匹のマウスの群に皮内、皮下および筋内経路により、１０
７ ｐｆｕで組換えワクシニアウイルスｖＰ９１９を接種した。最初の接種から７週間後、マ
ウスに同一経路と摂取量でもう一度追加抗原投与した。血清を１週間ごとに採取した。マ
ウスの群のそれぞれから１週間の出血を集積した。ＡＵＳＡＢラジオイムノアッセイキッ
20
ト（アボット）を用いてＨＢＶ表面抗原に対する抗体について、全ての血清を分析した。
ＣＯＲＡＢ比較ラジンイムノアッセイキット（アボット）を用いてＨＢＶコア抗原に対す
る抗体に関して、全ての血清を分析した。標準技術を用いてアッセイを行なった。これら
の分析の結果を表２（家ウサギ）、３（モルモット）および４（マウス）に示す。
【０２５８】
表２に示した結果を要約すると、６匹の家ウサギは全て、１度のｖＰ９１９の接種の後に
抗コア抗体応答を示した。６匹のうち５匹の家ウサギにおいて、抗コア抗体応答は、ｖＰ
９１９の２度の接種により追加抗原投与された。６匹のうち４匹の家ウサギは、１度のｖ
Ｐ９１９の接種の後に抗ｓＡｇ応答を示した。これらの４匹の家ウサギと追加の１匹のウ
サギは、２度の接種の後に抗ｓＡｇ応答の増大を示した。
30
【０２５９】
表３に示した結果を要約すると、１匹のモルモットは、最初のｖＰ９１９の接種後に抗コ
ア応答を示し、７週間後の追加抗原投与後には合計３匹のモルモットが抗コア応答を示し
た。３匹のうち１匹が８週間後に抗ｓＡｇ抗体応答を示した。
【０２６０】
表４の結果を要約すると、マウスの３つの群は全てｖＰ９１９の接種後様々な時期に抗コ
ア抗体応答を示、３つの群のうち２つの群が抗ｓＡｇ応答を示した。
【０２６１】
ＡＵＳＲＩＡアッセイ
ＨＢＶ含有ポックスウイルス組換え体に感染した細胞からの微粒子ＨＢＶ表面抗体の発現
40
を、市販されているＡＵＳＲＩＡ ＩＩ−１２５キット（ＩＬ、ノースシカゴ、アボット
ラボラトリーズ）を用いてアッセイした。２×１０
６ のベロ細胞を含有するディッシュ
に、２ｐｆｕ／細胞で３重に組換えワクシニアウイルスで感染せしめた。２４時間後、培
養培地を除去し、細胞を２ｍｌのＰＢＳで洗浄し、洗浄物を培地と組合せ、１０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離した。上澄みを培地分画と称した。２ｍｌのＰＶＳをディッシュに
加え、細胞を削り取り、上記からの細胞ペレットと組み合わせることにより細胞分画を調
製した。培地と細胞分画の両方の最終容積をＰＢＳで４ｍｌに調節した。細胞分画をアッ
セイの前に２分間音波処理した。細胞分画と培地分画を、ＡＵＳＲＩＡキットを用いて１
：５に希釈したＨＢＶ表面抗体の存在下でアッセイした。キットにより供給された負の対
照の２．１倍のカットオフ値より低い試料を負であると考えた。全てのディッシュからの
50
(52)
JP 3602844 B2 2004.12.15
細胞分画と培値分画の出力ウイルスをベロ細胞において滴定した。結果を表５に示す。
【０２６２】
ＥＰＶ４２ｋＤａプロモーターの制御下でＨＢＶ ｌｐｓＡｇを発現するワクシニア組換
え体の構築
ワクシニア組換えｖＰ９１９は、感染後の初期に機能する３つの異なるポックスウイルス
プロモーターの制御下で３つの異なるＨＢＶ遺伝子を含有している。同一のワクシニアバ
ックグラウンドで感染後初期に異種遺伝子を発現する様々なポックスウイルスプロモータ
ーの相対強度を比較するために、試験遺伝子として狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子を用いて
、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを行なった。この試験システムを用いると、ワクシニ
アＨ６プロモーターおよびワクシニアＩ３Ｌプロモーターは、牛痘ｕプロモーターよりも
10
強いプロモーターであることが分かった。ｖＰ９１９において、Ｈ６プロモーターはＨＢ
Ｖ ｓｐｓＡｇの発現を指示し、Ｉ３ＬプロモーターはＨＢＶ Ｓ１２／コア融合の発現
を指示し、ＵプロモーターはＨＢＶｌｐｓＡｇの発現を指示する。ｌｐｓＡｇの共発現は
粒子の形成とｓＡｇまたはｓｐｓＡｇの分泌を妨害することが示されたので、相対的に弱
いｕプロモーターはＨＢＶ ｌｐｓＡｇの発現のために故意に選択される（オウら、１９
８７；チェンら、１９８６；マックラクランら、１９８７；チサリら、１９８６）。
【０２６３】
ＨＢＶ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスによりｓＡｇまたはｓｐｓＡｇを含有
する粒子の生体外での産生を測定するためにＡＵＳＲＩＡラジオイムノアッセイキットを
用いた。予備実験により、ＡＵＳＲＩＡ反応性粒子の形成と分泌はｖＰ８５６（ｓｐｓＡ
20
ｇを含有）、ｖＰ８９６（ｓｐｓＡｇ＋ｌｐｓＡｇを含有）およびｖＰ９１９（ｓｐｓＡ
ｇ＋ｌｐｓＡｇ＋Ｓ１２／コアを含有）中に生じたことが示された。ｖＰ８９６およびｖ
Ｐ９１９において、ＡＵＳＲＩＡ反応性粒子の相対水準は、ｖＰ８５６に観察された水準
よりも低かった。
【０２６４】
ＡＵＳＲＩＡ反応性粒子の形成と分泌が高水準のｌｐｓＡｇ発現の存在下で観察されるこ
とを決定するために、エトモポックス（ＥＰＶ）４２ｋＤａプロモーターの制御下でｌｐ
ｓＡｇを配した。上述した比較ＥＬＩＳＡ試験により、ワクシニア組換えウイルス中のＥ
ＰＶ ４２ｋＤａプロモーターは、ワクシニアＨ６プロモーターまたはワクシニアＩ３Ｌ
プロモーターに観察された水準と等しい水準で異種遺伝子の発現を指示した。
30
【０２６５】
プラスミドｐＭＰ５５０ｕｌｐｓは、ワクシニアＩ４Ｌ欠損座に牛痘ｕプロモーターの制
御下でｌｐｓＡｇ遺伝子を含有している（第１２図）。プラスミドｐＭＰ５５０ｕｌｐｓ
中に存在する牛痘ｕプロモーターを以下のようにしてＥＰＶ４２ｋＤａプロモーターによ
り置換した：相補オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ３７１−３７４を内部５′末端でキナー
ゼして（ＭＰＳＹＮ３７２；ＭＰＳＹＮ３７３）、アニールして、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ
Ｉで切断したｐＵＣ８中にクローニングし、プラスミドｐＭＰ３７１／３７４を形成した
。ＭＰＳＹＮ３７１（配列認識番号１０２）、ＭＰＳＹＮ３７３（配列認識番号１０３）
、ＭＰＳＹＮ３７２（配列認識番号１０４）、およびＭＰＳＹＮ３７４（配列認識番号１
０５）
【化６３】
40
(53)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
は、ＨＢＶ Ｓ１領域（ＡＴＧ下線）からＢａｍＨＩ部位の後に３１ｂｐ ＥＰＶ ４２
ｋＤａプロモーター要素を含有している。ＤＮＡ配列の確認に続いて、挿入物をＢａｍＨ
Ｉ／ＢｇｌＩＩでの切断によりｐＭＰ３７１／３７４から単離し、以下のようにｐＭＰ５
５０ｕｌｐｓ中の対応ｕプロモーター／ＨＢＶ配列を置換するのに用いた：ｐＭＰ５５０
ｕｌｐｓをＢａｍＨＩ（部分的）／ＢｇｌＩＩで切断し、適切な５ｋｂベクター断片を単
20
離して、ｐＭＰ３７１／３７４からのＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ断片と連結した。産生した
プラスミド、ｐＭＰ５５０Ｅ３１ｌｐｓにおいて、ＨＢＶ ｌｐｓＡｇは、ＥＰＶ ４２
ｋＤａプロモーターの制御下にある。ＥＰＶ４２ｋＤａプロモーター／ｌｐｓＡｇ遺伝子
カセットの全縁配列を第１５図に示す。
【０２６６】
ｓｐｓＡｇ遺伝子を含有するワクシニア組換え体ｖＰ８５６に関する供与体プラスミドと
してｐＭＰ５５０Ｅ３１ｌｐｓを用いて、二重ＨＢＶ組換えワクシニアウイルスｖＰ９３
２を産生した。Ｓ１２／コア融合を含有する供与体プラスミドｐＭＰ５４４Ｉ３Ｓ１２Ｃ
に関する救助ウイルスとしてｖＰ９３２を用いて、三重ＨＢＶ組換えワクシニアウイルス
ｖＰ９７５を産生した。ＥＰＶ ４２ｋＤａプロモーター／ｌｐｓＡｇのみを含有するワ
30
クシニア組換え体を産生するために、ｖＰ８６６に関する供与体プラスミドとしてｐＭＰ
５５０Ｅ３１ｌｐｓを用いて組換えワクシニアウイルスｖＰ９３０を産生した。
【０２６７】
組換えワクシニアウイルスによる生体外ＨＢＶ表面抗原の分泌
ベロ細胞を含有するディッシュに、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）またはＨＢＶ ｓｐｓＡｇ
および／またはＨＢＶ ｌｐｓＡｇを発現する組換えワクシニアウイルスを三重に感染せ
しめた。感染細胞に関連するＨＢＶ表面抗原粒子の相対量を、ＡＵＳＲＩＡ ＩＩ−１２
５キットを用いて培地に分泌された量と比較した（表５）。培地中のＨＢＶ表面抗原の存
在は、ウイルス感染度の９９．８％以上が細胞関連にとどまっていたので、感染細胞の溶
解によるものではなかった。細胞ペレットと培地の容積は、直接の比較のために等しくし
40
た。ｓｐｓＡｇを発現する組換えワクシニアウイルスｖＰ８５６に感染した細胞において
、ＡＵＳＲＩＡ反応性表面抗原の４２％が培地に分泌された。比較的弱いｕプロモーター
（ｖＰ８９６）の制御下でのｌｐｓＡｇの共発現は、細胞関連ＡＵＳＲＩＡ反応性材料の
量を著しくは変化せしめなかったが、分泌した材料の相対量を合計の２４％まで減少せし
めた。比較的強いＥＰＶ ４２ｋＤａプロモーター（ｖＰ９３２）の制御下でのｌｐｓＡ
ｇの共発現は、分泌された材料の相対量を合計の６％まで低下せしめた。ｖＰ８９６に関
しては、ｖＰ９３２中のｓｐｓＡｇによるｌｐｓＡｇの共発現は、ＡＵＳＲＩＡ反応性細
胞関連材料の量を低下せしめなかった。興味をひくことに、ＥＰＶ４２ｋＤａプロモータ
ー（ｖＰ９３０）の制御下でｌｐｓＡｇのみの発現は、アッセイのためのバックグラウン
ドより著しく高い細胞関連ＡＵＳＲＩＡ反応性材料の水準の産生となり、一方でｕプロモ
50
(54)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ーター（ｖＰ８９７）の制御下でのｌｐｓＡｇの発現はそうならなかった。これは、内部
（Ｓ２またはＳ）開始コドンでの開始によるｖＰ９３０感染細胞中に産生された高水準の
ｓｐｓＡｇまたはｓＡｇによるようである。
【０２６８】
【表２】
10
20
30
【表３】
40
(55)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表４】
30
(56)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表５】
30
(57)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
実施例１４−Ｂ型肝炎ウイルスおよびエプステイン−バーウイルスを発現するＮＹＶＡＣ
組換え体の構築
40
エプステイン−バーウイルス（ＥＢＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、アフリカ
を含む類似の地理的区域に亘る地方特有のものであるので、両方の病原の免疫原を発現す
る組換えワクシニアウイルスを産生することが好ましい。この目的に関して、ＮＹＶＡＣ
バックグラウンドで３つのＥＢＶ遺伝子と３つのＨＢＶ遺伝子を含有する組換えワクシニ
アウイルス、ｖＰ９４１を産生した。
【０２６９】
ＨＢＶタンパク質の免疫沈降
ＨＢＶタンパク質の免疫沈降と代謝標識付けは、実施例１３のｖＰ９１９に記載したもの
に以下の改変を行なったものであった。組換えワクシニアウイルス、親ＮＹＶＡＣウイル
ス（ｖＰ８６６）による感染および疑似感染を、ベロ細胞ではなくＲＫ−１３細胞に行な
50
(58)
JP 3602844 B2 2004.12.15
った。抗Ｓ２と抗コア抗血清の両方に、ｖＰ８６６感染ＲＫ−１３細胞を吸着せしめた。
【０２７０】
組換えワクシニアウイルスｖＰ９１４の産生
ワクシニアウイルス組換え体ＥＢＶトリプレットｖＰ９４４を産生するのに用いた３つの
ＥＢＶ遺伝子を含有する供与体プラスミドであるプラスミドＥＢＶトリプル１を、救助ウ
イルスとして、ワクシニアウイルス組換え体ＨＢＶトリプレットである、ｖＰ９１９によ
る組換えに用いた。産生したウイルス、ｖＰ９４１を、
３ ２
Ｐ標識ＥＢＶ ＤＮＡにより
同定した。ｖＰ９４４のように、ｖＰ９４１は、エントモポックスウイルス４２ｋＤａプ
ロモーターの制御下でＥＢＶ遺伝子を、ワクシニアＨ６プロモーターの制御下でｇＢを、
そしてワクシニアＨ６プロモーターの制御下でｇｐ３４０を含有し、全てをワクシニアＴ
10
Ｋ欠損座に挿入した。ｖＰ９１９のように、ｖＰ９４１は、ＡＴＩ欠損座に挿入されたワ
クシニアＨ６プロモーターの制御下で合成ＨＢＶ ｓｐｓＡｇを、Ｉ４Ｌ欠損座に挿入さ
れた牛痘ｕプロモーターの制御下でＨＢＶ ｌｐｓＡｇを、そしてＨＡ欠損座に挿入され
たＩ３Ｌプロモーターの制御下でＨＢＶ Ｓ１２／コア融合を含有した。組換えワクシニ
アウイルスｖＰ９４１のゲノムの完全性は、ＤＮＡの制限分析により確認された。
【０２７１】
ｖＰ９４１によりＨＢＶタンパク質の発現
６組のＨＢＶ／ＥＢＶワクシニア組換え体ｖＰ９４１により合成された様々なＨＢＶタン
パク質をアッセイするために、ｖＰ９４１に感染したＲＫ−１３細胞中で合成された代謝
的標識タンパク質および適切な単一、二重および三重のＨＢＶ組換え体に、イムノプレシ
20
テーションを行なった。未感染細胞と、ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）、ｖＰ８５６（ｓｐｓ
Ａｇ）、ｖＰ８９６（ｓｐｓＡｇ＋ｌｐｓＡｇ）、ｖＰ９１９（ｓｐｓＡｇ＋ｌｐｓＡｇ
＋Ｓ１２／コア）、またはｖＰ９４１に感染した細胞中のタンパク質を、家ウサギ抗Ｓ２
抗血清を用いて免疫沈降を行なった。さらに未感染細胞およびさらにｖＰ９４１、ｖＰ９
１９、ｖＰ８５８（Ｓ１２／コア）、またはｖＰ８６６に感染した細胞中のタンパク質を
、抗コア抗血清を用いて免疫沈降を行なった。
【０２７２】
抗Ｓ２血清により、ｓｐｓＡｇの遺伝子を含有するワクシニア単一組換え体ｖＰ８５６か
ら３３ｋＤａと３６ｋＤａの２つのタンパク質が沈殿する。これらはＨＢＶ ｐｓｐＡｇ
の単一と二重にグリコシル化された形状の予期サイズに対応している。抗Ｓ２血清により
30
、ｓｐｓＡｇとｌｐｓＡｇの遺伝子を含有するワクシニア二重組換え体ｖＰ８９６が沈殿
する。加えて、ｌｐｓＡｇの単一グリコシル化形状に対応する４２ｋＤａのタンパク質が
、４５ｋＤａと４８ｋＤａの大きなタンパク質と同様に沈殿する。ｌｐｓＡｇの未グリコ
シル化形状に対応する３９ｋＤａのタンパク質は、グリコシル化形状と比較して少量で沈
殿する。抗Ｓ２血清によりｖＰ８５６とｖＰ８９６から沈殿した全てのタンパク質はまた
、ＨＢＶ三重組換え体ｖＰ９１９およびＨＢＶ／ＥＢＶ６重ｖＰ９４１から沈殿する。ラ
ジオオートグラムにおいて、ＨＢＶタンパク質は、ワクシニア組換え体に感染したＲＫ−
１３細胞からの抗Ｓ２により免疫沈降せしめられる。ＨＢＶタンパク質が、同一のワクシ
ニア組換え体（ｖＰ８５６、ｖＰ８９６およびｖＰ９１９）に感染したベロ細胞から免疫
沈降せしめられる場合、同一のタンパク質が観察されたが、異なる相対量であった。一般
40
的に、これらの組換えワクシニアウイルスにより発現されたｓｐｓＡｇとｌｐｓＡｇの両
者は、ベロ細胞中よりもＲＫ−１３細胞中でより完全にグリコシル化せしめられているよ
うに思われる。
【０２７３】
ｖＰ８５８に感染したベロ細胞に見られるように、ｖＰ８５８に感染したＲＫ−１３細胞
から抗コア血清により沈殿せしめられた最も豊富なタンパク質は、２７ｋＤａのサイズを
有する。これは、Ｓ１２／コア融合遺伝子が第２の（Ｓ２）ＡＴＧで始まる場合に予期さ
れる翻訳産生物のサイズに対応する。ベロ細胞のｖＰ８５８感染後に観察された状況とは
異なって、抗コア血清による免疫沈降後のＲＫ−１３細胞のｖＰ８５８感染は、完全Ｓ１
２／コア翻訳産生物に予期される３８ｋＤａのサイズに対応する可視帯とはならない。Ｈ
50
(59)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ＢＶ単一組換え体ｖＰ８５８から抗コア血清により沈殿せしめられた全てのタンパク質は
また、ＨＢＶ三重組換え体ｖＰ９１９とＨＢＶ／ＥＢＶ６重ｖＰ９４１からも沈殿せしめ
られる。
【０２７４】
実施例１５−狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇを発現するＡＬＶＡＣの構築
この実施例は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）と称するカナリヤポックス狂犬病組換え
体の開発およびその安全性並びに効果を記載するものである。
【０２７５】
細胞およびウイルス
親カナリヤポックスウイルス（レントシュラー菌株）はカナリヤのワクチン菌株である。
10
ワクチン菌株を野生型単離体から得て、鶏胚繊維芽細胞での２００連続以上の継代により
弱毒化した。マスターウイルス種子についてアガーで４連続のプラーク精製を行ない、１
つのプラーククローンを、株ウイルスが後に生体外組換え試験の親ウイルスとして用いら
れる５連続の追加の継代により増幅せしめた。プラーク精製カナリヤポックス単離体をＡ
ＬＶＡＣと称する。
【０２７６】
カナリヤポックス挿入ベクターの構築
８８０ｂｐのカナリヤポックスＰｖｕＩＩ断片をｐＵＣ９のＰｖｕＩＩ部位の間にクロー
ニングしてｐＲＷ７６４．５を形成した。この断片の配列を第１６図の位置１３７２と２
２５１の間に示す。Ｃ５と称する読取り枠の制限を規定した。読取り枠は、断片内の位置
20
１６６で開始し、位置４８７で終止することを決定した。読取り枠を妨害することなく、
Ｃ５欠損を行なった。位置１６７から位置４５５の塩基を、配列（配列認識番号１０６）
ＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴと置換した。この置換配
列は、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ挿入部位を含有し、この後にワクシニ
アウイルスＲＮＡポリメラーゼにより認識される翻訳停止および転写終止シグナルが続く
（ユエンら、１９８７）。Ｃ５ ＯＲＦの欠損を以下に記載するように行なった。プラス
ミドｐＲＷ７６４．５を部分的にＲｓａＩで切断し、線状産生物を単離した。ＲｓａＩ線
状断片をＢｇｋＩＩで再切断し、今では位置１５６から位置４６２ままでのＲｓａＩから
ＢｇｌＩＩが欠損したｐＲＷ７６４．５断片を単離して、以下の合成オリゴヌクレオチド
のベクターとして用いた：
30
ＲＷ１４５（配列認識番号１０７）
【化６４】
ＲＷ１４６（配列認識番号１０８）
【化６５】
オリゴヌクレオチドＲＷ１４５およびＲＷ１４６をアニールして、上述したｐＲＷ７６４
．５ＲｓａＩおよびＢｇｌＩＩベクターに挿入した。産生したプラスミドをｐＲＷ８３１
40
と称する。
【０２７７】
狂犬病Ｇ遺伝子を含有する挿入ベクターの構築
ｐＲＷ８３８の構築を以下に説明する。狂犬病ＧのＡＴＧを有するＨ６プロモーターの翻
訳開始コドンと重複するオリゴヌクレオチドＡからＥをｐＲＷ７３７としてｐＵＣ９中に
クローニングした。オリゴヌクレオチドＡからＥは、ＮｒｕＩで始まり、ＢｇｌＩＩが後
に続く狂犬病ＧのＨｉｎｄＩＩＩ部位までのＨ６プロモーターを含有する。オリゴヌクレ
オチドＡからＥ（配列認識番号１０９）から（配列認識番号１１３）の配列を以下に示す
：
【化６６】
50
(60)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
アニールしたオリゴヌクレオチドＡからＥのダニアグラムは以下の通りである：
【化６７】
20
オリゴヌクレオチドＡからＥをキナーゼして、アニールし（５分間９５℃で加熱し、次い
で室温まで冷却せしめる）、ｐＵＣ９のＰｖｕＩＩ部位の間に挿入した。産生したプラス
ミド、ｐＲＷ７３７をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、ｐｔｇ１５５ＰＲＯの
１．６ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片のベクター（キニーら、１９８４）とし
て用い、ｐＲＷ７３９を産生した。ｐｔｇ１５５ＰＲＯ ＨｉｎｄＩＩＩ部位は、狂犬病
Ｇ翻訳開始コドンの８６ｂｐ下流にある。ＢｇｌＩＩはｐｔｇ１５５ＰＲＯ中の狂犬病Ｇ
30
翻訳停止コドンの下流にある。ｐＲＷ７３９を部分的にＮｒｕＩで切断し、ＢｇｌＩＩで
完全に切断し、前述したＨ６プロモーターの３′末端（テイラーら、１９８８ａ、ｂ；グ
オら、１９８９；パーカスら、１９８９）から全縁狂犬病Ｇ遺伝子を含有する１．７ｋｂ
ｐ ＮｒｕＩ−ＢｇｌＩＩ断片をｐＲＷ８２４のＮｒｕＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間に挿
入した。産生したプラスミドをｐＲＷ８３２と称する。ｐＲＷ８２４への挿入は、Ｎｒｕ
ＩのＨ６プロモーター５′を加えた。ＳｍａＩが後に続くＢａｍＨＩのｐＲＷ８２４配列
は：ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧである。ｐＲＷ８２４は、ワクシニアウイルスＨ６プロモー
ターに正確に連結した非関連遺伝子を含有する。ＮｒｕＩとＢａｍＨＩによる切断は完全
にこの非関連遺伝子を切除した。Ｈ６プロモートした狂犬病Ｇを含有する１．８ｋｂｐ ｐＲＷ８３２ ＳｍａＩ断片をｐＲＷ８３１のＳｍａＩに挿入して、プラスミドｐＲＷ８
40
３８を形成した。
【０２７８】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧの開発
前述したリン酸カルシウム沈殿法を用いて、プラスミドｐＲＷ８３８をＡＬＶＡＣ感染初
代ＣＥＦ細胞にトランスフェクションした（パニカリら、１９８２；ピッチーニら、１９
８７）。特異的狂犬病Ｇプローブに対するハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラー
クを選択し、純粋な固体群となるまで６連続のプラーク精製を行なった。次いで１つの典
型的なプラークを増幅し、産生したＡＬＶＡＣ組換え体をＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５
）と称した。続いて突然変異しない狂犬病Ｇ遺伝子のＡＬＶＡＣゲノムへの正確な挿入を
配列分析により確認した。
50
(61)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０２７９】
蛍光抗体法
熟成狂犬病ウイルス粒子のアッセンブリの最終段階中に、糖タンパク質成分はゴルジ体か
ら血漿膜に運搬され、そこで、細胞膜の外面のタンパク質のバルクと細胞質中に延びるカ
ルボキシ末端により蓄積する。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ中で発現された狂犬病糖タンパク質が正
確に存在することを確認するために、ＡＬＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染した初代
ＣＥＦ細胞に、蛍光抗体法を行なった。前述したように（テイラーら、１９９０）狂犬病
Ｇ単クローン性抗体を用いて蛍光抗体法を行なった。強い表面蛍光がＡＬＶＡＣ−ＲＧに
感染したＣＥＦ細胞に検出されたが、親ＡＬＶＡＣには検出されなかった。
【０２８０】
10
免疫沈降
初代ＣＥＦ細胞、ベロ細胞（アフリカ緑猿肝臓細胞ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１の系統）および
ＭＲＣ−５細胞（通常のヒトの胎児の肺組織ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７Ｉから誘導した繊維芽
細胞状細胞形状）の前形成単層に、放射線標識した
３ ５
メチオニンの存在下で親ウイルス
ＡＬＶＡＣおよび組換えウイルスＡＬＶＡＣ−ＲＧを細胞あたり１０ｐｆｕで接種し、前
述したように処理した（テイラーら、１９９０）。免疫沈降反応を、狂犬病Ｇ特異的単ク
ローン性抗体を用いて行なった。約６７ｋＤａの分子量を有する狂犬病特異的糖タンパク
質の効果的な発現を組換えＡＬＶＡＣ−ＲＧに関して検出した。未感染細胞または親ＡＬ
ＶＡＣウイルスに感染した細胞中には、狂犬病特異的産生物は検出されなかった。
【０２８１】
20
連続継代実験
非アビアン種の範囲のＡＬＶＡＣウイルスに関する研究において、増殖性感染または顕著
な病気はなにも観察されなかった（テイラーら、１９９１ｂ）。しかしながら、非アビア
ン細胞中の増殖には親または組換えウイルスのいずれも適応できないことを確証するため
に、連続継代実験を行なった。
【０２８２】
２つのウイルス、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧを、３つの細胞株における１０連続
のブラインド継代に接種した：
（１）生後１１日の白のレグホン種のひなから産生された初代鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）
；
30
（２）ベロ細胞−アフリカ緑猿肝臓細胞の連続継代細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１）；お
よび
（３）ＭＲＣ−５細胞−ヒトの胎児肺組織から誘導した二倍体細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ
１７１）各ディッシュ２×１０
６ の細胞を含有する各細胞株の３つの６０ｍｍディッシ
ュを用いて、細胞当たり０．１ｐｆｕのｍ．ｏ．ｉ．で最初の接種を行なった。ＤＮＡ複
製の阻害因子であるシトシンアラビノシド（Ａｒａ Ｃ）４０μｇ／ｍｌの存在下で１つ
のディッシュを接種せしめた。３７℃の１時間の吸着期間後、接種物を取り出して、単層
を洗浄して未吸着ウイルスを除去した。この時点で、培地を、２つのディッシュの５ｍｌ
のＥＭＥＭ＋２％のＮＢＣＳ（試料ｔ０およびｔ７）および第３の４０μｇ／ｍｌのＡｒ
ａ Ｃを含有する５ｍｌのＥＭＥＭ＋２％のＮＢＣＳ（試料ｔ７Ａ）と置換した。試料ｔ
40
０を−７０℃で凍結せしめ、残留入力ウイルスの徴候を与えた。試料ｔ７およびｔ７Ａを
３７℃で７日間インキュベートし、その後成分を収集して感染音波処理により細胞を破壊
した。
【０２８３】
各細胞株の試料ｔ７の１ｍｌを希釈せずに、同一の細胞株の３つのディッシュ（試料ｔ０
、ｔ７およびｔ７Ａを提供する）および初代ＣＥＦ細胞の１つのディッシュに接種した。
試料ｔ０、ｔ７およびｔ７Ａを、継代１としての処理を施した。非アビアン細胞中に存在
するウイルスのより敏感な検出のための増幅工程を提供するために、ＣＥＦ細胞への追加
の接種を行なった。
【０２８４】
50
(62)
JP 3602844 B2 2004.12.15
この方法を、１０回（ＣＥＧおよびＭＲＣ−５）または８回（ベロ）の連続したブライン
ド継代について行なった。次いで試料を凍結せしめ、３回溶かし、初代ＣＥＦ単層での滴
定によりアッセイした。
【０２８５】
次いで各試料のウイルス産生を、アガロースでのＣＥＧ単層でのプラーク滴定により測定
した。実験の要約結果を表６と７に示す。
【０２８６】
その結果により、親ＡＬＶＡＣと組換えＡＬＶＡＣ−ＲＧの両者は、力価を損失すること
なくＣＥＦ単層で一様の複製ができることが示されている。ベロ細胞において、ウイルス
の水準は、ＡＬＶＡＣの２回の継代およびＡＬＶＡＣ−ＲＧの１回の継代の後に検出水準
10
より低下した。ＭＲＣ−５細胞において、同様の結果が明確であり、１回の継代後にはウ
イルスは検出されなかった。表６と７において、４回の継代の結果のみを示しているが、
一連の結果は、８回（ベロ）および１０回（ＭＲＣ−５）の継代に関して、いずれのウイ
ルスも非アビアン細胞での増殖への適応は検出不可能であった。
【０２８７】
継代１において、ＭＲＶ−５細胞とべロ細胞のｔ７試料では比較的高い水準のウイルスが
存在した。しかしながら、この水準のウイルスは、ウイルスの複製が生じないシトシンア
ラビノシドの存在下でインキュベートされたｔ０試料とｔ７Ａ試料に見られる水準と等し
かった。これにより、非アビアン細胞中の７日で見られるウイルスの水準は、残留ウイル
スを表し、新たに複製されたウイルスは表さないことが示された。
20
【０２８８】
アッセイをより敏感に行なうために、各細胞株から収集した７日の部分を任意のＣＥＦ単
層に接種し、細胞変性効果（ＣＰＥ）となったときに、またはＣＰＥが不明確な場合は７
日後に収集した。この実験の結果を表８に示す。任意の細胞株により増幅後でさえも、ウ
イルスは２回の追加の継代のＭＲＣ−５とベロ細胞に検出されたのみであった。これらの
結果により、使用した条件下では、ベロ細胞とＭＲＣ−５細胞にはいずれのウイルス増殖
も適応しないことが示された。
【０２８９】
マカクの接種
表９に記載したように、４つのＨＩＶ漿陽性（ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ）マカクに最初
30
にＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した。１００日後、これらの動物に再接種し、追加抗原投与効
果を測定し、追加の７匹の動物に供給量を変えて接種した。適切な間隔で血液を採取し、
５６℃で３０分間の熱不活性化後、急速蛍光焦点抑制アッセイ（Ｒａｐｉｄ Ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｔ Ｆｏｃｕｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）を用いた抗狂犬病抗体
の存在について血清を分析した（スミスら、１９７３）。
【０２９０】
チンパンジーの接種
２匹の大人のメスのチンパンジー（５０から６５ｋｇの範囲）に、１×１０
７ ｐｆｕの
ｖＣＰ６５を筋内または皮下に接種した。反応に関して動物を監視し、ＲＦＦＩ試験によ
る抗狂犬病抗体の存在の分析のために規則的な間隔で採血した（スミスら、１９７３）。
40
最初の接種から１３週間後に等量の供給量で動物を再接種せしめた。
【０２９１】
マウスの接種
マウスの群に、５０から１００μｌの範囲のｖＣＰ６５の異なるバッチの希釈物を接種し
た。マウスは足蹠で接種した。１４日目に、狂犬病ウイルスの毒性ＣＶＳ菌株の１５から
４３マウスＬＤ５０をマウスに皮内接種で抗原投与した。マウスの生存を監視し、接種後
２８日での防御量５０％（ＰＤ５０）を計算した。
【０２９２】
イヌとネコの接種
生後４か月の１０匹のビーグル犬と生後４か月の１０匹のネコに、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを６
50
(63)
JP 3602844 B2 2004.12.15
．７または７．７ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０で頭蓋内に接種した。接種後１４日と２８日に
動物の採血を行ない、ＲＦＦＩ試験において抗狂犬病抗体を評価した。６．７ｌｏｇ１０
ＴＣＩＤ５０のＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した動物に、ワクチン接種後２９日目に、３．７
ｌｏｇ１０マウスＬＤ５０（イヌ）または４．３ｌｏｇ１０マウスＬＤ５０（ネコ）のＮ
ＹＧＳ狂犬病ウイルス抗原投与菌株を抗原投与した。
【０２９３】
リスサル（ｓｑｕｉｒｒｅｌ ｍｏｎｋｅｙ）の接種
４匹のリスサル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）の３つの群には、（ａ）ＡＬＶＡ
Ｃ、親カナリヤポックスウイルス、（ｂ）ＡＬＶＡＣ−ＲＧ、狂犬病Ｇ糖タンパク質を発
現する組換え体、または（ｃ）ｖＣＰ３７、ネコ白血病ウイルスのエンベロープを発現す
10
るカナリヤポックスウイルス組換え体の３つのウイルスのうちの１つを接種した。接種は
ケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）麻酔により行なった。各動物に同時に：（１）乱切するこ
となく右目の表面に２０μｌを；（２）口に数滴として１００μｌを；（３）右腕の外面
の毛を剃った皮膚の２か所の皮内注射部位のそれぞれに１００μｌを；（４）右腿の前部
筋肉に１００μｌを与えた。
【０２９４】
４匹のサルに各ウイルスを接種した。２匹には合計５．０ｌｏｇ１０ｐｆｕを、他の２匹
には合計７．０ｌｏｇ１０ｐｆｕを接種した。動物から規則的な間隔で採血し、ＲＦＦＩ
試験を用いて抗狂犬病抗体の存在に付いて血清を分析した（スミスら、１９７３）。ワク
チン接種に対する反応について動物を毎日観察した。最初の接種から６か月後、ＬＡＶＡ
20
Ｃ−ＲＧを受けた４匹のサル、ｖＣＰ３７を受けた２匹のサル、および最初にＡＬＶＡＣ
を受けた２匹のサル、並びに１匹の未接種のサルに、６．５ｌｏｇ１０ｐｆｕのＡＬＶＡ
Ｃ−ＲＧを皮下に接種した。ＲＦＦＩ試験において、狂犬病中和抗体の存在について血清
をモニタした（スミスら、１９７３）。
【０２９５】
ヒト細胞株へのＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種
異種遺伝子の効果的な発現が、ウイルスが生産的に複製する非アビアン細胞中に得られる
か否かを決定するために、１つのアビアンと４つの非アビアンの５つの細胞型を、ウイル
ス産生、異種狂犬病Ｇ遺伝子の発現およびウイルス特異的ＤＮＡ蓄積に関して分析した。
接種した細胞は：
30
（ａ）ベロ、アフリカ緑サルの肝臓細胞、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１；
（ｂ）ＭＲＣ−５、ヒトの胎児の肺、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１；
（ｃ）ＷＩＳＨヒト羊膜、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２５；
（ｄ）デトロイト−５３２、ヒト包皮、ダウン症候群、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ５４；および
（ｅ）初代ＣＥＦ細胞であった。
【０２９６】
生後１１日の白レグホンの胚から産生された鶏胚繊維芽細胞を陽性対照として含む。全て
の接種は、以下に記載するように２×１０
６ 細胞の前形成単層上で行なった。
【０２９７】
Ａ．ＤＮＡ分析の方法
40
各細胞株の３つのディッシュに、５ｐｆｕ／細胞のウイルスを接種し、未接種の各細胞株
の余分の１つのディッシュを容易した。１つのディッシュを、４０μｇ／ｍｌのシトシン
アラビノシド（Ａｒａ Ｃ）の存在下でインキュベーションした。３７℃での６０分間の
吸着期間の後、接種物を除去し、単層を２回洗浄して未吸着ウイルスを除去した。次いで
培地（Ａｒａ Ｃの有無に関わらず）を置き換えた。ディッシュからの細胞（Ａｒａ Ｃ
のない）を時間ゼロ試料として収集した。残りのディッシュを３７℃で７２時間インキュ
ベーションし、その後細胞を収集し、ＤＮＡ蓄積を分析するのに用いた。各試料の２×１
０
６ 細胞を、４０ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．５ｍｌの食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ
）中に再懸濁せしめ、５分間３７℃でインキュベーションした。４２℃に予熱し、１２０
ｍＭのＥＤＴＡを含有する等容積の１．５％アガロースを細胞懸濁液に加え、穏やかに混
50
(64)
JP 3602844 B2 2004.12.15
合した。懸濁をアガロースプラグモールドに運搬し、少なくとも１５分間硬化せしめた。
次いでアガロースプラグを取り出し、そのプラグを完全に覆う容積の溶菌緩衝液（１％サ
ーコシル、１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ ｐＨ ７．
５、２００ｍＭのＥＤＴＡ）中において５０℃で１２−１６時間に亘りインキュベーショ
ンした。次いで溶菌緩衝液を５．０ｍｌのステリル０．５× ＴＢＥ（４４．５ｍＭのト
リスホウ酸塩、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）と置き換え、ＴＢＥ緩衝液の３回の交換により４
℃で６時間平衡せしめた。パルスフィールド電気泳動システムを用いて細胞ＲＮＡとＤＮ
Ａからプラグ内のウイルスＤＮＡを分画せしめた。０．５× ＴＢＥ中で１５℃の５０−
９０秒のランプでの１８０Ｖで２０時間に亘り電気泳動を行なった。ＤＮＡは、ラムダＤ
ＮＡ分子量標準で展開せしめた。電気泳動後、ウイルスＤＮＡ帯を、臭化エチジウムで染
10
色することにより視覚化した。次いでＤＮＡをニトロセルロース膜に運搬し、精製ＡＬＶ
ＡＣゲノムＤＮＡから調製した放射線標識プローブでプローブした。
【０２９８】
Ｂ．ウイルス産生の評価
入力多重度が０．１ｐｆｕ／細胞であることを除いて、上述したようにディッシュを正確
に接種した。感染の７２時間後、凍結と解凍の３連続のサイクルにより細胞を溶解せしめ
た。ＣＥＦ単層のプラーク滴定により、ウイルス産生を評価した。
【０２９９】
Ｃ．狂犬病Ｇ遺伝子の発現分析
ディッシュに１０ｐｆｕ／細胞の多重度で組換えウイルスまたは親ウイルスを接種し、未
20
感染ウイルス対照としての追加のディッシュを用意した。１時間の吸着時間後、培地を除
去し、メチオニン不含有培地と置き換えた。３０秒後、この培地を、２５ｕＣｉ／ｍｌの
３ ５
Ｓ−メチオニンを含有するメチオニン不含有培地と尾個か得た。感染細胞を１晩標識
し（約１６１間）、次いで緩衝液Ａ溶菌緩衝液の添加により溶解せしめた。狂犬病Ｇ特異
的単クローン性抗体を用いて、前述したように免疫沈降を行なった。
【０３００】
結果：ウイルス産生の評価
細胞当たり０．１ｐｆｕの接種７２時間後の産生の滴定の評価を表１０に示す。この結果
により、生産的な感染がアビアン細胞においては達成されるが、４つの非アビアン細胞株
においてはこの方法によりウイルスの産生の増大は検出されなかった。
30
【０３０１】
ウイルスＤＮＡ蓄積の分析
非アビアン細胞中の生産的ウイルス複製に対するブロックが、ＤＮＡ複製の前または後に
生じるか否かを決定するために、細胞溶解産物からのＤＮＡを、電気泳動により分画し、
ニトロセルロースに運搬し、ウイルス特異的ＤＮＡの存在下でプローブした。おそらくは
放射線標識した＋ＶＡＣ ＤＮＡプローブ調製におけるＣＥＦ細胞ＤＮＡの汚染のために
、未感染ＣＥＦ細胞、時間ゼロでのＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞、感染から７２時間
後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞および４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシドの存
在下での感染から７２時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞からのＤＮＡは全て、バ
ックグラウンド活性を示した。しかしながら、感染から７２時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感
40
染ＣＥＦ細胞は、ＡＬＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ蓄積を示す約３５０ｋｂｐの領域に強
い帯を示した。培地がＤＮＡ合成抑制因子、シトシンアラビノシドの存在下でインキュベ
ーションされる場合には、そのような帯は検知不可能である。ベロ細胞中で産生された等
量の試料は、時間ゼロでのＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ベロ細胞において約３５０ｋｂｐでは非
常にわずかな帯を示した。この水準は、残留ウイルスを示す。ウイルス後代の増大とはな
らないベロ細胞に生じたウイルス特異的ＤＮＡ複製の水準を示す帯の強度は、感染７２時
間後に増幅された。ＭＲＣ−５細胞中に産生された等量の試料により、この細胞株におけ
るこれらの条件下ではウイルス特異的ＤＮＡ蓄積が検出されないことが示された。次いで
この実験を、追加のヒト細胞株、特にＷＩＳＨおよびデトロイト−５３２細胞を含むまで
に広げた。ＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞は、陽性対照として作用した。ＡＬＶＡＣを接種し
50
(65)
JP 3602844 B2 2004.12.15
たＷＩＳＨまたはデトロイト細胞においてはウイルス特異的ＤＮＡ蓄積は生じなかった。
この方法の検出限界は完全に確認され、ういるくＤＮＡ蓄積が生じるが、方法の感度より
低い水準である。ウイルスＤＮＡ複製が
３ チミジン含有により測定された他の実験は、
ベロ細胞とＭＲＶ−５細胞に得られた結果を支持する。
【０３０２】
狂犬病遺伝子発現の分析
ウイルス遺伝子発現、特に挿入された異種遺伝子の発現が、ウイルスＤＮＡ複製のないヒ
ト細胞株でさえ生じるか否かを決定するために、ＡＬＶＡＣとＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染し
たアビアンと非アビアン細胞の
３ ５
メチオニン標識溶解産物に免疫沈降を行なった。狂犬
病Ｇ特異的単クローン性抗体を用いた免疫沈降の結果は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染したＷ
10
ＩＳＨおよびデトロイト細胞、ＣＥＦ、ベロおよびＭＲＶ−５細胞中の６７ｋＤａ糖タン
パク質の特異的免疫沈降を説明した。未感染、および親感染細胞溶解産物のいずれにもそ
のような特異的狂犬病遺伝子産生物を検出されなかった。
【０３０３】
この実験の結果により、分析したヒト細胞株において、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ組換え体は感染
を開始し、Ｈ６初期／晩期ワクシニアウイルスプロモーターの転写制御下で異種遺伝子産
生物を発現できるけれども、複製はＤＮＡ複製をとはならず、または検出可能なウイルス
後代は産生されなかった。ベロ細胞において、ある水準のＡＬＶＡＣ−ＲＧ特異的ＤＮＡ
蓄積が観察されたが、これらの方法によってはウイルス後代は検出されなかった。これら
の結果により、分析したヒト細胞株において、ウイルス複製に対するブロックは、ＤＮＡ
20
複製の着手の前に生じ、一方ベロ細胞においてブロックはウイルスＤＮＡ複製の着手の後
に生じる。
【０３０４】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧに発現された狂犬病糖タンパク質が免疫原性であるか否かを決定するた
めに、多くの動物種を組換え体の接種により試験した。現在の狂犬病ワクチンの硬化は、
マウスモデルシステムにおいて評価される。それゆえ、同様の試験をＡＬＶＡＣ−ＲＧを
用いて行なった。１ｍｌ当たり６．７から８．４ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０の範囲に亘る感
染力価を有する９つの異なるウイルスの調製物（種子ウイルスの１０連続の組織培地継代
後に産生された１つのワクチンバッチ（Ｊ）を含む）を連続的に希釈し、生後４から６週
間のマウスの足蹠に５０から１００μｌの希釈物を接種した。１４日後に、対照マウス群
30
の致死率滴定により決定されるような１５から４３マウスＬＤ５０を含有する狂犬病ウイ
ルスのＣＶＳ菌株３００μｌをマウスに頭蓋内経路により抗原投与した。ＰＤ５０（防御
量５０％）として表される効力は、抗原投与１４日後に計算した。実験結果を表１１に示
す。結果により、ＡＬＶＡＣ−ＲＧは、平均値が３．７３（ＳＴＤ０．４８）である３．
３３から４．５６に亘るＰＤ５０値での狂犬病ウイルス抗原投与に対して矛盾なくマウス
を防御することができたことが示された。この研究の延長として、おすのマウスに、６．
０ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０のＡＬＶＡＣ−ＲＧを含有する５０μｌのウイルスまたは等容
積の未感染細胞懸濁液を頭蓋内で接種した。マウスを接種から１、３および６日後に乱切
し、マウスの脳を取り出し固定して切り分けた。組織病理学的実験により、マウスのＡＬ
ＶＡＣ−ＲＧの神経毒性の証拠は見られなかった。
40
【０３０５】
イヌとネコのＡＬＶＡＣ−ＲＧの安全性と効果を評価するために、生後１４，５か月のビ
ーグル犬と生後１４，４ネコの群を分析した。各種において４匹をワクチン接種しなかっ
た。５匹の動物に６．７ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０を皮下に接種し、５匹の動物に７．７の
ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０を同一経路で接種した。抗狂犬病抗体についての分析のために、
動物から採血した。接種しなかった、または６．７ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０のＡＬＶＡＣ
−ＲＧを接種した動物に、ワクチン接種から２９日後に、３．７ｌｏｇ１０マウスＬＤ５
０（イヌ、こめかみの筋肉に）または４．３ｌｏｇ１０マウスＬＤ５０（ネコ、首に）の
ＮＹＧＳ狂犬病ウイルス抗原投与菌株を抗原投与した。この実験結果を表１２に示す。
【０３０６】
50
(66)
JP 3602844 B2 2004.12.15
いずれの接種ウイルスの供与量のネコまたはイヌにも接種に対して副作用は見られなかっ
た。６．７ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０で免疫した５匹のうち４匹のイヌがワクチン接種から
１４日後に抗体力価を有し、全てのイヌが２９日後には力価を有した。全てのイヌは、４
匹のうち３匹の対照を殺した抗原投与から防御された。ネコにおいて、６．７ｌｏｇ１０
ＴＣＩＤ５０で免疫した５匹のうち３匹のネコは、１４日後に特異的抗体力価を有し、全
てのネコが２９日後には陽性であったが、平均抗体力価は２．９ＩＵと低かった。５匹の
うち３匹のネコが、全ての対照を殺した抗原投与にも生き残った。７．７ｌｏｇ１０ＴＣ
ＩＤ５０で免疫した全てのネコが１４日後に抗体力価を有し、２９日後の幾何学平均力価
は８．１国際単位として計算された。
【０３０７】
10
ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ−ＲＧおよび未関連カナリヤポックスウイルス組換え体による接
種に対するリスサル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）の免疫応答を実験した。サル
の群に上述したように接種を行ない、狂犬病特異的抗体の存在に関して血清を分析した。
皮内経路による接種に対するわずかな典型的な皮膚反応を別にして、どのサルにも副作用
は見られなかった。皮内接種から２および４日後のみに、少量の残留ウイルスを皮膚の傷
から単離した。全ての種が７日後以降に陰性であった。筋内注射に対する局部的な反応は
見られなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した４匹全てのサルは、ＲＦＦＩ試験に測定さ
れた抗狂犬病血清中和抗体を発達せしめた。最初の接種から約６か月後に、全てのサルと
１匹の追加の純粋なサルに、皮下経路により、６．５ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０のＡＬＶＡ
Ｃ−ＲＧを左腿の外面に再接種した。抗狂犬病抗体の存在について血清を分析した。結果
20
を表１３に示す。
【０３０８】
狂犬病を未経験な５匹のサルのうち４匹が、ＡＬＶＡＣ−ＲＧの感染から７日後に免疫応
答を発達せしめた。接種から１１日後には５匹全てのサルが検知可能な抗体を有した。狂
犬病等タンパク質に以前に露出した４匹のサルのうち全てが、ワクチン接種後３から７日
の間に血清中和力価に著しい増大を示した。その結果により、ＡＬＶＡＣｐＲＧによるリ
スサルのワクチン接種は、簡単の側面効果を与えず、一次抗体応答が誘発せしめられたこ
とが示される。アムナネスティック（ａｍｎａｎｅｓｔｉｃ）応答もまた再ワクチン接種
により誘発せしめられる。ＡＬＶＡＣまたは未関連異種遺伝子を発現するカナリヤポック
ス組換え体への事前の露出は、再ワクチン接種により抗狂犬病免疫応答の誘発を妨害しな
30
い。
【０３０９】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種に対するＨＩＶ−２漿陽性マカクの免疫応答を評価した。上述し
たように動物を接種し、ＲＦＦＩ試験において抗狂犬病血清中和抗体の存在を評価した。
表１４に示した結果により、皮下経路により接種したＨＩＶ−２陽性動物は、１回の接種
から１１日後に抗狂犬病抗体を発達せしめた。最初の接種から約３か月後に与えられた追
加抗原投与の接種後に既往反応が検知された。口頭経路により組換え体を接種した動物に
はどのような反応も検知されなかった。加えて、一連の６匹の動物に、筋内または皮下経
路のいずれかにより与えたＡＬＶＡＣ−ＲＧの減少した供給量を接種した。接種した６匹
のうち５匹の動物は、ワクチン接種間から１４日後にそれほど違わない抗体力価で反応し
40
た。
【０３１０】
ＨＩＶに事前に露出した２匹のチンパンジーに、皮下または筋内経路により７．０ｌｏｇ
１０ｐｆｕのＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した。接種から３か月後、両方の動物は各様式で再
ワクチン接種した。結果を表１５に示す。
【０３１１】
皮下または筋内経路のいずれの経路によっても、接種に対して副作用は示されなかった。
両方のチンパンジーは、１４日後に最初の接種に反応し、強く上昇する反応が再ワクチン
接種後に検知された。
【０３１２】
50
(67)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【表６】
10
20
30
【表７】
40
(68)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
【表８】
40
(69)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表９】
30
(70)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
【表１０】
40
(71)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表１１】
30
(72)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
【表１２】
40
【表１３】
50
(73)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表１４】
30
(74)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表１５】
30
(75)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
実施例１６−フラビウイルスタンパク質を発現するＮＹＶＡＣ組換え体の構築
この実施例は、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、黄熱病ウイルス（ＹＶ）および１型デング
熱からの遺伝子を含有するＮＹＶＡＣ供与体プラスミドの構築、対応ＮＹＶＡＣフラビウ
イルス組換え体の単離、および相同ウイルスによる致死抗原投与に対してマウスを防御す
るＪＥＶまたはＹＦのゲノムの部分を発現するワクシニア組換え体の能力を記載している
。
40
【０３１３】
細胞株およびウイルス菌株
ワクシニアウイルスｖＰ４１０のコペンハーゲン菌株のチミジンキナーゼ変異体（グオら
、１９８９）を用いて組換え体ｖＰ８２５、ｖＰ８２９、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４を
産生した（下記参照）。ｖＰ５５５の産生は以前に記載している（メイソンら、１９９１
）。ＦＢＳと抗生物質を補給したイーグルス最小限基礎培地中に３７℃で増殖せしめられ
たヘラ（ＨｅＬａ）細胞を用いて生合成研究を行なった。全ての生体外実験で用いたＪＥ
Ｖウイルスは、ＪＥＶのナカヤマ菌株の継代５５哺乳マウス脳懸濁液に感染したＣ６／３
６から調製した浄化培養液であった（メイソン、１９８９）。ＪＥＶの高度病原Ｐ３菌株
を用いて動物抗原投与実験を行なった（下記参照）。
50
(76)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０３１４】
ＪＥＶ遺伝子のワクシニアウイルス供与体プラスミド中へのクローニング
ＪＲＶワクシニア組換えウイルスを構築するのに用いたＪＥＶ ｃＤＮＡは、ＪＥＶのナ
カヤマ菌株から誘導した（マックアダら、１９８７）。
【０３１５】
ｐＵＣ８のＳｍａＩとＥｃｏＲＩ部位にＪＥＶ ｃＤＮＡ（ヌクレオチド−２８から１０
００）を含有するプラスミドｐＤｒ２０をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断し、ＪＥＶ ｃ
ＤＮＡ挿入物をｐＩＢＩ２５（ＣＴ、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロ
ジーズ社）中にクローニングしてプラスミドＪＥＶ１８を産生した。ＪＥＶ１８をＪＥ配
列（ヌクレオチド２３）内のＡｐａＩとｐＩＢＩ２５内のＸｈｏＩで切断し、アニールし
10
たオリゴヌクレオチドＪ９０（配列認識番号１１４）およびＪ９１（配列認識番号１１５
）（ＸｈｏＩ付着末端、ＳｍａＩ部位、およびＪＥヌクレオチド１から２３を含有する）
と連結し、プラスミドＪＥＶ１９を産生した。ＪＥＶ１９をｐＩＢＩ２５内のＸｈｏＩと
ＪＥ配列（ヌクレオチド６０２）内のＡｃｃＩで切断し、産生した６１３ｂｐ断片を、プ
ラスミド起点と、カルボキシ末端４０％ｐｒＭおよびＥの３分の２のアミノ末端（ヌクレ
オチド６０２から２１２４）をコードするＪＥＶ ｃＤＮＡとを含有するＪＥＶ２のＸｈ
ｏＩとＡｃｃＩ断片（メイソンら、１９９１）中にクローニングし、ＣのＡＴＧからＥの
最後の３分の１に発見されたＳａｃＩ部位（ヌクレオチド２１２４）のＪＥ配列を含有す
るプラスミドＪＥＶ２０を産生した。
【０３１６】
20
ＴＴＴＴＴＧＴヌクレオチド１３０４から１３１０がＴＣＴＴＴＧＴに改変せしめられ、
Ｅの最後の３分の１からＮＳ２Ｂの最初の２つのアミノ酸（ヌクレオチド２１２４から４
１２６）までのＪＥ配列、プラスミド起点およびワクシニア配列を含有するＪＥＶ８から
のＳｍａＩ−ＳａｃＩ断片をＪＥＶ２０からの精製ＳｍａＩ−ＳａｃＩ挿入物に連結し、
ＪＥＶ２２−１を産生した。オリゴヌクレオチド定方向二本鎖切断突然変異誘発（マンデ
ッキ、１９８６）を用いて、ＪＥＶ２２−１を構築するのに用いたユニークＳｍａＩ部位
に対応する６ｂｐを除去し、Ｈ６プロモーターが直接ＡＴＧ開始コドンに先立つＪＥＶ２
４を産生した。
【０３１７】
プラスミドＪＥＶ７（メイソンら、１９９１）をＪＥ配列内のＳｐｈＩ（ヌクレオチド２
30
１８０）とＩＢＩ２４内のＨｉｎｄＩＩＩで切断した。アニールしたオリゴヌクレオチド
Ｊ９４とＪ９５［ＳｐｈＩ付着末端、翻訳停止、ワクシニア初期転写終止シグナル（ＴＴ
ＴＴＴＡＴ；ユエンら、１９８７）翻訳停止、ＥａｇＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ付着末
端を含有する］への連結により、Ｅの最後の３分の１のＳａｃＩ部位（ヌクレオチド２１
２４）からＥのカルボキシ末端に亘るＪＥｃＤＮＡを含有するプラスミドＪＥＶ２５が産
生された。ＪＥＶ２５からのＳａｃＩ−ＥａｇＩ断片をＪＥＶ８のＳａｃＩ−ＥａｇＩ断
片（１５ａａＣ、ｐｒＭおよびＥヌクレオチド３３７から２１２４の３分の２のアミノ末
端をコードするＪＥ ｃＤＮＡ、プラスミド起点およびワクシニア配列を含有する）に連
結し、プラスミドＪＥＶ２６を産生した。ＡＴＧ開始コドンを先行するユニークＳｍａＩ
部位を上述したように除去し、Ｈ６プロモーターが直接ＡＴＧ開始コドンを先行するＪＥ
40
Ｖ２７を産生した。
【０３１８】
オリゴヌクレオチドＪ９６、Ｊ９７、Ｊ９８およびＪ９９（ＳｐｈＩ付着末端を有するＪ
Ｅヌクレオチド２２４３から２３８０を含有する）をキナーゼし、アニールし、ＳｍａＩ
−ＳｐｈＩ切断してアルカリ性ホスファターゼ処理したｐＩＢＩ２５に連結し、プラスミ
ドＪＥＶ２８を産生した。ＪＥＶ２８をＪＥ配列内のＨｐａＩ（ヌクレオチド２３０１）
とｐＩＢＩ２５配列内のＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アルカリ性ホスファターゼ処理した。
ＪＥＶ１からのＨｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片またはＪＥＶ７からのＨｐａＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ断片（メイソンら、１９９１）への連結により、ＪＥＶ２９（ＳｍａＩ部位とそれ
に続く、３０ａａＥ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ヌクレオチド２２９３から４１２６をコードす
50
(77)
JP 3602844 B2 2004.12.15
るＪＥ ｃＤＮＡを含有する）およびｊｅｖ３０（ＳｍａＩ部位とそれに続く３０ａａＥ
、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ヌクレオチド２２９３から４５１２をコードするＪＥ ｃＤＮＡを含有する）を産生した。
【０３１９】
ＪＥＶ２９からのＳｍａＩ−ＥａｇＩ断片をＳｍａＩ−ＥａｇＩ切断したｐＴＰ１５（メ
イソンら、１９９１）に連結してＪＥＶ３１を産生した。ＪＥＶ３１を産生するのに用い
たユニークＳｍａＩ部位に対応する６ｂｐを上述したように除去して、Ｈ６プロモーター
が直接ＡＴＧ開始コドンを先行するＪＥＶ３３を産生した。
【０３２０】
ＪＥＶ３０からのＳｍａＩ−ＥａｇＩ断片をＳｍａＩ−ＥａｇＩ切断したｐＴＰ１５と連
10
結してＪＥＶ３２を産生した。ＪＥＶ３２を産生するのに用いたユニークＳｍａＩ部位に
対応する６ｂｐを上述したように除去して、Ｈ６プロモーターが直接ＡＴＧ開始コドンを
先行するＪＥＶ３４を産生した。オリゴヌクレオチドＪ９０（配列認識番号１１４）、Ｊ
９１（配列認識番号１１５）、Ｊ９４（配列認識番号１１６）、Ｊ９５（配列認識番号１
１７）、Ｊ９６とＪ９７（配列認識番号１１８）およびＪ９９とＪ９８（配列認識番号１
１９）を以下に示す：
【化６８】
20
ワクシニアウイルスＪＥＶ組換え体の構築
30
プラスミドＪＥＶ２４、ＪＥＶ２７、ＪＥＶ３３およびＪＥＶ３４をｖＰ４１０感染細胞
にトランスフェクションして、それぞれワクシニア組換え体ｖＰ８２５、ｖＰ８２９、ｖ
Ｐ８５７およびｖＰ８６４を産生した（第１８図）。
【０３２１】
生体外ウイルス感染および標識付け
ヘラ細胞単層を３５ｍｍの直径のディッシュに調製し、放射線標識付けの前にワクシニア
ウイルス（細胞当たり２ｐｆｕのｍ．ｏ．ｉ．）またはＪＥＶ（細胞当たり５ｐｆｕのｍ
．ｏ．ｉ．）に感染せしめた。細胞を
３ ５
Ｓ−Ｍｅｔを含有する培地で瞬間標識し、メイ
ソンらに記載されたように（１９９１）正確に過剰の未標識Ｍｅｔの存在下で６時間追跡
した。
40
【０３２２】
放射性免疫沈降、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびエンドグリコシダーゼ処理
放射線標識細胞溶解産物と培地液体を収集し、ウイルスタンパク質を免疫沈降し、エンド
グリコシダーゼで切断し、メイソンにより記載されているように（１９８９）ＳＤＳ含有
ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で分離した。
【０３２３】
動物防御実験
メイソンらにより記載されているように（１９９１）、マウス防御実験を正確に行なった
。手短に言うと、生後３週間のマウスの群を、１０
７ ｐｆｕのワクシニアウイルス組換
え体で腹腔内（ｉｐ）注射により免疫せしめ、３週間後に選択したマウスから血清を集め
50
(78)
JP 3602844 B2 2004.12.15
た。次いでマウスに組換えウイルスを再接種せしめるか、またはＪＥＶのＰ３菌株に感染
した哺乳マウス脳の懸濁液を腹腔内により１．３×１０
３ ＬＤ５０で抗原投与した。３
週間後、追加免疫した動物をレブル（ｒｅｂｌｅｄ）し、４．９×１０
５ ＬＤ５０のＪ
ＥＶのＰ３菌株で抗原投与した。抗原投与に続いて、３週間に亘り毎日マウスを観察し、
実験動物の同腹兄弟を用いて各抗原投与実験において致死救急量滴定を行なった。加えて
、抗原投与後４週間後の全ての生存動物から血清を採取した。
【０３２４】
組換えウイルスの免疫応答
メイソンらに記載されたよう（１９９１）に正確に、
３ ５
Ｓ−Ｍｅｔ標識ＪＥＶ感染細胞
から得た培養液または洗浄剤処理細胞溶解産物からのＪＥＶタンパク質を沈殿せしめる能
10
力に関して血清を試験した。ＮＥＵＴ試験においてカルボキシメチルセルロースを培地に
用いたことを除いてメイソンらに記載されたよう（１９９１）に、血球凝集素阻害（ＨＡ
Ｉ）および中和（ＮＥＵＴ）試験を行なった。
【０３２５】
組換えワクシニアウイルスの構造
ＣからＮＳ２Ｂに亘るＪＥＶコード領域の部分を発現した４つの異なるワクシニア組換え
体（ＨＡ座における）を構築した。これらの組換えウイルス中に含有されたＪＥＶ ｃＤ
ＮＡ配列を第１８図に示す。４つの組換えウイルス全てにおいて、ＪＥＶ ｃＤＮＡの感
覚鎖はワクシニアウイルス初期／晩期Ｈ６プロモーターの背後に位置し、翻訳はウイルス
ｃＤＮＡ配列の５′末端に位置する自然発生ＪＥＶ Ｍｅｔコドンから開始されると予期
20
された。
【０３２６】
組換え体ｖＰ８２５は、カプシドタンパク質、構造タンパク質前駆体ｐｒＭ、構造糖タン
パク質Ｅ、非構造糖タンパク質ＮＳ１、および非構造タンパク質ＮＳ２Ａをコード下（マ
ックエイダら、１９８７）。組換え体ｖＰ８２９は、ｐｒＭのアミノ末端に先行する推定
１５ａａシグナル配列、ｐｒＭおよびＥをコードした（マックエイダら、１９８７）。組
換え体ｖＰ８５７は、Ｅの３０ａａ疎水性カルボキシ末端、続いてＮＳ１およびＮＳ２Ａ
をコードするｃＤＮＡを含有した。組換え体ｖＰ８６４は、ｖＰ８５７と同様のタンパク
質と追加にＮＳ２ＢをコードするｃＤＮＡを含有した。組換え体ｖＰ８２５とｖＰ８２９
において、Ｅ中の潜在的なワクシニアウイルス初期転写終止シグナル（ＴＴＴＴＴＧＴ；
30
ヌクレオチド１３０４−１３１０）を、ａａ配列を改変することなくＴＣＴＴＴＧＴに改
変した。この配列は生体外転写アッセイにおける転写終止を増大するのが示されているの
で、Ｅの発現の水準を高めるためにこの改変を行なった（ユエンら、１９８７）。
【０３２７】
組換えワクシニアウイルスにより発現される場合には、ＥおよびｐｒＭは正確に処理され
る
瞬間標識実験により、Ｅとサイズが同一のタンパク質が、Ｅ遺伝子を含有する全ての組換
えワクシニアウイルスに感染した細胞中で合成されたことが示された（表１６）。ＪＥＶ
、ｖＰ５５５およびｖＰ８２９に感染した細胞において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で遅く移動
したＥタンパク質はまた、感染細胞から収集された培養液中にも観察された（表１６）。
40
ＪＥＶおよびｖＰ５５５感染細胞により産生されたＥの細胞外形状は、ｖＰ８２９感染細
胞により産生されたＥの細胞外形状に確認されるように、熟成したＮ連結グリカンを含有
した（メイソン、１９８９；メイソンら、１９９１）。興味のあることに、ｐｒＭとＥに
加えてＣコード領域を含有したｖＰ８２５は、細胞外液体中に放出されない形状のＥの合
成を特定した（表１６）。Ｍ（およびｐｒＭ）に特有なＭＡｂを用いた放射線標識組換え
ワクシニア感染細胞から調製した免疫沈降により、ｐｒＭはｖＰ５５５、ｖＰ８２５、お
よびｖＰ８２９に感染した細胞中で合成され、ＭはｖＰ５５５またはｖＰ８２９に感染し
た細胞の培養液中に検出されたことが分かった（表１６）。
【０３２８】
ｖＰ５５５およびｖＰ８２９に感染した細胞から収集した細胞外液体は、ｖＰ４１０、ｖ
50
(79)
JP 3602844 B2 2004.12.15
Ｐ８２５、ｖＰ８５７またはｖＰ８６４に感染した細胞の培養液には検出されなかったＨ
Ａ活性を含有した。このＨＡは、抗ＪＥＶ抗体とそのｐＨ最適条件によるその阻害に基づ
いてＪＥＶ感染細胞中に産生されたＨＡと同一であるように思われた（メイソンら、１９
９１）。ワクシニアウイルスＪＥＶ組換え体ｖＰ８２９、ｖＰ８２５、ｖＰ８５７および
ｖＰ８６４に感染した細胞からの培養液に関してショ糖密度勾配を調製した。勾配の分析
により、ＪＥＶ培養液に見られた遅い沈降血球凝集素（ＳＨＡ）のピークとともに移動し
たｖＰ８２９感染試料のＨＡ活性のピークを同定した（データは示さず）。この結果によ
り、ｖＰ８２９感染細胞は、ｖＰ５５５感染細胞から収集された培養液中に観察されたＥ
およびＭを含有する空のウイルスエンベロープに同一の細胞外粒子を産生することが示さ
れた（表１６およびメイソンら、１９９１）。
10
【０３２９】
組換えワクシニアウイルスにより発現される場合、ＮＳ１は正確に処理され分泌される
瞬間標識実験により、真正ＮＳ１およびＮＳ１′とサイズが同一なタンパク質がｖＰ５５
５、ｖＰ８２５、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４に感染した細胞中で合成されることが示さ
れた。ｖＰ５５５感染細胞により産生されたＮＳ１は、高分子量形状の感染細胞の培養液
中に放出された。ＮＳ１はまた、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４感染細胞の培養液中に放出
されるが、一方でＮＳ１は、ｖＰ８２５に感染した細胞からは放出されなかった（表１６
）。ＮＳ２Ａ（ｖＰ８５７）コード領域またはＮＳ２ＡおよびＮＳ２Ｂコード領域を含有
する組換えワクシニアウイルスからのＮＳ１の合成の比較により、ＮＳ２Ｂコード領域の
存在または不在は、ＮＳ１の発現には影響せず、ＮＳ２Ａ遺伝子のみがＮＳ１の真正処理
20
に必要であることを示す以前のデータと首尾一貫していることが分かった（ファルゴート
ら、１９８９；メイソンら、１９９１）。
【０３３０】
組換えワクシニアウイルスはＪＥＶ抗原に対する免疫応答を誘発した
各群から選択した動物から採取した前抗原投与した血清を、放射線標識したＥとＮＳ１を
イムノプレイピテーションする能力に関して試験した。これらの研究の結果により以下の
ことが示された（表１６）：（１）Ｅに対して誘発せしめられた免疫応答の大きさは、ｖ
Ｐ８２９＞ｖＰ５５５＞ｖＰ８２５であった、（２）ＮＳ１およびＮＳ２Ａをコードする
全てのウイルスはＮＳ１に対する抗体を誘発した、（３）全ての免疫応答は、組換えウイ
ルスの２回目の接種により増大せしめられた。これらの動物から採取した血清に関する中
30
和とＨＡＩデータの分析により（表１７）、免疫沈降分析の結果が確認でき、ＲＩＰによ
り示されたようにＥに対する免疫応答は、他の血清学的試験と良好に相関関係にあること
を示す（表１７）。
【０３３１】
組換えウイルスによるワクチン接種は致死ＪＥＶ感染からの防御を提供した
全ての組換えワクシニアウイルスは、ＪＥＶの末梢病原Ｐ３菌株による致死感染からの防
御をマウスに与えることができた（ハング、１９８２）（表１７）。これらの研究により
ｖＰ５５５の防御潜在能力が確認され（メイソンら、１９９１）ｖＰ８２５とｖＰ８２９
に感染した動物において同様の防御を示した。ＮＳ１に対する強い免疫応答を誘発した組
換えウイルスｖＰ８５７およびｖＰ８６４は、低水準の防御を示したが、これらの組換え
40
体を接種したマウスは、対照ウイルス、ｖＰ４１０を接種したマウスと比較してまだ十分
に防御された（表１７）。
【０３３２】
後抗原投与免疫応答はＪＥＶ複製の水準を示す
これらの組換えウイルスを接種した動物の致死抗原投与からの防御の機構をよりよく理解
するために、後抗原投与血清における抗体のＪＥＶを認識する能力を評価した。これらの
研究に関して、放射線標識したＪＥＶ感染細胞の溶解産物に存在する抗原を用い、高度免
疫したマウス（メイソンら、１９８７ａ）中の高水準の抗体を誘発するＮＳ３タンパク質
に対する応答を試験した。これらの研究結果（表１８）は、高水準の防御を誘発した組換
えウイルス（ｖＰ８２９、ｖＰ５５５、およびｖＰ８２５）でワクチン接種した動物の群
50
(80)
JP 3602844 B2 2004.12.15
がＮＳ３に対する低い後抗原投与応答を示したが、一方でＮＳ１のみを発現した組換え体
（ｖＰ８５７およびｖＰ８６４）でワクチン接種した群の生存者からの血清はＮＳ３に対
して高い後抗原応答を示したという生存データと相関性がある。
【０３３３】
【表１６】
10
20
【表１７】
30
(81)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
【表１８】
40
(82)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
ＪＥＶ遺伝子のワクシニア（ＮＹＶＡＣ）供与体プラスミド中へのクローニング
プラスミドｐＭＰ２ＶＣＬ（Ｋ１Ｌ宿主域遺伝子の上流のワクシニア配列内にポリリンカ
ー領域を含有する）をポリリンカー内のＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで切断し、アニールし
たオリゴヌクレオチドＳＰＨＰＲＨＡ ＡからＤと連結し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、Ｈ６プ
ロモーター−１２４から−１（パーカスら、１９８９）、並びにＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ、Ｓ
ｍａＩ、ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩ部位を含有するＳＰ１２６を産生した。
40
【０３３４】
プラスミドｐＳＤ５４４ＶＣ（ポリリンカー領域と置換されたＨＡ遺伝子の部位を包囲す
るワクシニア配列および６つの読取り枠中の翻訳終止コドンを含有する）をポリリンカー
領域内のＸｈｏＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を充填し、アルカリ性
ホスファターゼで処理した。ＳＰ１２６をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、クレノウで処理し、
ＳｍａＩの切断によりＨ６プロモーターを単離した。Ｈ６プロモーター断片のｐＳＤ５４
４ＶＣへの連結により、ポリリンカー領域（ＨＡ転写方向内）にＨ６プロモーターを含有
したＳＰＨＡ−Ｈ６を産生した。
【０３３５】
プラスミドＪＥＶＬ１４ＶＣをＨ６プロモーター内のＥｃｏＲＶとＪＥＶ配列内のＳａｃ
50
(83)
JP 3602844 B2 2004.12.15
Ｉ（ヌクレオチド２１２４）で切断し、１７８９ｂｐ断片を単離した。ＪＥＶＬ１４ＶＣ
（メイソンら、１９９１）をＴ５ＮＴ後のＥａｇＩ部位でのＥｃｌＸＩで切断し、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩのクレノウ断片で充填し、ＪＥＶ配列内のＳａｃＩ（ヌクレオチド２１２
４）で切断し、２００５ｂｐ断片を産生した。１７８９ｂｐ ＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩおよ
び２００５ｂｐ（ＳａｃＩ充填ＥｃｌＸＩ）断片をＥｃｏＲＶ（Ｈ６内）に連結し、Ｓｍ
ａＩ（ポリリンカー内）で切断し、ＳＰＨＡ−Ｈ６をアルカリ性ホスファターゼ処理しＪ
ＥＶ３５を産生した。ＪＥＶ３５をｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）感染細胞中にトランスフェ
クションし、ワクシニア組換え体ｖＰ９０８を産生した（第１８図）。
【０３３６】
ＪＥＶ３５をＳａｃＩ（ＪＥ配列ヌクレオチド２１２４内）とＥｃｌＸＩ（Ｔ５ＮＴの後
10
）で切断し、５４９７ｂｐ断片を単離し、ＪＥＶ２５のＳａｃＩ（ＪＥＶヌクレオチド２
１２４）からＥａｇＩ断片（Ｅの残りの３分の２、翻訳終止およびＴ５ＮＴを含有する）
に連結し、ＪＥＶ３６を産生した。ＪＥＶ３６をｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）感染細胞中に
トランスフェクションし、ワクシニア組換え体ｖＰ９２３を産生した（第１８図）。ＳＰ
ＨＰＲＨＡ ＡからＤオリゴヌクレオチドＳＰＨＰＲＨＡ：Ａ＋Ｂ（配列認識番号１２０
）およびＳＰＨＰＲＨＡ：Ｃ＋Ｄ（配列認識番号１２１）を以下に示す
【化６９】
20
ＹＦワクシニア組換えウイルス（クローン１０ＩＩＩおよびクローン２８ＩＩＩ）を構築
するのに用いたＹＦ１７Ｄ ｃＤＮＡクローンをチャールスライス（ＭＯ、セントルイス
、ワシントン大学スクールオブメディスン）から得た。全てのヌクレオチド座標はライス
30
ら１９８５に存在した配列データから誘導した。
【０３３７】
カルボキシ末端８０％ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端８０％ＮＳ１（ヌクレオチド５３７−
１６５９）をコードするＹＦ ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ０を、ＹＦ ｃＤＮＡ
のＡｖａＩからＮｓｉＩ断片（ヌクレオチド５３７−１６５９）とＹＦ ｃＤＮＡのＮｓ
ｉＩからＫｐｎＩ断片（ヌクレオチド１６６０−３２６６）をＡｖａＩとＫｐｎＩで切断
したＩＢＩ２５（ＣＴ、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）中に
クローニングすることにより誘導した。Ｃおよびアミノ末端２０％ｐｒＭをコードするＹ
Ｆ ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ１を、ＹＦ ｃＤＮＡのＲｓａＩからＡｖａＩ断
片（ヌクレオチド１６６−５３６）とアニールしたオリゴヌクレオチドＳＰ４６とＳＰ４
40
７（不能ＨｉｎｄＩＩＩ付着末端、ＸｈｏＩとＣｌａＩ部位およびＹＦヌクレオチド１１
９−１６５を含有する）をＡｖａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニ
ングすることにより誘導した。Ｅのカルボキシ末端６０％とＮＳ１のアミノ末端２５％を
コードするＹＦ ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ３を、ＹＦ ｃＤＮＡのＡｐａＩか
らＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１６０４−２７２５）をＡｐａＩとＢａｍＨＩで切断し
たＩＢＩ２５中にクローニングすることにより産生した。カルボキシ末端２０％ＮＳ１、
ＮＳ２ａ、ＮＳ２Ｂおよびアミノ末端２０％ＮＳ３をコードするＹＦ ｃＤＮＡを含有す
るプラスミドＹＦ８を、ＹＦ ｃＤＮＡのＫｐｎＩからＸｂｎＩ断片（ヌクレオチド３２
６７−４９４０）をＫｐｎＩとＸｂａＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすること
により誘導した。カルボキシ末端６０％ＮＳ２Ｂおよびアミノ末端２０％ＮＳ３をコード
50
(84)
JP 3602844 B2 2004.12.15
するＹＦ ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ９を、ＹＦ ｃＤＮＡのＳａｃＩからＸｂ
ａＩ断片（ヌクレオチド４３３９−４９４０）をＳａｃＩとＸｂａＩで切断したＩＢＩ２
５中にクローニングすることにより産生した。Ｃのカルボキシ末端２５％、ｐｒＭおよび
Ｅのアミノ末端４０％をコードするＹＦ ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ１３を、Ｙ
Ｆ ｃＤＮＡのＢａｌＩからＡｐａＩ断片（ヌクレオチド３８４−１６０３）をＡｐａＩ
とＳｍａＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより誘導した。
【０３３８】
オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発（クンケル、１９８５）を用いて、以下の潜在的
なワクシニアウイルス初期転写終止シグナル（ユエンら、１９８７）（１）ＹＦ１中のＣ
遺伝子のアミノ末端からの４９ａａ（ＴＴＴＴＴＣＴヌクレオチド２６３−２６９および
10
ＴＴＴＴＴＧＴヌレオチド２６９−２７５）を（配列認識番号１２２）ＴＴＣＴＴＣＴＴ
ＣＴＴＧＴに改変してプラスミドＹＦ１Ｂを産生し、ＹＦ３中のＥ遺伝子において（ヌク
レオチド１８８６−１８９３ＴＴＴＴＴＴＧＴからカルボキシ末端からのＴＴＣＴＴＴＧ
Ｔ１８９ａａおよびヌクレオチド２４２９−２３５ＴＴＴＴＴＧＴをカルボキシ末端から
のＴＴＣＴＴＧＴ８ａａ）に改変することにより、それぞれＹＦ３ＢとＹＦ３Ｃを産生し
た。ＹＦ３ＣからのＰｓｔＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１９６５−２７２５）を
ＹＦ３Ｂの対応断片と交換し、両者とも突然変異誘発転写終止シグナルを有するカルボキ
シ末端６０％Ｅとアミノ末端２５％ＮＳ１をコードするＹＦ ｃＤＮＡを含有するＹＦ４
（ヌクレオチド１６０４−２７２５）を産生した。ＹＦ４からのＡｐａＩからＢａｍＨＩ
断片（ヌクレオチド１６０４−２７２５）をＹＦ０中の相当領域と置換して、両者とも突
20
然変異誘発転写終止シグナルを有するカルボキシ末端８０％ｐｒＭ、Ｅとアミノ末端８０
％ＮＳ１をコードするＹＦ ｃＤＮＡを含有するＹＦ６（ヌクレオチド５３７−３２６６
）を産生した。プラスミドＹＦ６をＩＢＩ２５内のＥｃｏＲＶとヌクレオチド５３７での
ＡｖａＩで切断し、ＹＦ１ＢからのＥｃｏＲＶからＡｖａＩ断片（ＩＢＩ２５内のＥｃｏ
ＲＶからヌクレオチド５３６でのＡｖａＩ）と連結し、１１９にＸｈｏＩおよびＣｌａＩ
部位並びに４つの突然変異誘発終止シグナルを有するＣからＮＳ１のアミノ末端８０％を
コードするＹＦ ｃＤＮＡを含有するＹＦ２（ヌクレオチド１１９−３２６６）を産生し
た。
【０３３９】
上述したオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を用いて、（１）Ｅのカルボキシ末端か
30
らのＡＴＧ１７ａａに先行するＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位（ヌクレオチド２４０２−２
４０４）をプラスミドＹＦ３Ｃに挿入してＹＦ５を産生し、（２）ｐｒＭのカルボキシ末
端からのＡＴＧ１９ａａに先行するＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位（ヌクレオチド９１７−
９１９）をプラスミドＹＦ１３に挿入してＹＦ１４を産生し、（３）Ｅのカルボキシ末端
からのＡＴＧ２３ａａに先行するＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド２３８４−２３８６）をプ
ラスミドＹＦ３Ｃに挿入してＹＦ２５を産生し、（４）Ｃのカルボキシ末端からのＡＴＧ
２１ａａおよびＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド４１９）をプラスミドＹＦ１に挿入してＹＦ
４５を産生した。
【０３４０】
ＹＦ５からのＡｐａＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１６０４−２７２５）をＹＦ０
40
の対応領域と交換して、２４０２でＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位（Ｅのカルボキシ末端か
らの１７ａａ）並びに２４２９−２４３５での突然変異誘発転写終止シグナル（Ｅのカル
ボキシ末端からの８ａａ）を有するカルボキシ末端８０％ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端８
０％ＮＳ１をコードするＹＦ ｃＤＮＡを含有するＹＦ７（ヌクレオチド５３７−３２６
６）を産生した。ＹＦ２５からのＡｐａＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１６０４−
２７２５）をＹＦ０の対応領域と交換して、２３８４でＸｈｏＩ部位（Ｅのカルボキシ末
端からの２３ａａ）および２４２８−２４３５での突然変異誘発転写終止シグナル（Ｅの
カルボキシ末端からの８ａａ）を有するカルボキシ末端８０％ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末
端８０％ＮＳ１をコードするＹＦ ｃＤＮＡを含有するＹＦ２６（ヌクレオチド５３７−
３２６６）を産生した。
50
(85)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０３４１】
ＹＦ１４からのＡｖａＩからＡｐａＩ断片（ヌクレオチド５３７−１６０３）をＹＦ６の
対応領域と交換して、ヌクレオチド９１７でＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位（ｐｒＭのカル
ボキシ末端からの１９ａａ）および２つの突然変異誘発転写終止シグナルを有するカルボ
キシ末端８０％ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端８０％ＮＳ１をコードするＹＦ ｃＤＮＡを
含有するＹＦ２６（ヌクレオチド５３７−３２６６）を産生した。ＹＦ６をＩＢＩ２５内
のＥｃｏＲＶとＹＦ内のヌクレオチド５３７でのＡｖａＩで切断し、ＹＦ４５のＥｃｏＲ
Ｖ（ＩＢＩ２５内）からＡｖａＩ断片に連結して４１９でＸｈｏＩ部位（Ｃのカルボキシ
末端からの２１ａａ）および除去し２つの転写終止シグナルを有するＣからアミノ末端８
０％ＮＳ１をコードするＹＦ ｃＤＮＡを含有するＹＦ４６（ヌクレオチド１１９−３２
10
６６）を産生した。
【０３４２】
上述したオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を用いて、ＮＳ２Ｂのカルボキシ末端で
のＳｍａＩ部位（ヌクレオチド４５６９）をプラスミドＹＦ９に挿入してＹＦ１１を産生
し、ＮＳ２Ａのカルボキシ末端のＳｍａＩ部位（ヌクレオチド４１８０）をプラスミドＹ
Ｆ８に挿入してＹＦ１０を産生した。ＹＦ１１からのＳａｃＩからＸｂａＩ断片（ヌクレ
オチド４３３９−４９４０）およびＹＦ８からのＡｓｐ７１８からＳａｃＩ断片（ヌクレ
オチド３２６２−４３３８）をＡｓｐ７１８とＸｂａＩで切断したＩＢＩ２５に連結して
、ＮＳ２Ｂのカルボキシ末端の後にあるＳｍａＩ部位（ヌクレオチド４５６９）を有する
カルボキシ末端２０％ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂおよびアミノ末端２０％ＮＳ２Ｂまを
20
コードするＹＦ ｃＤＮＡを含有するＹＦ１２（ヌクレオチド３２６２−４９４０）を産
生した。
【０３４３】
ＹＦ遺伝子のｐＨＥＳシステムワクシニアウイルス供与体プラスミドへのクローニング
ＹＦクローニング配列のＮＹＶＡＣ供与体プラスミドへの挿入の前に、ＹＦコード配列を
ワクシニアプラスミドｐＨＥＳ４に挿入した（パーカスら、１９８９）。カルボキシ末端
２０％ＮＳ１、ＮＳ２ＡおよびＮＳ２ＢをコードするＹＦ１２からのＫｐｎＩからＳｍａ
Ｉ断片（ヌレオチド３２６７−４５６９）、１９ａａｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端８０％
ＮＳ１をコードするＹＦ１５からのＸｈｏＩからＫｐｎＩ断片（ヌクレオチド９１７−３
２６６）およびＸｈｏＩ−ＳｍａＩで切断したｐＨＥＳ４を連結してＹＦ２３を産生した
30
。２３ａａＥ、アミノ末端２５％ＮＳ１をコードするＹＦ２６からのＸｈｏＩからＢａｍ
ＨＩ断片（ヌクレオチド２３８４−２７２５）をＹＦ２３（カルボキシ末端７５％ＮＳ１
、ＮＳ２ＡおよびＮＳ２Ｂ、複製の起点並びにワクシニア配列を含有する）からのＸｈｏ
ＩからＢａｍＨＩ断片と連結してＹＦ２８を産生した。
【０３４４】
ＸｈｏＩ−ＳｍａＩ切断したｐＨＥＳ４を、１７ａａＥおよびアミノ末端８０％ＮＳ１を
コードするＹＦ７からのＸｈｏＩからＫｐｎＩ断片（ヌクレオチド２４０２−３２６６）
およびカルボキシ末端２０％ＮＳ１およびＮＳ２ＡをコードするＹＦ１０からのＫｐｎか
らＳｍａＩ（ヌクレオチド３２６７−４１８０）を連結することにより、ＹＦ１８を産生
した。Ｃ、ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端２５％ＮＳ１をコードするＹＦ２からのＸｈｏＩ
40
からＢａｍＨＩ断片をＹＦ１８のＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片（カルボキシ末端７５％Ｎ
Ｓ１およびＮＳ１Ａ、不正の起点並びにワクシニア配列を含有する）に連結し、ＹＦ１９
を産生した。ＹＦ２からの同一のＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片をＹＦ２８からのＸｈｏＩ
からＢａｍＨＩ断片（カルボキシ末端７５％ＮＳ１およびＮＳ２Ａ、複製の起点並びにワ
クシニア配列を含有する）に連結し、ＹＦ２０を産生した。２１ａａＣ、ｐｒＭ、Ｅおよ
びアミノ末端２５％ＮＳ１をコードするＹＦ４６からのＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片（ヌ
クレオチド４１９−２７２５）をＹＦ１８からのＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片と連結し、
ＹＦ４７を産生した。オリゴヌクレオチドＳＰ４６（配列認識番号１２３）およびＳＰ（
配列認識番号１２４）は以下の通りである：
【化７０】
50
(86)
JP 3602844 B2 2004.12.15
組換え体ＹＦワクシニアウイルスの構築
ＣからＮＳ２Ｂに亘るＹＦコード領域の部分を発現した５つの異なるワクシニアウイルス
組換え体を、宿主範囲選択システムを用いて構築した（パーカスら、１９８９）。プラス
ミドＹＦ１８、ＹＦ２３、ＹＦ２０、ＹＦ１９およびＹＦ４７をｖＰ２９３感染細胞中に
10
トランスフェクションし、ワクシニア組換え体ｖＰ７２５、ｖＰ７２９、ｖＰ７６４、ｖ
Ｐ７６６およびｖＰ８６９を産生した。これらの組換え体中に含まれたＹＦ ｃＤＮＡ配
列を第１９図に示す。５つの組換えウイルス全てにおいて、ＹＦ ｃＤＮＡの間隔鎖は、
ワクシニアウイルス初期／晩期Ｈ６プロモーターの背後に位置し、翻訳は、ウイルスｃＤ
ＮＡ配列の５′末端に位置するＭｅｔコドンから開始すると予期された（第１９図）。
【０３４５】
組換え体ｖＰ７２５は、非構造タンパク質ＮＳ１のＮ末端に先行する推定１７−ａａシグ
ナル配列および非構造タンパク質ＮＳ１とＮＳ２Ａをコードした（ライスら、１９８５）
。組換え体ｖＰ７２９は、ＥのＮ末端に先行する推定１９−ａａシグナル配列、Ｅ、ＮＳ
１、ＮＳ２ＡおよびＮＳ２Ｂをコードした（ライスら、１９８５）。組換え体ｖＰ７６４
20
は、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２ＡおよびＮＳ２Ｂをコードした（ライスら、１９８
５）。組換え体ｖＰ７６６は、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１およびＮＳ２Ａをコードした（ラ
イスら、１９８５） 。組換え体ｖＰ８６９は、ｐｒＭ構造タンパク質前駆体のＮ末端に
先行する推定２１−ａａシグナル配列、並びにｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、およびＮＳ２Ａをコ
ードした（ライスら、１９８５）。
【０３４６】
致死ＹＦ抗原投与からの防御
ｖＰ８６９は、他の組換え体に感染した培養液中に見られなかったＨＡ活性を分泌した。
このＨＡは、抗ＹＦ抗体により抑制とｐＨ最適条件に基づいてＹＦ感染細胞中に産生され
たＨＡと同一であるように思われた。
【０３４７】
生後３週間のマウスに、１０
７ ｐｆｕのｖＰ８６９、ｖＰ７６４、またはＹＦ−１７Ｄ
を腹腔内に接種し、３週間後に１００ＬＤ５０のＹＦのフレンチ神経親和性菌株を抗原投
与した。ｖＰ８６９は著しい防御を提供したが（表１９）、一方でｖＰ７６４は、ＹＦ遺
伝子を欠如した対照ワクシニアウイルスよりも良好な防御を提供しなかった（ｖＰ４５７
）。
【０３４８】
【表１９】
30
(87)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
ＹＦ遺伝子のＮＹＶＡＣ供与体プラスミド中へのクローニング
２１アミノ酸Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ（ＮＳ１が掛けたヌクレオチド２９６２
を有する）をコードするＹＦ ｃＤＮＡを含有するＹＦ４７からのＸｈｏＩからＳｍａＩ
断片（ヌクレオチド４１９−４１８０）をＸｈｏＩ−ＳｍａＩで切断したＳＰＨＡ−Ｈ６
（ＨＡ領域供与体プラスミド）と連結し、ＹＦ４８を産生した。ＹＦ４８をＳａｃＩ（ヌ
クレオチド２４９０）で切断し、Ａｓｐ７１８（ヌクレオチド３２６２）で部分的に切断
し、６７００ｂｐ断片を単離し、（複製のプラスミド起点、ワクシニア配列、２１アミノ
20
酸Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、アミノ末端３．５％ＮＳ１、カルボキシ末端２３％ＮＳ１、ＮＳ２Ａ
を含有する）、ＹＦ１８からのＳａｃＩ−Ａｓｐ７１８断片（２９６２に存在する塩基と
ともにＮＳ１の残りを含有する）に連結し、ＹＦ５１を産生した。オリゴヌクレオチド定
方向二本鎖切断突然変異誘発（マンデッキ、１９８６）を用いて、ＹＦ５１中の特有のＸ
ｈｏＩ部位に対応する６ｂｐを除去し、ＨＡ座供与体プラスミド中にＹＦ２１アミノ酸Ｃ
、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａをコードするプラスミドを産生した。供与体プラスミド
ＹＦ５０をｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）感染細胞中にトランスフェクションしてワクシニア
組換え体ｖＰ９８４を産生した。
【０３４９】
オリゴヌクレオチド定方向二本鎖切断突然変異誘発を用いて、ＹＦ４８中の特有のＸｈｏ
30
Ｉ部位に対応する６ｂｐを除去してＹＦ４９を産生した。オリゴヌクレオチド定方向突然
変異誘発を用いて、Ｅのカルボキシ末端でのＳｍａＩ部位をＹＦ４中に挿入し、ＹＦ１６
を産生した。ＹＦ４９のＡｐａＩ−ＳｍａＩ断片（２１アミノ酸Ｃ、ｐｒＭおよびアミノ
末端４３％ＥをコードするＹＦ ｃＤＮＡ、並びに複製のプラスミド起点、ワクシニア配
列を含有する）をＹＦ１６からのＡｐａＩ−ＳｍａＩ断片（カルボキシ末端５７％Ｅを含
有するヌクレオチド１６０４−２４５３）に連結し、ＨＡ座にＥ、ｐｒＭ、Ｃの２１アミ
ノ酸を含有するＹＦ５３を産生した。供与体プラスミドＹＦ５３をｖＰ９１３（ＮＹＶＡ
Ｃ−ＭＶ）に感染した細胞中にトランスフェクションしてワクシニア組換え体ｖＰ９９７
を産生した。
【０３５０】
40
１型デング熱のワクシニアウイルス供与体プラスミド中へのクローニング
カルボキシ末端８４％ＮＳ１およびアミノ末端４５％ＮＳ２ＡをコードするＤＥＮ ｃＤ
ＮＡを含有するプラスミドＤＥＮ１（ヌクレオチド２５５９−３７４５、メイソンら、１
９８７ｂ）を、ＤＥＮ ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片（ヌクレオチド２５５９−
３７４０）およびアニールしたオリゴヌクレオチドＤＥＮ１（配列認識番号１２５）とＤ
ＥＮ２（配列認識番号１２６）（ＸｂａＩ付着末端、翻訳終止コドン、Ｔ５ＡＴワクシニ
アウイルス初期転写終止シグナル（ユエンら、１９８７）、ＥａｇＩ部位およびＨｉｎｄ
ＩＩＩ付着末端を含有する）をＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ８中にクロ
ーニングすることにより誘導した。ＤＥＮ１からのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ヌ
クレオチド２５５９−３７４５）およびＥのカルボキシ末端３６％とアミノ末端１６％Ｎ
50
(88)
JP 3602844 B2 2004.12.15
Ｓ１をコードするＤＥＮ ｃＤＮＡのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓａ
ｃＩで切断したＩＢＩ２４（ＣＴ、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジ
ー社）に連結し、カルボキシ末端６４％Ｅからアミノ末端４５％ＮＳ２Ａをコードし、Ｎ
Ｓ１に塩基の欠けた（ヌクレオチド２４６７）ＤＥＮ３を産生した。
【０３５１】
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩで切断したＩＢＩ２４をアニールしたオリゴヌクレオチドＤＥ
Ｎ９（配列認識番号１２７）およびＤＥＮ１０（配列認識番号１２８）［ＨｉｎｄＩＩＩ
付着末端、ＳｍａＩ部位、ＤＥＮヌクレオチド３７７−４２８（メイソンら、１９８７ｂ
）およびＸｂａＩ付着末端を含有する］に連結し、ＳＰＤ９１０を産生した。ＳＰＤ９１
０をＳａｃＩ（ＩＢＩ２４内）とＡｖａＩ（ヌクレオチド４２３のＤＥＮ内）で切断し、
10
ＤＥＮ ｃＤＮＡのＡｖａＩ−ＳａｃＩ断片（ヌクレオチド４２４−１４４７メイソンら
、１９８７）に連結し、カルボキシ末端１１ａａＣ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％Ｅを
コードするＤＥＮ４を産生した。
【０３５２】
カルボキシ末端６４％Ｅおよびアミノ末端１８％ＮＳ１をコードするＤＥＮ ｃＤＮＡを
含有するプラスミドＤＥＮ６（ヌクレオチド２４６７が存在するヌクレオチド１４４７−
２５７９、メイソンら、１９８７ｂ）を、ＤＥＮ ｃＤＮＡのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片を
ＩＢＩ２５（ＣＴ、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）中にクロ
ーニングすることにより誘導した。ＤＥＮ５′未翻訳領域の５１塩基、Ｃ、ｐｒＭおよび
アミノ末端３６％ＥをコードするＤＥＮ ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＥＮ１５を、
20
ＤＥＮ ｃＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片（ヌクレオチド２０−１４４７、メイ
ソンら、１９８７ｂ）をＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニン
グすることにより誘導した。カルボキシ末端５５％ＮＳ２Ａおよびアミノ末端２８％ＮＳ
２ＢをコードするＤＥＮ ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＥＮ２３を、ＤＥＮ ｃＤＮ
ＡのＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片をＸｂａｉ−ＳｐｈＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニン
グすることにより誘導した。カルボキシ末端５５％ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂおよびアミノ酸Ｎ
Ｓ３をコードするＤＥＮ ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＥＮ２０（ヌクレオチド３７
４５−４５６３）を、ＤＥＮ ｃＤＮＡのＸｂａＩからＥｃｏＲＩ断片をＸｂａＩ−Ｅｃ
ｏＲＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより誘導した。
【０３５３】
30
オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発（クンケル、１９８５）を用いて以下の潜在的な
ワクシニアウイルス初期転写終止シグナルを改変せしめた（ユエンら、１９８７）。ＤＥ
Ｎ４中のｐｒＭ遺伝子における２つのＴ５ＮＴ配列、（１）カルボキシ末端からの２９ａ
ａ（ヌクレオチド８２２−８２８ＴＴＴＴＴＣＴをＴＡＴＴＴＣＴに）および（２）カル
ボキシ末端からの１３ａａ（ヌクレオチド８７０−８７５ＴＴＴＴＴＡＴからＴＡＴＴＴ
ＡＴに）を突然変異誘発せしめてプラスミドＤＥＮ４７を産生した。ＤＥＮ６中のＮＳ１
遺伝子における単一のＴ５ＮＴ配列、アミノ末端からの１７ａａを突然変異誘発せしめて
（ヌクレオチド２４４８−２４５４ＴＴＴＴＴＧＴからＴＡＴＴＴＧＴに）プラスミドＤ
ＥＮ７を産生した。
【０３５４】
40
上述したようにオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を用いて、（１）ＮＳ２Ａのカル
ボキシ末端でのＥａｇＩとＥｃｏＲＩ部位（ヌクレオチド４１０２）をプラスミドＤＥＮ
２３に挿入してＤＥＮ２４を産生し、（２）Ｅのカルボキシ末端らのＡＴＧ１５ａａとＳ
ｍａＩ部位をＤＥＮ７（ヌクレオチド２３４８）に挿入してＤＥＮ１０を産生し、（３）
ＮＳ２Ｂのカルボキシ末端でのＥａｇＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位（ヌクレオチド４４９２）
をプラスミドＤＥＮ２０に挿入してプラスミドＤＥＮ２１を産生し、そして（４）プラス
ミドＤＥＮ１５中のフクレオチド６３−６７をワクシニアウイルス初期／晩期Ｈ６プロモ
ーター（位置−１から−２１、パーカスら、１９８９）と置換してＤＥＮ１６（ＤＥＮヌ
クレオチド２０−５９、ＥｃｏＲＶ部位からＨ６プロモーターの−１およびＤＥＮヌクレ
オチド６８−１４４７を含有する）を産生した。
50
(89)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０３５５】
ＤＥＮ７からのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片（ヌクレオチド１４４７−２５７９）を、ＤＥＮ
１３中の対応領域と置換して、カルボキシ末端６４％Ｅとアミノ末端４５％ＮＳ２Ａをコ
ードするＤＥＮ ｃＤＮＡを含有し（ヌクレオチド１４４７−３７４５）、ヌクレオチド
２４６７が存在し改変転写終止シグナル（ヌクレオチド２４４８−２４５４）を有するＤ
ＥＮ１９を産生した。ＤＥＮ１９からのＸｈｏＩ−Ｘｂａｉ断片（ヌクレオチド２５７９
−３７４５）およびＤＥＮ２４からのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ＸｂａＩヌクレオ
チド３７４５ＤＥＮからＩＢＩ２４中のＨｉｎｄＩＩＩ）をＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで
切断したＩＢＩ２５に連結して、カルボキシ末端８２％ＮＳ１、ＮＳ２Ａおよびアミノ末
端２８％ＮＳ２ＢをコードするＤＥＮ ｃＤＮＡを含有し（ヌクレオチド２５７９−４２
10
１３）、４１０２でのＥａｇＩ部位、ヌクレオチド２４６７が存在し、突然変異誘発転写
終止シグナルを有する（ヌクレオチド２４４８−２４５４）ＤＥＮ２５を産生した。ＤＥ
Ｎ１９からのＸｈｏＩ−ＸｂａＩ断片（ヌクレオチド２５７９−３７４５）をＸｈｏＩ（
ＩＢＩ２５内）とＸｂａＩ（ＤＥＮヌクレオチド３７４５）で切断したＤＥＮ２１に連結
し、カルボキシル末端８２％ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂおよびアミノ末端２４ａａＮＳ
３をコードし（ヌクレオチド２５７９−４５６４）、ヌクレオチド２４６７が存在し、改
変転写終止シグナル（ヌクレオチド２４４８−２４５４）および４４９２でのＥａｇＩ部
位を有するＤＥＮ２２を産生した。
【０３５６】
ＤＥＮ１６からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片（ヌクレオチド２０−４９４）をＤＥＮ
20
４７からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片（Ｅのカルボキシ末端８３％ｐｒＭとアミノ末
端３６％ヌクレオチド４９４−１４４７および複製のプラスミド起点をコードする）と連
結し、Ｃ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％Ｅ並びにＣのアミノ末端に先行するＥｃｏＲＶ
部位とＨ６プロモーターの部分をコードするＤＥＮ１７を産生した。
【０３５７】
カルボキシ末端１３ａａＣ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％ＥをコードするＤＥＮ１７か
らのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片（ヌクレオチド３７０−１４４７）をアニールした
オリゴヌクレオチドＳＰ１１１およびＳＰ１１２（不能ＨｉｎｄＩＩＩ付着末端、Ｅｃｏ
ＲＶ部位からＨ６プロモーターの−１、およびＢｇｌＩＩ付着末端を有するＤＥＮヌクレ
オチド３５０−３６９）に連結し、ＥｃｏＲＶ部位からＨ６プロモーターの−１、カルボ
30
キシ末端２０ａａＣ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％ＥをコードするＤＥＮ３３を産生し
た。
【０３５８】
ＳｍａＩ−ＥａｇＩで切断したｐＴＰ１５（メイソンら、１９９１）を、カルボキシ末端
１１ａａＣ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％ＥをコードするＤＥＮ４からのＳｍａＩ−Ｓ
ａｃＩ断片（ヌクレオチド３７７−１４４７）と、カルボキシ末端６４％Ｅ、ＮＳ１およ
びアミノ末端４５％ＮＳ２ＡをコードするＤＥＮ３からのＳａｃＩ−ＥａｇＩ断片とに連
結し、ＤＥＮＬを産生した。カルボキシ末端６４％Ｅおよびアミノ末端１８％ＮＳ１をコ
ードするＤＥＮ７からのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片（ヌクレオチド１４４７−２５７９）を
、ＤＥＮ４７からのＢｓｔＥＩＩ−ＳａｃＩ断片（カルボキシ末端５５％ｐｒＭおよびア
40
ミノ末端３６％Ｅヌクレオチド６３１−１４４７をコードする）とＤＥＮＬからのＢｓｔ
ＥＩＩ−ＸｈｏＩ断片（カルボキシ末端１１ａａＣ、アミノ末端４５％ｐｒＭ、カルボキ
シ末端８２％ＮＳ１、カルボキシ末端ＮＳ２Ａ、複製の起点およびワクシニア配列をコー
ドする）とに連結し、ＤＥＮ８を産生した。オリゴヌクレオチド定方向二本鎖切断突然変
異誘発（マンデッキ、１９８６）を用いて特有のＳｍａＩ部位（Ｈ６プロモーターとＡＴ
Ｇの間に位置する）を除去し、Ｈ６プロモーターが直接ＡＴＧ開始コドンに先行するＤＥ
Ｎ８ＶＣを産生した。
【０３５９】
ＤＥＮ１７からのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（位置−２１から−１Ｈ６プロモーターＤＥ
Ｎヌクレオチド６８−１４４７）をＤＥＮ８ＶＣのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（ワクシニ
50
(90)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ア配列、−２１から−１２４のＨ６プロモーター、複製の起点およびアミノ末端６４％Ｅ
、ＮＳ１、アミノ末端４５％ＮＳ２Ａヌクレオチド１４４７−３７４５）に連結し、ＤＥ
Ｎ１８を産生した。ＤＥＮ２５からのＸｈｏＩ−ＥａｇＩ断片（ヌクレオチド２５７９−
４１０２）をＤＥＮ１８のＸｈｏＩ−ＥａｇＩ断片（複製の起点、ワクシニア配列および
ＤＥＮ Ｃ、ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端１８％ＮＳ１を含有する、ヌクレオチド６８−
２５７９）に連結し、ＤＥＮ２６を産生した。ＤＥＮ８ＶＣからのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ
断片（位置−２１から−１Ｈ６プロモーター、ヌクレオチド３７７−１４４７）をＤＥＮ
２６からのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（カルボキシル末端６４％Ｅ、ＮＳ１およびＮＳ２
Ａをコードしヌクレオチド２８９４でＮＳ１に塩基の欠けたＤＥＮ領域、複製の起点およ
びワクシニア配列を含有する）に連結し、ＤＥＮ３２を産生した。ＤＥＮ３２をｖＰ４１
10
０に感染した細胞中にトランスフェクションして組換え体ｖＰ８６７を産生した（第２０
図）。
【０３６０】
ＤＥＮ１０からのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片（ヌクレオチド１４４７−２５７９）をＤＥＮ
３中の対応領域と置換して、カルボキシ末端６４％Ｅ、ＮＳ１およびアミノ末端４５％Ｎ
Ｓ２Ａをコードし、Ｅのカルボキシ末端からのＡＴＧ１５ａａとＳｍａＩ部位を有するＤ
ＥＮ ｃＤＮＡを含有するＤＥＮ１１を産生した。ＤＥＮ１１からのＳｍａＩ−ＥａｇＩ
断片（カルボキシ末端１５ａａＥ、ＮＳ１およびアミノ末端４５％ＮＳ２Ａをコードする
、ヌクレオチド２３４８−３７４５）をＳｍａＩ−ＥａｇＩで切断したｐＴＰ１５に連結
し、ＤＥＮ１２を産生した。
20
【０３６１】
ＤＥＮ２２からのＸｈｏＩ−ＥａｇＩ断片（ヌクレオチド２５７９−４４９２９を上述し
たＤＥＮ１８からのＸｈｏＩ−ＥａｇＩ断片に連結して、ＤＥＮ２７を産生した。ＤＥＮ
１２からのＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ断片（位置−２１から−１Ｈ６プロモーターＤＥＮ、ヌ
クレオチド２３４８−３４４７）を、ＤＥＮ２７からのＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ断片（複製
の起点、ワクシニア配列、Ｈ６プロモーター−２１から−１２４およびＮＳ２ＡとＮＳ２
ＢをコードするＤＥＮ ｃＤＮＡを含有する）に連結し、ＤＥＮ３１を産生した。
【０３６２】
ＤＥＮ８ＶＣからのＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ断片（カルボキシ末端１１ａａＣ、ｐｒＭ Ｅ
、アミノ末端１８％ＮＳ１をコードする位置−２１から−１Ｈ６プロモーターＤＥＮヌク
30
レオチド）をＤＥＮ３１らのＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ断片（カルボキシ末端８２％ＮＳ１、
ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂをコードし、位置２８９４でＮＳ１に塩基が存在するＤＥＮ ｃＤＮ
Ａ、ワクシニア配列および複製の起点を含有する）に連結し、ＤＥＮ３５を産生した。Ｄ
ＥＮ３５をｖＰ４１０感染細胞中にトランスフェクションして組換え体ｖＰ９５５を産生
した（第２０図）。ＤＥＮ３３からのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（カルボキシ末端２０ａ
ａＣ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％Ｅをコードする位置−２１から−１Ｈ６プロモータ
ーＤＥＮヌクレオチド３５０−１４４７）およびＤＥＮ３２からのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断
片（カルボキシ末端６４％Ｅおよびアミノ末端１８％ＮＳ１ヌクレオチドをコードする）
を上述したＤＥＮ３１からのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片に連結し、ＤＥＮ３４を産生した
。ＤＥＮ３４をｖＰ４１０に感染した細胞中にトランスフェクションして、組換え体ｖＰ
９６２を産生した（第２０図）。オリゴヌクレオチドＤＥＮ１（配列認識番号１２５）、
ＤＥＮ２（配列認識番号１２６）、ＤＥＮ９（配列認識番号１２７）、ＤＥＮ１０（配列
認識番号１２８）、ＳＰ１１１（配列認識番号１２９）、およびＳＰ（配列認識番号１３
０）を以下に示す：
【化７１】
40
(91)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
実施例１７−改変ＮＹＶＡＣウイルスの構築
ワクシニアの左側末端に近い［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠損のサイズを異なる程度に増大せしめ
、右側末端に近い欠損を導入することにより、ＮＹＶＡＣを改変した。全ての欠損は、Ｅ
．ｃｏｌｉグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子とミコフェノール酸を一過
20
性選択システムで使用することにより行なった。
【０３６３】
一過性優性選択
環状供与体プラスミドを用いて、リン酸カルシウム沈殿プラスミドＤＮＡをワクシニア感
染ベロ細胞へトランスフェクションする標準方法によりワクシニアウイルスの組換えを行
なった。２４時間後、感染細胞を収集して、溶解産物を１マイクログラム／ｍｌのミコフ
ェノール酸（ＭＰＡ）の存在下で平板培養した。個々のプラークを採取してＭＰＡの存在
下においてベロ細胞で増幅した。ウイルスを収集して、ＭＰＡが存在しない条件でプラー
クの採取を２回行なってプラークを精製した。ＭＰＡなくして各回で採取したプラークを
ベロ細胞において平板培養し、適切な遺伝子の存在下でフィルターをハイブリダイゼーシ
30
ョンした。
【０３６４】
ＮＹＶＡＣ．１．
ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）中に存在する［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠損を、隣の２つのＯＲＦか
ら右側のＫ２ＬおよびＫ３Ｌを含有するように拡張せしめた。Ｋ２ＬＯＲＦに関する推定
の翻訳産生物は、セリンプロテアーゼ阻害剤の類に対する相同性を示す（ボースネル、１
９８８）。しかしながら、ワクシニアゲノムのこの領域の転写地図作成は発現されない（
マルガンら、１９８４）。
【０３６５】
Ｋ３Ｌの翻訳産生物は、セリン（アミノ酸５１）ホスホリル化部位に亘り重複する８７ア
40
ミノ酸に亘る真核性阻害因子２アルファ（ｅＩＦ−２アルファ）に対して２８％の相同性
を示す。ｅＩＦ−２アルファのホスホリル化は、インターフェロンにより誘発された抗ウ
イルス状態における段階であり、ワクシニアがインターフェロンの効果を回避する機構に
は、ワクシニアＫ３Ｌ遺伝子産生物が必要であることを示す。ワクシニアのコペンハーゲ
ン菌株からのＫ３Ｌ遺伝子を欠損せしめた（ビーティーら、１９９１）。産生したウイル
スは、タンパク質合成のウイルス誘発の阻害とウイルス複製の阻害により測定されるよう
な生体外インターフェロンに対して増大した感度を示した。これにより、ワクシニアウイ
ルスからのＫ３Ｌの欠損は、ワクチン接種の合併症の場合にはインターフェロンにより制
御されるより安全なワクチン菌株となることが示される。
【０３６６】
50
(92)
JP 3602844 B2 2004.12.15
Ｃ７ＬからＫ３Ｌが欠損したプラスミドｐＭＰＣ７Ｋ３ＧＰＴの構築
［Ｃ７Ｌ−Ｋ３Ｌ］欠損を側腹に有する左右ワクシニアアームを別々に組み立てた。左ア
ームをｐＳＤ４２０から誘導し（パーカスら、１９９０）、中間欠損プラスミドｐＭＰ２
５６／２５７中に組み立てた（パーカスら、１９９１）。合成オリゴヌクレオチドＮＰＳ
ＹＮ３７９（配列認識番号１３１）、ＭＰＳＹＮ３８０（配列認識番号１３２）
【化７２】
10
を、テンプレートとしてプラスミドｐＳＤ４２０を用いたＰＣＲ反応におけるプライマー
として用いた。差錬成した０．１４ｋｂ断片をＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩで切断し、ｐ
ＭＰ２５６／２５７に挿入して、プラスミドの左アームを置換した。産生したプラスミド
をｐＭＰ３７９／３８０と称した。０．７ｋｂ ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＳＤ４２
０から単離して、ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＭＰ３７９／３８０に連結し、プラ
スミドｐＭＰＣ７Ｆ４を形成した。
【０３６７】
Ｋ３Ｌの右側の配列を含有する右側欠損接合部を構築するために、合成オリゴヌクレオチ
ドＭＰＳＹＮ３８１／ＭＰＳＹＮ３８２（配列認識番号１３３／配列認識番号１３４）
20
【化７３】
をアニールしてＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ８に連結し、プラスミドｐＭＰ
３８１／３８２を形成した。１．０ｋｂ ＨｐａＩ（部分的）／ＥｃｏＲＶ断片をクロー
ニングしたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｋから単離して、ｐＰ３８１／３８２に連結し、
全縁右側ワクシニアフランキングアームを含有するプラスミドｐＭＰＫ３Ｒを形成した。
左側ワクシニアフランキングアームを０．８ｋｂ ＢｇｌＩＩ（部分的）／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片としてのｐＭＰＣ７Ｆ４から単離して、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐ
30
ＭＰＫ３Ｒに挿入した。産生したプラスミド、ｐＭＰＣ７Ｋ３は、１４遺伝子［Ｃ７Ｌ−
Ｋ３Ｌ］が欠損している。
【０３６８】
選択可能なマーカーとしての使用のために、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
（Ｅｃｏｇｐｔ）をコードするＥ．ｃｏｌｉ遺伝子（プラットら、１９８３）を、ポック
スウイルスプロモーターの制御下で配した。昆虫ポックス４２ｋＤａタンパク質をコード
する遺伝子から直接上流の３１ｂｐプロモーター要素は、感染後の初期に組換えワクシニ
アウイルスの強力な真プロモーターとして機能できる。３１ｂｐ ＥＰＶ４２ｋＤａプロ
モーターを含有するアニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ３６９／３７０（配
列認識番号１３５／配列認識番号１３６）
40
【化７４】
を、ｐＢＳ−ＳＫバックグラウンドのＥｃｏｇｐｔ遺伝子ら上流に連結し、プラスミドｐ
50
(93)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ＭＰ４２ＧＰＴを産生した。４２ｋＤａプロモーター／Ｅｃｏｇｐｔ遺伝子発現カセット
を含有するＳｍａＩ断片をｐＮＰ４２ＧＰＴから単離して、ｐＵＣ／ワクシニア接合部で
のＳｍａＩ部位のワクシニア欠損プラスミドｐＭＰＣ７Ｋ３に挿入した。産生したプラス
ミド、ｐＭＰＣ７Ｋ３ＧＰＴをｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）中にトランスフェクションした
。一過性優性選択システムにおける組換えの中間産生物の選択に関して培養培地にミコフ
ェノール酸を用いた（フォークナーら、１９９０）。選択的な圧力の除去後に、Ｋ２Ｌ ＤＮＡ配列の損失したプラークハイブリダイゼーションとＫ４Ｌの保持により、後代ウイ
ルスをスクリーニングした。欠損接合部の適合度をＰＣＲおよびＤＮＡ制限および配列分
析により確認した。組換えワクシニアウイルスｖＰ９５４（ＮＹＶＡＣ．１．）は、［Ｃ
７Ｌ−Ｋ３Ｌ］欠損、並びにＮＹＶＡＣに存在する他の欠損（ＴＫ、ＨＡ、ＡＴＩ、Ｉ４
10
Ｌ、［Ｂ１３−Ｂ１４］）も含有する。
【０３６９】
ＮＹＶＡＣ．２．
ＮＹＶＡＣに存在する［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠損を、３８のＯＲＦ、［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］
の合計を含有するように両方向に拡張した。これは以前にワクシニア欠損変異体ｖＰ７９
６に報告した同一の欠損である（パーカスら、１９９１）。拡張した欠損領域で除去した
著しいＯＲＦは、ＮＹＶＡＣ欠損の左側に位置するワクシニア増殖因子（ＶＧＦ；Ｃ１１
Ｒ）を含有する。ＶＧＦの２つのコピーを含有するワクシニアのＷＲ菌株と対称的に、Ｃ
１１Ｒは、ワクシニアのコペンハーゲン菌株中のＶＧＦをコードする唯一のＯＲＦである
。ＷＲからのワクシニア増殖因子の両方のコピーの欠損は、家ウサギの皮内接種で皮膚の
20
外傷の酷さを除去し、マウスのウイルスの神経毒性を減少することが示されている（バラ
ーら、１９８８）。［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］欠損における右側のＯＲＦ、Ｆ４Ｌは、リボヌ
クレオチドレダクターゼの小さなサブユニットの遺伝子をコードする（スラボーら、１９
８８）。この欠損にはＯＲＦ Ｆ２Ｌが含まれ、これは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｄＵＴＰａｓｅ
、ヌクレオチド配列に必要な別の酵素に対する相同性を示す（ゲーベルら、１９９０ａ、
ｂ）。Ｆ２Ｌはまたレトロウイルスプロテアーゼに対する相同性を示す（スラボーら、１
９８９）。
【０３７０】
Ｃ２３ＬからＦ４Ｌの欠損したプラスミドｐＭＰＴＲＦ４ＧＰＴの構築
ワクシニア欠損変異体ｖＰ７９６の産生に中間体として使用したプラスミドｐＭＰＬＥＮ
30
ＤΔ（パーカスら、１９９１）を、ｐＵＣ／ワクシニア接合部でＥＰＶ４２ｋＤａプロモ
ーター／Ｅｃｏｇｐｔ遺伝子を含有するＳｍａＩ発現カセットを添加することにより改変
した。産生したプラスミド、ｐＭＰＴＲＦ４ＧＰＴをＮＹＶＡＣ中にトランスフェクショ
ンした。ＭＰＡを用いた選択後に、Ｆ４Ｌ ＤＮＡ配列の損失のためのプラークハイブリ
ダイゼーションとＦ５Ｌの保持によりスクリーニングした。ＰＣＲおよびＤＮＡ制限分析
により、欠損接合部の適合度を確認した。組換えウイルスｖＰ９３８（ＮＹＶＡＣ．２．
）は、［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］欠損並びにＮＹＶＡＣ中に存在する他の欠損を含有する。
【０３７１】
ＯＲＦ Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒの欠損
ＮＹＶＡＣ中に存在するｕ欠損［Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ］を、右側の全てのＯＲＦ、１７の
40
ＯＲＦ［Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］の合計を含有するように拡張せしめた。これは、以前に報
告したワクシニア欠損変異体ｖＰ７５９中の同一の欠損である（パーカスら、１９９１）
。拡張欠損領域は、その産生物が互いに２０％のアミノ酸同一性を示す２つの遺伝子を含
有する（スミスら、１９９１）。これらの遺伝子産生物をコードするＯＲＦは、コペンハ
ーゲンのＢ１６ＲとＢ１９Ｒを示し（ゲーベルら、１９９０ａ、ｂ）、これらはそれぞれ
ＷＲ菌株中のＯＲＦ Ｂ１５ＲとＢ１８Ｒに対応する（スミスら、１９９１）。両方の遺
伝子産生物が典型的なシグナル配列を含有するワクシニアのＷＲ菌株とは違って、コペン
ハーゲンＯＲＦ Ｂ１６の予期した翻訳産生物をアミノ末端で切断されている。Ｂ１９Ｒ
は、感染後初期に発現されたワクシニア表面タンパク質（Ｓ抗原）をコードした（ウエダ
ら、１９９０）。Ｂ１６ＲとＢ１９Ｒの両者は、免疫グロブリン上科、特にＩＬ−１受容
50
(94)
JP 3602844 B2 2004.12.15
体に対する相同性を示す。ワクシニア遺伝子産生物の１つまたは両方は、ワクシニアが、
シトキン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）を結合せしめ、それゆえ宿主炎症応答を減少せしめるこ
とにより免疫システムを避けるのを助けることが示唆されている（スミスら、１９９１）
。
【０３７２】
Ｂ１３ＲからＢ２９Ｒの欠損したプラスミドｐＮＰＴＲＢ１３ＧＰＴの構築
ワクシニア欠損変異体ｖＰ７５９およびｖＰ８１１の産生に中間体として用いたプラスミ
ドｐＭＰＲＥＮＤΔ（パーカスら、１９９１）を、ｐＵＣ／ワクシニア接合部でＥＰＶ４
２ｋＤａプロモーター／Ｅｃｏｇｏｔ遺伝子を含有するＳｍａＩ発現カセットの添加によ
り改変した。産生したプラスミド、ｐＭＰＴＲＢ１３ＧＰＴをＮＹＶＡＣ中にトランスフ
10
ェクションした。ＭＰＡを用いた選択の後に、Ｂ１５ＤＮＡ配列の損失したプラークハイ
ブリダイゼーションとＢ１２の保持により、後代ウイルスをスクリーニングした。ＰＣＲ
とＤＮＡ制限分析により欠損接合部の適合度を確認した。組換えウイルスｖＰ９５３は、
［Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］欠損並びにＮＹＶＡＣ中に存在する他の欠損を含有する。
【０３７３】
左側［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］欠損と右側［Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］欠損の結合
ワクシニアウイルスの左側［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］と右側［Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］末端の両
方で欠損を含有する、真ワクシニア欠損変異体ｖＰ８１１の産生を記載した（パーカスら
、１９９１）。ｖＰ８１１は、ワクシニア宿主域遺伝子、Ｃ７Ｌおよび選択可能マーカー
Ｅｃｏｇｐｔの両者を含有する。ＮＹＶＡＣバックグラウンド中にＣ７ＬまたはＥｃｏｇ
20
ｐｔを有さない巨大末端欠損を含有するウイルスを産生するために、ｖＰ９５３による組
換えの供与体プラスミドとしてｐＭＰＴＲＦ４ＧＰＴを用いた。後代ウイルスは上述した
一過性優性選択システムにおいてＭＰＡにより選択され、Ｆ４Ｌ ＤＮＡ配列の損失した
プラークハイブリダイゼーションとＦ５Ｌの保持によりスクリーニングされている。組換
えウイルスｖＰ９７７は、［Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］および［Ｃ２３Ｒ−Ｆ４Ｌ］の欠損並
びにＮＹＡＶＣ中に存在する他の欠損を含有する。ｖＰ８１１のように、ｖＰ９７７は、
ワクシニア末端反復のコピーの両方からの全ての遺伝子が欠損している。
【０３７４】
実施例１８−宿主制限ポックスウイルスによるＨＩＶ遺伝子産生物の発現
この実施例は、ＨＩＶ−１遺伝子産生物を発現する宿主制限ポックスウイルスの産生を記
30
載するものである。使用したベクターはＮＹＶＡＣとＡＬＶＡＣである。
【０３７５】
細胞およびウイルス
ＮＹＶＡＣとＡＬＶＡＣウイルスベクターおよびそれらの誘導体を前述したように繁殖せ
しめた（ピッチーニら、１９８９；テイラーら、１９８８ａ、ｂ）。ベロ細胞と初代鶏胚
繊維芽細胞（ＣＥＦ）を前述したように増殖せしめた（テイラーら、１９８８ａ、ｂ）。
Ｐ８１５マウスの肥満細胞種（Ｈ−２
ｄ ）をＡＴＣＣ（＃ＴＩＢ６４）から得て、１０
％のウシ胎仔血清ＣＦＢＳおよび１００Ｉｕ／ｍｌペニシリンおよび１ｍｌ当たり１００
μｇのストレプトマイシンを補給したイーグルＭＥＭ中に保持した。
【０３７６】
40
マウス
メスＢＡＬＢ／ｃＪ（Ｈ−２
ｄ ）マウスをジャクソン研究所（ＭＥ、バーハーバー）か
ら購入し、不断給餌で保持した。全てのマウスは、生後６から１５週間のものを用いた。
【０３７７】
培地
免疫学的アッセイのアッセイ培地は、１０％のＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、２０ｍ
ＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホネート
）、５×１０
− ５
Ｍの２−メルカプトエタノール、１ｍｌ当たり１００ＩＵのペニシリン
、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ１６４０培地からな
るものであった。スチム（ｓｔｉｍ）は、４ｍＭのＬ−グルタミン、１０
− ４
Ｍの２−メ
50
(95)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ルカプトエタノール、１ｍｌ当たり１００ＩＵのペニシリン、および１ｍｌ当たり１００
μｇのストレプトマイシンを補給したイーグル最小必須培地からなる。
【０３７８】
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）エンベロープのエピトープおよびＶ３ループを含有するＡＬＶＡ
ＣおよびＮＹＶＡＣ組換え体
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）のＶ３ループを包含する１５０ｂｐ（アミノ酸２９９−３４４；
ジャブヘリアンら、１９８９）を、テンプレートとしてのｐＨＸＢ．２Ｄ（ＩＩＩ）を有
するオリゴヌクレオチドＨＩＶ３ＢＬ５（配列認識番号１３７）
【化７５】
10
およびＨＩＶ３ＢＬ３（配列認識番号１３８）
【化７６】
（ＭＤ．ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ、Ｄｒ．Ｒ．Ｃ．ガロにより供給された）を用いたＰ
ＣＲにより誘導した。オリゴヌクレオチドＨＩＶ８８Ａ（配列認識番号１３９）
【化７７】
20
およびＨＩＶ８８Ｂ（配列認識番号１４０）
【化７８】
をともにアニールして、ＨＩＶ−１エピトープ８８を含有する二本鎖断片を産生した（ア
ミノ酸９５−１０５、シャファーマンら、１９８９）。相補性配列の存在によるＰＣＲに
より、エピトープを含有する１５０ｂｐ Ｖ３含有ＰＣＲ断片および８８エピトープ配列
を含有する４２ｂｐ断片をともに融合せしめた。この反応はオリゴヌクレオチドＨＩＶ８
30
８Ｃ（配列認識番号１４１）（５′−ＡＧＴＡＡＴＧＴＧＡＣＡＧＡＡＡＡＴＴＴＴＡＡ
Ｃ−３′）およびＨＩＶ３ＢＬ３（配列認識番号１３８）を用いて行なった。１９２ｂｐ
ＰＣＲ誘導断片は、Ｖ３ループ配列の上流で融合したエピトープ８８配列を含有する。
終止コドン（ＴＡＡ）をオリゴヌクレオチドＨＩＶ３ＢＬ３Ｐに含有せしめ、読取り枠の
翻訳を終止し、開始コドンを翻訳の開始として機能するオリゴヌクレオチドＨＩＶ８８Ｃ
に含有せしめ、エピトープ８８／Ｖ３ループ融合タンパク質を発現した。加えて、オリゴ
ヌクレオチドＨＩＶ３ＢＬ３を、ＥｃｏＲＩ部位が１９２ｂｐ ＰＣＲ断片の３′末端に
存在するように合成した。テンプレートとしてプラスミド、ｐＡＭ１２とともに、オリゴ
ヌクレオチドＲＧ２７３（配列認識番号１４２）（５′−ＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡ
ＡＡＡＡＡＴＡＴＡＡＡＴＧＡＴＴＣ−３′）およびＲＧ２７４（配列認識番号１４３）
40
（５′−ＴＴＴＡＴＡＴＴＧＴＡＡＴＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＣ−３′）を用いたＰＣＲに
より、昆虫ポックスウイルス４２ｋＤａ（初期）プロモーターを産生した。４２ｋＤａプ
ロモーターを含有する１０８ｂｐ断片を、５′末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有するよう
に合成した。断片を含有する４２ｋＤａをキナーゼして、ＥｃｏＲＩで切断したエピトー
プ８８／Ｖ３断片とＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＲＷ８３１に連結する前に
ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。産生したプラスミドをｐＣ５ＨＩＶＬ８８と称した。このプ
ラスミドを、治療ウイルスとしてのＣＰｐｐとともに生体外組換えアッセイにおいてｖＣ
Ｐ９５を産生した。ＡＬＶＡＣ組換え体、ｖＣＰ９５は、ＣＰｐｐのｄｅ−ＯＲＦｅｄ Ｃ５座にエピトープ８８／Ｖ３ループを含有する。
【０３７９】
50
(96)
JP 3602844 B2 2004.12.15
プラスミドｐＣ５ＨＩＶＬ８８をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断して、叙述したエピ
トープ８８／Ｖ３発現カセットを含有する３００ｂｐ断片を離生した。この断片をＬＭＰ
−アガロースゲルから切除して、フェノール抽出（２×）とエーテル抽出（１×）により
単離した。２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断
片を用いて、単離した断片をブラントエンドした。断片をｐＳＤ５５０に連結し、ｐＳＤ
５４８からの誘導体（第６図）をＳｍａＩで切断してプラスミドｐＨＩＶＬ８８ＶＣを産
生した。このプラスミドを治療ウイルスとしてのｖＰ８６６とともに用いてｖＰ８７８を
産生した。ｖＰ８７８は、ＮＹＶＡＣのｄｅ−ＯＲＦｅｄ Ｉ４Ｌ座にエピトープ８８／
Ｖ３ループカセットを含有する。
【０３８０】
10
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）エンベロープ糖タンパク質を発現するＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡ
Ｃベースの組換え体
ワクシニアウイルスＨ６プロモーターに３′が隣接したＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）ｅｎｖ遺
伝子からなる発現カセット（グオら、１９８９；テイラーら、１９８８ａ、ｂ）を、ＡＬ
ＶＡＣおよびＮＹＶＡＣベクターによりＨＩＶ−１からｇｐ１６０の発現に関して操作し
た。オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列認識番号１４４）
【化７９】
およびＨＩＶ３Ｂ５（配列認識番号１４５）
20
【化８０】
を用いて１．４ｋｂ断片をｐＨＸＢ．２Ｄ（ＩＩＩ）（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ
、Ｄｒ．Ｒ．Ｃ．ガロにより供給された）から増幅せしめた。この断片は、ｅｎｖ遺伝子
の３′部分を含有する。これらのプライマーによるＰＣＲ増幅は、コード配列の後にワク
シニアウイルス初期転写終止Ｔ５ＮＴ配列モチーフを配し、アミノ酸配列を改変すること
なく位置６１４６から６１５２に位置したＴ５ＮＴモチーフ（ラトナー、１９８５）を除
去した。この変化（ＴからＣ）は、この位置にＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）を産生する。
この１．４ｋｂ断片をＥｃｏＲＩ（５′末端）とＸｂａＩ（３′末端）で切断し、Ｅｃｏ
30
ＲＩとＸｂａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に挿入した
。産生したプラスミドをｐＢＳＨＩＶＥＮＶ１、５と称した。この断片のヌクレオチド配
列分析により、配列は位置７８４８でのＴからＣの塩基転移を除いて完全に正確であるこ
とが示された。この塩基転移は以下のように正確であった：テンプレートとしてのｐＨＸ
Ｂ．２Ｄ（ＩＩＩ）とともにオリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列認識番号１４４）
【化８１】
およびＨＩＶ３Ｂ１７（配列認識番号１４６）
【化８２】
40
を用いてＰＣＲにより２５０ｂｐ断片を誘導した。この断片をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで
切断した。この断片を、ＧｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＢＳＨＩＶ３Ｂ１、５に挿
入し、それゆえ不正確なヌクレオチドノ領域と置換してプラスミドｐＢＳＨＩＶ３ＢＢＰ
を産生した。
【０３８１】
テンプレートとしてのｐＨＸＢ．２Ｄ（ＩＩＩ）とともにオリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ
９（配列認識番号１４７）
【化８３】
50
(97)
JP 3602844 B2 2004.12.15
およびＨＩＶ３Ｂ１０（配列認識番号１４８）
【化８４】
を用いたＰＣＲにより、ｅｎｖ遺伝子の５′部分を含有する１５０ｂｐ断片を誘導した。
オリゴヌクレオチドＶＶＨ６５Ｐ（配列認識番号１４９）
【化８５】
10
およびＶＶＨ６３Ｐ（配列認識番号１５０）
【化８６】
を用いたＰＣＲによりｐＣ３ＦＧＡＧからのワクシニアウイルスＨ６プロモーターを含有
する１２８ｂｐ断片を産生した。両方の断片をＫｐｎＩで切断し、これらの断片をＫｐｎ
Ｉで切断したｐＢＳ−ＳＫに挿入する前に、１５０ｂｐ断片をキナーゼした。産生したプ
ラスミドをｐＢＳＨ６ＨＩＶ３Ｂ５Ｐと称した。
【０３８２】
20
オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ２（配列認識番号１５１）
【化８７】
およびＨＩＶ３Ｂ７（配列認識番号１５２）
【化８８】
を用いたＰＣＲにより、ｐＨＸＢ．２Ｄ（ＩＩＩ）からの６００ｂｐ断片を産生した。こ
の断片をＥｃｏＲＩで切断し、キナーゼした。同一のテンプレートであるが、オリゴヌク
30
レオチドＨＩＶ３Ｂ６（配列認識番号１５３）
【化８９】
およびＨＩＶ３Ｂ８（配列認識番号１５４）
【化９０】
を用いたＰＣＲにより、５００ｂｐ断片を誘導した。この断片をＫｐｎＩで切断した。こ
れらの断片は、ヌクレオチド５８７８から６３６８にともに対応するものである（ラトナ
40
ーら、１９８５）。これらのプライマーによりこれらの断片の操作はまた、アミノ酸配列
を改変することなく、ヌクレオチド６３３２から６３２８に位置するＴ５ＮＴ配列を除去
する。これらの２つの断片をＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＢＳＨＩＶ３Ｂ３Ｐに挿
入した。このプラスミドをｐＢＳＨＩＶ３ＢＰ２７６８と称した。
【０３８３】
プラスミドｐＢＳＨ６ＨＩＶ３Ｂ５ＰをＫｐｎＩで切断し、ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子の
５′部分（１５０ｂｐ）およびＨ６プロモーターを含有する３６０ｂｐ断片を離生した。
このＫｐｎＩ断片をＫｐｎＩで切断したｐＢＳＨＩＶ３ＢＰ２７６８に連結し、プラスミ
ドｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＡＩＩを産生した。ＸｂａＩの切断と続いての部分的なＫｐｎＩの
切断により２．８ｋｂ断片をｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＡＩＩから誘導した。この断片をブラン
50
(98)
JP 3602844 B2 2004.12.15
トエンドし、ＳｍａＩで切断したｐＳＤ５５０に挿入した。プラスミドｐＩ４ＬＨ４ＨＩ
Ｖ３Ｂを産生し、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６とともに生体外組換え実験に用いた。
これにより、ＮＹＶＡＣゲノムのＩ４Ｌ座にＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子を含有するｖＰ９
１１が産生せしめられた。
【０３８４】
ＨＩＶ−１ ｅｖｎ遺伝子をＡＬＶＡＣベクターに挿入するために、ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥ
ＡＩＩをＮｒｕＩとＸｂａＩで切断した。２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ Ｄ
ＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で誘導した２．７ｋｂ断片をブラントエンドした。この
断片は、ワクシニアＨ６プロモーターの３′末端側の２１ｂｐ（ＮｒｕＩ部位に対して）
に３′が隣接した全縁ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子を含有する。ｐＲＷ８３８のＮｒｕＩと
10
ＥｃｏＲＩによる切断と続いてのクレノウによるブラントエンドにより誘導した３．１ｋ
ｂ断片に、この断片を連結した。ｐＲＷ８３８誘導断片は、カナリヤポックスから誘導し
た相同アームを含有し、異種遺伝子をＣ５座に向ける。この断片はまた、Ｈ６プロモータ
ーの５′末端側の１００ｂｐを含有する。それゆえ、これらの断片の連結により、ＨＩＶ
−１ ｅｎｖ遺伝子の発現カセットを含有する挿入プラスミドが産生され、これをｐＣ５
ＨＩＶ３ＢＥと称した。治療ウイルスとしてとＡＬＶＡＣによる生体外組換え実験にこの
プラスミドを用いてｖＣＰ１１２を産生した。
【０３８５】
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）ｇｐ１２０を発現するＮＹＶＡＣベースの組換え体
プラスミドｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＡＩＩをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断し、４．３ｋｂ断片
20
を離生した。この断片は、ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子に連結したワクシニアウイルスＨ６
プロモーターからヌクレオチド６９４６を含有する（ラトナーら、１９８５）。４．３ｋ
ｂ断片を、ｇｐ１２０コード配列の３′部分に対応する３００ｂｐのＥｃｏＲＩ／Ｘｂａ
Ｉ切断ＰＣＲ誘導断片に連結した。テンプレートとしてのｐＨＸＢ．２Ｄとともにオリゴ
ヌクレオチドＨＩＶ１−１２０Ａ（配列認識番号１５５）
【化９１】
30
およびＨＩＶ１−１２０Ｂ（配列認識番号１５６）
【化９２】
を用いて３００ｂｐ ＰＣＲ断片を誘導した。４．３ｋｂ ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ断片と
３００ｂｐ ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ断片の連結により、プラスミドｐＢＳＨＩＶＢ１２０
を産生した。
【０３８６】
最初にプラスミドをＸｂａＩで線状化して続いて部分的にＫｐｎＩ切断により１．６ｋｂ
のＫｐｎＩ／ＸｂａＩ断片をｐＢＳＨＩＶＢ１２０から誘導した。２ｍＭのｄＮＴＰの存
40
在下でＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片による処理でブラントエンドし
た。この断片をＳｍａＩで切断したｐＳＤ５４ＩＶＣに挿入し、ｐＡＴＩＨＩＶＢ１２０
を産生した。このプラスミドを生体外組換え実験に用いてｖＰ９２１を産生した。この組
換え体は、ＮＹＶＡＣのＡＴＩ座においてｇｐ１２０をコードするＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺
伝子の部分を含有する。
【０３８７】
免疫沈降
ｖＰ９１１、ｖＰ９２１およびｖＣＰ１１２により発現されたＨＩＶ−１遺伝子産生物の
真正を決定するために、免疫沈降分析を行なった。ベロ細胞単層を、１０ＰＦＵ／細胞の
ｍ．ｏ．ｉ．で、疑似感染、親ウイルスｖＰ８６６、または組換えウイルスに感染せしめ
50
(99)
JP 3602844 B2 2004.12.15
た。１時間の吸着期間後、接種物を吸引して、細胞に２ｍｌのＭＥＭ（２％のＦＢＳおよ
び［
３ ５
Ｓ］−メチオニン（２０ｕＣｉ／ｍｌ）を含有するマイナスメチオニン）を添加
した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス ｐＨ７．４、１５
０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ Ａｚｉｄｅ、および０．６ｍ
ｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）を添加して続いて細胞単層を書き取ることにより、感染から１８時
間後に細胞を収集した。
【０３８８】
感染細胞から誘導した溶解産物を、ＨＩＶ−１血清陽性個体（ＭＤ、ＮＣＩ−ＮＩＨ、Ｄ
ｒ．ゲノベファフランチーニから得た）から採取した血清を用いてＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺
伝子発現に関して分析した。この血清をｖＰ感染ベロ細胞で前に吸着せしめた。前に吸着
10
せしめたヒトの血清を４℃の１晩のインキュベーションによりタンパク質Ａプロテアーゼ
に結合せしめた。ある場合には、ｇｐ１２０に特異的な単クローン性抗血清（デュポン）
を第１血清として用い、第２抗体としてラット抗マウスを用いた。このインキュベーショ
ン期間の後に、物質を１×の緩衝液Ａで４回洗浄した。次いでタンパク質Ａセファロース
に結合した血清陽性の個体からのヒトの血清とともに、通常のヒト血清とタンパク質Ａセ
ファロースにより前に浄化した溶解産物を４℃でインキュベーションした。１晩のインキ
ュベーション期間の後に、試料を、１×緩衝液Ａと２×ＬｉＣｌ２ ／尿素緩衝液で４回
洗浄した。２×のラエムリス緩衝液（１２５ｍＭのとリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ
、２０％のグリセロール；１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間沸騰せ
しめることにより、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。タンパク質を１０％
20
のドリファスゲルシステム（ドリファスら、１９８４）で分画し、固定し、蛍光光度法の
ために１ＭのＮａ−サリチル酸
塩で処理した。
【０３８９】
ＨＩＶ−１血清陽性個体から採取した血清を用いた免疫沈降の結果により、ｖＰ９１１巻
戦災房溶解産物からのｇｐ１６０エンベロープ糖タンパク質のｇｐ１２０およびｇｐ４１
熟成形状の特異的な沈殿が示された。親（ＮＹＶＡＣ；ｖＰ８６６）感染細胞溶解産物に
はそのような特異的遺伝子産物を検出されなかった。ｇｐ１２０の特異的沈殿はまたｖＰ
９２１感染細胞溶解産物にも見られた。
【０３９０】
30
同一の血清による免疫沈降分析により、それぞれｖＰ９１１およびｖＰ９２１により発現
されたｇｐ１６０およびｇｐ１２０種は、感染細胞の表面に存在したことが示された。
【０３９１】
免疫沈降を、ｖＣＰ１１２感染細胞に関しても行なった。ＡＬＶＡＣ親ウイルスに感染し
た細胞および未感染細胞からのｇｐ１２０細胞外部分に対して向けられた単クローン性抗
体に関しては、ＨＩＶ−特異的ポリペプチドは沈殿しなかった。しかしながら、２つのＨ
ＩＶ特異的ポリペプチド種は、ｖＣＰ１１２感染細胞からは沈殿した。これらの種は、そ
れぞれ前駆体ｅｎｖ遺伝子産生物および熟成細胞外形状に対応する１６０ｋＤａおよび１
２０ｋＤａの明確な移動度で移動した。
【０３９２】
40
接種
外側の尾の静脈により、０．１ｍｌの食塩加リン酸緩衝液中５×１０
７ プラーク形成単
位（ＰＦＵ）をマウスに静脈接種せしめた。
【０３９３】
脾臓細胞調製
頸部の脱臼による安楽死の後に、ハンクス平衡塩溶液を含有する無菌のプラスチックバッ
グに、マウスの脾臓を移した。単一の実験群からの個々の脾臓または採取した脾臓を、ス
トマッチャーブレンダー中での１分間のサイクルにより１つの細胞懸濁液に処理した。脾
臓細胞懸濁液を、アッセイ培地またはスチム培地のいずれかで適切に数回洗浄した。血球
計算盤および顕微鏡を用いて、トリパンブルー染料排除により、またはカトラーカウンタ
50
(100)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ーの使用により脾臓細胞を枚挙した。
【０３９４】
血清
マウスにエーテルで軽く麻酔をかけ、血液をレトロオービタル集網から採取した。実験群
からなるマウスからの血液を採取し、凝固せしめた。血清を採取し、使用まで−７０℃で
貯蔵した。
【０３９５】
二次細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の産生のための生体外刺激
様々な実験群（応答細胞）から採取した脾臓細胞をスチム培地中で５×１０
６ 細胞／ｍ
ｌまで希釈した。同系の未経験のマウス（スティミュレーター）からの脾臓細胞を、１ｍ
ｌ当たり１×１０
７ 10
まで希釈して、細胞当たり２５ｐｆｕのｍ．ｏ．ｉ．で適切なワク
シニアウイルスにより３７℃で２％のＦＢＳを含有する組織培養培地中において１時間、
感染せしめた。感染後、スティミュレーター細胞をスチム培地中で数回洗浄し、スチム培
地により１ｍｌ当たり１×１０
６ と５ｍｌの反応細胞を、２５ｃｍ
細胞まで希釈した。５ｍｌのスティミュレーター細胞
３ の組織培養フラスコに加え、５％のＣＯ２ 中で３
７℃、直立して５日間インキュベーションした。アッセイの日に、脾臓細胞をアッセイ培
地中で数回洗浄し、顕微鏡を使用したトリパンブルーの血球計算盤で数えた。
【０３９６】
標的細胞の調製
ワクシニア特異的ＣＴＬ活性に関して、組織培養細胞を、３７℃で１時間に細胞当たり２
20
５ｐｆｕのｍ．ｏ．ｉ．での２％のＦＢＳを含有する組織培養培地中に１ｍｌ当たり１×
１０
７ 細胞でのインキュベーションにより一晩感染せしめる。インキュベーション後、
細胞を、１０％のＦＢＳを含有する組織培養培地により１ｍｌ当たり１−２×１０
６ 細
胞の間に希釈し、使用するまでさらに５％のＣＯ２ 中でインキュベーションした。ＨＩ
Ｖ特異的ＣＴＬ活性に関して、組織培養細胞を、それぞれＨＩＶ−１単離体ＩＩＩＢ 、
ＳＦ２、およびＭＮのｇｐ１２０のＶ３ループ領域に対応する２０μｇ／ｍｌのペプチド
ＨＢＸ２（ＭＡ、ケンブリッジ、アメリカンバイオテクノロジーズ）、ＳＦ２（ＭＡ、ケ
ンブリッジ、アメリカンバイオテクノロジーズ）、またはＭＮ（ＭＡ、ケンブリッジ、ア
メリカンバイオテクノロジーズ）で一晩インキュベーションした。アッセイの日に、アッ
セイ培地中での遠心分離により標的を数回洗浄した。最後の洗浄後、約１００μＣｉのＮ
ａ２ ５ １
ＣｒＯ４ （
５ １
30
Ｃｒ）中で再懸濁せしめた。３７℃での１時間のシンキュベ
ーション後、遠心分離によりアッセイ培地中で少なくとも３回洗浄し、血球計算盤上で計
測し、アッセイ培地中で１×１０
５ ／ｍｌに希釈した。
【０３９７】
細胞傷害性アッセイ
一次ＣＴＬアッセイに関して、新鮮に調製した脾臓細胞を１ｍｌ当たり１×１０
７ 細胞
までアッセイ培地で希釈した。二次ＣＴＬアッセイに関して（生体内接種または生体外刺
激のいずれかの後の）、脾臓細胞をアッセイ培地中で２×１０
６ ／ｍｌまで希釈した。
０．１ｍｌの脾臓細胞懸濁液を、９６ウェル（ｗｅｌｌ）の丸底マイクロタイタ板（ＥＸ
Ｐ）のウェル中で
５ １
Ｃｒ標識標的細胞に加えた。ほとんどの場合、第１のＣＴＬ活性に
40
関してアッセイされる脾臓細胞は、標的細胞の添加の前に、マイクロタイタ板のウェル中
でさらに２倍に希釈した。
５ １
Ｃｒ（ＳＲ）の自発的放出の測定の場合、標的細胞をアッ
セイ培地のみでインキュベーションした。
５ １
Ｃｒ（ＭＡＸ）の最大放出を測定するため
に、アッセイの初めに、０．１ｍｌの１０％ナトリウムドデシル硫酸塩を適切なウェルに
加えることにより、標的細胞を慎重に溶解せしめた。アッセイを開始するために、マイク
ロタイタ板を２分間２００×ｇで遠心分離し、５％のＣＯ２ 中、３７℃で４、５時間イ
ンキュベーションした。インキュベーション後、各ウェルの培養上澄みを、スカトロン上
澄み採取システムを用いて採取した。ベックマン５５００Ｂガンマカウンターにより放出
した
５ １
Ｃｒを測定した。特異的細胞傷害性のパーセントは、以下の式によるカウントか
ら決定した：
50
(101)
JP 3602844 B2 2004.12.15
細胞傷害性％＝（ＥＸＰ−ＳＲ）／（ＭＡＸ−ＳＲ）×１００
単クローン性抗ＣＤ４と単クローン性抗ＣＤ８を用いたＴヘルパー細胞と細胞傷害性Ｔリ
ンパ球の欠損
抗ＣＤ４（単クローン性抗体１７２．４）の１：５の希釈物または抗ＣＤ８（単クローン
性抗体抗Ｌｙｔ２．２）の１：２００の希釈物およびセダーレインロー−トックス家ウサ
ギ補体の１：１６の希釈物を含有する細胞傷害性培地（０．２％のＢＳＡおよび５ｍＭの
ＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ１６４０）中で１０
７ ／ｍｌの密度に脾臓細胞懸濁液を
希釈した。単一成分の適切な対照（補体、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８）を含有した。
【０３９８】
抗ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０ ＥＬＩＳＡ
10
ＥＬＩＳＡ板のウェル（イムロンＩＩ）を、炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６中で１００ｎｇの
精製ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０（ＮＣ、ダーハム、デューク大学、Ｄｒ．Ｄ．ボログネシー
により提供された）により４℃で一晩被膜した。次いでその板を、０．０５％トイーン２
０を含有する食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳＴ）により洗浄した。次いでその板を、１％の
子牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳＴで３７℃で２時間ブロックした。ＰＢ
ＳＴによる洗浄後、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴ（希釈緩衝液）で血清を最初に
１：２０に希釈した。ＥＬＩＳＡ板のウェル中で血清をさらに２倍に希釈した。板を３７
℃で２時間インキュベーションし、ＰＢＳＴで洗浄した。ウサギ抗マウスムノグロブリン
（ＤＡＫＯ）に接合したホースラディッシュペルオキシダーゼを、希釈緩衝液出１：２０
００に希釈史、ＥＬＳＡ板のウェルに加え、３７℃で１時間シンキュベーションした。Ｐ
20
ＢＳＴでの洗浄後、基質緩衝液中のＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド
）を加え、約２０分間周囲温度で色を呈させた。２．５ＭのＨ２ ＳＯ４ の添加により
、反応を終わらせた。バイオテックＥＬ−３０９ＥＬＩＳＡリーダーで４９０ｎｍでの吸
収を測定した。血清の終端は、１．０の吸収値を与えた希釈の逆数として定義した。
【０３９９】
リンパ球増殖反応測定
各マウスからの脾臓細胞の単一の細胞懸濁液をアッセイ培地で２×１０
６ ／ｍｌまで希
釈し、アッセイ培地のみ、１、５、または１０μｇのＨＩＶ−１ペプチドＴ１、１、５、
または１０μｇのＨＩＶ−１ペプチドＴ２、および１、または１０μｇの精製ＨＩＶ−１
ｇｐ１６０（イムノ）を含有する９６ウェル、平底マイクロタイタ板のウェルに加えた
30
。細胞を５％のＣＯ２ 中、３７℃で５日間インキュベーションした。最終の６時間のイ
ンキュベーションのために、１．０はμＣｉの［
３ Ｈ］−チミジンまを各ウェルに加え
、ケンブリッジＰＨＤ細胞収集器を用いてベックマンレディーフィルターに収集した。フ
ィルターディスクを液体シンチレーションカウンター中でドライカウントした。
【０４００】
刺激指数＝ＣＰＭＥＸＰ ／ＣＰＭＭＥＤＩＵＭ
結果：ＨＩＶ ｇｐ１２０を発現する組換えワクシニアウイルスは、一次ＨＩＶ特異的細
胞傷害性Ｔリンパ球活性を誘発する
５×１０
７ ＰＦＵのワクシニアウイルス組換え体ｖＰ８７８、ｖＰ９１１、またはｖＰ
９２１、または、対照としてのＮＹＶＡＣベクターでのｉｖ投与の後に、ペプチドＨＢＸ
40
２で一晩インキュベーションした有性生殖Ｐ８１５細胞に対して、ＢＡＬＢ／ｃマウスの
脾臓ＣＴＬ活性を評価した（表２０）。ＨＩＶ ｇｐ１２０を発現するｖＰ９２１を投与
したマウスの脾臓において、適度であるが、著しい（Ｐ＜０．０５）の一次ＣＴＬ活性が
産生された。どの法の組換えワクシニアウイルスまたはＮＹＶＡＣ親ベクターも、一次Ｈ
ＩＶ特異的ＣＴＬ活性を誘発できなかった。これは、一次ワクシニア特異的ＣＴＬ活性に
応答したワクシニアウイルスをマウスの各群に投与したときの不適切な感染のためではな
かった。対照である、免疫しなかったマウスも標的には応答しなかった。
【０４０１】
ＨＩＶ ｅｎｖペプチドを発現する組換えポックスウイルスは、ＨＩＶ特異的記憶細胞傷
害性Ｔリンパ球を産生する
50
(102)
JP 3602844 B2 2004.12.15
組換えワクシニアウイルスの１つを１回接種してから少なくとも１か月後、マウス脾臓細
胞を、ＮＹＶＡＣまたは各ＨＩＶ組換えワクシニアウイルスに事前に感染した有性生殖未
経験脾臓細胞で生体外刺激した（表２１）。ｖＰ８７８、ｖＰ９１１、またはｖＰ９２１
で免疫したマウスの脾臓細胞培養においてのみ強いＨＩＶ特異的ＣＴＬ活性検出され、こ
の培養細胞は、同一のワクシニアウイルスＨＩＶ組換え体（ｖＰ８７８、ｖＰ９１１、ま
たはｖＰ９２１）のうちの１つに感染した細胞で生体外で再刺激された。ＨＩＶ ｇｐ１
２０またはｇｐ１６０を発現するワクシニアウイルス組換え体は、８８エピトープに融合
されるＶ３ループのみを発現するワクシニアウイルス組換え体よりも良好に記憶ＣＴＬを
産生できた。ＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬ活性は、免疫しなかった対照またはＮＹＶＡＣ免疫
脾臓細胞からは誘発できなかった。使用したいかなるワクシニアウイルスに感染した脾臓
10
細胞での生体外刺激の後に明確であったので、ワクシニア特異的記憶ＣＴＬ活性がベクタ
ー免疫したマウスにはないことは乏しい免疫のためではなかった。
【０４０２】
同様の研究において、８８エピトープ（ｖＣＰ９５）に融合されるＶ３ループ領域を発現
するカナリヤポックス組換え体のＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬを産生する能力を試験した（表
２２）。１０
８ ＰＦＵのｖＣＰ９５またはＡＬＶＡＣベクターの１回の接種から３週間
後、ＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬ応答、ＣＰｐｐを、組換えワクシニアウイルスアナログ、ｖ
Ｐ８７８により誘発された応答と比較した。ワクシニアおよびカナリヤポックスＣＴＬ応
答は、適切な免疫の対照として含んだ。ｖＰ８７８およびｖＣＰ９５面液化マウスからの
脾臓細胞のみが、ｖＰ８７８により刺激されたＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬ活性を示した。機
20
能的な細胞溶解性ＣＴＬに対して、存在する記憶ＣＴＬを刺激するｖＣＰ９５の不能は、
ワクシニアウイルス組換え体の使用に基づいて最大にせしめられた生体外条件に関連する
。いうまでもなく、ｖＣＰ９５は、免疫マウスの脾臓中に著しいＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬ
を産生することができた。
【０４０３】
生体外刺激細胞傷害性細胞の特徴付け
ＨＩＶペプチド瞬間標的細胞に対して細胞傷害性を介在する細胞が、ナチュラルキラー細
胞のようなＣＴＬに関連のない非特異的エフェクター細胞の個体群を表すことが考えられ
る。このことを試験するために、ｖＰ９２１で免疫し、ｖＰ９２１感染脾臓細胞で生体外
刺激したマウスの脾臓細胞は、Ｔヘルパーリンパ球（ＣＤ４）または細胞傷害性リンパ球
30
（ＣＤ８）のＴリンパ球結果表面抗原特性が枯渇しており、Ｖ３ループペプチド瞬間標的
細胞に対してアッセイした（表２３）。前述したように、ｖＰ９１１面液化したマウスの
みが、ｖＰ９２１感染有性生殖脾臓細胞で生体外刺激できる記憶ＨＩＶ特異的ＣＴＬ活性
を示した。補体調製（Ｃ′）および単クローン性抗ＣＤ４および抗ＣＤ８はある程度毒性
効果を示したが、ＣＤ８結果細胞（抗ＣＤ８＋Ｃ′）が枯渇した培養のみがＨＩＶ特異的
細胞傷害性エフェクター細胞が枯渇している。それゆえ、ＨＩＶペプチド瞬間標的細胞に
対する細胞介在細胞傷害性活性は、その細胞膜上に、ＭＨＣ科Ｉ制限ＣＴＬの特性である
、ＣＤ８抗原を有した。
【０４０４】
ＨＩＶ ｇｐ１２０のＶ３ループ領域のＣＴＬ抗原受容体認識の特異性
40
Ｔリンパ球抗原受容体は、エピトープ断片の主要アミノ酸配列における小さな改変に対し
て鋭敏に感度を有する。ＨＩＶ ｇｐ１２０のＶ３領域は、超可変性であり、免疫学的に
ＨＩＶ単離体の中でも異なる。この超可変性は、いくつかのアミノ酸の置換および添加に
ある。ＨＩＶワクシニアウイルス組換え体により産生された細胞傷害性細胞の特異性を試
験するために、ＨＩＶ単離体ＩＩＩＢ 、ＳＦ２、およびＭＮのＶ３ループ領域に対応す
るペプチドをパルスしたＰ８１５標的細胞の中でＣＴＬ活性に対する感受性を比較した。
ｖＰ９１１およびｖＰ９２１による免疫のみがＨＩＶ特異的一次ＣＴＬ活性を誘発した（
表２４）。さらに、ＨＩＶ特異的ＣＴＬ活性は、ＨＩＶ単離体ＩＩＩＢ のＶ３ループに
対応するペプチドでパルスしたＰ８１５標的細胞のみに限られた。ワクシニアウイルス組
換え体ｖＰ８７８７、ｖＰ９１１およびｖＰ９２１による免疫により誘発された生体外刺
50
(103)
JP 3602844 B2 2004.12.15
激したＨＩＶ特異的二次ＣＴＬ活性に関して同様の結果が得られた（表２５）。それゆえ
、ＨＩＶ単離体ＩＩＩＢ のｅｎｖ遺伝子の様々な部分を発現する組換えワクシニアウイ
ルスにより誘発されたＨＩＶ特異的ＣＴＬは、同一の抗原単離体から誘導された標的エピ
トープのみを認識する。
【０４０５】
ワクシニアウイルスＨＩＶ組換え体により免疫後のＨＩＶエピトープに対するリンパ球増
殖応答
抗原に対するリンパ球増殖は、細胞性免疫の生体外体件（ｃｏｒｒｅｌａｔｅ）である。
適切な抗原の提示は、抗原の受容体を発現する細胞の免疫個体群において細胞増殖を誘発
する。増殖の開始と継続には、溶性媒介物によるＴヘルパーリンパ球の介在が必要である
10
。ＨＩＶ抗原を発現する組換えワクシニアウイルスで免疫したマウス中のＨＩＶ抗原に対
する細胞性免疫を評価するために、２７日前に免疫したマウスからの脾臓細胞を、Ｔ１ およびＴ２ と称するＴヘルパーリンパ球エピトープに関連するペプチド、並びに精製Ｈ
ＩＶ ｇｐ１６０で５日間インキュベーションした（表２６）。脾臓細胞培養では、Ｔヘ
ルパー細胞エピトープＴ１ およびＴ２ に対する増殖応答は観察されなかった。しかし
ながら、ｖＰ９２１で事前に免疫したマウスの脾臓細胞は、［
３ Ｈ］−チミジンの包含
により測定されるように、ＨＩＶ ｇｐ１６０に活発に応答した。２．０より大きな刺激
指数（ＳＩ）は免疫性を示すと考えられる。それゆえ、ｖＰ９２１によるマウスの接種は
、ＨＩＶ ｇｐ１６０に対する細胞性免疫を誘発した。
【０４０６】
20
ワクシニアウイルスＨＩＶ組換え体を接種したマウスの抗体応答
ＨＩＶに対する液性免疫応答を評価するために、マウスを０日にワクシニアウイルスＨＩ
Ｖ組換え体の１つで免疫し、第５週に２回目の免疫を行なった。マウスを最初の免疫から
９週間に亘り様々な間隔で採血した。各処理群から採取した血清を、抗原として精製ｇｐ
１６０を用いたＥＬＩＳＡによりＨＩＶに対する抗体についてアッセイした（表２７）。
一次抗体応答は、一般的に適度であったが、ｖＰ９１１により誘発された最高水準は、検
出可能であった。二次免疫後に、ｖＰ９１１およびｖＰ９２１で免疫したマウスの抗体力
価は増大し、第９週にやや減少するまで、それぞれ４，６００と３，２００を越えた力価
で第７週にピークとなった。それゆえ、２つのワクシニアウイルスＨＩＶ組換え体、ｖＰ
９１１およびｖＰ９２１は、著しい抗体応答を誘発することができた。
【０４０７】
【表２０】
30
(104)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表２１】
30
(105)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
【表２２】
40
(106)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
【表２３】
50
(107)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表２４】
30
(108)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表２５】
30
(109)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
【表２６】
40
(110)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表２７】
30
(111)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
実施例１９−ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ中のＨＩＶ−１（ＡＲＶ−２ま
たはＳＦ−２菌株）ｅｎｖ遺伝子の発現
プラスミドの構築
全縁ＨＩＶ−１（ＡＲＶ−２またはＳＦ−２菌株）ゲノムを含有するラムダクローンを、
Ｊ．レビーにより得て、これは前述したものである（サンチェス−ペスカドールら、１９
８５）。ｅｎｖ配列をｐＵＣ１３中にサブクローニングし、プラスミドｐＭＰ７ＭＸ３７
３を産生した。このプラスミドは、ｅｎｖ遺伝子産生物の開始コドン（ＡＴＧ）に対して
−１からｅｎｖ遺伝子の終止コドン（ＴＡＡ）の７１５ｂｐ下流までの配列を含有してい
40
る。これらのｅｎｖ配列をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩによる切断によりｐＭＰ７ＭＸ３
７３から切除し、プラスミドベクター、ｐＩＢＩ２５（ＣＴ、ニューハブン、インターナ
ショナルバイオテクノロジー社）に挿入し、プラスミドｐＩＢＩ２５ｅｎｖを産生した。
【０４０８】
組換え体プラスミドｐＯＢＯ２５ｅｎｖは、応答能のあるＥ．ｃｏｌｉ ＣＪ２３６（ｄ
ｕｔ
−
ｕｎｇ
−
）細胞を転換するのに用いた。一本鎖ＤＮＡを、転換Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ
Ｊ２３６細胞のヘルパーファージ、ＭＧ４０８による感染により誘導したファージから単
離した。この一本鎖テンプレートは、オリゴヌクレオチドＭＵＥＮＶＴ１２（配列認識番
号１５７）
【化９３】
50
(112)
JP 3602844 B2 2004.12.15
により生体外突然変異誘発反応（クンケルら、１９８５）に用いた。このオリゴヌクレオ
チドによる突然変異誘発により、ＴからＣ転移が行なわれ、ＡＲＶ−２ゲノムのヌクレオ
チド位置６９２９−６９３５でＴ５ＣＴモチーフを分断する（サンチェス−ペスカドール
ら、１９８５）。この突然変異は、ｅｎｖ遺伝子のアミノ酸配列を改変せず、突然変異誘
発したプラスミドクローンのスクリーニングに用いられるＥｃｏＲＩ部位を産生する。ジ
デオキシヌクレオチド鎖終止法により配列の確認を行なった（サンガーら、１９７７）。
産生した突然変異誘発プラスミドをｐＩＢＩ２５ｍｕｔｅｎｖ１１と称した。
【０４０９】
10
１．４５ｋｂのＢｇｌＩＩ断片をｐＩＢＩ２５ｍｕｔｅｎｖ１１から誘導した。この断片
は、突然変異したｅｎｖ配列を含有した。この断片をｐＩＢＩｅｎｖ中の対応未突然変異
断片を置換するのに用いた。産生したプラスミドをｐＩＢＩ２５ｍｕｔｅｎｖ８と称した
。さらに改変をｐＩＢＩ２５ｍｕｔｅｎｖ８に行なった。レックスタンパク質とＬＴＲ配
列（ＬＴＲ領域）をコードする配列を遺伝子の３′末端から除去し、アミノ酸５８３から
５９９の推定免疫抑制（ＩＳ）領域（配列認識番号１５８）
【化９４】
20
を欠損するために、生体外突然変異誘発を行なった（クラッセら、１９８８）。オリゴヌ
クレオチドＬＴＲ２（配列認識番号１５９）
【化９５】
およびＭＵＥＮＳＶＩＳＲ（配列認識番号１６０）
【化９６】
30
によりｐＩＢＩｍｕｔｅｎｖ８から誘導した単一標準テンプレートに関してこれらの反応
を行なった。ハイブリダイーションと制限分析により突然変異誘発したクローンを認識し
た。ＩＳ領域とＬＴＲ領域の両方が欠損し、またはＬＴＲが欠損するように突然変異誘発
せしめられたクローンをヌクレオチド配列により確認し、それぞれｐＩＢＩ２５ｍｕｔ３
ｅｎｖ４０およびｐＩＢＩ２５ｍｕｔ２ｅｎｖ２２と称した。
【０４１０】
全縁ｅｎｖ遺伝子を含有する３．４ｋｂのＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＩＢＩ２５
ｍｕｔ３ｅｎｖ４０とｐＩＢＩｍｕｔ２ｅｎｖ２２から誘導し、ｐＣＰＣＶ１に挿入し、
ＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。プラスミドｐＣＰＣＶ１は、ＣＰ組換え体の産生
を可能にする挿入プラスミドである。異種遺伝子は、Ｃ３挿入座に向いていた。プラスミ
40
ドｐＣＰＣＶ１とｐＦＰＣＶ２は、１９８９年４月２０日に発行されたＰＣＴ国際出願第
ＷＯ８９／０３４２９号に記載され、ここに参照文献として包含する。
【０４１１】
ＶＶＨ６プロモーターとｅｎｖ配列により正確なＡＴＧ：ＡＴＧ構造を構築するために、
マンデッキの方法（１９８６）による生体外突然変異誘発反応に、オリゴヌクレオチドＰ
ＲＯＶＥＣＮＳ（配列認識番号１６１）
【化９７】
を用いた。潜在的な変異体を、ＳｍａＩ部位の損失に関してスクリーニングした。Ｓｍａ
50
(113)
JP 3602844 B2 2004.12.15
Ｉ部位の欠如したプラスミドクローンを認識し、ヌクレオチド配列分析により確認した。
適切に突然変異誘発したプラスミドクローンを認識し、ｐＣＰｅｎｖＩＳ＋またはｐＣＶ
ｅｎｖＩＳ−およびｐＦＰｅｎｖＩＳ＋またはｐＦＰｅｎｖＩＳ−と称した。
【０４１２】
ＮｒｕＩとＨｉｎｄＩＩＩでの切断により、ＨＩＶ−１
ｅｎｖ遺伝子をｐＣＰｅｎｖＩＳ−から切除した。それぞれ２．５ｋｂ（ｅｎｖＩＳ＋）
および２．４ｋｂ（ｅｎｖＩＳ−）の２つのｅｎｖ断片を単離し、２ｍＭのｄＮＴＰの存
在下でＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片との反応によりブラントエンド
した。これらの断片を、ＮｒｕＩとＰｓｔＩによるｐＳＩＶｅｎｖＶＶの切断と続いての
２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片による
10
ブランティング工程により誘導した３．５ｋｂの断片に連結せしめた。プラスミドｐＳＩ
ＶｅｎｖＶＶは、ＡＴＩ挿入座のワクシニアウイルスＨ６プロモーターにより規制される
ＳＩＶ ｅｎｖ遺伝子発現カセットを含有する。ｐＳＩＶ ｅｎｖＶＶのＮｒｕＩとＰｓ
ｔＩによる切断は、全縁ＳＩＶ ｅｎｖコード配列とプロモーター要素の３′末端側の２
０ｂｐを切除する。ｅｎｖ ＩＳ−とｅｎｖ ＩＳ＋断片との連結により、Ｈ６プロモー
ターの２０ｂｐが保存され、ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子をＡＴＩ挿入プラスミドに挿入す
る。産生したプラスミドをそれぞれ、ｅｎｖ ＩＳ＋とｅｎｖ ＩＳ−に関してｐＡＴＲ
５ＶＶ＋とｐＡＲ６ＶＶと称した。
【０４１３】
生体外組換えと組換え体の精製
20
前述したように（ピッチーニら、１９８７）、ＣＰ（ＡＬＶＡＣ）とＦＰ（ＴＲＯＶＡＣ
）組換え体の両者のリン酸カルシウム沈殿により、プラスミドＤＮＡを感染細胞に導入す
ることにより組換えを行なった。それぞれ組換え体ｖＣＰ６１とｖＣＰ６０を産生するた
めにプラスミドｐＳＰｅｎｖＩＳ＋とｐＣＰｅｎｖＩＳ−（Ｃ５座、第１６図）を用いた
。それぞれ組換え体ｖＦＰ６３とｖＦＰ６２を産生するために、プラスミドｐＦＰｅｎｖ
ＩＳ＋とｐＦ＋ｅｎｖＩＳ−（Ｆ７座、第２２図）を用いた。治療としてｖＰ８６６（Ｎ
ＹＶＡＣ）により生体外組換え実験にプラスミドｐＡＲ５ＶＶ＋とｐＡＲ６ＶＶを用いて
、それぞれｖＰ９３９とｖＰ９４０を産生した。前述したように、
３ ２
Ｐ−標識したｅｎ
ｖ特異的プローブによるハイブリダイゼーション後のオートラジオグラフィーにより組換
えプラークを選択し、純度を確認するために連続して３回継代を行なった（ピッチーニら
30
、１９８７）。
【０４１４】
放射性免疫沈降分析
細胞単層に、１０ｐｆｕ／細胞を修飾イーグルメチオニン不含有培地（ＭＥＭｍｅｔ−）
で感染せしめた。感染から２時間後、２０ｕＣｉ／ｍｌの［
３ ５
Ｓ］−メチオニンを２％
の透析したウシ胎仔血清（フロー）を含有するＭＥＭ（−ｍｅｔ）中に加えた。それらを
溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８、１０ｍＭのトリス−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ７．４、０．２ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ、１％のＮＰ４０、０．０１％のＮａ Ａｚｉｄｅ）と５０μｌのアプロチニン中に再懸濁せしめ、エッペンドルフ管に集めるこ
とにより細胞を感染から１５時間後に収集し、溶解産物を４℃で２０分間回転せしめるこ
40
とにより精製した。６０ｍｍの直径のペトリディッシュの上澄み液の３分の１を、１μｌ
の通常のヒトの血清と１００μｌのタンパク質Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂ（ＳＰＡ）（
ファーマシア）とともに室温で２時間インキュベーションした。１分間の回転後、上澄み
液を、２μｌの、ＨＩＶ血清陽性の個体（熱不活性化した）からの前吸着したヒト血清と
１００μｌのＳＰＡとともに４℃で１時間と３０分間インキュベーションした。
【０４１５】
ペレットを、溶解緩衝液で４回、塩化リチウム／尿素緩衝液（０．２Ｍ ＬｉＣｌ、２Ｍ
尿素、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８）で２回洗浄し、沈殿したタンパク質を６０
μｌのセエムリ緩衝液中に溶解せしめた（ラエムリ、１９７０）。１００℃での５分間の
加熱と１分間の回転を行ないセファロースを除去した後、上澄み中のタンパク質をＳＤＳ
50
(114)
JP 3602844 B2 2004.12.15
１０％ポリアクリルアミドゲル上で再溶解せしめ、間接撮影を行なった。
【０４１６】
ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子の発現
ＡＲＶ−２またはＳＦ−２菌株のＨＩＶ ｅｎｖ遺伝子がワクシニア初期−晩期プロモー
ター、Ｈ６の下流に挿入された６つの異なる組換えウイルスを調製した。簡単にするため
に、２つのＡＬＶＡＣベースの組換えウイルス、ｖＣＰ６１およびｖＣＰ６０をＣＰＩＳ
＋およびＣＰＩＳ−と称し、２つのＴＲＯＶＡＣベースの組換え体、ｖＦＰ６３およびｖ
ＦＰ６２をＦＰＩＳ＋およびＦＰＩＳ−と称し、２つのＮＹＶＡＣベースの組換え体、ｖ
Ｐ９３９およびｖＰ９４０をＶＶ−とＶＶ＋と称した。
【０４１７】
10
ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子の開始コドンがワクシニアＨ６プロモーターのＡＴＧと重複し
ている点で、全ての構成が正確であった。さらに、３′から終止コドンまでの異種の遺伝
子情報は除去されていた。ｇｐ４１遺伝子産生物の５′部分の近くに位置したアミノ酸５
８３−５９９に対応する５１ｂｐ領域を欠損せしめることにより、ＣＰＩＳ−、ＦＰＩＳ
−、およびＶＶ−を得た。この領域は、他のレトロウイルス糖タンパク質の膜貫通ポリペ
プチド（チアンチオロ、１９８５；ルーグら、１９８９ａ、ｂ）に生じる推定の免疫抑制
領域（クラッセら、１９８８；ルーグら、１９８９ｂ）との相同性を有する。
【０４１８】
６つの組換えウイルスの発現分析は、ＣＥＦ、ベロ、およびＭＲＣ−５細胞単層中で行な
った。ＨＩＶ血清陽性の個体から採取した血清を用いた免疫沈降実験は、材料と方法に記
20
載したように行なった。６つの全ての組換え体は、ＨＩＶ−１ ｇｐ１６１エンベロープ
前駆体の合成を指示した。しかしながら、ｇｐ１６０からｇｐ１２０およびｇｐ４１への
処理の効果は、細胞の種類により異なり、また免疫抑制領域の欠損の影響を受けた。ＨＩ
Ｖ血清陽性個体から採取した血清によるｇｐ４１の認識はまた、ウイルスバックグラウン
ドと細胞の種類により変化した。
【０４１９】
実施例２０−ＮＹＶＡＣ中のＨＩＶ−２（ＩＳＳＹ菌株）ｅｎｖ遺伝子の発現
ｇｐ１６０の発現
オリゴヌクレオチドＨＩＶ２５ＰＡ（配列認識番号１６２）
【化９８】
30
およびＨＩＶ２５ＰＢ（配列認識番号１６３）
【化９９】
40
をアニールして、ＨＩＶ−２ ＳＢＬ／ＩＳＹ単離体（フランチーニら、１９８９）ｅｎ
ｖコード配列の最初の５４ｂｐを構築した。この断片は、テンプレートとしてｐＴＰ１５
を用いてオリゴヌクレオチドＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６４）
【化１００】
およびＨ６３ＰＨＩＶ２（配列認識番号１６５）
【化１０１】
50
(115)
JP 3602844 B2 2004.12.15
によるＰＣＲにより誘導した融合３′から１２９ｂｐ断片である。オリゴヌクレオチドＨ
ＩＶ２５ＰＣ（配列認識番号１６６）
【化１０２】
およびＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６４）を用いたＰＣＲによりこれら２つの断片の融合
を行なった。１７４ｂｐ ＰＣＲ誘導断片をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩとＳａｃＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに挿入した（ストラタジェネ、ラジョラ、Ｃ
Ａ）。産生したプラスミドをｐＢＳＨ６ＨＩＶ２と称した。挿入はヌクレオチド配列分析
により確認した。
10
【０４２０】
ＨＩＶ−２ ｅｎｖ遺伝子の３′部分をＰＣＲにより誘導した。この反応において、テン
プレートとしてｐＩＳＳＹ−ＫＰＮ（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ、Ｄｒ．ジェノベ
ファフランチーニにより提供された）を用いてオリゴヌクレオチドＨＩＶ２Ｂ１（配列認
識番号１６７）
【化１０３】
およびＨＩＶ２Ｂ２（配列認識番号１６８）
【化１０４】
20
に関して増幅した。この断片をＢａｍＨＩとＸｂａＩで切断した。この切断により誘導し
た１５０ｂｐ断片は、５′ＢａｍＨＩおよび３′ＸｂａＩ付着末端を含有した。ワクシニ
アウイルス初期転写終止シグナルとして認識されることが知られているＴ５ＮＴ配列モチ
ーフを、終止コドンの後に含有するようにこの断片を操作した。
【０４２１】
ＨＩＶ−２ ｅｎｖ遺伝子の大部分は、ＳａｃＩとＢａｍＨＩの切断によりｐＩＳＳＹ−
ＫＰＮから得た。この切断により産生された２．７ｋｂ断片を、遺伝子の３′末端に対応
する１５０ｂｐ ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ断片とともにＳａｃＩとＸｂａＩで切断したｐＢ
30
Ｓ−ＳＫに挿入した。産生したプラスミドをｐＢＳＨＩＶ２ＥＮＶと称した。
【０４２２】
ｐＢＳＨ６ＨＩＶ１からの１７４ｂｐ ＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片とｐＢＳＨＩＶ２
ＥＮＶからの２．５ｋｂ ＳｐｅＩ／ＸｂａＩ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで切断
したｐＢＳ−ＳＫに連結し、ｐＢＳＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶを産生した。ｐＢＳＨ６ＨＩＶ３
ＥＮＶからの２．７ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ挿入物を単離し、２ｍＭのｄＮＴＰ
の存在下でＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドした。こ
のブラントエンドした断片をＳｍａＩ切断ｐＳＤ５ＨＩＶＣ挿入ベクターに挿入した。産
生したプラスミドをｐＡＴＩＨＩＶ２ＥＮＶと称した。このプラスミドを、治療ウイルス
としてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実験に用いてｖＰ９２０を産生
40
した。
【０４２３】
免疫沈降分析を行なって、ｖＰ９２０が真正のＨＩＶ−２ ｇｐ１６０を発現するか否か
を確認した。ベロ細胞単層を、疑似感染か、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．で親ウイル
スｖＰ８６６に感染せしめるか、またはｖＰ９２０に感染せしめた。１時間の吸着期間後
、接種物を吸引し、その細胞に、２％のウシ胎仔血清と［
３ ５
Ｓ］−メチオニン（２０μ
Ｃｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（メチオニンのない）を添加した。１
ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリスｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮ
ａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰ
ＭＳＦ）の添加と続いての細胞単層のひきかきにより感染から１８時間後に細胞を収集し
50
(116)
JP 3602844 B2 2004.12.15
た。
【０４２４】
感染細胞からの溶解産物を、ＨＩＶ−２血清陽性個体（Ｄｒ．ジェノベッフェフランチー
ニから供給された）からの採取した血清を用いてＨＩＶ−２ ｅｎｖ遺伝子発現に関して
分析した。血清をｖＰ８６６感染ベロ細胞で前吸着した。前吸着したヒト血清を、４℃の
一晩のインキュベーションによりタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキ
ュベーション期間の後に、この物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通常ヒト血清
とタンパク質Ａセファロースで前浄化したした溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに
結合した血清陽性個体からのヒト血清と、４℃で一晩インキュベーションした。一晩のイ
ンキュベーション期間後、試料を１×緩衝液で４回と、ＬｉＣｌ２ ／尿素緩衝液で２回
10
洗浄した。２×のラエムリス緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ
、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰に
より沈殿タンパク質を免疫複合体から分離した。タンパク質を１０％のドリファスゲルシ
ステム（ドリファスら、１９８４）で分画し、固定して蛍光光度法のために１ＭのＮａ−
サリチル酸塩で処理した。
【０４２５】
ＨＩＶ−２血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＰ９２０感染細胞からのＨＩＶ−２ ｇｐ
１６０エンベロープ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめた。さらに、ｇｐ１６０ポリタン
パク質を熟成ｇｐ１２０およびｇｐ４１タンパク質種に処理されるので、発現ＨＩＶ−２
ｅｎｖ遺伝子産生物の真正が確認された。疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ親ウイルスに
20
感染した細胞からはＨＩＶ特異的タンパク質種は全く沈殿しなかった。また、ｖＰ９２０
によるＨＩＶ−２ ｅｎｖの適切な発現の平衡は、遺伝子産生物はｖＰ９２０感染細胞の
表面上に発現されるということである。
【０４２６】
ｇｐ１２０の発現
ＨＩＶ−２ ｅｎｖ遺伝子の５′末端に融合されたワクシニアウイルスＨ６プロモーター
を含有するプラスミドｐＢＳＨ６ＨＩＶ２を、ＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、これ
らの配列を含有する１８０ｂｐ断片を離生した。この断片をＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで
切断したｐＢＳ−ＳＫに、ｐＢＳＨＩＶ２１２０Ａの１．４ｋｂ ＳｐｅＩ／ＸｂａＩ断
片とともに連結し、ｐＳＨＩＶ２１２０Ｂを産生した。
30
【０４２７】
最初にｇｐ１２０コード配列の３′部分をＰＣＲにより誘導することにより、プラスミド
ｐＢＳＨＩＶ２１２０Ａを誘導した。ＰＣＲは、テンプレートとしてのｐＩＳＳＹ−ＫＰ
ＮとともにオリゴヌクレオチドＨＩＶ２１２０Ａ（配列認識番号１６９）
【化１０５】
およびＨＩＶ２１２０Ｂ（配列認識番号１７０）
【化１０６】
40
を用いて行なった。ＰＣＲ誘導断片をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断し、５′ＥｃｏＲＩ付
着末端と３′ＸｂａＩ付着末端を含有する３００ｂｐ断片を産生した。この断片を、翻訳
終止配列（ＴＡＡ）と５′からＸｂａＩ部位のＴ５ＮＴ配列モチーフについて操作した。
３００ｂｐのＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ ＰＣＲ断片を、ｐＩＳＳＹ−ＫＰＮから誘導された
１．４ｋｂのＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩ断片とともにＳａｃＩ／ＸｂａＩで切断したｐＢＳ−
ＳＫに連結した。
【０４２８】
プラスミドｐＢＳＨＩＶ２１２０ＢをＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで切断し、３′に隣接し
たＨＩＶ−２ ｇｐ１２０コード配列からワクシニアウイルスＨ６プロモーターを含有す
50
(117)
JP 3602844 B2 2004.12.15
る１．８ｋｂ断片を産生した。この断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片とブラントエンドした。ブラントエンドした断片をＳ
ｍａＩで切断したｐＳＤＳＨＩＶＣに連結し、ｐＡＴＩ ＨＩＶ２１２０を産生した。こ
のプラスミドを生体外組換え実験に用いてｖＰ９２２を産生した。
【０４２９】
ｖＰ９２２感染細胞の免疫沈降実験を、全縁ＨＩＶ−２ ｅｎｖ遺伝子の発現に関して上
述したように行なった。疑似感染細胞またはｖＰ８６６感染ベロ細胞からはＨＩＶ特異的
種は沈殿しなかった。しかしながら、１２０ｋＤａのタンパク質種が、ｖＰ９２２に感染
した細胞から誘導した溶解産物から沈殿した。ｖＰ９２２により発現されたＨＩＶ−２ ｇｐ１２０は、ｖＰ９２０感染ベロ細胞の細胞表面上に存在することが分かった。
10
【０４３０】
実施例２１−ＮＹＶＡＣ中のＳＩＶ遺伝子の発現
ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ ｇｐ１４０組換え体の産生
ＳＩＶ（Ｍａｃ１４２ ）ｅｎｖ遺伝子を含有するプラスミドｐＳＳＩＩＥをＤｒ．ジェ
ノバフランチーニ（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプラスミドをＨｉ
ｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで切断し、ＳＩＶ ｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド２２０から翻訳終
止コドンから１６０ｂｐ下流の領域を含有する２．２ｋｂの断片を離生した。この断片を
が有する発現カセットは、ｇｐ１６０の種よりもｇｐ１４０タンパク質種の発現となる。
膜貫通領域の４０％欠損は、ゲノムのヌクレオチド７，９３４での成熟前終止から生じる
（フランチーニら、１９８７）。ｅｎｖ遺伝子産生物のそのような成熟前終止は、培養中
20
のＳＩＶの繁殖後には観察されない（コダマら、１９８９）。
【０４３１】
テンプレートとしてのｐＳＳＩＩＥおよびオリゴヌクレオチドＳＩＶＥＮＶ１（配列認識
番号１７１）
【化１０７】
とＳＩＶＥＮＶ２（配列認識番号１７２）
【化１０８】
30
を用いたＰＣＲにより遺伝子のアミノ部分を誘導した。産生した２５０ｂｐ断片は、ワク
シニアウイルスＨ６プロモーターの３′側の２０ｂｐ（ＮｒｕＩ部位の３′末端）から下
流に隣接したＳＩＶ ｅｎｖ遺伝子の５′側の２３０ｐｂを含有する。ＳＩＶ ｅｎｖ遺
伝子配列の８０ｂｐを除去するＨｉｎｄＩＩＩの断片の切断により１７０ｂｐの断片を得
た。
【０４３２】
成熟前終止シグナルの後のＳＩＶ ｅｎｖ遺伝子の残りを含有する配列をＰＣＲによりｐ
ＳＳ３５Ｅ（Ｄｒ．ジェノベファフランチーニから得た）から誘導した。このプラスミド
は、ＳＩＶ ｅｎｖ遺伝子のＣ末端部分からｅｎｖ遺伝子から下流のＬＴＲ領域を含有す
る配列を含有している。３６０ｂｐ断片を誘導するのに用いたオリゴヌクレオチドは、Ｓ
ＩＶＥＮＶ３（配列認識番号１７３）
【化１０９】
とＳＩＶＥＮＶ４Ａ（配列認識番号１７４）
【化１１０】
40
(118)
JP 3602844 B2 2004.12.15
であった。この断片をＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで切断し、５′ＰｓｔＩ付着末端と３′Ｅｃ
ｏＲＩ付着末端を有する２６０ｂｐ断片を産生した。
【０４３３】
ｐＳＳＩＩＥからの２．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ断片、遺伝子の５′末端を含
有する１７０ｂｐのＮｒｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片および遺伝子の３′末端を含有する２
６０ｂｐ ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩを、ｐＲＷ８３８から誘導した３．１ｋｂのＮｒｕＩ／
10
ＥｃｏＲＩと連結した。ｐＲＷ８３８は、遺伝子のＣ５座への挿入を可能にするカナリヤ
ポックスウイルス配列により側腹に位置する狂犬病Ｇ遺伝子に連結したワクシニアウイル
スＨ６プロモーターを含有している。ＮｒｕＩとＥｃｏＲＩの切断により、狂犬病Ｇ遺伝
子を離生し、Ｈ６プロモーターの３′側２０ｂｐを除去する。ワクシニアＨ６プロモータ
ーに連結したＳＩＶ ｅｎｖ遺伝子を含有する産生したＣ５挿入プラスミドをｐＣ５ＳＩ
ＶＥＮＶと称した。
【０４３４】
プラスミドｐＣ５ＳＩＶＥＮＶをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断し、ＳＩＶ ｅｎｖ
遺伝子のヌクレオチド１５０から全縁遺伝子の末端までを含有する２．２ｋｂ断片を離生
した。ＰＣＲを用いてｐＣ５ＳＩＶＥＮＶからのワクシニアＨ６プロモーター／ＳＩＶ 20
ｅｎｖ結合を、オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２８６（配列認識番号１７５）
【化１１１】
とＳＩＶＥＮＶ２（配列認識番号１７６）
【化１１２】
により誘導した。３２０ｂｐ断片をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、２４０ｂｐ断片を誘導した
。２．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩと２４０ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ断片をＨｉｎ
30
ｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＣ３Ｉにともに連結した。ＳＩＶｅｎｖコード配列に
関して適切な配向のＨｉｎｄＩＩＩ断片を含有する産生したプラスミドをｐＣ３ＳＩＮＥ
Ｍと称した。プラスミドｐＣ３Ｉは以下のようにして誘導した。２．５ｋｂのＢｇｌＩＩ
カナリヤポックスウイルスゲノム断片のヌクレオチド配列分析により、全縁Ｃ３読取り枠
と５′および３′非コード領域が明確となった。Ｃ３読取り枠が完全に切除された、異種
遺伝子のＣ３座への挿入のための供与体プラスミドを構築するために、ＰＣＲプライマー
を用いてＣ３に対する５′および３′配列を増幅した。５′配列のプライマーは、ＲＧ２
７７（配列認識番号１７７）
【化１１３】
40
およびＲＧ２７８（配列認識番号１７８）
【化１１４】
であった。
【０４３５】
３′配列のプライマーは、ＲＧ２７９（配列認識番号１７９）
50
(119)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【化１１５】
およびＲＧ２８０（配列認識番号１８０）
【化１１６】
であった。ワクシニア転写および翻訳終止シグナルにより側腹にある多重クローニング部
10
位を含有するようにプライマーを設計した。また、左側アームと右側アームの５′末端と
３′末端には、２つのアームをＡｓｐ７１８／ＳａｃＩで切断したｐＢＰ−ＳＫプラスミ
ドベクターに連結せしめる適切な制限部位（左側アームにはＡｓｐ７１８とＥｃｏＲＩ、
そして右側アームにはＥｃｏＲＩとＳａｃＩ）を含有した。産生したプラスミドをｐＣ３
Ｉと称した。
【０４３６】
ＥｃｏＲＩでの切断により、プラスミドｐＣ３ＳＩＶＥＭを線状とした。続いての部分的
なＨｉｎｄＩＩＩでの切断により、２．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片を離生
した。この断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのク
レノウ断片での処理によりブラントエンドした。この断片をＳｍａＩで切断したｐＳＤ５
20
５０ＶＣに連結した。産生したプラスミドをｐＳＩＶＥＭＶＣと称した。このプラスミド
を、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６により生体外組換え実験に用いて、ｖＰ８７３を産
生した。ｖＰ８７３はＩ４Ｌ座にＳＩＶ ｅｎｖ遺伝子を含有した。
【０４３７】
ＮＹＶＡＣ／ｇａｇ／ｐｏｌおよびｇａｇ組換え体の産生
ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を包含するＳＩＶ ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミド、ｐＳ
ＩＶＡＧＳＳＩＩＧをＤｒ．ジェノベファフランチーニ（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩ
Ｈ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を、ワクシニアｔｋフラ
ンキングアームの間のワクシニアＩ３Ｌプロモーターに対して３′に隣接せしめた。これ
は、ｇａｇおよびＩ３Ｌプロモーターに対応するオリゴヌクレオチドＳＩＶＬ１（配列認
30
識番号１８１）
【化１１７】
とＳＩＶＬ２（配列認識番号１８２）
【化１１８】
を含有するｐＳＩＶＧＡＧＳＳＩＩＧの４，８００ｂｐ ＣｆｏＩ／ＴａｇＩ断片をｐＳ
Ｄ４６０の誘導体であるｐＳＤ５４２の４，０７０ｂｐ ＸｈｏＩ／ＡｃｃＩ断片中にク
ローニングすることにより行なった（第１図）。この操作により産生したプラスミドをｐ
ＳＩＶＧ１と称した。
【０４３８】
ｐｏｌ遺伝子を除去するために、オリゴヌクレオチドＳＩＶＰ５（配列認識番号１８３）
【化１１９】
40
(120)
JP 3602844 B2 2004.12.15
およびＳＩＶＰ６（配列認識番号１８４）
【化１２０】
を用いて、２１５ｂｐのＰＣＴ断片をｐＳＩＶＧＡＧＳＳＩＩＧから誘導した。ＰＣＲ誘
導断片をＢａｍＨＩとＳｔｕＩで切断し、ＳＩＶＧ１の５，３７０ｂｐの部分的なＢａｍ
ＨＩ／ＳｔｕＩ断片に連結した。これにより、ｐＳＩＶＧ２が産生した。ｐＳＩＶＧ２を
、治療ウイルスとしてのｖＰ８７３と生体外組換え実験に用いてｖＰ９４８を産生した。
10
【０４３９】
ｇａｆとｐｏｌの両者をＮＹＶＡＣベースのベクターに挿入するプラスミドを以下のよう
にして操作した。上述したｐＳＩＶＧ１は、１ｋｂのＰＣＲ断片を用いて除去した異種３
′非コード配列を含有する。この断片を、オリゴヌクレオチドＳＩＶＰ５とＳＩＶＰ６に
よりプラスミドｐＳＩＶＧＡＧＳＳＩＩＧから産生した。ｐｏｌ遺伝子の３′末端を含有
するこのＰＣＲ誘導断片をＢａｍＨＩとＨｐａＩで切断した。１ｋｂのＢａｍＨＩ／Ｈｐ
ａＩ断片をｐＳＩＶＧ１の７，４００ｂｐの部分的なＢａｍＨＩ／ＨｐａＩ断片に連結し
、ｐＳＩＶ４を産生した。
【０４４０】
ｐＳＩＶ４の配列分析により、ｐｏｌ遺伝子内に１つの塩基対欠損が発見された。このエ
20
ラーを修正するために、ｐＳＩＶＧ１からの２，３００ｂｐのＢｇｌＩ／ＳｔｕＩ断片を
ｐＳＩＶＧ４の６，１００ｂｐの部分的なＢｇｌＩ／ＳｔｕＩ断片に挿入し、ｐＳＩＶＧ
５を産生した。プラスミド、ｐＳＩＶＧ５を、治療としてのｖＰ８７３とともに生体外組
換え実験に用いてｖＰ９４３を産生した。
【０４４１】
ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ ｐ１６およびｐ２８組換え体の産生
ｐ２８、ｐ２、ｐ８、ｐ１およびｐ６をコードするｇａｇ遺伝子の部分とｐｏｌ遺伝子を
ｐＳＩＶＧ１から除去した。これは、オリゴヌクレオチドＳＩＶＬ１０（配列認識番号１
８５）
【化１２１】
30
およびＳＩＶＬ１１（配列認識番号１８６）
【化１２２】
40
をｐＳＩＶＧ１の４，４３０ｂｐ ＡｃｃＩ／ＢａｍＨＩ断片中にクローニングすること
により行ないｐＳＩＶＧ３を産生した。このプラスミドは、ワクシニアＩ３Ｌプロモータ
ーにより発現されたＳＩＶ ｐ１７遺伝子産生物の発現カセットを含有する。
【０４４２】
昆虫ポックスウイルス４２ｋＤａプロモートしたＳＩＶ ｐ２８遺伝子（５′末端のみ）
をＩ３Ｌプロモートしたｐ１７遺伝子から下流に挿入した。これは、ｐ２８遺伝子の５′
末端を含有するｐＳＩＶＧＩの３６０ｂｐ ＢｓｐＭＩ／ＢａｍＨＩ断片、昆虫ポックス
４２ｋＤａプロモーターを含有するオリゴヌクレオチドｐＳＩＶＬ１４（配列認識番号１
８７）
【化１２３】
50
(121)
JP 3602844 B2 2004.12.15
およびＳＩＶＬ１５（配列認識番号１８８）
【化１２４】
10
を、ｐＳＩＶＧ３の４，４７０ｂｐの部分的なＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ断片中にクローニン
グすることにより行なった。産生したプラスミドをｐＳＩＶＧ６と称した。
【０４４３】
次いでｐ２８遺伝子の３′部分をｐＳＩＶＧ６中に挿入した。ＳＩＶ ｐ２８遺伝子の３
′末端を含有する２９０ｂｐ ＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチドＳＩＶＰ１２（配列認
識番号１８９）
【化１２５】
20
およびＳＩＶＰ１３（配列認識番号１９０）
【化１２６】
を用いてｐＳＩＶＧＩから誘導した。この断片をＢａｍＨＩで切断し、ｐＳＩＶＧ７の４
，８３０ｂｐの断片に連結し、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６とｖＰ８７３とともに生
体外組換え実験に用いて、それぞれｖＰ９４２およびｖＰ９５２を産生した。
【０４４４】
発現アッセイ
ＳＩＶ ｇｐ１４０ ｅｎｖ遺伝子産生物は、感染細胞の形質膜と関連した典型的な糖タ
30
ンパク質である。これは１１２ｋＤａの細胞外種と２８ｋＤａの膜貫通領域に対してタン
パク質分解的に切断された１４０ｋＤａのポリタンパク質として発現される（フランチー
ニら、１９８７）。ＳＩＶに血清陽性のアカゲサルマカクからの血清と続いてウサギ抗サ
ルＩｇＧに接合したフルオレセインを用いた免疫発光分析により、組換え体感染ベロ細胞
の表面にｅｎｖ遺伝子産生物の発現が示された。表面発現は、疑似感染細胞またＮＹＶＡ
Ｃ（ｖＰ８６６）親ウイルスに感染した細胞の表面には観察されなかった。さらに、ｇａ
ｇ遺伝子のみを含有する組換え体に感染した細胞は、表面にＳＩＶ成分を発現したことを
示さなかった。ｖＰ８７３、ｖＰ９４３、ｖＰ９４８およびｖＰ９５２に感染した細胞中
の表面発現はすべて表面発現を示し、ＳＩＶ ｅｎｖ遺伝子を著しく含有する。
【０４４５】
40
ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ組換え体に感染したベロ細胞中の発現ＳＩＶ遺伝子産生物（ｅｎｖお
よびｅｎｖ）の真正をイムノプレシピテーショにより分析した。１０のｍ．ｏ．ｉ．でベ
ロ細胞を個々の組換えウイルス、ＮＹＶＡＣ親ウイルスに感染せしめ、または疑似感染せ
しめた。吸着期間の１時間後、接種物を除去し、感染細胞に、［
３ ５
Ｓ］−メチオニン（
２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌのメチオニン不含有培地を添加した。１ｍｌの３×
緩衝液Ａの添加により、感染から１７時間後に全ての試料を収集した。感染細胞からの溶
解産物を、ＳＩＶ血清陽性アカゲサルマカクから採取した血清、またはｇａｇ ｐ２４遺
伝子産生物に特異的な単クローン性抗体（両者ともＭＤ、ベセスダ、ＮＩＣ−ＮＩＨ、Ｄ
ｒ．ジェノベファフランチーニから得た）に関して分析した。
【０４４６】
50
(122)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ＳＩＶ血清陽性のマカクの血清に関して免疫沈降を以下のようにして行なった。マカク血
清を、タンパク質Ａセファロースとともに４℃で１６時間に亘りインキュベーションした
。緩衝液Ａによる洗浄後、タンパク質Ａセファロースに結合した血清を、通常のサル血清
とタンパク質Ａセファロースで前浄化した溶解産物に加えた。４℃での一晩のインキュベ
ーション後、沈殿物を緩衝液Ａで４回とＬｉＣｌ／尿素緩衝液で２回洗浄した。沈殿した
タンパク質を抗体から分離するために、試料を８０μｌの２×ラエムリ緩衝液中で５分間
沸騰せしめた。ドリファスゲルシステムを用いて１２．５％のゲルで試料を分画した（ド
リファスら、１９８４）。ゲルを固定して、蛍光光度法のために１ＭのＮａ−サリチル酸
塩で処理した。ＳＩＶ遺伝子を含有する全ての組換え体を適切な遺伝子産生物を発現して
いた。ＳＩＶ ｅｎｖ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣ組換え体ｖＰ８７３、ｖＰ９４３、ｖ
10
Ｐ９４８およびｖＰ９５２は全て真正のｇｐ１４０を発現した。しかしながら、ｇｐ１４
０タンパク質の１１２ｋＤａおよび２８ｋＤａ熟成形状への処理を評価するのは困難であ
る。疑似感染ベロ細胞、ｖＰ８６６感染ベロ細胞およびＳＩＶ ｅｎｖ遺伝子を含有しな
いＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ組換え体に感染した細胞からのマカク抗ＳＩＶ血清によっては、１
４０ｋＤａのみかけ分子量を有する種は沈殿しなかった。ＳＩＶに感染したマカクから採
取した血清およびｐ２８ ｇａｇ成分に特異てきな単クローン性抗体を用いて、ｖＰ９４
２、ｖＰ９４３、ｖＰ９４８、およびｖｐ９５２によるＳＩＶｇａｇコード遺伝子産生物
の発現が示された。ベロ細胞中のＮＹＶＡＣ（ｖＰ９４８）によりプロテアーゼ機能を含
むｐｏｌ領域のない全縁ｐ５５ ｇａｇタンパク質の発現は明確である。これらの結果に
より、ＳＩＶプロテアーゼ発現の欠如はｐ５５の熟成形状への完全なタンパク質分解を妨
20
げることが示された。ｐ２８に特異的な単クローン性抗体を用いてｇａｇ特異的遺伝子産
生物をｖＰ９４８感染ベロ細胞から沈殿させる場合、このことはより明確に示される。こ
の結果に対して、ｖＰ９４３感染ベロ細胞中にｐｏｌ遺伝子（プロテアーゼを含む）を有
するＳＩＶ ｇａｇの発現により、発現されたｐ５５ ｇａｇ前駆体ポリペプチドがその
熟成形状にタンパク質分解的に切断させることができた。
【０４４７】
ＳＩＶに感染したマカクから採取した血清を用いて、ｖＰ９４２およびｖＰ９５２感染ベ
ロ細胞中のｐ１６とｐ２８ ＳＩＶ遺伝子産生物の両方の発現が示された。ｐ２８に特異
的な単クローン性抗体は明らかにｐ２８発現成分のみを認識した。
【０４４８】
30
実施例２２−アビアンインフルエンザウイルスの血球凝集素糖タンパク質を発現するＴＲ
ＯＶＡＣ組換え体の構築
この実施例は、アビアンインフルエンザウイルスの３つの血清型の血球凝集素遺伝子を発
現する鶏痘ウイルス組換え体の開発を記載するものである。
【０４４９】
細胞およびウイルス
Ｈ４、Ｈ５およびＨ７血球凝集素遺伝子のｃＤＮＡクローンを含有するプラスミドを、テ
ネシー州、メンフィスのセントジュード小児科研究病院のＤｒ．ロバートウェブスターか
ら得た。ＦＰ−１と称するＦＰＶの菌株は以前に記載した（テイラーら、１９８８ａ、ｂ
）。これは生後１日の鶏のワクチン接種に有用な弱毒化ワクチン菌株である。親ウイルス
40
菌株デュベッティを、鶏からの鶏痘かいせんとしてフランスから得た。鶏の感染幼虫包蔵
卵での５０回の継代と続いての鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）での２５回の継代によりウイル
スを弱毒化した。このウイルスを、フランス、リヨン、ローンメリクスにより１９８０年
の９月に得て、マスターウイルス種を設立した。１９８９年の９月にウイルスをバイロジ
ェネティックスが受けとり、ここで４連続のプラーク精製を行なった。初代ＣＥＦ細胞中
で１つのプラーク単離体をさらに増幅し、ＴＲＯＶＡＣと称する株ウイルスを設立した。
ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）およびＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）を
産生する生体外組換え試験に用いた株ウイルスをさらに初代ＣＥＦ細胞中で８回の継代に
より増幅した。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７（ｖＦＰ１００）を産生するのに用いた株ウイル
スはさらに初代ＣＥＦ細胞中で１２回の継代により増幅した。
50
(123)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０４５０】
Ｆ８座での鶏痘挿入プラスミドの構築
プラスミドｐＲＷ７３１．１５は、ＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡからクローニングされた１
０ｋｂｐのＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片を含有する。ヌクレオチド配列を、３６６１ｂｐ
ＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片の両鎖に決定した。この配列を第２１図に示す。Ｆ８とし
てこの研究所で称する読取り枠をこの配列内に決定した。読取り枠は位置７０４で開始し
、位置８８８で終止する。隣接する読取り枠を妨害しないように、以下に記載するように
、位置７８１から位置１９２８に欠損を作った。
【０４５１】
プラスミドｐＲＷ７６１は、２４３０ｂｐ ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶ断片を含有するｐＲ
10
Ｗ７３１．１５のサブクローンである。Ｆ８ ＯＲＦは完全に、ＰＲＷ７６１のＸｂａＩ
部位とＳｓｐＩ部位の間に含有された。ＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡによる組換えにおいて
Ｆ８ ＯＲＦを除去する挿入プラスミドを産生するために、以下の工程を行なった。プラ
スミドｐＲＷ７６１をＸｂａＩで完全に、ＳｓｐＩで部分的に切断した。３７００ｂｐの
ＸｂａＩ−ＳｓｐＩ帯を単離して、アニールした二本鎖オリゴヌクレオチドＪＣＡ０１９
（配列認識番号１９１）およびＪＣＡ０１８（配列認識番号１２９）
【化１２７】
20
と連結した。
【０４５２】
この連結により産生したプラスミドをｐＪＣＡ００２と称した。プラスミドｐＪＣＡ００
４は、プラスミドｐＪＣＡ００２中のワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結した非
関連遺伝子を含有する。ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの配列は以前に記載した（
テイラーら、１９８８ａ、ｂ；グオら、１９８９；パーカスら、１９８９）。プラスミド
ｐＪＡＣ００４を、非関連遺伝子とＨ６プロモーターの３′末端の部分を欠損せしめるＥ
30
ｃｏＲＶとＢａｍＨＩで切断した。アニールしたオリゴヌクレオチドＲＷ１７８（配列認
識番号１９３）およびＲＷ１７９（配列認識番号１９４）をＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで切
断し、ＪＣＡ００４のＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩ部位の間に挿入し、ｐＲＷ８４６を形成し
た。
【０４５３】
【化１２８】
40
それゆえ、プラスミドｐＲＷ８４６は、ｄｅ−ＯＲＦｅｄ Ｆ８座にＥｃｏＲＶのＨ６プ
ロモーター５′を含有する。ｐＲＷ８４６中のＨ６プロモーターには、終止コドン、ワク
シニアウイルス初期プロモーターにより認識される転写終止配列（ユエンら、１９８７）
およびＳｍａＩ部位が続いている。
【０４５４】
Ｆ７座での鶏痘挿入プラスミドの構築
起源Ｆ７非ｄｅ−ＯＲＦｅｄ挿入プラスミド、ｐＲＷ７３１．１３は、ｐＵＣ９のＰｖｕ
ＩＩ部位に５．５ｋｂのＦＰゲノムＰｖｕＩＩ断片を含有した。挿入部位は、これらの配
50
(124)
JP 3602844 B2 2004.12.15
列内の特有のＨｉｎｃＩＩ部位であった。第２２図に示したヌクレオチド配列は、特有の
ＨｉｎｃＩＩ部位を包含する２３５６ｂｐ領域に関して決定した。この配列の分析により
、特有のＨｉｎｃ部位（第２２図での下線）が９０アミノ酸のポリペプチドをコードする
ＯＲＦ内に位置することが示された。ＯＲＦは、位置１５３１でのＡＴＧで開始し、位置
８９８で終止する（第２２図の矢印により示した位置）。
【０４５５】
ｄｅ−ＯＲＦｅｄ挿入プラスミドのアームを、テンプレートとしてのｐＲＷ７３１．１３
を用いたＰＣＲにより誘導した。ＯＲＦから上流の領域に対応する５９６ｂｐアーム（Ｈ
Ｂと称する）を、オリゴヌクレオチドＦ７３ＰＨ２（配列認識番号１９５）
【化１２９】
10
およびＦ７３ＰＢ（配列認識番号１９６）
【化１３０】
で増幅した。ＯＲＦから下流の領域に対応する２７０ｂｐアーム（ＥＨと称する）を、オ
リゴヌクレオチドＦ７５ＰＥ（配列認識番号１９７）
【化１３１】
20
およびＦ７３ＰＨ１（配列認識番号１９８）
【化１３２】
で増幅した。
【０４５６】
断片ＥＨをＥｃｏＲＶで切断し、１２６ｂｐ断片を産生した。ＥｃｏＲＶ部位は３′末端
であり、５′末端はＨｉｎｃＩＩ部位の３′末端を含有するようにＰＣＲにより形成した
。この断片を、ＨｉｎｃＩＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ
30
）に挿入し、プラスミドｐＦ７Ｄ１を形成した。配列を、ジデオキシヌクレオチド配列分
析により確認した。プラスミドｐＦ７Ｄ１をＡｐａＩで線状化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いてブラントエンドし、５９６ｂｐ ＨＢ断片に連結した。産生したプラスミド
をｐＦ７Ｄ２と称した。全縁配列と包囲をヌクレオチド配列分析により確認した。
【０４５７】
プラスミドｐＦ７Ｄ２をＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで切断し、６００ｂｐ断片を産生した。
この断片を、ＡｐａＩで切断されたｐＢＳ−ＳＫに挿入し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで
ブラントエンドし、続いてＢａｍＨＩで切断した。産生したプラスミドをｐＦ７Ｄ３と称
した。このプラスミドは、４０４ｂｐのＨＢアームと１２６ｂｐのＥＨアームを含有する
。
40
【０４５８】
プラスミドｐＦ７Ｄ３をＸｈｏＩで線状化し、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下で、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片によりブラントエンドした。この線状化したプラ
スミドを、アニールしたオリゴヌクレオチドＦ７ＭＣＳＢ（配列認識番号１９９）
【化１３３】
およびＦ７ＭＣＳＡ（配列認識番号２００）
50
(125)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【化１３４】
に連結した。これを行なって、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩの制限部位を含
有する多重クローニング領域をＥＨとＨＢアームの間に挿入した。産生したプラスミドを
ｐＦ７ＤＯと称した。
【０４５９】
Ｆ８座でのＨ４血球凝集素の挿入プラスミドの構築
10
プラスミドｐＴＭ４Ｈ８３３中に、Ａ／Ｔｙ／Ｍｉｎ／８３３／８０から誘導したアビア
ンインフルエンザＨ４をコードするｃＤＮＡコピーをＤｒ．Ｒ．ウェブスターから得た。
このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＮｒｕＩで切断し、ｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリメ
ラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。Ｈ４コード領域を含有するブラント
エンドした２．５ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｒｕＩ断片をｐＩＢＩ２５（ＣＴ、ニュー
ハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した。産
生したプラスミドｐＲＷ８２８を部分的にＢａｎＩＩで切断し、線状産生物を単離し、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩで再度切断した。１００ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｎＩが欠損したプラス
ミドｐＲＷ８２８を、合成オリゴヌクレオチドＲＷ１５２（配列認識番号２０１）および
ＲＷ１５３（配列認識番号２０２）のベクターとして用いた。これらのオリゴヌクレオチ
20
ドは、ＥｃｏＲＶ部位からのＨ６プロモーターの３′部分を表し、プロモーターのＡＴＧ
をＨ４ ｃＤＮＡのＡＴＧと配列させる。
【０４６０】
【化１３５】
30
オリゴヌクレオチドをアニールし、ＢａｎＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上述したＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＢａｎＩＩが欠損したｐＲＷ８２８ベクターに挿入する。産生したプラスミ
ドｐＲＷ８４４をＥｃｏＲＶとＤｒａＩで切断し、３′Ｈ６プロモートしたＨ４コード配
列を含有する１．７ｋｂｐ断片をｐＲＷ８４６（前出）のＥｃｏＲＶとＨｉｎｃＩＩ部位
の間に挿入し、プラスミドｐＲＷ８４８を形成した。それゆえ、プラスミドｐＲＷ８４８
は、鶏痘ウイルスのｄｅ−ＯＲＦｅｄＦ８座のワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連
結したＨ４コード配列を含有する。
【０４６１】
Ｆ８座でのＨ５血球凝集素の挿入プラスミドの構築
プラスミドｐＴＨ２９中に、Ａ／ターキー／アイルランド／１３７８／８３から誘導した
アビアンインフルエンザＨ５のｃＤＮＡクローンをＤｒ．Ｒ．ウェブスターから得た。合
成オリゴヌクレオチドＲＷ１０（配列認識番号２０３）からＲＷ１３（配列認識番号２０
６）を、前述したワクシニアウイルスＨ６プロモーターの翻訳開始コドンとＨ５遺伝子の
ＡＴＧが重複するように設計した。配列はＨ５遺伝子の５′ＳａｌＩ部位を通じて継続し
、Ｈ５終止コドンを含有する３′Ｈ５ ＤｒａＩ部位で再度開始する。
【０４６２】
【化１３６】
40
(126)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
オリゴヌクレオチドを９５℃で３分間アニールし、続いて室温で徐冷した。これにより、
表示した末端を有する以下の二本鎖構造となる。
【０４６３】
【化１３７】
20
ｐＲＷ７４２ＢのＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩ部位の間のオリゴヌクレオチドのクローニン
グによりｐＲＷ７４４が産生した。プラスミドｐＲＷ７４２Ｂは、前述したｐＲＷ７３１
．１５のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入された非関連遺伝子に連結したワクシニアウイルスＨ６
プロモーターを含有する。ＰｓｔＩとＥｃｏＲＶの切断により、Ｈ６プロモーターの３′
末端と非関連遺伝子が除去される。プラスミドｐＲＷ７４４はここで、アビアンインフル
エンザＨ５のＡＴＧと重複するＨ６プロモーターの３′部分を含有する。このプラスミド
30
はまた、Ｈ５配列から５′ＳａｌＩ部位までとＨ５終止コドン（ＤｒａＩ部位を含有する
）からの３′配列を含有する。ＤｒａＩ部位を使用するとＨ５ ３′非コード末端が除去
される。オリゴヌクレオチドは、初期ワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼにより認識
される転写終止シグナルを加える（ユエンら；１９８７）。Ｈ６プロモートしたＨ５構造
を完成するために、Ｈ５コード領域をｐＴＨ２９から１．６ｋｂｐ ＳａｌＩ−ＤｒａＩ
断片として単離した。プラスミドｐＲＷ７４４を部分的にＤｒａＩで切断し、線状断片を
単離し、ＳａｌＩで再度切断した。ここでＳａｌＩとＤｒａＩの間の８つの塩基が欠損し
たプラスミドを、１．６ｋｂｐのｐＴＨ２９ ＳａｌＩおよびＤｒａＩ断片のベクターと
して用いた。産生したプラスミドをＥｃｏＲＶとＤｒａＩで切断した。３′Ｈ６プロモー
ターおよびＨ５遺伝子を含有する１．７ｋｂｐ ＰＲＷ７５９ ＥｃｏＲＶ−ＤｒａＩ断
40
片をｐＲＷ８４６（前出）のＥｃｏＲＶとＨｉｎｃＩＩ部位の間に挿入した。産生したプ
ラスミドｐＲＷ８４９は、ｄｅ−ＯＲＦｄｅＦ８座にＨ６プロモートしたアビアンインフ
ルエンザウイルスＨ５遺伝子を含有する。
【０４６４】
Ｆ７座でのＨ７血球凝集素の挿入ベクターの構築
Ａ／ＣＫ／ＶＩＣ／１／８５からのＨ７血球凝集素を含有するプラスミドｐＣＶＨ７１を
Ｄｒ．Ｒ．ウェブスターから得た。Ｈ７遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を
ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドし、ＰＲＷ８２７としてｐＩＢＩ２
５のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した。合成オリゴヌクレオチドＲＷ１６５（配列認識番号２
０７）およびＲＷ１６６（配列認識番号２０８）をアニールし、ＨｉｎｃＩＩとＳｔｙＩ
50
(127)
JP 3602844 B2 2004.12.15
で切断し、ｐＲＷ８２７のＥｃｏＲＶとＳｔｙＩ部位の間に挿入してｐＲＷ８４５を産生
した。
【０４６５】
【化１３８】
10
オリゴヌクレオチドＲＷ１６５（配列認識番号２０７）およびＲＷ１６６（配列認識番号
２０８）は、Ｈ６プロモーターの３′部分をＨ７遺伝子に連結させる。ｐＲＷ８４５のＡ
ｐａＬＩ切断の線状産生物を単離し、これをＥｃｏＲＩで再度切断し、最大の断片を単離
して合成オリゴヌクレオチドＲＷ２２７（配列認識番号２０９）およびＲＷ２２８（配列
認識番号２１０）でアニールすることにより、Ｈ７遺伝子の３′非コード末端を除去した
20
。産生したプラスミドはｐＲＷ８５４であった。
【０４６６】
【化１３９】
ＰＲＷ８５４中のＨ７の終止コドンの次にはＨｐａＩ部位が続いている。ｄｅ−ＯＲＦｅ
30
ｄ Ｆ７座中の中間Ｈ６プロモートしたＨ７構造（以下に記載する）を、ＥｃｏＲＶで切
断し、そのＰｓｔＩ部位でブラントエンドしたｐＲＷ８５８中にｐＲＷ８５４ ＥｃｏＲ
Ｖ−ＨｐａＩ断片を移動せしめることにより産生した。プラスミドｐＲＷ８５８（以下に
記載する）はＦ７ ｄｅ−ＯＲＦｅｄ挿入プラスミド中にＨ６プロモーターを含有する。
非関連遺伝子に連結したＨ６プロモーターを含有する８５０ｂｐ ＳｍａＩ／ＨｐａＩ断
片を前述したｐＦ７ＤＯのＳｍａＩ部位に挿入することによりプラスミドｐＲＷ８５８を
構築した。ｐＲＷ８５８をＥｃｏＲＶ（Ｈ６プロモーターの３′末端の２４ｂｐ上流の部
位）とＰｓｔＩでの切断により非関連配列を切除した。産生した３．５ｋｂ断片を単離し
、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用い
てブラントエンドした。このブラントエンドした断片を、ｐＲＷ８５４（前出）から誘導
40
した１７００ｂｐのＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ断片に連結した。このＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ断
片は、ＶＶ Ｈ６プロモーターの３′側の２４ｂｐに隣接した３′の全縁ＡＩＶ ＨＡ（
Ｈ７）遺伝子を含有する。産生したプラスミドをｐＲＷ８６１と称した。
【０４６７】
１２６ｂｐ ＥＨアーム（以前に規定した）をｐＲＷ８６１中で延長せしめ、組換え頻度
をゲノムＴＲＯＶＡＣ ＤＮＡで増大せしめた。このことを達成するために、５７５ｂｐ
ＡｃｃＩ／ＳｎａＢＩ断片をｐＲＷ７３１．１３（前に規定した）から誘導した。この
断片を単離し、ｐＲＷ８６１のＡｃｃＩとＮａｅＩ部位の間に挿入した。７２５ｂｐのＥ
ＨアームとＡＩＶ Ｈ７を側腹に有する４０４ｂｐのＨＢアームを含有する、産生したプ
ラスミドをｐＲＷ８６９と称した。それゆえ、プラスミドｐＲＷ８６９は、５′末端でワ
50
(128)
JP 3602844 B2 2004.12.15
クシニアウイルスＨ６プロモーターに連結したＨ７コード配列からなる。左側のフランキ
ングアームは、４０４ｂｐのＴＲＯＶＡＣ配列からなり、右側フランキングアームは、ｄ
ｅ−ＯＲＦｅｄ Ｆ７座への挿入を指向する７２５ｂｐのＴＲＶＡＣ配列からなる。
【０４６８】
ＴＲＯＶＡＣアビアンインフルエンザウイルスの開発
アビアンインフルエンザウイルスＨＡコード配列を含有する挿入プラスミドを、前述した
リン酸カルシウム沈殿法を用いてＴＲＯＶＡＣ感染初代ＣＥＦ細胞に個々にトランスフェ
クションした（パニカリら、１９８２；ピッチーニら、１９８７）。ＨＡ特異的放射線標
識プローブに対するハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な個
体群となるまで、連続したプラーク精製を行なった。次いで１つの代表的なプラークを増
10
幅して株ウイルスを産生した。プラスミドｐＲＷ８４９を生体外組換え試験に用いてＨ５
血球凝集素を発現する組換え体ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）を産生した。プラ
スミドｐＲＷ８４８を用いてＨ４血球凝集素を発現する組換え体ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４
（ｖＦＰ９２）を産生した。プラスミドｐＲＷ８６９を用いて、Ｈ７血球凝集素を発現す
る組換え体ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７（ｖＦＰ１００）を産生した。
【０４６９】
蛍光光度法
インフルエンザウイルス感染細胞において、ＨＡ分子を合成し、粗い小胞体での前駆体分
子としてグリコシル化する。形質膜に通過中に、ジスルヒド連結ＨＡ１ およびＨＡ２ サブユニットへのタンパク質分解切断となる広範囲の翻訳後修飾と、続いて熟成ウイルス
20
エンベロープに含まれる宿主細胞膜への挿入を経る。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＶ組換えウイル
スに感染した細胞中に産生されたＨＡ分子が細胞表面上に発現されたか否かを測定するた
めに、蛍光光度法を行なった。間接蛍光光度法を記載したように行なった（テイラーら、
１９９０）。間接蛍光光度法により、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５のＨ５血球凝集素、ＴＲＯ
ＶＡＣ−ＡＩＨ４のＨ４血球凝集素、およびＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７のＨ７血球凝集素の
表面発現を確認した。Ｈ５ＨＡに特異的な単クローン性抗体の貯留を用いて、Ｈ５血球凝
集素の発現を検出した。ヒツジ単特異的抗Ｈ４血清を用いてＨ４ＨＡの発現を分析した。
Ｈ７特異的単クローン性抗体標品を用いてＨ７ＨＡの発現を分析した。
【０４７０】
免疫沈降
30
血球凝集素ポリペプチドの切断はウイルス粒子が感染性であるために必要であるので、血
球凝集素分子の切断部位がウイルスの毒性を決定するのに重要な役割を果たすことが分か
っている。毒性Ｈ５およびＨ７ウイルスの血球凝集素タンパク質はＨＡ１のカルボキシ末
端に１つより多くの塩基アミノ酸を有している。これにより、一連の塩基アミノ酸を認識
する細胞プロテアーゼが血球凝集素を切断でき、感染ウイルスが生体外と体内の両方に広
がる。Ｈ４無毒性菌株の血球凝集素分子は、異種トリプシンが加えられるまで、組織培養
中で切断されない。
【０４７１】
ＴＲＯＶＡＣ組換え体により発現された血球凝集素分子が確実に処理されたことを測定す
るために、上述した特異的試薬を用いて記載したように（テイラーら、１９９０）免疫沈
40
降を行なった。
【０４７２】
ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）により発現されたＨ５血球凝集素の免疫沈降分析
により、糖タンパク質は、それぞれ約４４および２３ｋＤａの分子量を有する２つの切断
産生物ＨＡ１ およびＨＡ２ として明確であることが示された。未感染細胞または親Ｔ
ＲＯＶＡＣに感染した細胞からはそのようなタンパク質は沈殿しなかった。ＴＲＯＶＡＣ
−ＡＩＨ７（ｖＦＰ１００）により発現された血球凝集素の同様の免疫沈降分析により、
ＨＡ２ 切断産生物の特異的な沈殿が示された。ＨＡ１ 切断産生物は確認されなかった
。未感染ＣＥＦ細胞またはＴＲＯＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞からはタンパク質は特異的には沈
殿しなかった。これに対して、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）の発現産生物の免
50
(129)
JP 3602844 B2 2004.12.15
疫沈降分析により、前駆体タンパク質ＨＡ０ のみの発現が示された。これは、組織培養
中の無毒性亜種の血球凝集素に切断のないことと一致する。未感染ＣＥＦ細胞またはＴＲ
ＯＶＡＣに感染した細胞にはＨ４特異的タンパク質は検出されなかった。
【０４７３】
実施例２３−３つのアビアンインフルエンザ遺伝子を発現する３重組換え体の発生
プラスミドの構築
プラスミドｐＲＷ８４９は以前に記載しており、Ｈ６プロモートしたアビアンインフルエ
ンザＨ５遺伝子を含有する。このプラスミドをｖＦＰ８９の発生に用いた。プラスミドｐ
ＲＷ８６１は、ｖＦＰ１００の発生に用いた以前に記載した中間プラスミドであった。こ
のプラスミドは、Ｈ６プロモートしたアビアンインフルエンザＨ７遺伝子を含有する。プ
10
ラスミドｐＲＷ８４９をＳｍａＩで切断し、Ｈ６プロモーターの５′末端からＨ５遺伝子
までの産生した１．９ｋｂｐの断片をｐＲＷ８６１のＳｍａＩ部位に挿入し、ｐＲＷ８６
５を産生した。Ｈ４コード配列を挿入するために、プラスミドｐＲＷ８４８を用いた。プ
ラスミドｐＲＷ８４８をｖＦＰ９２の発生に用いた。このプラスミドをＨ６プロモートし
たＨ４遺伝子を含有する（前述）。プラスミドｐＲＷ８４８をＳｍａＩで切断し、Ｈ６プ
ロモートしたＨ４コード配列を含有する１．９ｋｂｐの断片をＨ６プロモートしたＨ５配
列のＳｍａＩ部位５′でｐＲＷ８６５に挿入した。それゆえ、産生したプラスミドｐＲＷ
８７２は、Ｆ７ ｄｅ−ＯＲＦｅｄ挿入プラスミド中にＨ４、Ｈ５およびＨ７コード配列
を含有する。
【０４７４】
20
遺伝子のｄｅ−ＯＲＦｅｄ Ｆ８座への挿入を指向するために、ｐＲＷ８７２を部分的に
ＳｍａＩで切断し、線状断片を単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで再度切断した。３つのＨ６プロ
モートしたアビアンインフルエンザ遺伝子を含有する５．７ｋｂｐのＳｍａＩからＨｉｎ
ｄＩＩＩ ｐＲＷ８７２断片をブラントエンドし、ＨｉｎｃＩＩで切断されたｐＣＥＮ１
００に挿入した。プラスミドｐＣＥＮ１００は、転写および翻訳終止シグナルおよび多重
挿入部位を含有するｄｅ−ＯＲＦｅｄ Ｆ８挿入ベクターである。プラスミドｐＣＥＮ１
００を以下のように産生した。合成オリゴヌクレオチドＣＥ２０５（配列認識番号２１１
）およびＣＥ２０６（配列認識番号２１２）をアニールし、ホスホリル化し、ｐＪＣＡ０
０２（前述）のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ｐＣＥ７２を形成した。
ｐＣＥ７２からのＢｇｌＩＩからＥｃｏＲＩ断片をｐＪＣＡ０２１のＢｇｌＩＩおよびＥ
30
ｃｏＲＩ部位に挿入し、ｐＣＥＮ１００を形成した。
【０４７５】
【化１４０】
40
ｐＲＷ７３１−１５（前述）からの４９００ｂｐ ＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩ断片をｐＢ
ＳＳＫＴのＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＪＣＡ
０２１を得た。
【０４７６】
最終の挿入プラスミドｐＲＷ８７４は、欠損Ｆ８ ＯＲＦと同一の方向に転写した３つの
アビアンインフルエンザＨＡ遺伝子を有した。Ｈ４遺伝子に隣接したプラスミドの左側フ
ランキングアームは、２３５０ｂｐの鶏痘配列からなるものであった。Ｈ７遺伝子に隣接
する右側フランキングアームは１７００ｂｐの鶏痘配列からなるものであった。このプラ
スミドの線状表示を以下に示す。
50
(130)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０４７７】
【化１４１】
組換え体ｖＦＰ１２２の発生
前述したリン酸カルシウム沈殿法（パニカリら、１９８２；ピッチーニら、１９８７）を
用いて、プラスミドｐＲＷ８７４をＴＲＯＶＡＣ感染初代ＣＥＦ細胞中にトランスフェク
ションした。特異的Ｈ４、Ｈ５およびＨ６放射線標識プローブに対するハイブリダイゼー
10
ションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な個体群となるまで、５連続のプラーク精
製を行なった。前述した特定の試薬を用いたプラークイムノスクリーンにより、３つの糖
タンパク質の全ての表面発現を確認した。２回の増幅後に、挿入遺伝子の安定性を確認し
、組換え体をｖＦＰ１２２と称した。
【０４７８】
実施例２４−ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣのＬＤ５０の様々なワクシニアウイルス菌株と
の比較
マウス
オスの非近交スイスウェブスターマウスをタコニック農場（ＮＹ、ジャーマンタウン）か
ら購入し、生後３週間までマウスに任意に餌と水を与え続けた（「通常の」マウス）。新
20
生の非近交スイスウェブスターマウスは両方の性であり、タコニック農場により行なわれ
た妊娠により得た。使用した全ての新生マウスは２日間で生まれたものであった。
【０４７９】
ウイルス
カナリヤポックス個体群のプラーク精製によりＡＬＶＡＣを誘導し、初代鶏胚繊維芽細胞
（ＣＥＦ）において調製した。ショ糖密度勾配の遠心分離により精製に続いて、ＣＥＦ細
胞中でユニットを形成するプラークに関してＡＬＶＡＣを列挙した。ＷＲの巨大なプラー
ク表現型の選択により、ワクシニアウイルスのＷＲ（Ｌ）変形を誘導した。ワクシニアウ
イルスのエス（Ｗｙｅｔｈ）ニューヨーク州保健局ワクチン菌株を、対照番号３０２００
１Ｂとして、製薬牛リンパ型ワクチンドライバックスから得た。コペンハーゲン菌株ワク
30
シニアウイルスＶＣ−２を、フランスのインスティテュートメリクスから得た。ワクシニ
アウイルス菌株ＮＹＶＡＣをコペンハーゲンＶＣ−２から誘導した。エス菌株を除いて全
てのワクシニアウイルス菌株はベロアフリカグリーンサル肝臓細胞中で培養し、ショ糖勾
配密度遠心分離により精製し、ベロ細胞上のユニットを形成するプラークに関して列挙し
た。エス菌株をＣＥＦ細胞中で増殖せしめ、ＣＥＦ細胞中で列挙した。
【０４８０】
接種
１０匹の通常のマウスの群に、無菌の食塩加リン酸緩衝液中で株標品を１０倍に希釈する
ことにより調製したウイルスいくつかの希釈物の１つの０．０５ｍｌを頭蓋内（ｉｃ）に
より接種した。ある例においては、未希釈の株ウイルス標品を接種に用いた。
40
【０４８１】
０．０３ｍｌの接種容量を用いたことを除いて、生後１または２日の１０匹の新生マウス
の群に頭蓋内に通常のマウスと同様に接種した。
【０４８２】
接種後、全てのマウスを１４日間（新生マウス）または２１日間（通常のねすみ）に亘り
、死亡率を毎日観察した。接種後の翌朝に死亡したマウスは、外傷による潜在的な死のた
めに除外した。
【０４８３】
実験個体群の５０％の死亡率となるのに必要な致死量（ＬＤ５０）を、リードとミュンヒ
の比例法により決定した。
50
(131)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０４８４】
ｉｃ経路による通常、若い非近交マウスに関するＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣのＬＤ５０
と様々なワクシニアウイルス菌株との比較
若い通常のマウスにおいて、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの毒性は、試験した他のワクシ
ニアウイルス菌株よりも数桁低い大きさであった（表２８）。ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡ
Ｃは、通常のマウスにおいてエス菌株よりも３，０００倍も毒性が弱く；親ＶＣ−２菌株
よりも１２，５００倍も毒性が弱く；ＷＲ（Ｌ）変形よりも６３，０００，０００倍も毒
性が弱いことが分かった。これらの結果により、ＮＹＶＡＣは他のワクシニア菌株と比較
して非常に弱毒化されており、ＡＬＶＡＣは頭蓋内に施されたときに若いマウスにとって
は一般的に無毒性であるが、両者とも、この経路による接種の未決定の機構による非常に
高い接種量（３．８５×１０
８ ＰＦＵ、ＡＬＶＡＣおよび３×１０
８ 10
ＰＦＵ、ＮＹＶ
ＡＣ）ではマウスを死に至らせる。
【０４８５】
ｉｃ経路による新生非近交マウスに関するＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣのＬＤ５０と様々
なワクシニアウイルス菌株との比較
頭蓋内（ｉｃ）抗原投与モデルシステムの滴定により、通常の新生マウスに関して５ポッ
クスウイルス菌株の相対毒性を試験した（表２９）。最終点での死亡率に関して、ＬＤ５
０値は、ＡＬＶＡＣは、ワクシニアウイルスのエスワクチン菌株よりも１００，０００倍
も毒性が弱く；ワクシニアウイルスのコペンハーゲンＶＣ−２菌株よりも２００，０００
倍も毒性が弱く；ワクシニアウイルスＷＲ−Ｌ変形よりも２５，０００，０００倍も毒性
が弱いことが示された。言うまでもなく、試験した最高の接種量、６．３×１０
Ｕでは、１００％の死亡率となった。３３．３％の死亡率は、６．３×１０
６ ７ 20
ＰＦ
ＰＦＵで
観察された。最高接種群のマウスの平均生存時間（ＭＳＴ）（約６．３ＬＤ５０）は６．
７±１．５日であるので、死亡の原因は、実際には決定されないが、毒性学的性質または
外傷性質によるものではないようである。ＭＳＴが４．８±０．６日である５ＬＤ５０の
抗原投与量でのＷＲ（Ｌ）と比較した場合、ＡＬＶＡＣを抗原投与したマウスのＭＳＴは
著しく長い（Ｐ＝０．００１）。
【０４８６】
ＮＹＶＡＣと比較して、エスは、１５，０００倍も毒性が強く；ＶＣ−２は３５，０００
倍も毒性が強く；ＷＲ（Ｌ）は３，０００，０００倍も毒性が強いことが分かった。ＡＬ
ＶＡＣと同様に、ＮＹＶＡＣの２つの最高接種量、６×１０
８ および６×１０
７ ＰＦ
Ｕでは１００％の死亡率となった。しかしながら、３８０ＬＤ５０に対応する、最高接種
量を抗原投与したマウスのＭＳＴは、２日のみであった（２日目に９匹死に、４日目に１
匹死んだ）。対称的に、５００ＬＤ５０と等量の、ＷＲ−Ｌの最高接種量を抗原投与した
全てのマウスは４日目まで生存した。
【０４８７】
【表２８】
30
(132)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表２９】
30
40
実施例２５−ＥＨＶ−１ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質相同物を発現するＮＹＶＡ
Ｃベースの組換え体の産生
ワクシニアウイルスＩ３Ｌプロモーターの制御下にＥＨＶ−１ ｇＢ相同物遺伝子を配す
ることにより、ＥＨＶ−１ ｇＢ糖タンパク質の発現を行なった。ワクシニアウイルスＨ
６プロモーターの制御下にＥＨＶ−１ ｇＣ相同物遺伝子を配することによりＥＨＶ−１
ｇＣ糖タンパク質の発現を行なった。昆虫ポックスウイルス４２Ｋ遺伝子プロモーター
の制御下にＥＨＶ−１ ｇＤ相同物遺伝子を配することによりＥＨＶ−１ ｇＤ糖タンパ
50
(133)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ク質の発現を行なった。
【０４８８】
ｖＰ１０２５の産生（ＡＴＩ座におけるｇＢおよびｇＣ；ＨＡ座におけるｇＤ）
供与体プラスミドｐＪＣＡ０４２の産生
ＥＨＶ−１ ｇＢコード配列の４３０ｂｐの５′側領域を、テンプレートとしてのプラス
ミドｐＪＣＡ０１１（ＡＴＩ座カセットＨ６−ＥＨＶ−１ ｇＢ）およびオリゴヌクレオ
チドＪＣＡ１５６（配列認識番号２２３）
【化１４２】
10
とＪＣＡ１５７（配列認識番号２２４）
【化１４３】
を用いてＰＣＴ誘導し、ＢａｍＨＩで切断してキナーゼした。この４３０ｂｐの断片を、
テンプレートとしてのプラスミドｐＭＰ６９１（Ｉ３Ｌ１０１ＲＡＢ）およびオリゴヌク
レオチドＪＣＡ１５８（配列認識番号２２５）
【化１４４】
20
とＭＰ２８７（配列認識番号２２６）
【化１４５】
を用いて得られたＩ３Ｌプロモーター要素を含有する１２０ｂｐのＰＣＴ誘導断片に融合
した。この１２０ｂｐ断片をＸｂａＩで切断し、ＥＨＶ−１ ｇＢ断片の４３０ｂｐ ５
′側領域と連結する前にキナーゼした。産生したプラスミドをｐＪＣＡ０３４と称した。
ｐＪＣＡ０３４の直接の塩基配列決定法により、接合Ｉ３Ｌ−ＡＴＧおよびＥＨＶ−１ ５′側領域のＩ３Ｌプロモーターの配列を確認した。プラスミドｐＪＣＡ０３４をＳｍａ
ＩとＢａｍＨＩで切断して５５０ｂｐのＳｍａＩ−Ｉ３Ｌ−ＥＨＶ−１ ｇＢ ５′−Ｂ
30
ａｍＨＩ断片（Ａ）を切除した。プラスミドｐＭＰ６６５（ＣＯＰＣＳシステム中のカセ
ットＨ６−ＨＥＶ−１ ｇＢ）をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断し、２５３０ｂｐのＢａｍ
ＨＩ−ＥＨＶ−１ ｇＢ ３′断片（Ｂ）を切除した。次いで断片ＡおよびＢをともに、
ＳｍａＩとＸｈｏＩで切断したベクターｐＳＤ５４１ＶＣ（ＡＴＩ ｄｅｏｒｆｅｄ座）
に連結し、ｐＪＣＡ０３７を産生した。プラスミドｐＪＣＡ０３７は、ＡＴＩ ｄｅｏｒ
ｆｅｄ座にカセットＩ３Ｌ−ＥＨＶ−１ ｇＢを含有する供与体プラスミドである。プラ
スミドｐＪＣＡ０３７をＳｍａＩとＸｈｏＩで切断し、３０５０ｂｐのＳｍａＩ−Ｉ３Ｌ
−ＥＨＶ−１ ｇＢ−ＸｈｏＩ断片（Ｃ）を単離した。２２５ｂｐのＫｐｎＩ−ＥＨＶ−
１ ｇＣ ３′末端浄化ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、プラスミドｐＶＨＡＨ６ｇ１３（ＨＡｄ
ｅｏｒｆｅｄ座のカセットＨ６−ＥＨＶ−１ ｇＣ）およびオリゴヌクレオチドＪＣＡ１
40
５４（配列認識番号２２７）
【化１４６】
とＪＣＡ１６３（配列認識番号２２８）
【化１４７】
を用いてＰＣＲ誘導し、ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩ
で切断したベクターｐＢＳ−ＳＫ
＋ 中に連結し、ｐＪＣＡ０３３を産生した。ｐＪＣＡ
50
(134)
JP 3602844 B2 2004.12.15
０３３の直接の配列塩基決定方により確認した。プラスミドｐＪＣＡ０３３をＫｐｂＩと
ＥｃｏＲＶで切断し、２２ｂｐＫｐｎＩ−ＥＨＶ−１ ｇＣ′末端ＥｃｏＲＶ断片（Ｄ）
を単離した。プラスミドｐＶＨＡＨ６ｇ１３をＢｇｌＩＩとＫｐｎＩで切断し、１３３０
ｂｐのＢｇｌＩＩ−Ｈ６−ＥＨＶ−１ｇＣ ５′ＫｐｎＩ断片（Ｅ）を単離した。
【０４８９】
断片Ｃ、ＤおよびＥを最終的に、ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで切断したベクターｐＳＤ５４１
ＶＣ中にともに連結し、プラスミドｐＪＣＡ０４２を産生した。プラスミドｐＪＣＡ０４
２は、ＮＹＶＡＣ ＡＴＩ ｄｅｏｒｆｅｄ座にＩ３Ｌ−ＥＨＶ−１ ｇＢ−−Ｈ６−Ｅ
ＨＶ−１ ｇＣ二重構造を挿入する供与体プラスミドである。プラスミドｐＪＣＡ０４２
はＩＶＲの前にＮｏｔＩを用いて線状化した。
10
【０４９０】
供与体プラスミドとしてのｐＪＣＡ０４２および治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹ
ＶＡＣ）を用いてベロ細胞において生体外組換え実験を行なった。標準プロトコルを用い
て組換えウイルスを同定し精製した（ピッチーニら、１９８７）。ＡＴＩ ｄｅｏｒｆｅ
ｄ座にＥＨＶ−１ ｇＢおよびｇＣ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣベースの組換え体をｖＰ
９５６と称した。
【０４９１】
供与体プラスミドｐＪＣＡ０６４の産生
プラスミドｐＥＨＶ１ＢａｍＨＩＤ（ＥＨＶ−１ ＢａｍＨＩ Ｄ断片を含有する）をＨ
ｉｎｄＩＩＩで切断し、全縁ＥＨＶ−１ ｇＤコード配列を含有するが１５ ５′側ｂｐ
20
を含有しない１２４０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを切除した。１２４０ｂｐ
のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をクレノウポリメラーゼでブラントエンドし、Ｓ
ｍａＩで切断したベクターｐＣＯＰＣＳ６５７に連結し、ホスファターゼした。産生した
プラスミドはｐＪＣＡ００６と称した。プラスミドｐＪＣＡ００６をＢｇｌＩＩとＨｉｎ
ｄＩＩＩで切断し、１５００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｈ６−−ＥＨＶ−１ ｇＤ−Ｂｇｌ
ＩＩ断片を切除した。この断片を、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したベクターｐＩ
ＢＩ２４に連結し、プラスミドｐＥＨＶ１ｇｐ５０ａを産生した。プラスミドｐＥＨＶ１
ｇｐ５０ａを、両者とも特有部位であるＥｃｏＲＶとＮｃｏＩで切断し、４１００ｂｐ断
片を切除した。この断片を、オリゴヌクレオチドＪＣＡ０５２（配列認識番号２２９）
【化１４８】
30
およびＪＣＡ０５３（配列認識番号２３０）
【化１４９】
との間のハイブリダイゼーションにより得た合成二本鎖オリゴヌクレオチドに連結した。
産生したプラスミドをｐｇｐ５０ａ３−２と称した。４９０ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＥＨＶ−
１ ｇＤ ３′末端浄化−ＨｐａＩを、テンプレートとしてのプラスミドｐＪＣＡ００５
およびオリゴヌクレオチドＪＣＡ０４１（配列認識番号２３１）
【化１５０】
とＪＣＡ０９９（配列認識番号２３２）
【化１５１】
40
(135)
JP 3602844 B2 2004.12.15
を用いてＰＣＴ誘導した。プラスミドｐｇｐ５０ａ３−２をＥｃｏＲＩで切断し、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩで部分的に切断し、８５０ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｈ６−ＥＨＶ−１ ｇＤ ５
′−ＥｃｏＲＩ断片を切除した。この断片を４９０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩ断片とと
もにＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩで切断したベクターｐＢＳ−ＳＫ
＋ に連結し、プラスミ
ドｐＪＣＡ０２０を産生した。プラスミドｐＪＣＡ０２０はカセットＨ６−ＥＨＶ−１ ｇＤを含有する。
【０４９２】
ＥＨＶ−１ ｇＤコード配列の７２０ｂｐの５′側領域を、テンプレートとしてのプラス
10
ミドｐＪＣＡ０２０およびオリゴヌクレオチドＪＣＡ０４４（配列認識番号２３３）
【化１５２】
とＪＣＡ１６５（配列認識番号２３４）
【化１５３】
を用いてＰＣＴ誘導した。この断片をＥｃｏＲＩで切断し、キナーゼした。１０７ｂｐ ４２Ｋプロモーター要素を、テンプレートとしてのプラスミドｐＡＭ１２およびオリゴヌ
20
クレオチドＲＧ２８６（配列認識番号２３５）
【化１５４】
とＪＣＡ１６４（配列認識番号２３６）
【化１５５】
を用いてＰＣＲ誘導した。この断片をＢａｍＨＩで切断し、キナーゼし、７２０ｂｐのＡ
ＴＧ−ＥＨＶ−１ ｇＤ ５′−ＥｃｏＲＩ断片とともにＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断
したベクターｐＢＳ−ＳＫ
＋ 30
に連結し、プラスミドｐＪＣＡ０３５を産生した。接合４
２Ｋ−ＥＨＶ−１ ｇＤおよびＥＨＶ−１ ｇＤ ５′部分の４２Ｋプロモーターの配列
をｐＪＣＡ０３５の直接の塩基配列決定法により確認した。
【０４９３】
プラスミドｐＪＣＡ０３５をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断し、８３０ｂｐのＢａｍＨＩ
−４２Ｋ−ＥＨＶ−１ ｇＤ ５′部分−ＥｃｏＲＩ断片（Ｆ）を単離した。プラスミド
ｐＪＣＡ０２０をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断し、５００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＥＨＶ−１
ｇＤ ３′末端浄化−ＸｂａＩ断片（Ｇ）を単離した。次いで断片ＦおよびＧを、Ｂａ
ｍＨＩとＸｂａＩで切断したベクターｐＢＳ−ＳＫ
＋ にともに連結し、プラスミドｐＪ
ＣＡ０３８を産生した。プラスミドｐＪＣＡ０３８は、ベクターｐＢＳ−ＳＫ
＋ 中にカ
40
セット４２Ｋ−ＥＨＶ−１ ｇＤを含有している。プラスミドｐＪＣＡ０３８をＢａｍＨ
ＩとＨｐａＩで切断し、１３４０ｂｐのＨｐａＩ−４２Ｋ−ＥＨＶ−１ ｇＤ−ＢａｍＨ
Ｉ断片を単離した。この断片を、ＢａｍＨＩとＳｍａＩで切断したプラスミドｐＳＤ５４
４（ＨＡ ｄｅｏｒｆｅｄ座）に連結し、プラスミドｐＪＣＡ０６４を産生した。プラス
ミドｐＪＣＡ０６４は、カセット４２Ｋ−ＥＨＶ−１ ｇＤをＮＹＶＡＣＨＡ ｄｅｏｒ
ｆｅｄ座に挿入する供与体プラスミドである。ＩＶＲの前にＮｔＩを用いてプラスミドｐ
ＪＣＡ０６４を線状化した。
【０４９４】
供与体プラスミドとしてのｐＪＣＡ０６４および治療ウイルスとしての組換えワクシニア
ウイルスｖＰ９５６（ＮＹＶＡＣバックグラウンド）を用いてベロ細胞において生体外実
50
(136)
JP 3602844 B2 2004.12.15
験を行なった。これは標準方法に関して行なった（ピッチーニら、１９８７）。ＡＴＩ ｄｅｏｒｆｅｄ座にＥＨＶ−１ ｇＢおよびｇＣ遺伝子を、ＨＡ ｄｅｏｒｆｅｄ座にＥ
ＨＶ−１ ｇＤ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣベースの組換え体をｖＰ１０２５と称した。
【０４９５】
供与体プラスミドｐＪＣＡ０４３の産生
プラスミドｐＪＣＡ０１１およびオリゴヌクレオチドＪＣＡ１５９（配列認識番号２３７
）
【化１５６】
10
とＪＣＡ１６０（配列認識番号２３８）
【化１５７】
を用いて２２０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥＨＶ−１ ｇＢ ３′側領域をＰＣＲ誘導した
。この断片をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断
したベクターｐＢＳ−ＳＫ
＋ に連結し、プラスミドｐＪＣＡ０３６を産生した。ｐＪＣ
Ａ０３６の直接の塩基配列決定法により、ＥＨＶ−１ ｇＢ ３′側領域ＰＣＲ断片の配
列を確認した。
【０４９６】
20
プラスミドｐＪＣＡ０３３をＥｃｏＲＶとＫｐｎＩで切断し、ＫｐｎＩ−ＥＨＶ−１ ｇ
Ｃ ３′側領域−ＥｃｏＲＶ断片（Ｈ）を単離した。プラスミドｐＪＣＡ０３８をＢａｍ
ＨＩとＨｐａＩで切断し、１３６０ｂｐのＨｐａＩ−４２Ｋ−ＥＨＶ−１ ｇＤ−Ｂａｍ
ＨＩ断片（Ｉ）を単離した。プラスミドｐＶＨＡＨ６ｇ１３をＫｐｎＩとＸｈｏＩで切断
し、９００ｂｐのＸｈｏＩ−ＥＨＶ−１ ｇＣ中央部分−ＫｐｎＩ断片（Ｊ）を単離した
。次いで断片Ｈ、ＩおよびＪを、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断したベクターｐＢＳ−ＳＫ
＋ にともに連結し、プラスミドｐＪＣＡ０４１を産生した。
【０４９７】
プラスミドｐＪＣＡ０３４をＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで切断し、５９００ｂｐの線状化
ベクターＸｈｏＩ−ｐＢＳ−ＳＫ
＋ −Ｉ３Ｌ−ＥＨＶ−１ ｇＢ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片
30
（Ｋ）を単離した。プラスミドｐＪＣＡ０３６をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、
２２０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥＨＶ−１ ｇＢ ３−−側領域−ＢａｍＨＩ断片（Ｌ）
を単離した。プラスミドｐＶＨＡＨ６ｇ１３をＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで切断し、４４０ｂ
ｐのＢｇｌＩＩ−Ｈ６−ＥＨＶ−１ｇＣ ５′部分−ＸｈｏＩ断片（Ｍ）を単離した。次
いで断片Ｋ、Ｌおよびｍをともに連結し、プラスミドｐＪＣＡ０４０を産生した。
【０４９８】
プラスミドｐＪＣＡ０４０をＳｍａＩとＸｈｏＩで切断し、３５５０ｂｐのＳｍａＩ−Ｉ
３Ｌ−ＥＨＶ−１ ｇＢ−−ＥＨＶ−１ ｇＣ ５′部分−ＸｈｏＩ断片（Ｎ）を単離し
た。プラスミドｐＪＣＡ０４１をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断し、２４６０ｂｐのＸｈｏ
Ｉ−ＥＨＶ−１ ｇＣ ３′部分−−４２Ｋ−ＥＨＶ−１ ｇＤ−ＢａｍＨＩ断片（Ｏ）
40
を単離した。断片ＮおよびＯを最終的に、ＢｇｌＩＩとＳｍａＩで切断したプラスミドｐ
ＳＤ５４１ＶＣ（ＮＹＶＡＣ ＡＴＩ ｄｅｏｒｆｅｄ座）にともに連結し、プラスミド
ｐＪＣＡ０４３を産生した。プラスミドｐＪＣＡ０４３は、Ｉ３Ｌ−ＥＨＶ−１ ｇＢ−
−Ｈ６−ＥＨＶ−１ ｇＣ−−４２Ｋ−ＥＨＶ−１ ｇＤ三重構造をＮＹＶＡＣ ＡＴＩ
ｄｅｏｒｆｅｄ座に挿入する供与体プラスミドである。ＩＶＲの前にＮｏｔＩを用いて
プラスミドｐＪＣＡ０４３を線状化した。
【０４９９】
供与体プラスミドとしてｐＪＣＡ０４３および治療ウイルスとしてｖＰ８６６（ＮＹＶＡ
Ｃ）を用いて初代鶏胚繊維芽細胞において生体外実験を行なった。標準方法を用いて産生
した組換え体を同定し、精製した（ピッチーニら、１９８７）。ＡＴＩ ｄｅｏｒｆｅｄ
50
(137)
JP 3602844 B2 2004.12.15
座にＥＨＶ−１ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣベースの組換え体を
ｖＰ１０４３と称した。
【０５００】
実施例２６−ＥＨＶ−１ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質相同物を発現するＡＬＶＡ
Ｃベースの組換え体の産生
供与体プラスミドｐＪＣＡ０４９の産生
プラスミドｐＪＣＡ０４０をＳｍａＩとＸｈｏＩで切断し、３５５０ｂｐのＳｍａＩ−Ｉ
３Ｌ−ＥＨＶ−１ ｇＢ−−Ｈ６−ＥＨＶ−１ ｇＣ ５′部分−ＸｈｏＩ断片（Ａ）を
単離した。プラスミドｐＪＣＡ０４１をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断し、２４６０ｂｐの
ＸｈｏＩ−ＥＨＶ−１ ｇＣ ３′部分−−４２Ｋ−ＥＨＶ−１ ｇＤ−ＢａｍＨＩ断片
10
（Ｂ）を単離した。断片ＡおよびＢを、ＢａｍＨＩとＳｍａＩで切断したプラスミドｐＳ
ＰＶＱＣ３Ｌにともに連結し、プラスミドｐＪＣＡ０４９を産生した。ｐＪＣＡ０４９は
、Ｉ３Ｌ−ＥＨＶ−１ ｇＢ−−Ｈ６−ＥＨＶ１ ｇＣ−−４２Ｋ−ＥＨＶ−１ ｇＤ三
重構造をＡＬＶＡＣ Ｃ３ ｄｅｏｒｆｅｄ座に挿入するプラスミドである。ＩＶＲの前
に、ＮｏｔＩを用いてプラスミドｐＪＣＡ０４９を線状化した。
【０５０１】
供与体プラスミドとしてのｐＪＣＡ０４９および治療ウイルスとしてのＣＰｐｐ（ＡＬＶ
ＡＣ）を用いて、初代鶏胚繊維芽細胞において生体外実験を行なった。標準方法を用いて
産生した組換え体を同定し精製した（ピッチーニら、１９８７）。Ｃ３ ｄｅｏｒｆｅｄ
座にＥＨＶ−１ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有するＡＬＶＡＣベースの組換え体を
20
ｖＣＰ１３２と称した。
【０５０２】
実施例２７−ＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣ−ベースのウマヘルペスウイルス１型三重組
換え体の発現分析
ＥＨＶ−１ ｇＢ（１６Ｇ５または３Ｆ６）、ＥＨＶ−１ ｇＣ（１４Ｈ７）およびＥＨ
Ｖ−１ ｇＤ（２０Ｃ４）に特異的な単クローン性抗体を用いて、前述したように（テイ
ラーら、１９９０）蛍光抗体法アッセイを行なった。全ての抗ＥＨＶ−１単クローンをジ
ョージアレン（４０５４６−００７６、ケンタッキー州、レキシントン、ケンタッキー大
学、獣医科学科）から得た。３つのＥＨＶ−１特異的産生物全ての発現は、ｖＰ１０２５
、ｖＰ１０４３まはｖＣＰ１３２のいずれに感染した細胞内部に検出可能であった。ＥＨ
30
Ｖ−１ ｇＣ糖タンパク質のみが、感染細胞の表面上に良好に発現された。ＥＨＶ−１ ｇＢ糖タンパク質の表面発現は非常に弱く、ＥＨＶ−１ ｇＤ糖タンパク質の表面発現は
疑わしいものであった。
【０５０３】
同一の単クローン性抗体を用いて免疫沈降を行ない、発現されたＥＨＶ−１ ｇＢ、ｇＣ
およびｇＤ遺伝子産生物の真正を測定した。ＥＨＶ−１ ｇＢ糖タンパク質に特異的な単
クローン性３Ｆ６は、組換えウイルスｖＰ９５６、ｖＰ１０２５、ｖＰ１０４３またはｖ
ＣＰ１３２に感染した細胞から誘導された溶解産物からの１３８ｋＤａ、７０ｋＤａおよ
び５４ｋＤａのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルシステム上の見かけ分子質量を有するタンパク質を
沈殿せしめた。未感染細胞またはいずれの親ウイルス（ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ）感
40
染細胞から誘導された溶解産物からはどのタンパク質も沈殿しなかった。ＥＨＶ−１ ｇ
Ｃ糖タンパク質に特異的な単クローン性１４Ｈ７は、ｖＰ９５６、ｖＰ１０２５またはｖ
Ｐ１０４３のいずれかに感染した細胞から誘導された溶解産物からは９０ｋＤａの見かけ
分子質量を有する糖タンパク質を沈殿せしめた。組換え体ｖＣＰ１３２により発現された
ＥＨＶ−１ ｇＣ糖タンパク質は、組換え体ｖＰ９５６、ｖＰ１０２５またはｖＰ１０４
３により発現された糖タンパク質よりもやや小さな（約２ｋＤａ小さい）見かけ分子質量
を有する。ＥＨＶ−１ ｇＤ糖タンパク質に特異てきな単クローン性抗体２０Ｃ４は、ｖ
Ｐ１０２５、ｖＰ１０４３またはｖＣＰ１３２に感染した細胞から誘導された溶解産物か
らは５５ｋＤａの見かけ分子質量を有する糖タンパク質を沈殿せしめた。
【０５０４】
50
(138)
JP 3602844 B2 2004.12.15
またはＧ．アレンから得たウサギ抗−ＥＨＶ−１高度免疫血清を用いて免疫沈降を行なっ
た。この血清は、ｖＰ１０２５、ｖＰ１０４３またはｖＣＰ１３２のいずれかに感染した
細胞から誘導された溶解産物から３つのＥＨＶ−１産生物全てを沈殿せしめた。
【０５０５】
実施例２８−ハムスター抗原投与モデルを用いて得られた防御データ
抗原投与実験（ハムスターモデル）をローンメリクス（フランス、リヨン）で行ない、ポ
ックスウイルスＥＨＶ−１組換え体ｖＰ９５６、ｖＰ１０２５およびｖＣＰ１３２により
誘発した防御の相対水準を評価した。ハムスターを０日にワクチン接種し、１４日にＥＨ
Ｖ−１組換え体の様々な希釈物を追加抗原投与した。全て免疫し、対照の動物に、２８日
にハムスター適用ＥＨＶ−１抗原投与気株を抗原投与した。死亡した動物の最終的な数は
10
３５日（抗原投与後７日）に数えた。抗原投与実験の結果を表３０に示す。
【０５０６】
【表３０】
20
30
実施例２９−イヌの免疫持続期間の研究
この研究の目的は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の１回の接種後のイヌに防御免疫応
答が保持される期間を測定することにある。抗狂犬病抗体を有さない生後８か月の、４１
匹のビーグル犬に、皮下経路により６．７ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０のＡＬＶＡＣ−ＲＧの
１回の接種量を接種した。ワクチン接種後、０日と１、２、３、６および１２か月でイヌ
を採血し、ＲＦＦＩ試験を用いて抗狂犬病抗体の存在について血清をアッセイした。全て
40
の動物を、ワクチン接種の副作用について監視した。
【０５０７】
ワクチン接種から６か月後、５匹のイヌに、狂犬病ウイルスの毒性ＮＹＧＳ菌株を筋内接
種により抗原投与した。その動物には側頭筋に１０
３ ． ４ ５０％マウス致死量を投与し
た。３匹の未接種対照動物にも同一の接種を行なった。１１匹のワクチン接種したイヌと
３匹の未接種対し卯よイヌには、ワクチン接種から１２か月後に同一の方法で抗原投与し
た。血清学的結果と６および１２か月での抗原投与の結果を表３１に示す。
【０５０８】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）でワクチン接種したどのイヌもワクチン接種に対する副
作用は示さなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を接種した全てのイヌは、ワクチ
50
(139)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ン接種から７日後に狂犬病ウイルス中和抗体の誘発を示した。最大の力価は、ワクチン接
種後１４から２８日の間に達成され、その後減少した。ワクチン接種から６または１２か
月後での抗原投与の時に、力価は低く、ある動物においてはゼロに近かった。低い力価に
もかかわらず、全ての動物は、ワクチン接種をしなかった対照イヌが死んだ致死狂犬病抗
原投与にも生存した。ワクチン接種から６か月後の抗原投与に生存した動物のＲＦＦＩ力
価を８か月目（抗原投与から２か月後）に評価した。これらの動物の血清力価は、７．４
、７．４、２．３、１．８、および７．４国際単位であった。狂犬病中和抗体のこれらの
上昇し保持された水準は、動物が最初の１回の接種により効果的に備えられたことを示す
。実験は進行中であり、残りの動物は、ワクチン接種から２または３年後に抗原投与する
。しかしながら、データに関して、実験を成功であり、本発明の効用を説明している。
【０５０９】
【表３１】
10
(140)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(141)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
実施例３０−ＮＹＶＡＣ中のウシヘルペスウイルス１型ＢＨＶ１遺伝子の発現
ＮＹＶＡＣ／ＢＨＶ１ ｇＩＶ組換え体の産生
プラスミドｐＢＨＶｇＩＶをローンメリクスから得た。このプラスミドは、３．９ｋｂ ＰｓｔＩ断片上にコードされ、ｐＢＳ−ＳＫ
＋ のＰｓｔＩ部位にクローニングされるＢ
ＨＶ１ ｇＩＶ遺伝子（ストローブ菌株）を含有する。このプラスミドからのｇＩＶ遺伝
子（チコーら、Ｊ．ビロル（１９９０）６４：５１３２）をワクシニアウイルスフランキ
50
(142)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ングアームの間にクローニングした。ｇＩＶ遺伝子をが有するｐＢＨＶｇＩＶの２，００
０ｂｐ ＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ断片を、ｐＳＤ５４２のＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ部位（実施例３
２に定義）にクローニングすることによりこのことを行なった。この操作により産生され
たプラスミドをｐＢＨＶ１と称する。
【０５１０】
次いでπプロモーターの３′末端をｇＩＶ遺伝子の上流にクローニングした。これは、π
プロモーターの３′末端とｇＩＶ遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌクレオチドＢＨ
ＶＬ７（配列認識番号２３９）
【化１５８】
10
およびＢＨＶＬ８（配列認識番号２４０）
【化１５９】
20
をｐＢＨＶ１の５，５００ｂｐの部分的ＳｓｔＩＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングするこ
とにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ３と称する。
【０５１１】
次いで異種３′非コード配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチドＢＨＶＬ５（配列
認識番号２４１）（５′−ＧＧＧＴＧＡＣＴＧＣＡ−３′）およびＢＨＶＬ６（配列認識
番号２４２）（５′−ＧＴＣＡＣＣＣ−３′）をｐＢＨＶ３の５，２００ｂｐの部分的Ｓ
ｍａＩ−ＰｓｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生した
プラスミドをｐＢＶＨ４と称する。
【０５１２】
30
次いで異種リンカー配列を除去した。これはｐＢＨＶ４の５，２００ｂｐ ＰｓｔＩ断片
を連結することにより行なった。この操作により産生されたプラスミドをｐＢＨＶ５と称
する。
【０５１３】
次いでπプロモーターの５′末端をｐＢＨＶ５にクローニングした。これは、πプロモー
ターの５′末端を含有するｐＰＩ４の１３０ｂｐ ＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＢＨＶ
５の５，２００ｂｐ ＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった
。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ６と称する。
【０５１４】
ｐＢＨＶ６を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実験
40
に用いてｖＰ１０５１を産生した。
【０５１５】
免疫沈降を行なって、ｖＰ１０５１が真正ＢＨＶ１ ｇＩＶ糖タンパク質を発現するか否
かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．でＮ
ＹＶＡＣに感染せしめたか、またはｖＰ１０５１に感染せしめた。１時間の吸着期間後、
接種物を吸引して、２％のウシ胎仔血清と［
３ ５
Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）
を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（メチオニンのない）を細胞に添加した。１ｍｌの
３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ
、０．０３％のＮａ Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）および５０ｍｌの
アプロチニンの添加と続いての細胞単層のかきとりにより細胞を感染から７時間後に収集
50
(143)
JP 3602844 B2 2004.12.15
した。
【０５１６】
次いでＢＨＶ１ ｇＩＶ特異的単クローン性抗体３４０２（ＷＩ、マジソン、ウィスコン
シン大学、Ｄｒ．ジオフリーリッチワースから得た）を用いて溶解産物を、ＢＨＶ１ ｇ
ＩＶ発現に関して分析した。これは以下の方法によって行なった。ラット抗マウス血清を
室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５
回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体をｇＩＶ特異的単クロ
ーン性抗体３４０２に結合せしめた。一方で、通常のマウス血清およびタンパク質Ａセフ
ァロース結合ラット抗マウス抗体を４℃で一晩に亘りインキュベーションすることにより
、溶解産物を前浄化した。この物質を１×の緩衝液Ａで５回洗浄した後、ＢＨＶ１セファ
10
ロース単クローン性抗体、ラット抗マウス、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物
に加え、４℃で一晩に亘りインキュベーションした。その試料を、１×緩衝液Ａで５回、
ＬｉＣｌ２ ／尿素緩衝液で２回洗浄した後、２×ラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス
（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノ
ール）を添加し、５分間沸騰せしめることにより、沈殿したタンパク質を免疫複合体から
分離した。次いでタンパク質を１０％のドリファスゲルシステムで分画し（ドリファスら
、１９８４）、固定し、蛍光光度法のために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【０５１７】
ＢＨＶ１ ｇＩＶ特異的単クローン性抗体３４０２は、ｖＰ１０５１感染細胞からＢＨＶ
１ ｇＩＶ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、ＮＹＶＡＣまたは疑似感染細胞から
20
はＢＨＶ１−特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
【０５１８】
ＮＹＶＡＣ／ＢＨＶ１ ｇＩおよびｇＩＶ組換え体の産生
ＢＨＶ１ ｇＩＶ遺伝子を含有するプラスミドｐＢＨＶｇＩＶは、ローンメリクスから得
た。このプラスミドからのｇＩＶ遺伝子をワクシニアウイルスフランキングアームの間に
クローニングした。これは、ｇＩＶ遺伝子を含有するｐＢＨＶ１ｇＩＶの２，０００ｂｐ
のＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ断片を、ｐＳＤ５４２のＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングす
ることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ１と称する。
【０５１９】
次いでπプロモーターの３′末端をｇＩＶ遺伝子の上流にクローニングした。これは、π
30
プロモーターの３′末端とｇＩＶ遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌクレオチドＢＨ
ＶＬ７（配列認識番号２３９）およびＢＨＶＬ８（配列認識番号２４０）をｐＢＨＶ１の
５，５００ｂｐの部分的ＳｓｔＩＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なっ
た。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ３と称する。
【０５２０】
次いで異種３′非コード配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチドＢＨＶＬ５（配列
認識番号２４１）およびＢＨＶＬ６（配列認識番号２４２）をｐＢＨＶ３の５，２００ｂ
ｐ部分的ＳｍａＩ−ＰｓｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作によ
り産生したプラスミドをｐＢＨＶ４と称する。
【０５２１】
40
次いで異種リンカー配列を除去した。これし、ｐＢＨＶ４の５，２００ｂｐのＰｓｔＩ断
片を連結することにより行なった。この操作により産生されたプラスミドをｐＢＨＶ５と
称する。
【０５２２】
次いでπプロモーターの５′末端をｐＢＨＶ５にクローニングした。これは、πプロモー
ターの５′末端を含有するｐＰＩ４の１３０ｂｐのＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＢＨＶ
５の５，２００ｂｐのＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった
。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ６と称する。
【０５２３】
次いでＢＨＶ１ ｇＩ遺伝子をｐＢＨＶ６にクローニングした。これは、Ｈ６プロモート
50
(144)
JP 3602844 B2 2004.12.15
したｇＩ遺伝子を含有するｐＢＨＶ８の２，９００ｂｐのＢｇｌＩＩ断片をｐＢＨＶ６の
ＢｇｌＩＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラス
ミドをｐＢＨＶ９と称する。
【０５２４】
ｐＢＨＶ８を以下の方法により産生した。プラスミドｐＩＢＲＳ６をローンメリクスから
得た。このプラスミドは、ＢＨＶ１ｇＩ遺伝子を含有する６．６ｋｂのＳａｌＩ断片（ス
トローブ菌株）を含有する。ｇＩ遺伝子の５′末端（ホワイトベックら、Ｊ．ビロル（１
９８８）６２：３３１９）をＨ６プロモーターの下流と、ワクシニアウイルスＨＡフラン
キングアームの間にクローニングした。これは、ｐＩＢＲＳ６の５４ｂｐのＳａｌＩ−Ｐ
ｓｔＩ断片をｐＧＤ５の４，４００ｂｐのＳａｌＩ−ＰｓｔＩ断片にクローニングするこ
10
とにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＩＢＲ２と称する。
【０５２５】
次いでＨ６プロモーターの開始コドンを、オリゴヌクレオチドＩＢＲＬ１（配列認識番号
２４３）
【化１６０】
およびＩＢＲＬ２（配列認識番号２４４）
20
【化１６１】
を、ｐＩＢＲ２の３，８００ｂｐのＮｒｕＩ−ＳｓｔＩ断片にクローニングすることによ
り行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＩＢＲ４と称する。
【０５２６】
次いで将来の操作に必要なＮｃｏＩ部位をｇＩ配列の下流に産生した。これは、オリゴヌ
クレオチドＩＢＲＬ３（配列認識番号２４５）
30
【化１６２】
およびＩＢＲＬ４（配列認識番号２４６）
【化１６３】
をｐＩＢＲ４のＰｓｔＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産
生したプラスミドをｐＩＢＲ５と称する。
【０５２７】
40
次いで追加のｇＩ配列をｐＩＢＲ５にクローニングした。これは、ｐＩＢＲＳ６の１，７
４０ｂｐのＴｔｈ１１１Ｉ−ＮｃｏＩ断片をｐＩＢＲ５の３，７００ｂｐのＴｔｈ１１１
Ｉ−ＮｃｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラ
スミドをｐＩＢＲ７と称した。
【０５２８】
次いで将来の操作に必要なＢｇｌＩＩ部位をｇＩ配列の下流に産生した。これは、オリゴ
ヌクレオチドＩＢＲＬ５（配列認識番号２４７）
【化１６４】
50
(145)
JP 3602844 B2 2004.12.15
およびＩＢＲＬ６（配列認識番号２４８）
【化１６５】
をｐＩＢＲ７のＮｃｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産
生したプラスミドをｐＩＢＲ８と称する。
【０５２９】
次いでｇＩ遺伝子の３′末端をｐＩＢＲ８にクローニングした。これは、ｐＩＢＲＳ６の
２，２８５ｂｐ ＳｔｕＩ断片をＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）
が充填されたｐＩＢＲ８の４，３００ｂｐ ＳｔｕＩ−ＢｇｌＩＩ（部分的）断片にクロ
10
ーニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＩＢＲ２０と
称する。
【０５３０】
次いでＨ６プロモートしたＢＨＶ１ ｇＩ遺伝子をワクシニアウイルス供与体プラスミド
に移動せしめた。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）が充填
されたｐＩＢＲ２０の２，９００ｂｐ ＢｇｌＩ−ＮｃｏＩ（部分的）断片をｐＳＤ５４
２のＳｍａＩ部位にクローニングすることにより行なった。これによりＨ６プロモートし
たｇＩ遺伝子をｔｋフランキングアームの間に配する。この操作により産生したプラスミ
ドをｐＩＢＲ２２と称する。
【０５３１】
20
次いでＢｇｌＩＩ部位をＨ６プロモーターの下流に産生した。これは、ｐＩＢＲ２２の２
，８００ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＧＤ３の３，５００ｂｐ Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片にクローニングすることにより行なった。（ｐＧＤ３は、Ｈ６プ
ロモートした２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ２）ｇＤ遺伝子から下流のＧｇｌＩＩ部
位を含有する。この操作により、ＨＳＶ２ｇＤ配列をＢＨＶＩｇＩ遺伝子が置換され、そ
れゆえＨ６プロモートしたｇＩ遺伝子から下流にＢｇｌＩＩ部位を産生する）。この操作
により産生したプラスミドをｐＢＨＶ８と称する。
【０５３２】
ｐＢＨＶ９を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実験
に用いてｖＰ１０７４を産生した。
30
【０５３３】
免疫沈降分析を行ない、ｖＰ１０７４が真正ＢＨＶ１ ｇＩおよびｇＩＶ糖タンパク質を
発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染したか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．
ｉ．でＮＹＶＡＣに感染せしめたか、またはｖＰ１０７４に感染せしめた。１時間の吸着
期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［
３ ５
Ｓ］−メチオニン（
２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）を
添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）
、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ
）および５０ｍｌのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることにより、感染
から７時間後に細胞を収集した。
40
【０５３４】
次いでＢＨＶ１ ｇＩ特異的単クローン性抗体５１０６、およびｇＩＶ特異的単クローン
性抗体３４０２（ＷＩ、マジソン、ウィスコンシン大学、Ｄｒ．ジオフェリーリッチワー
スから得た）を用いて、溶解産物をＢＨＶ１ ｇＩおよびｇＩＶ発現に関して分析した。
これは以下の方法により行なった。ラット抗マウス血清を室温で４時間に亘りタンパク質
Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセ
ファロース結合ラット抗マウス抗体をｇＩ特異的単クローン性抗体とｇＩＶ特異的単クロ
ーン性抗体に結合せしめた。一方で、通常マウス血清とタンパク質Ａセファロース結合ラ
ット抗マウス抗体を４℃で一晩インキュベーションすることにより溶解産物を前浄化した
。この物質を１×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、ｇＩまたはｇＩＶ特異的単クローン性抗
50
(146)
JP 3602844 B2 2004.12.15
体、ラット抗マウス、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩イ
ンキュベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、ＬｉＣｌ２ ／尿素緩衝液で２回
洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤ
Ｓ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸
騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を１０％の
ドリファスゲルシステムで分画し（ドリファスら、１９８４）、固定し、蛍光光度法のた
めに１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【０５３５】
ＢＨＶ１ ｇＩおよびｇＩＶ特異的単クローン性抗体、５１０６および３４０２は、ｖＰ
１０７４感染細胞からＢＨＶ１ ｇＩおよびｇＩＶ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめた
10
が、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ感染細胞からのＢＨＶ１−特異的タンパク質は沈殿し
なかった。
【０５３６】
ＮＹＶＡＣ／ＢＨＶ１ ｇＩＩＩ組換え体の産生
プラスミドｐＢＨＶｇＩＩＩをローンメリクスから得た。このプラスミドは、ｐＢＳＫ
＋
のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされた３．４ｋｂのＢａｍＨＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ断片上にコードされたＢＨＶ１ ｇＩＩＩ遺伝子（ストローブ菌株）を含有
する。このプラスミドからのｇＩＩＩ遺伝子（フィッツパトリックら、ウイルス学、（１
９８９）１７３ ：１４６ ）をワクシニアウイルスフランキングアームの間にクローニ
ングした。これは、ｇＩＩＩ遺伝子の５′末端を含有するｐＢＨＶｇＩＩＩの１，０００
20
ｂｐのＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片、およびＩ３Ｌプロモーターをコードするオリゴヌクレオ
チドＢＨＶＬ１（配列認識番号２４９）
【化１６６】
とＢＨＶＬ２（配列認識番号２５０）
【化１６７】
30
をｐＳＤ５４４のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。こ
の操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ２と称する。
【０５３７】
次いでｇＩＩＩ遺伝子の３′末端をｐＢＨＶ２にクローニングした。これは、ｇＩＩＩ遺
伝子の３′末端をコードする、オリゴヌクレオチドＢＨＶＬ１５（配列認識番号２５１）
【化１６８】
40
およびＢＨＶＬ１６（配列認識番号２５２）
【化１６９】
をｐＢＨＶ２の４，７００ｂｐ ＸｈｏＩ−Ａｓｐ７１８断片にクローニングすることに
50
(147)
JP 3602844 B2 2004.12.15
より行なった。この操作により産生したフラクションをｐＢＨＶ７と称する。
【０５３８】
次いでｇＩＩＩ遺伝子の残りをｐＢＨＶ７にクローニングした。これは、ｇＩＩＩ遺伝子
の内側部分を含有するｐＢＨＶｇＩＩＩの５００ｂｐ 部分的ＳｍａＩ−ＸｈｏＩ断片を
ｐＢＨＶ７の４，７５０ｂｐの部分的ＳｍａＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることに
より行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ１０と称する。
【０５３９】
ｐＢＨＶ１０を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実
験に用いてｖＰ１０７３を産生した。
【０５４０】
10
免疫沈降分析を行なって、ｖＰ１０７３が真正ＢＨＶ１ ｇＩＩＩ糖タンパク質を発現す
るか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ
．でＮＹＶＡＣに感染せしめたか、またはｖＰ１０７３に感染せしめた。１時間の吸着期
間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［
３ ５
Ｓ］−メチオニン（２
０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）を添
加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、
３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）
および５０ｍｌのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることにより、感染か
ら７時間後に細胞を収集した。
【０５４１】
20
次いでＢＨＶ１ ｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体１５０７（ＷＩ、マジソン、ウィスコ
ンシン大学、Ｄｒ．ジオフェリーリッチワースから得た）を用いて、溶解産物をＢＨＶ１
ｇＩＩＩ発現に関して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗マウス血
清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質
を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体をｇＩＩＩ特異的
単クローン性抗体、１５０７に結合せしめた。一方で、通常マウス血清とタンパク質Ａセ
ファロース結合ラット抗マウス抗体を４℃で一晩インキュベーションすることにより溶解
産物を前浄化した。この物質を１×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、ｇＩＩＩ特異的単クロ
ーン性抗体、ラット抗マウス、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃
で一晩インキュベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、ＬｉＣｌ２ ／尿素緩衝
30
液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４
％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５
分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を
１０％のドリファスゲルシステムで分画し（ドリファスら、１９８４）、固定し、蛍光光
度法のために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【０５４２】
ＢＨＶ１ ｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体、１５０７は、ｖＰ１０７３感染細胞からの
ＢＨＶ１ ｇＩＩＩ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＮＹＶ
ＡＣ感染細胞からのＢＨＶ１−特異的タンパク質は沈殿せしめなかった。
【０５４３】
40
ＮＹＶＡＣ／ＢＨＶ１ ｇＩＩＩおよびｇＩＶ組換え体の産生
ＢＨＶ１ ｇＩＶ遺伝子を含有するプラスミドｐＢＨＶｇＩＶをローンメリクスから得た
。このプラスミドからのｇＩＶ遺伝子をワクシニアウイルスフランキングアームの間にク
ローニングした。これは、ｇＩＶ遺伝子を含有するｐＢＨＶｇＩＶの２，０００ｂｐ Ｐ
ｓｔＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＳＤ５４２のＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングすること
により行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ１と称する。
【０５４４】
次いでπプロモーターの３′末端をｇＩＶ遺伝子の上流にクローニングした。これは、π
プロモーターの３′末端およびｇＩＶ遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌクレオチド
ＢＨＶＬ７（配列認識番号２３９）およびＢＨＶＬ８（配列認識番号２４０）をｐＢＨＶ
50
(148)
JP 3602844 B2 2004.12.15
１の５，５００ｂｐ 部分的ＳｓｔＩＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行
なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ３と称する。
【０５４５】
次いで異種３′非コード配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチドＢＨＶＬ５（配列
認識番号２４１）およびＢＨＶＬ６（配列認識番号２４２）をｐＢＨＶ３の５，２００ｂ
ｐの部分的ＳｍａＩ−ＰｓｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作に
より産生したプラスミドをｐＢＨＶ４と称する。
【０５４６】
次いで異種リンカー配列を除去した。これは、ｐＢＨＶ４の５，２００ｂｐ ＰｓｔＩ断
片を連結することにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ５と称
10
する。
【０５４７】
次いでπプロモーターの５′末端をｐＢＨＶ５にクローニングした。これは、πプロモー
ターの５′末端を含有するｐＰＩ４の１３０ｂｐ ＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＢＨＶ
５の５，２００ｂｐ ＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった
。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ６と称する。
【０５４８】
次いでＢＨＶ１ ｇＩＩＩ遺伝子をｐＢＨＶ６にクローニングした。これは、Ｉ３Ｌプロ
モートしたｇＩＩＩ遺伝子を含有するｐＢＨＶ１０の１，６００ｂｐＡｓｐ７１８−Ｂａ
ｍＨＩ断片をｐＢＨＶ６の５，３００ｂｐ 部分的ＢａｍＨＩ−Ａｓｐ７１８断片にクロ
20
ーニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ１１と
称する。
【０５４９】
ｐＢＨＶ１１を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実
験に用いてｖＰ１０８３を産生した。
【０５５０】
免疫沈降分析を行なって、ｖＰ１０８３が真正ＢＨＶ１ ｇＩＩＩおよびｇＩＶ糖タンパ
ク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞
のｍ．ｏ．ｉ．でＮＹＶＡＣに感染せしめたか、またはｖＰ１０８３に感染せしめた。１
時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［
３ ５
Ｓ］−メ
30
チオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグルス培地（メチオニンを含
まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐ
Ｈ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌ
のＰＭＳＦ）および５０ｍｌのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることに
より、感染から７時間後に細胞を収集した。
【０５５１】
次いでＢＨＶ１ ｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体１５０７、およびｇＩＶ特異的単クロ
ーン性抗体３４０２（ＷＩ、マジソン、ウィスコンシン大学、Ｄｒ．ジオフェリーリッチ
ワースから得た）を用いて、溶解産物をＢＨＶ１ ｇＩＩＩおよびｇＩＶ発現に関して分
析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗マウス血清を室温で４時間に亘りタ
40
ンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパ
ク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体をｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体およびｇ
ＩＶ特異的単クローン性抗体に結合せしめた。一方で、通常マウス血清とタンパク質Ａセ
ファロース結合ラット抗マウス抗体を４℃で一晩インキュベーションすることにより溶解
産物を前浄化した。この物質を１×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、ＢＨＶ１ ｇＩＩＩま
たはｇＩＶ特異的単クローン性抗体、ラット抗マウス、タンパク質Ａセファロース複合体
を溶解産物に加え、４℃で一晩インキュベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、
ＬｉＣｌ２ ／尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのト
リス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエ
タノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離し
50
(149)
JP 3602844 B2 2004.12.15
た。次いでタンパク質を１０％のドリファスゲルシステムで分画し（ドリファスら、１９
８４）、固定し、蛍光光度法のために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【０５５２】
ＢＨＶ１ ｇＩＩＩおよびｇＩＶ特異的単クローン性抗体、１５０７および３４０２は、
ｖＰ１０８３感染細胞からのＢＨＶ１ ｇＩＩＩおよびｇＩＶ糖タンパク質を特異的に沈
殿せしめたが、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ感染細胞からのＢＨＶ１特異的タンパク質
は沈殿せしめなかった。
【０５５３】
ＮＹＶＡＣ／ＢＨＶ１ ｇＩおよびｇＩＩＩ組換え体の産生
ＢＨＶ１ ｇＩＩＩ遺伝子を含有するプラスミドｐＢＨＶｇＩＩＩをローンメリクスから
10
得た。このプラスミドからのｇＩＩＩ遺伝子を、ワクシニアウイルスフランキングアーム
の間にクローニングした。これは、ｇＩＩＩ遺伝子の５′末端を含有するｐＢＨＶｇＩＩ
Ｉの１，０００ｂｐ ＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片、およびＩ３Ｌプロモーターをコードする
オリゴヌクレオチドＢＨＶＬ１（配列認識番号２４９）とＢＨＶＬ２（配列認識番号２５
０）をｐＳＤ５４４ＶＣのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行な
った。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ２と称する。
【０５５４】
次いでｇＩＩＩ遺伝子の３′末端をｐＢＨＶ２にクローニングした。これは、ｇＩＩＩ遺
伝子の３′末端をコードするオリゴヌクレオチドＢＨＶＬ１５（配列認識番号２５１）お
よびＢＨＶＬ１６（配列認識番号２５２）をｐＢＨＶ２の４，７００ｂｐ ＸｈｏＩ−Ａ
20
ｓｐ７１８断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラス
ミドをｐＢＨＶ７と称する。
【０５５５】
次いでｇＩＩＩ遺伝子の残りをｐＢＨＶ７にクローニングした。これは、ｇＩＩＩ遺伝子
の内側部分を含有するｐＢＨＶｇＩＩＩの５００ｂｐ 部分的ＳｍａＩ−ＸｈｏＩ断片を
ｐＢＨＶ７の４，７５０ｂｐ部分的ＳｍａＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることによ
り行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ１０と称する。
【０５５６】
次いでＢＨＶ１ ｇＩ遺伝子をｐＢＨＶ１０にクローニングした。これは、Ｈ６プロモー
トしたｇＩ遺伝子を含有するｐＢＨＶ８の２，９００ｂｐ ＢｇｌＩＩ断片をｐＢＨＶ１
30
０のＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプ
ラスミドをｐＢＨＶ１２と称する。
【０５５７】
ｐＢＨＶ１２を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実
験に用いてｖＰ１０８７を産生した。
【０５５８】
免疫沈降分析を行なって、ｖＰ１０８７が真正ＢＨＶ１ ｇＩおよびｇＩＩＩ糖タンパク
質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞の
ｍ．ｏ．ｉ．でＮＹＶＡＣに感染せしめたか、またはｖＰ１０８７に感染せしめた。１時
間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［
３ ５
Ｓ］−メチ
40
オニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグルス培地（メチオニンを含ま
ない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ
７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌの
ＰＭＳＦ）および５０ｍｌのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることによ
り、感染から７時間後に細胞を収集した。
【０５５９】
次いでＢＨＶ１ ｇＩ特異的単クローン性抗体５１０６、およびＢＨＶ１ ｇＩＩＩ特異
的単クローン性抗体１５０７（ＷＩ、マジソン、ウィスコンシン大学、Ｄｒ．ジオフェリ
ーリッチワースから得た）を用いて、溶解産物をＢＨＶ１ ｇＩおよびｇＩＩＩ発現に関
して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗マウス血清を室温で４時間に
50
(150)
JP 3602844 B2 2004.12.15
亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、
タンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体をｇＩ特異的単クローン性抗体および
ｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体に結合せしめた。一方で、通常マウス血清とタンパク質
Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体を４℃で一晩インキュベーションすることにより
溶解産物を前浄化した。この物質を１×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、ＢＨＶ１ ｇＩま
たはｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体、ラット抗マウス、タンパク質Ａセファロース複合
体を溶解産物に加え、４℃で一晩インキュベーションした。この試料を１×緩衝液で４回
、ＬｉＣｌ２ ／尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭの
トリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプト
エタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離
10
した。次いでタンパク質を１０％のドリファスゲルシステムで分画し（ドリファスら、１
９８４）、固定し、蛍光光度法のために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【０５６０】
ＢＨＶ１ ｇＩおよびｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体、５１０６および１５０７は、ｖ
Ｐ１０８７感染細胞からＢＨＶ１ ｇＩおよびｇＩＩＩ糖タンパク質を特異的に沈殿せし
めたが、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ感染細胞からＢＨＶ１特異的タンパク質は沈殿せ
しめなかった。
【０５６１】
ＮＹＶＡＣ／ＢＨＶ１ ｇＩ、ｇＩＩＩおよびｇＩＶ組換え体の産生
ＢＨＶ１ ｇＩＶ遺伝子を含有するプラスミド、ｐＢＨＶｇＩＶをローンメリクスから得
20
た。このプラスミドからのｇＩＶ遺伝子をワクシニアウイルスフランキングアームの間に
クローニングした。これは、ｇＩＶ遺伝子を含有する２，００ｂｐ ＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ
断片をｐＳＤ５４２ＶＣＶＱのＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行
なった。この操作により産生されたプラスミドをｐＢＨＶ１と称する。
【０５６２】
次いでπプロモーターの３′末端をｇＩＶ遺伝子の上流にクローニングした。これは、π
プロモーターの３′末端およびｇＩＶ遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌクレオチド
、ＢＨＶＬ７およびＢＨＶＬ８を、ｐＢＨＶ１の５，５００ｂｐ 部分的ＳｓｔＩ−Ｘｈ
ｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生されたプラスミド
をｐＢＨＶ３と称する。
30
【０５６３】
次いで異種３′非コード配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、ＢＨＶＬ５（配
列認識番号２４１）およびＢＨＶＬ６（配列認識番号２４２）をｐＢＨＶ３の５，２００
ｂｐの部分的ＳｍａＩ−ＰｓｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作
により産生したプラスミドをｐＢＨＶ４と称する。
【０５６４】
次いで異種リンカー配列を除去した。これは、ｐＢＨＶ４の５，２００ｂｐ ＰｓｔＩ断
片を連結することにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ５と称
する。
【０５６５】
40
次いでπプロモーターの５′末端をｐＢＨＶ５にクローニングした。これは、πプロモー
ターの５′末端を含有するｐＰＩ４の１３０ｂｐ ＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＢＨＶ
５の５，２００ｂｐ ＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった
。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ６と称する。
【０５６６】
次いでＢＨＶ１ ｇＩＩＩ遺伝子をｐＢＨＶ６にクローニングした。これは、Ｉ３Ｌプロ
モートしたｇＩＩＩ遺伝子を含有するｐＢＨＶ１０の１，６００ｂｐＡｓｐ７１８−Ｂａ
ｍＨＩ断片をｐＢＨＶ６の５，３００ｂｐ 部分的ＢａｍＨＩ−Ａｓｐ７１８断片にクロ
ーニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ１１と
称する。
50
(151)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０５６７】
次いでＢＨＶ１ ｇＩ遺伝子をｐＢＨＶ１１にクローニングした。これは、Ｈ６プロモー
トしたｇＩ遺伝子を含有するｐＢＨＶ８の２，９００ｂｐ ＢｇｌＩＩ断片をｐＢＨＶ１
１のＢｇｌＩＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプ
ラスミドをｐＢＨＶ１３と称する。
【０５６８】
ｐＢＨＶ１３を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実
験に用いてｖＰ１０７９を産生した。
【０５６９】
免疫沈降分析を行なって、ｖＰ１０７９が真正ＢＨＶ１ ｇＩ、ｇＩＩＩおよびｇＩＶ糖
10
タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ
／細胞のｍ．ｏ．ｉ．でＮＹＶＡＣに感染せしめたか、またはｖＰ１０７９に感染せしめ
た。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［
３ ５
Ｓ
］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグルス培地（メチオニ
ンを含まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリ
ス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ
／ｍｌのＰＭＳＦ）および５０ｍｌのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとる
ことにより、感染から７時間後に細胞を収集した。
【０５７０】
次いでＢＨＶ１ ｇＩ特異的単クローン性抗体５１０６、ＢＨＶ１ ｇＩＩＩ特異的単ク
20
ローン性抗体１５０７、およびｇＩＶ特異的単クローン性抗体、３４０２（ＷＩ、マジソ
ン、ウィスコンシン大学、Ｄｒ．ジオフェリーリッチワースから得た）を用いて、溶解産
物をＢＨＶ１ ｇＩ、ｇＩＩＩおよびｇＩＶ発現に関して分析した。これは以下の方法に
より行なった。ラット抗マウス血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結
合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合ラッ
ト抗マウス抗体をｇＩ、ｇＩＩＩおよびｇＩＶ特異的単クローン性抗体に結合せしめた。
一方で、通常マウス血清とタンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体を４℃で一
晩インキュベーションすることにより溶解産物を前浄化した。この物質を１×緩衝液Ａで
５回洗浄した後に、ＢＨＶ１ ｇＩ、ｇＩＩＩおよびｇＩＶ特異的単クローン性抗体、ラ
ット抗マウス、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩インキュ
30
ベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、ＬｉＣｌ２ ／尿素緩衝液で２回洗浄し
た後に、２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２
０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰によ
り、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を１０％のドリフ
ァスゲルシステムで分画し（ドリファスら、１９８４）、固定し、蛍光光度法のために１
ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【０５７１】
ＢＨＶ１ ｇＩ、ｇＩＩＩおよびｇＩＶ特異的単クローン性抗体、５１０６、１５０７お
よび３４０２は、ｖＰ１０７９に感染した細胞から、ＢＨＶ１ ｇＩ、ｇＩＩＩおよびｇ
ＩＶ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＭＹＶＡＣ感染差異簿
40
からはＢＨＶ１特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
【０５７２】
実施例３１−ＮＹＶＡＣ中のウシウイルス性下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）の発現
ＮＹＶＡＣ／ＢＶＤＶ ｇＥ１／ｇＥ２組換え体の産生
ＢＶＤＶ ｇＥ１（ｇｐ４８／ｇｐ２５）「遺伝子」（オスロス菌株）をｐＩＢＩ２５に
クローニングした。これは、ｐＳＰ６５−ｇＥ１の１，３７０ｂｐ ＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片（ベルギー、リージ、ユーロジェネティックから得た；レナードら、欧州特許第
８６８７００９５号）をＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）でブラン
トエンドし、その末端にＸｈｏＩリンカーを連結し、産生したプラスミドをｐＩＢＩ２５
のＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラス
50
(152)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ミドをｐＢＤＶ１と称する。
【０５７３】
次いでＨ６プロモーターの開始コドンをｇＥ１「遺伝子」の「開始コドン」に配列した。
これは、Ｈ６プロモーターの３′末端およびｇＥ１「遺伝子」の５′末端をコードする、
オリゴヌクレオチド、ＢＤＶＭ４（配列認識番号２５３）
【化１７０】
10
およびＢＤＶＭ５（配列認識番号２５４）
【化１７１】
を、ｐＢＤＶ１の４，２５０ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｈｇｌＩ（部分的）断片にクロー
ニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ６と称す
る。
【０５７４】
次いでｇＥ１「遺伝子」を、Ｈ６＋ＡＴＩ＋ＨＡ三重プロモーター（ポーテテレら、ワク
チン（１９９１）９ ：１９４ ）の下流およびＨＡフランキングアームの間にクローニ
20
ングした。これは、ｇＥ１「遺伝子」を含有するｐＢＤＶ６の１，３８０ｂｐ ＥｃｏＲ
Ｖ−ＰｓｔＩ（部分的）断片を、ｐＡＴＩ２５の３，７００ｂｐ ＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ
断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢ
ＤＶ７と称する。
【０５７５】
次いで、将来の操作に必要なＢａｍＨＩ部位をＢＶＤＶ配列の下流に産生した。これは、
オリゴヌクレオチド、ＢＤＶＭ６（配列認識番号２５５）
【化１７２】
30
を、ｐＢＤＶ７のＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により
産生したプラスミドをｐＢＤＶ８と称する。
【０５７６】
次いでｇＥ２（ｇｐ５３）配列（オスロス菌株）の約８３０ｂｐをｇＥ１配列の下流にク
ローニングした。これは、ｇＥ２配列を含有する、ｐ７Ｆ２の９８０ｂｐ ＢｇｌＩＩ−
ＢａｍＨＩ断片（ベルギー、リージ、ユーロジェネティックから得た；レナードら、欧州
特許第８６８７００９５号）を、ｐＢＤＶ８の５，１００ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ
（部分的）断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラス
ミドをｐＢＤＶ９と称する。
【０５７７】
40
次いでＨ６プロモートしたｇＥ１／ｇＥ２配列をＡＴＩフランキングアームの間にクロー
ニングした。これは、ｇＥ１／ｇＥ２配列を含有する、ｐＢＤＶ９の２，２００ｂｐ Ｎ
ｒｕＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＰＧＩ７の４，９００ｂｐ ＮｒｕＩ−ＢａｍＨＩ断片にク
ローニングすることにより行なった。これにより、ｇＥ１／ｇＥ２配列がＨ６プロモータ
ーの転写制御下に置かれ、挿入ベクターに配される。この操作により産生したプラスミド
をｐＢＤＶ２３と称する。
【０５７８】
次いで約２７０ｂｐの追加のｇＥ２配列（オスロス菌株）を存在するＢＶＤＶ配列の下流
にクローニングした。これは、ｇＥ２配列を含有する、ｐＳＰ６５Ｅ１＋Ｅ２−１の１，
２６０ｂｐ ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（ベルギー、リージ、ユーロジェネティックか
50
(153)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ら得た；レナードら、欧州特許第８６８７００９５号）を、ｐＶＤＶ２３の６，１００ｂ
ｐ断片にクローニングすることにより行なわれた。この操作により産生されたプラスミド
をｐＢＤＶ２４と称する。
【０５７９】
ｐＢＤＶ２４を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実
験に用いて、ｖＰ９７２を産生した。
【０５８０】
免疫沈降分析を行なって、ｖＰ９７２が真正ＢＶＤＶ ｇＥ１およびｇＥ２糖タンパク質
を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ
．ｏ．ｉ．でＮＹＶＡＣに感染せしめたか、またはｖＰ９７２に感染せしめた。１時間の
吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［
３ ５
10
Ｓ］−メチオニ
ン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない
）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．
４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭ
ＳＦ）および５０ｍｌのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることにより、
感染から１８時間後に細胞を収集した。
【０５８１】
次いでＢＶＤＶ ｇｐ４８特異的単クローン性抗体、ＮＹＣ１６およびＮＹ１２Ｂ１、お
よびＢＶＤＶ ｇｐ５３特異的単クローン性抗体、２０９Ｄ３（フランス、リヨン、ロー
ンメリクスから得た）を用いて、溶解産物をＢＶＤＶ ｇＥ１およびｇＥ２発現に関して
20
分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗マウス血清を室温で４時間に亘り
タンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タン
パク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体をｇＥ１特異的単クローン性抗体、ＮＹＣ
１６およびＮＹ１２Ｂ１、およびｇＥ２特異的単クローン性抗体、２０９Ｄ３に結合せし
めた。一方で、通常マウス血清とタンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体を４
℃で一晩インキュベーションすることにより溶解産物を前浄化した。この物質を１×緩衝
液Ａで５回洗浄した後に、ＢＶＤＶ ｇＥ１またはｇＥ２特異的単クローン性抗体、ラッ
ト抗マウス、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩インキュベ
ーションした。この試料を１×緩衝液で４回、ＬｉＣｌ２ ／尿素緩衝液で２回洗浄した
後に、２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０
30
％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により
、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を１０％のドリファ
スゲルシステムで分画し（ドリファスら、１９８４）、固定し、蛍光光度法のために１Ｍ
のＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【０５８２】
ＢＶＤＶ ｇＥ１またはｇＥ２特異的単クローン性抗体は、ｖＰ９７２感染細胞からＢＶ
ＤＶ特異的糖タンパク質を沈殿せしめたが、ＮＹＶＡＣ感染細胞または疑似感染細胞から
はＢＶＤＶ特異的タンパク質は沈殿せしめなかった。
【０５８３】
ＮＹＶＡＣ／ＢＶＤＶ カプシド／ｇＥ１／ｇＥ２組換え体の産生
40
ＢＶＤＶｇＥ１「遺伝子」をｐＩＢＩ２５にクローニングした。これは、ｇＥ１「遺伝子
」を含有する、ｐＳＰ６５−ｇＥ１の１，３７０ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＥ
．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）でブラントエンドし、その末端にＸ
ｈｏＩリンカーを連結し、産生したプラスミドをｐＩＢＩ２５のＸｈｏＩ部位にクローニ
ングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ１と称する
。
【０５８４】
次いでｇＥ１「遺伝子」をｕフランキングアームの間にクローニングした。これは、ｇＥ
１配列を含有する、ｐＢＤＶ１の１，４００ｂｐ ＸｈｏＩ断片をｐＳＤ４８６のＸｈｏ
Ｉ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生されたプラスミドを
50
(154)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ｐＢＤＶ１１と称する。
【０５８５】
次いでｇＥ１「遺伝子」の「開始コドン」をｕプロモーターの開始コドンに配列した。こ
れは、ｕプロモーターの３′末端およびｇＥ１配列の５′末端をコードする、オリゴヌク
レオチド、ＢＤＶＭ７（配列認識番号２５６）
【化１７３】
およびＢＤＶＭ８（配列認識番号２５７）
【化１７４】
10
を、ｐＢＤＶ１１の４，８００ｂｐ 部分的ＢｇｌＩ−ＣｌａＩ断片にクローニングする
ことにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ１２と称する。
【０５８６】
次いでＢＶＤＶ ｇＥ２「遺伝子」の一部をｇＥ１配列から下流のｐＢＤＶ１２にクロー
ニングした。これは、ｇＥ２配列を含有する、ｐ７Ｆ２の１，０００ｂｐ ＢｇｌＩＩ−
ＢａｍＨＩ断片をｐＢＤＶ１２の４，６５０ｂｐ ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片にクロー
ニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ１４と称
する。
20
【０５８７】
次いでｇＥ２「遺伝子」の残りをｐＢＤＶ１４にクローニングした。これは、ｇＥ２「遺
伝子」を含有する、ｐＳＰ６５Ｅ１＋Ｅ２−１の１，２６０ｂｐ ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片をｐＢＤＶ１４の４，６５０ｂｐ ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングす
ることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ１７と称する。
【０５８８】
次いでカプシド「遺伝子」（オスロス菌株）をｇＥ１配列の上流のｐＢＤＶ１７にクロー
ニングした。これは２工程で行なった。最初の工程では、ｕプロモーターの開始コドンを
カプシド「遺伝子」の「開始コドン」と配列せしめた。これは、ｕプロモーターの３′末
端およびカプシド配列の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、ＶＤＶＬ１２（配
30
列認識番号２５８）
【化１７５】
およびＢＤＶＬ１３（配列認識番号２５９）
【化１７６】
40
を、ｐＢＤＶ１７の５，２００ｂｐ ＣｌａＩ−ＸｂａＩ断片にクローニングすることに
より行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ２５と称する。第２の工程
で、カプシド「遺伝子」の残りをｐＢＤＶ２５にクローニングした。これは、カプシド「
遺伝子」を含有する、ｐＳＰ６５Ｃ−Ｅ１−Ｅ２の１，８７０ｂｐ ＢｓｔＥＩＩ−Ｂｇ
ｌＩＩ断片（ベルギー、リージ、ユーロジェネティックから得た；レナードら、欧州特許
第８６８７００９５号）を、ｐＢＤＶ２５の４，７００ｂｐ ＢｓｔＥＩＩ−ＢｇｌＩＩ
断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢ
ＤＶ２６と称する。
【０５８９】
50
(155)
JP 3602844 B2 2004.12.15
次いでｕプロモートしたカプシド／ｇＥ１／ｇＥ２配列をｔｋフランキングアームの間に
クローニングした。これは、ｕプロモートしたカプシド／ｇＥ１／ｇＥ２配列を含有する
、ｐＢＤＶ２６の３，２００ｂｐ ＳｎａＢＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＳＤ５４２の４，
０００ｂｐ ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操
作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ２７と称する。
【０５９０】
ｐＢＤＶ２７を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実
験に用いてｖＰ１０１７を産生した。ｖＰ９７２の発現に関して、ｖＰ１０１７感染細胞
の免疫沈降実験を上述したように行なった。疑似感染ベロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ
細胞からはＢＶＤＶ特異的タンパク質は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ１０１７の
10
溶解産物からは、ＢＶＤＶ特異的タンパク質が沈殿した。
【０５９１】
ＮＹＶＡＣ／ＢＶＤＶ ｇＥ２組換え体の産生
ＢＶＤＶ ｇＥ１「遺伝子」をｐＩＢＩ２５にクローニングした。これは、ｇＥ１「遺伝
子」を含有するｐＳＰ６５−ｇＥ１の１，３７０ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＥ
．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）でブラントエンドし、その末端にＸ
ｈｏＩリンカーを連結し、産生したプラスミドをｐＩＢＩ２５のＸｈｏＩ部位にクローニ
ングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ１と称する
。
【０５９２】
20
次いでＨ６プロモーターの開始コドンをｇＥ１「遺伝子」の推定「開始コドン」と配列せ
しめた。これは、Ｈ６プロモーターの３′末端およびｇＥ１「遺伝子」の５′末端をコー
ドする、オリゴヌクレオチド、ＢＤＶＭ４（配列認識番号２５３）およびＢＤＶＭ５（配
列認識番号２５４）を、ｐＢＤＶ１の４，２５０ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩ（部分
的）断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドを
ｐＢＤＶ６と称する。
【０５９３】
次いでｇＥ１「遺伝子」をＨ６＋ＡＴＩ＋ＨＡ三重プロモーターの下流とＨＡフランキン
グアームの間にクローニングした。これは、ｇＥ１「遺伝子」を含有する、ｐＢＤＶ６の
１，３８０ｂｐ ＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ（部分的）断片を、ｐＡＴＩ２５の３，７００ｂ
30
ｐ ＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により
産生したプラスミドをｐＢＤＶ７と称する。
【０５９４】
次いで、将来の操作に必要なＢａｍＨＩ部位をＢＶＤＶ配列の下流に産生した。これは、
オリゴヌクレオチドＢＤＶＭ６（配列認識番号２５５）をｐＢＤＶ７のＸｈｏＩ部位にク
ローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ８と
称する。
【０５９５】
次いでＢＶＤＶ ｇＥ２配列の約８３０ｂｐをｇＥ１「遺伝子」の下流にクローニングし
た。これは、ｇＥ２配列を含有する、ｐ７Ｆ２の９８０ｂｐ ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断
40
片をｐＢＤＶ８の５，１００ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ（部分的）断片にクローニン
グすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ９と称する。
【０５９６】
次いでｇＥ１／ｇＥ２配列をＡＴＩフランキングアームの間にクローニングした。これは
、Ｈ６プロモートしたｇＥ１／ｇＥ２「遺伝子」を含有するｐＢＤＶ９の２，２００ｂｐ
ＮｒｕＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＰＧＩ７の４，９００ｂｐＮｒｕＩ−ＢａｍＨＩ断片に
クローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ２
３と称する。
【０５９７】
次いで、約２７０ｂｐの追加のｇＥ２配列を存在するＢＶＤＶ配列の下流にクローニング
50
(156)
JP 3602844 B2 2004.12.15
した。これは、追加のｇＥ２配列を含有する、ｐＳＰ６５Ｅ１＋Ｅ２−１の１，２６０ｂ
ｐ ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＤＶ２３の６，１００ｂｐ ＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ
ＩＩ（部分的）断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプ
ラスミドをｐＢＤＶ２４と称する。
【０５９８】
次いでｇＥ１配列をＢＤＶ２４から欠損せしめた。これは、Ｈ６プロモーターの３′末端
およびｇＥ２「遺伝子」の５′末端を含有する、１３０ｂｐ ＮｒｕＩ−ＰｓｔＩ ＰＣ
Ｒ断片をｐＢＤＶ２４の５，９００ｂｐ ＮｒｕＩ−ＰｓｔＩ断片にクローニングするこ
とにより行なった。このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＢＤＶＰ１４（配列認識番
号２６０）
10
【化１７７】
およびＢＤＶＰ１５（配列認識番号２６１）
【化１７８】
によりプラスミド、ｐＢＤＶ１７から産生した。この操作により産生されたプラスミドを
ｐＢＤＶ２８と称する。
【０５９９】
20
配列分析により、ｐＢＤＶ２８中のＨ６プロモーターは２ｂｐ挿入物を含有することが分
かった。この誤りを直すために、Ｈ６プロモーターの３′末端およびｇＥ２「遺伝子」の
５′末端を含有する、ｐＢＤＶ２８の１３０ｂｐ ＮｒｕＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＢＤＶ２
４の５，９００ｂｐ ＮｒｕＩ−ＰｓｔＩ断片にクローニングした。この操作荷より産生
したプラスミドをｐＢＤＶ２９と称する。
【０６００】
ｐＢＤＶ２９を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実
験に用いてｖＰ１０９７を産生した。
【０６０１】
上述したようにｖＰ１０９７感染細胞に関する免疫沈降を行なって、細胞または溶解産物
30
からＢＶＤＶタンパク質を産生した。
【０６０２】
実施例３２−ポックスウイルスベクター中のヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）糖タ
ンパク質抗原のクローニングおよび発現
ＨＣＭＶ ｇＢ遺伝子のＮＹＶＡＣ供与体プラスミド，ｐＳＤ５４２へのクローニング
ＨＣＭＶ ＤＮＡのＨｉｎｄＤプラスミド４，８００ｂｐ Ｈｉｎｄ−ＢａｍＨＩ断片を
プラスミドｐＩＢＩ２４の２８００ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニン
グした。オリゴヌクレオチドＣＭＶＭ５（配列認識番号２６２）
【化１７９】
40
およびＣＭＶＭ３（配列認識番号２６３）
【化１８０】
を用いた生体外突然変異誘発（クンケル、１９８５；ラッセルら、１９８６）により、ワ
クシニアＨ６プロモーターの制御下でｇＢ遺伝子を改変して発現せしめた（テイラーら、
50
(157)
JP 3602844 B2 2004.12.15
１９８８ａ、ｂ；パーカスら、１９８９）。改変ｇＢを含有するプラスミドを２４ＣＭＶ
ｇＢ（５＋３）と称した。
【０６０３】
２４ＣＭＶｇＢ（５＋３）の２９００ｂｐ ＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩ断片をｐＳＰ１３１
の３１００ｂｐ ＥｃｏＲＶ−ＢｇｌＩＩ断片にクローニングした。このクローニング工
程により、ｇＢ遺伝子がＨ６プロモーターの制御下におかれた。産生したプラスミドをＳ
Ｐ１３１ｇＢと称した。
【０６０４】
ＳＰ１３１ｇＢ中のＨ６プロモートしたｇＢを側腹に有する制限部位を改変するために、
以下の工程を行なった。プラスミドｐＭＰ２２ＢＨＰは、ＢａｍＨＩ部位でのポリリンカ
10
ー領域にＨＢＶ ｓＡｇの部分を含有するワクシニアのＨｉｎｄＩＩＩ Ｆ断片（ＷＲ菌
株）のサブクローンを含有する。ｐＭＰ２２ＢＨＰをポリリンカー内でＨｉｎｄＩＩＩに
より切断し、ＳＰ１３１ＣＭＶｇＢからのＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｈ６プロモートしたｇＢ
遺伝子を含有する）に連結し、プラスミドＳＡｇ２２ＣＭＶｇＢを産生した。ＳＡｇ２２
ＣＭＶｇＢをＢａｍＨＩで切断し、部分的にＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＢａｍＨＩとＨｉ
ｎｄＩＩＩの切断によりｐＩＢＩ２４から誘導したポリリンカーに連結し、Ｈ６プロモー
トしたｇＢ遺伝子を含有するがＨＢＶ ｓＡｇを有さないプラスミド２２ＣＭＶｇＢを産
生した。
【０６０５】
実施例７に記載したようにベクタープラスミドｐＳＤ５１３を形成することにより、プラ
20
スミドｐＳＤ４６０からプラスミドｐＳＤ５４２（ＮＹＶＡＣ ＴＫ座供与体プラスミド
）を誘導した（タータグリアら、１９９２）。ｐＳＤ５１３のポリリンカー領域を、Ｐｓ
ｔＩ／ＢａｍＨＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２８８（配
列認識番号２６４）
【化１８１】
およびＭＰＳＹＮ２８９（配列認識番号２６５）
【化１８２】
30
に連結することにより改変し、プラスミドｐＳＤ５４２を産生した。
【０６０６】
２２ＣＭＶｇＢを、ＢａｍＨＩとＮｓｉＩで切断してＨ６プロモーターおよびｇＢ遺伝子
の一部を含有する断片を産生し、ＮｓｉＩとＰｓｔＩで切断してｇＢ遺伝子の残りを含有
する断片を産生した。これら２つの断片を、ポリリンカー内のＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切
断したｐＳＤ５４２と連結し、ＮＹＶＡＣ供与体プラスミド５４２ＣＭＶｇＢを産生した
。
【０６０７】
ＨＣＭＶ ｇＢサイズのＡＬＶＡＣ供与体プラスミドＣＰ３ＬＶＱＨ６へのクローニング
40
８．５ｋｂのカナリヤポックスＢｇｌＩＩ断片をｐＢＳ−ＳＫプラスミドベクターのＢａ
ｍＨＩ部位にクローニングしてｐＷＷ５を形成した。ヌクレオチド配列分析により、Ｃ３
と称する読取り枠が示された。異種遺伝子を、Ｃ３読取り枠を完全切除したＣ３座に挿入
するための供与体プラスミドを構築するために、ＰＣＲプライマーを用いてＣ３に関連し
た５′および３′配列を増幅した。５′配列のプライマーは、ＲＧ２７７（配列認識番号
１７７）およびＲＧ２７８（配列認識番号１７８）であった。
【０６０８】
３′配列のプライマーは、ＲＧ２７９（配列認識番号１７９）およびＲＧ２８０（配列認
識番号１８０）であった。ワクシニア転写および翻訳終止シグナルを側腹に有する多重ク
ローニング部位を含有するようにプライマーを設計した。また、左側アームおよび右側ア
50
(158)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ームの５′末端および３′末端に、２つのアームをＡｓｐ７１８／ＳａｃＩ切断したｐＢ
Ｓ−ＳＫプラスミドベクターに連結させる適切な制限部位（左側アームにはＡｓｐ７１８
とＥｃｏＲＩ、右側アームにはＥｃｏＲＩとＳａｃＩ）を含んだ。産生したプラスミドを
ｐＣ３Ｉと称した。
【０６０９】
プラスミドｐＷＷ５のＮｓｉＩとＳｓｐＩの切断によりＣ３座から直接上流のカナリヤポ
ックスの９０８ｂｐの断片を得た。テンプレートとしてのプラスミドｐＷＷ５およびオリ
ゴヌクレオチドＣＰ１６（配列認識番号２６６）
【化１８３】
10
とＣＰ１７（配列認識番号２６７）
【化１８４】
を用いたＰＣＲ（エンゲルケら、１９８８）によりカナリヤポックスとＤＮＡの６０４ｂ
ｐ断片を得た。６０４ｂｐの断片をＡｓｐ７１８とＸｈｏＩ（それぞれオリゴヌクレオチ
ドＣＰ１６とＣＰ１７の５′末端に存在する部位）で切断し、Ａｓｐ７１８−ＸｈｏＩで
切断しアルカリ性ホスファターゼ処理したＩＢＩ２５（ＣＴ、ニューハブン、インターナ
ショナルバイオテクノロジー社）にクローニングしてプラスミドＳＰＣ３ＬＡを産生した
20
。ＳＰＣ３ＬＡを、ＩＢＩ２５内のＥｃｏＲＶとカナリヤポックスＤＮＡ内のＮｓｉＩで
切断し、９０８ｂｐのＮｓｉＩ−ＳｓｐＩ断片に連結し、Ｃ３座の上流の１４４４ｂｐの
カナリヤポックスＤＮＡを含有するＳＰＣＰＬＡＸを産生した。
【０６１０】
カナリヤポックスＤＮＡの２１７８ｂｐ ＢｇｌＩＩ−ＳｔｙＩ断片をプラスミドｐＸＸ
４（ｐＢＳ−ＳＫのＰｓｔＩ部位にクローニングされたカナリヤポックスＤＮＡの６．５
ｋｂ ＮｓｉＩ断片を含有する）から単離した。テンプレートとしてのプラスミドｐＸＸ
４およびオリゴヌクレオチドＣＰ１９（配列認識番号２６８）
【化１８５】
30
とＣＰ２０（配列認識番号２６９）
【化１８６】
を用いたＰＣＲ（エンゲルケら、１９８８）によりカナリヤポックスＤＮＡの２７９ｂｐ
断片を単離した。２７９ｂｐ断片をＸｈｏＩとＳａｃＩ（それぞれオリゴヌクレオチドＣ
Ｐ１９とＣＰ２０の５′末端に存在する部位）で切断し、ＳａｃＩ−ＸｈｏＩで切断しア
ルカリ性ホスファターゼ処理したＩＢＩ２５にクローニングして、プラスミドＳＰＣ３Ｒ
Ａを産生した。
【０６１１】
ポリリンカーに追加の特有の部位を加えるために、ｐＣ３Ｉをポリリンカー領域内のＥｃ
ｏＲＩとＣｌａＩで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、キナーゼしてアニール
したオリゴヌクレオチドＣＰ１２（配列認識番号２７２）とＣＰ１３（配列認識番号２７
３）（ＥｃｏＲＩ付着末端、ＸｈｏＩ部位、ＢａｍＨＩ部位およびＣｌａＩに一致する付
着末端を含有する）に連結し、プラスミドＳＰＣＰ３Ｓを産生した。
【０６１２】
【化１８７】
40
(159)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ＳＰＣＰ３Ｓを、Ｃ３座の下流のカナリヤポックス配列内のＳｔｙＩとＳａｃＩ（ｐＢＳ
−ＳＫ）で切断し、ＳＰＣ３ＲＡからの２６１ｂｐ ＢｇｌＩＩ−ＳａｃＩ断片とｐＸＸ
４からの２１７８ｂｐ ＢｇｌＩＩ−ＳｔｙＩ断片に連結し、Ｃ３座の下流の２５７２ｂ
ｐのカナリヤポックスＤＮＡを含有するプラスミドＣＰＲＡＬを産生した。ＳＰＣＰ３Ｓ
を、Ｃ３座の上流のカナリヤポックス配列内のＡｓｐ７１８（ｐＢＳ−ＳＫ内）とＡｃｃ
Ｉで切断し、ＳＰＣＰＬＡＸからの１４３６ｂｐ Ａｓｐ７１８−ＡｃｃＩ断片に連結し
10
、Ｃ３座の下流の１４５７ｂｐのカナリヤポックスＤＮＡを含有するプラスミドＣＰＬＡ
Ｌを産生した。ＣＰＬＡＬを、Ｃ３座の下流のカナリヤポックス配列内のＳｔｙＩとＳａ
ｃＩ（ｐＢＳ−ＳＫ内）で切断し、ＣＰＲＡＬからの２４３８ｂｐ ＳｔｙＩ−ＳａｃＩ
断片に連結し、Ｃ３座の上流の１４５７ｂｐのカナリヤポックスＤＮＡ、６つの読取り枠
の終止コドン、初期転写終止シグナル、ポリリンカー領域、初期転写終止シグナル、６つ
の読取り枠の終止コドン、およびＣ３座の下流の２５７２ｂｐのカナリヤポックスＤＮＡ
を含有するプラスミドＣＰ３Ｌを産生した。産生したプラスミドをＳＰＣＰ３Ｌと称した
。
【０６１３】
テンプレートとしてのｐＲＷ８３８およびオリゴヌクレオチドＣＰ２１（配列認識番号２
20
７０）
【化１８８】
とＣＰ２２（配列認識番号２７１）
【化１８９】
を用いたＰＣＲ（エンゲルケら、１９８８）により、初期／晩期Ｈ６ワクシニアウイルス
プロモーター（グオら、１９８９；パーカスら、１９８９）を誘導した。ＰＣＲ産生物を
30
、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ（それぞれオリゴヌクレオチドＣＰ２１とＣＰ２２の５′末端
に存在する部位）で切断し、ポリリンカー内のＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断されたＣＰ
３Ｌに連結し、プラスミドＶＱＨ６ＣＰ３Ｌを産生した。ＡＬＶＡＣ供与体プラスミドＶ
ＱＨ６ＣＰ３Ｌを、ポリリンカー内のＸｈｏＩとＨ６プロモーター内のＮｒｕＩで切断し
、Ｈ６プロモーターとｇＢ遺伝子を含有する２２ＣＭｇＢからのＮｒｕＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片並びにＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩの切断によりｐＩＢＩ２４から誘導したポリリン
カーに連結し、ＡＬＶＡＣ供与体プラスミドＣＰ３ＬＣＭＶｇＢを産生した。
【０６１４】
実施例３３−組換えウイルス：サイトメガロウイルスの構築
ＣＭＶ（サイトメガロウイルス） ｇＢ遺伝子をＮＹＶＡＣのＴＫ部位に挿入した。組換
40
えウイルスをｖＰ１００１と称した。ＣＭＶ ｇＢ遺伝子をＡＬＶＡＣのＣ３座に挿入し
た。組換え体をｖＣＰ１３９と称した。
【０６１５】
実施例３４−組換えウイルス感染細胞中のＣＭＶ ＧＢタンパク質の蛍光抗体法モルモッ
ト多クローン性血清と続いてフルオレセインイソチオシアネートヒツジ抗モルモットを用
いて、蛍光抗体法研究を前述したように行なった（テイラーら、１９９０）。ｖＰ１００
１に感染した細胞は、形質膜上に発現されたｇＢを示した。ｖＣＰ１３９に感染した細胞
内では弱い内側発現が検出された。
【０６１６】
実施例３５−組換え体感染細胞中にＣＭＶ ＧＢの免疫沈降
50
(160)
JP 3602844 B2 2004.12.15
前述したように免疫沈降実験を行なった（テイラーら、１９９０）。ＣＭＶ感染細胞中で
産生されたＣＭＶ ｇＢ糖タンパク質は、１３０ｋＤａの前駆体形状とともに５５ｋＤａ
の分子量を有する（グレッチら、１９８８）。ｖＰ１００１とｖＣＰ１３９に感染した細
胞は、約１１６ｋＤａと約５５ｋＤａの２つのＣＭＶ ｇＢコードタンパク質を産生する
。
【０６１７】
実施例３６−中和抗体
ｖＰ１００１（ＮＹＶＡＣ−ＨＣＮＶ ｇＢ）によるＣＢＡマウスの免疫の後で、接種し
たマウスの血清の中和抗体力価を評価した（ゴンクゾル、１９８６）。ヒトサイテメガロ
ウイルスを中和できる抗体をマウスの血清中に、免疫後１４−２１日（１：１６の幾何学
10
平均力価（ｇｍｔ））および２８と６０日の間（ｇｍｔ＝１：２６）で検出した。ＣＢＡ
マウスのＡＬＶＡＣ−ＨＣＭＶ ｇＢによる免疫により、１：６４ｇｍｔ（１４−２１日
のｐｉ、２１と２８日のｐｉでは１：９１ｇｍｔ）および２８と６０日の間のｐｉでは１
：１１１のＨＣＭＶ中和抗体力価を示した。それゆえ、ＨＣＭＶ ｇＢを発現するカナリ
ヤポックスウイルス組換え体またはワクシニアウイルスでのマウスの免疫は、ＨＣＭＶの
感染性を中和できる抗体を誘発した。
【０６１８】
実施例３７−細胞性免疫
ＨＣＭＶ中和抗体力価以外にも、ｖＣＰ１３９はまた、ＨＣＭＶ ｇＢを発現する組換え
ワクシニアウイルス（ワクシニアＷＲ−ｇＢ）に感染したマウスＬ９２９細胞を殺すこと
のできる細胞傷害性Ｔリンパ球を誘発できる。ＣＢＡマウスに、２．５×１０
８ 20
ｐｆｕ
のｖＣＰ１３９を腹腔内により免疫した。１６から３０日後、マウスの脾臓細胞の懸濁液
を２：１の比率でｖＰ１００１に事前に感染せしめた同系脾臓細胞とともにコインキュベ
ーションすることにより生体外で再刺激した。５日後、脾臓細胞を数え、
５ １
Ｃｒ−放出
アッセイ（ジンカーナゲルら、１９８４）を用いて、未感染Ｌ９２９細胞またはアデノウ
イルスＡｄ５ｄｌＥ３、ＨＣＭＶ ｇＢを発現する組換えアデノウルイス（Ａｄ−ｇＢ）
、ワクシニアウイルス、およびＨＣＭＶ ｇＢを発現する組換えワクシニアウイルスに感
染したＬ９２９細胞に対する細胞傷害性を評価した。未感染標的並びにＡｄ５ｄｌＥ３に
感染した標的に対して、反応性のバックグラウンド水準のみが測定された。これに反して
、生体外刺激脾臓細胞は、ＨＣＭＶ ｇＢを発現するＡｄ−ｇＢに感染したＬ９２９細胞
30
を容易に殺した。ワクシニアウイルスベクターに感染した標的に対して溶菌がある程度観
察されたが、ｇＢを発現する組換えワクシニアウイルスに感染した標的に対してはより高
い細胞溶解が測定された。これにより、ＨＣＭＶ ｇＢ内に位置するエピトープに特異的
な細胞傷害性Ｔリンパ球は、ＨＣＭＶ ｇＢを発現する組換えカナリヤポックスウイルス
（ｖＣＰ１３９）の接種により産生されることが明確に示された。
【０６１９】
実施例３８−ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ供与体プラスミド構築：イヌパルボウイルス
イヌパルボウイルスＶＰ２カプシド遺伝子を発現するポックスウイルス組換え体を産生す
るために、ＶＰ２遺伝子がＣＰＶ−ｄ単離体のゲノム（ＣＰＶ−２抗原型）から増幅され
、ワクシニアＨ６プロモーターに結合せしめられ（パーカスら、１９８９）、ＮＹＶＡＣ
40
まはＡＬＶＡＣ挿入ベクターに挿入された供与体プラスミドを構築した。ＮＹＶＡＣ挿入
部位はｄｅｏｒｆｅｄＡＴＩ座であり、ＡＬＶＡＣ挿入部位はｄｅｏｒｆｅｄＣ３座であ
る。
【０６２０】
ＶＰ２遺伝子配列は、プラスミドｐＢＩ２６５（１）からＰＣＲにより得た。ＮＹ、イタ
カ、コーネル大学、ジェームズＡ．ベーカー研究所、Ｄｒ．コリンＲ．パリッシュ、から
得たこのプラスミドは、ＣＰＶ−ｄ単離体のゲノムを含有する（コーネル７９０３２０）
（抗原型ＣＰＶ−２）。この単離体からのＶＰ２遺伝子のＤＮＡ配列は公表されている（
パリッシュら、１９８８）。
【０６２１】
50
(161)
JP 3602844 B2 2004.12.15
テンプレートとしてのｐＢＩ２６５（１）およびプライマーとしてのオリゴヌクレオチド
ＲＧ４５１（配列認識番号２７４）
【化１９０】
とＲＧ４５２（配列認識番号２７５）
【化１９１】
10
を用いて、ＰＣＲにより完全ＶＰ２読取り枠（ＯＲＦ）を増幅した。精製したＤＮＡ断片
をＡｓｐ７１８とＥｃｏＲＩで切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋中のＡｓｐ７１
８およびＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｐＤＴ４を産生した。ＤＮＡ配列分析により
ＶＰ２遺伝子を確認した。
【０６２２】
ＶＰ２遺伝子は、初期転写終止シグナルとして機能できるＯＲＦ内に２つのＴＴＴＴＴＮ
Ｔ配列を含有する（ユエンら、１９８７）。これらのシグナルを除去するために、ＰＣＲ
部位定方向突然変異誘発を用いて、正確なアミノ酸配列を保持しながら、ヌクレオチド配
列を改変した。合成オリゴヌクレオチドＲＧ４５３（配列認識番号２７６）
20
【化１９２】
およびＲＧ４５４（配列認識番号２７７）
【化１９３】
を用いてｐＢＩ２６５（１）から２５０ｂｐの断片を増幅せしめた。精製した断片をＢｇ
ｌＩＩとＡｃｃＩで切断し、ＢｇｌＩＩ／ＡｃｃＩ ＶＰ２断片をｐＤＴ４に配するのに
用いた。産生したプラスミドｐＥＤ３は、ＴＴＴＴＴＮＴ配列がＴＴＴＣＴＡＴおよびＴ
30
ＴＣＴＴＣＴに改変された改変ＶＰ２遺伝子を含有した。
【０６２３】
ｐＭＰＡＴＩＨ６ＨＳＶＴＫは、Ｈ６プロモーターの制御下でＨＳＶ−１チミジンキナー
ゼ遺伝子のコード配列を含有する発現カセットがポリリンカー領域のＨｐａＩとＸｈｏＩ
部位の間に挿入されたｐＳＤ５５２（この明細書の別の箇所に記載されている）の誘導体
である。このプラスミドをＮｒｕＩとＸｈｏＩ部位で切断してｔｋ遺伝子を切除するがＨ
６プロモーターの５′末端を保持する。上述したこのベクターへの改変ＶＰ２遺伝子の挿
入によりｐＡＴＩ−ＶＰ２が産生される。このＮＹＶＡＣ供与体プラスミドは、ＡＴＩ挿
入アームを側腹に有するＨ６プロモートしたＶＰ２遺伝子である。
【０６２４】
40
ＣＰＶ ＶＰ２カプシド遺伝子を含有するＡＬＶＡＣ供与体プラスミドを以下のように構
築した。改変ＶＰ２遺伝子をＮｒｕＩとＸｈｏＩによりｐＥＤ３から切除し、精製したプ
ラスミドをＮｒｕＩとＸｈｏＩで切断したｐＶＱＨ６ＣＰ３Ｌ（フラビウイルスのセクシ
ョンに記載されたプラスミド）にクローニングした。産生したプラスミド、ｐＣ３−ＶＰ
２は、Ｃ３挿入アームを側腹に有するＨ６プロモートしたＶＰ２遺伝子を含有する。
【０６２５】
実施例３９−ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ組換え体：イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）の構
築
供与体プラスミドｐＡＴＩ−ＶＰ２を、治療ウイルスとしてのＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）
とＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）とともにベロ細胞において生体外組換え実験に用いて
50
(162)
JP 3602844 B2 2004.12.15
、それぞれｖＰ９９８とｖＰ９９９を産生した（タータグリアら、１９９２）。放射線標
識したＶＰ２特異的ＤＮＡプローブを用いて現場でのハイブリダイゼーション方法（ピッ
チーニら、１９８７）により組換えウイルスを同定した。３回のプラーク精製により組換
えプラークを精製し、さらなる分析のために増幅した。
【０６２６】
供与体プラスミドｐＣ３−ＶＰ２を、治療ウイルスとしてのＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）とＡ
ＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５Ａ）をＣＥＦ細胞において生体外組換え実験に用いて、それ
ぞれｖＣＰ１２３とｖＣＰ１３６を産生した。放射線標識したＶＰ２特異的プローブ（陽
性信号）とＣ３ ＯＲＦ特異的プローブ（陰性信号）を用いた現場でのハイブリダイゼー
ション方法により組換えウイルスを同定した。３回のプラーク精製により組換えプラーク
10
を精製し、さらなる分析のために増幅した。
【０６２７】
実施例４０−ＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣ−ベースのＣＰＶ ＶＰ２組換え体の発現分
析
多クローン性ＣＰＶイヌ血清またはＶＰ２エピトープに特異的な単クローン性抗体を用い
る前述したような蛍光抗体法（テイラーら、１９９０）により、ＣＰＶ ＶＰ２遺伝子を
含有する全ての組換え体を発現に関して試験した。全ての血清は、ＮＹ、イサカ、コーネ
ル大学、ジェームズＡ．ベーカー研究所、Ｄｒ．コリンＲ．パリッシュから得た。ＮＹＶ
ＡＣベースの組換え体をベロ細胞において試験し、一方ＡＬＶＡＣベースの組換え体はＣ
ＥＦ細胞において試験した。組換え体ｖＰ９９８、ｖＰ９９９、ｖＣＰ１２３、およびｖ
20
ＣＰ１３６は全て、核内に局在した内部蛍光を示した。表面には蛍光は検出されなかった
。加えて、狂犬病Ｇ遺伝子を含有する２つの組換え体（ｖＰ９９９およびｃＣＰ１３６）
は、狂犬病Ｇエピトープに特異的な単クローン性抗体でスクリーニングした。両者とも細
胞の表面に強い蛍光を示した。
【０６２８】
上述した組換え体中の真正ＶＰ２遺伝子産生物の発現をさらに特徴付けるために、同一の
抗血清を用いて免疫沈降を行なった（テイラーら、１９９０）。ＮＹＡＶＣベースの組換
え体をベロ細胞において試験し、一方ＡＬＶＡＣベースの組換え体はＣＥＦ細胞において
試験した。全ての組換え体（ｖＰ９９８、ｖＰ９９９、ｖＣＰ１２３、およびｖＣＰ１３
６）において、抗血清は６５ｋＤａのタンパク質を沈殿せしめ、これは天然ＶＰ２遺伝子
30
のサイズと一致する。このサイズのタンパク質は、細胞溶解産物またはいずれの親ウイル
ス（ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ）からは検出されなかった。
【０６２９】
実施例４１−エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）遺伝子のＡＬＶＡＣへの挿入
供与体プラスミドＥＢＶトリプル２の構築
プラスミドＥＢＶトリプル（Ｔｒｉｐｌｅ）１（実施例１１）は、全てワクシニアＴＫ座
挿入プラスミドに挿入されたＥＢＶ遺伝子ｇＨ、ｇＢおよびｇｐ３４０の発現カセットを
含有する。プラスミドＥＢＶトリプル１をＳｍａＩ／ＢａｍＨＩで切断し、４２ｋＤａ昆
虫ポックスウイルスプロモーターとＥＢＶ ｇＨ遺伝子の５′末端を含有する０．３ｋｂ
断片を単離した。またＥＢＶトリプルプラスミドをＢａｍＨＩで切断し、ＥＢＶ ｇＨ遺
40
伝子の３′末端、ＥＢＶ ｇＢ発現カセット、およびＥＢＶ ｇｐ３４０発現カセットを
含有する７．３ｋｂの断片を単離した。次いでこれら２つの断片を、ＳｍａＩ／ＢａｍＨ
Ｉで切断したＡＬＶＡＣ Ｃ４座挿入プラスミドｐＮＶＱＣ５ＬＳＰ７（テタナスの実施
例参照）に連結した。産生したプラスミドをＥＢＶトリプル２と称した。
【０６３０】
ＥＢＶ遺伝子のＡＬＶＡＣへの挿入
Ｃ５挿入座に、３つのＥＢＶ遺伝子、ｇＨ、ｇＢおよびｇｐ３４０の発現カセットを含有
するプラスミドＥＢＶトリプル２をＡＬＶＡＣによる組換えの供与体プラスミドとして用
いてＡＬＶＡＣ組換え体ｖＣＰ１６７を産生した。
【０６３１】
50
(163)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ｖＰ９４４およびｖＣＰ１５７によるＥＢＶタンパク質の発現
ＡＬＶＡＣ組換え体ｖＣＰ１６７とｖＰ９４４、同一の３つの遺伝子を含有するＮＹＶＡ
Ｃベースの組換え体（実施例１１）に感染した細胞からの代謝標識した溶解産物に、ＥＢ
Ｖに対してはヒト多クローン性血清、並びにＥＢＶ ｇＢとｇｐ３４０に対してはマウス
単クローン性抗体を用いた免疫沈降を行なった。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
と続いてのラジオオートグラフィーにより沈殿物を分析した。ＮＹＶＡＣベースの組換え
体ｖＰ９４４およびＡＬＶＡＣベースの組換え体ｖＣＰ１６７について、正確な分子量の
タンパク質とＥＢＶ ｇＢ、ｇＨおよびｇｐ３４０の特異性を観察した。
【０６３２】
実施例４２−ウマインフルエンザＨＡ（Ａ１／プラハ／５６）のＮＹＶＡＣおよびＡＬＶ
10
ＡＣへの挿入のための発現カセットの構築
産生したＥＩＶ（Ａ１／プラハ／５６）ゲノムＲＮＡをローンメリクス（フランス、リヨ
ン）から得た。ガブラーとホフマンにより記載されたように（１９８３）、ＥＩＶ−特異
的ｃＤＮＡを調製した。オリゴヌクレオチドＥＩＶＳＩＰ（配列認識番号２７８）
【化１９４】
を用いて第１の鎖ｃＤＮＡを合成した。このオリゴヌクレオチド（配列認識番号２７８）
は、各ゲノムＲＮＡ断片の３′末端に相補的である。ガブラーとホフマン（１９８３）に
よると、ｃＤＮＡはｄＧテイルされ（ｔａｉｌｅｄ）、ＥｃｏＲＶで切断されたｐＭＧ５
20
に挿入され、ｄＣテイルされる。この方法によるｃＤＮＡのｐＭＧ５への挿入により、両
方のプラスミド／ｃＤＮＡ配列縁にＢａｍＨＩ部位が産生される。
【０６３３】
このＥＩＶ ｃＤＮＡライブラリーからの５００のコロニーを、アンピシリン（５０μｇ
／ｍｌ）を含有するＬＢ−アガープレートに二通りに運搬した。コロニーを放射線標識し
たＥＩＶ ＨＡ特異的プローブとともにハイブリダイゼーションのためにニトロセルロー
スに運搬した。オリゴヌクレオチドＥＩＶＳＩＰ（配列認識番号２７８）により合成した
放射線標識した第１の鎖ｃＤＮＡおよびテンプレートとしての精製ＨＡゲノムＲＮＡを用
いてこのプローブを誘導した。ＨＡゲノム断片を１．２％の低融点アガロースゲル（ＭＤ
、ゲイサルスバーグ、ベセスダリサーチラボラトリーズ）から精製した。このゲルシステ
30
ムにおいて１×のＴＢＥの２ボルト／ｃｍで展開して合計ゲノムＲＮＡを分画した。ＨＡ
帯を切除し、アガロースを７５℃で融合し、続いて２回のフェノール抽出と１回のエーテ
ル抽出とＥＴＯＨ沈殿によりＨＡ ＲＮＡを収集した。
【０６３４】
標準方法（マニアチスら、１９９１）にしたがってコロニーハイブリダイゼーションを行
ない、１．４ｋｂ ＨＡ ｃＤＮＡ挿入物を含有するｃＤＮＡクローンを同定した。その
クローンは、ゲノムＲＮＡに対するノーザンブロット分析とヌクレオチド配列分析により
、ＨＡ特異的であることが分かった。この１．４ｋｂの断片を用いて、続いてのｃＤＮＡ
ライブラリースクリーニングのための放射線標識したＨＡ特異的ＤＮＡプローブを産生し
た。
40
【０６３５】
このプローブを用いて、他のＨＡ特異的ｃＤＮＡクローンを同定した。最大のものは、１
．０ｋｂ、１．２ｋｂ、および１．４ｋｂであり、それぞれ、ｐＥＩＶＡＩＰＨＡ−１、
−１０、および−８と称した。集団的に、これらのコロニーは、ヌクレオチド配列分析に
より決定される全縁ＥＩＶ ＨＡコード配列を含有する。これらの分析により決定された
ＥＩＶ ＨＡの全縁配列（Ａ１／プラハ／５６）を第２３図に示す（配列認識番号２７９
）。
【０６３６】
次に、異なるｃＤＮＡクローンからの断片をスプライシングすることによりＥＩＶ ＨＡ
の全長のｃＤＮＡクローンを産生した。ＨＡコード配列の５′側の１２００ｂｐを、テン
50
(164)
JP 3602844 B2 2004.12.15
プレートとしてのこのプラスミドおよびオリゴヌクレオチドＥＩＶＳＩＰ（配列認識番号
２７８）とＥＩＶＡＩＰ７Ａ（配列認識番号２８０）
【化１９５】
を用いたＰＣＲによりｐＥＩＶＡＩＰＨＡ−８から誘導した。この１２００ｂｐの断片を
ＰｓｔＩで切断し、５′と３′の両末端にＰｓｔＩ付着末端を産生した。ＨＡコード配列
の３′側の６００ｂｐを、ＢａｍＨＩとＰｓｔＩでの切断によりｐＥＩＶＡＩＰＨＡ−１
０から誘導した。これら２つの断片を、ＰｓｔＩとＢａｍＨＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ（
ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に挿入した。全縁ＥＩＶ ＨＡ（Ａ１／プラハ／５６
10
）コード配列を含有する産生したプラスミドをｐＢＳＥＩＶＡＩＰＨＡと称した。
【０６３７】
オリゴヌクレオチドＥＩＶＡＩＰＨＡ５Ｐ（配列認識番号２８１）
【化１９６】
およびＥＩＶＡＩＰＨＡ３Ｐ（配列認識番号２８２）
【化１９７】
20
を用いて、ｐＢＳＥＩＶＡＩＰＨＡからＰＣＲによりＥＩＶ ＨＡコード配列（ＡＴＧか
らＴＡＡ）を誘導した。オリゴヌクレオチドＥＩＶＡＩＰＨＡ５Ｐ（配列認識番号２８１
）は、枠ウイルスＨ６プロモーター（ゲーベルら、１９９０ａ、ｂ）の３′側２６ｂｐ（
ＮｒｕＩ部位）を提供した。１．７ｋｂのＰＣＲ誘導断片をＮｒｕＩ切断ｐＣＰＣＶ１に
挿入し、ｐＣ３ＥＩＶＡＩＰＨＡを産生した。ｐＣＰＣＶ１は、Ｈ６プロモーターを含有
する挿入ベクターである。適切な方向で１．７ｋｂのブラントエンドした断片を挿入する
ことにより、Ｈ６プロモーターに対してＥＩＶ ＨＡ３′を配した。プラスミドｐＣＰＣ
Ｖ１を以下のようにして誘導した。ｐＴＰ１５（グオら、１９８９）のＰｓｔＩ部位にＦ
30
ｅＬＶ ｅｎｖ遺伝子（ギルホットら、１９８７）を含有する２．４ｋｂの断片を含有す
るプラスミドｐＦｅＬＶ１ＡをＰｓｔＩで切断して、ＦｅＬＶ配列を切除し、再結合せし
めてプラスミドｐＦｅＬＶＦを産生した。ポリリンカー領域の次のワクシニアウイルスＨ
６プロモーター要素は、ＫｐｎＩとＨｐａＩの切断によりｐＦｅＬＶＦ４から離生した。
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて１５０ｂｐの断片をブラントエンドし、カナリヤポッ
クスＤＮＡの３．３ｋｂ ＰｖｕＩＩゲノム断片を含有するプラスミド、ｐＲＷ７６４．
２に挿入した。ｐＲＷ７６４．２を、カナリヤポックス配列内の特有のＥｃｏＲＩ部位を
認識するＥｃｏＲＩで線状化し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用
いてブラントエンドした。産生したプラスミドをｐＣＰＣＶ１と称した。このプラスミド
は、ポリリンカー領域が続き、カナヤポックスウイルス相同配列を側腹に有するワクシニ
40
アウイルスＨ６プロモーターを含有する。
【０６３８】
実施例４３−ＥＩＶ ＨＡ（Ａ２／フォンテインブルー（ＦＯＮＴＡＩＮＥＢＬＥＡＵ）
／７９）をＮＹＶＡＣとＡＬＶＡＣに挿入するための発現カセットの構築
精製ＥＩＶ（Ａ２／フォンテインブルー／７９）ゲノムＲＮＡをローンメリクス（フラン
ス、リヨン）から得た。ガブラーとホフマン（１９８３）により記載され、ＥＩＶ（Ａ１
／プラハ／５６）ｃＤＮＡ調製に記載されたように、ＥＩＶ特異的ｃＤＮＡを調製した。
第１の鎖ｃＤＮＡ合成には、オリゴヌクレオチドＥＩＶＳＩＰ（配列認識番号２７８）を
用いた。
【０６３９】
50
(165)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ＨＡ遺伝子の全長ｃＤＮＡクローンを含有する細菌コロニーをスクリーニングするために
、転換したコロニーの８つのプールを５００ｍｌの培養中で増幅し、標準方法により（サ
ムブルックら、１９８９）プラスミドＤＮＡ標品を得た。オリゴヌクレオチドＥＩＶＳＩ
Ｐ（配列認識番号２７８）およびＥＩＶＳＩＰ（配列認識番号２８３）
【化１９８】
による標準ＰＣＲ反応において全プラスミドＤＮＡをテンプレートとして用いた。これら
のプライマーはこれらの８つの断片の５′および３′末端での保存した（ｃｏｎｓｅｒｖ
ｅｄ）配列に相補的であったので、そのような反応は、潜在的に８つのＥＩＶゲノム断片
10
の全長ｃＤＮＡ配列のみを増幅する。
【０６４０】
テンプレートとしてのプラスミド標品、ｐＰＥＩＶＡ２Ｆ−０５は、全長ＨＡ特異的断片
のサイズと一致する１．８ｋｂのＰＣＲ誘導断片を産生した。このＰＣＲ誘導断片を、ｃ
ＤＮＡライブラリーの残りに対するプローブとしての使用のために、ＰＣＲにより再度増
幅した。このプローブを用いて、クローンｐＥＩＶＡ２ＦＨＡ−７および−８を同定し、
注文合成したオリゴヌクレオチド（ゲーベルら、１９９０ａ）を用いたヌクレオチド配列
分析によりｃＤＮＡ挿入物を分析した。
【０６４１】
ヌクレオチド配列分析により、クローン＃７および＃８は、ＥＩＶ（Ａ２／フォンテイン
20
ブルー／７９）ＨＡコード配列（第２４図）（配列認識番号２８４）の３′側１２００ｂ
ｐを表すことが分かった。
【０６４２】
オリゴヌクレオチドＡ２Ｆ３Ｐ（配列認識番号２８５）
【化１９９】
およびＡ２ＦＢＡＭ２（配列認識番号２８６）
【化２００】
30
を用いたＰＣＲにより、１２００ｂｐ ＥＩＶ（配列認識番号をクローン＃７から増幅し
た。ＢａｍＨＩによる切断後のこの１２００ｂｐの断片の５′末端は、第２４図の完全Ｅ
ＩＶ（Ａ２／フォンテインブルー／７９）ＨＡコード配列（配列認識番号２８４）のヌク
レオチド６１７に対応する。またこの断片を、オリゴヌクレオチドＡ２Ｆ３Ｐ（配列認識
番号２８５）を用いてコード配列に対して操作した３′であるＳｐｅＩで切断した。この
１２００ｂｐ断片を、５′側６１６ｂｐを含有する断片（以下に定義する）とともにＳｍ
ａＩ／ＳｐｅＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）にともに挿
入した。しかしながら、潜在的な転換体のスクリーニングは、１２００ｂｐの断片が挿入
されたことのみを示した。ヌクレオチド配列分析のために多くのクローンを選択した。
40
【０６４３】
多くのクローンのヌクレオチド配列分析後、さらなる操作のために、ｐＢＳＥＩＶＡ２Ｆ
ＨＡ−１９を選択した。このクローンは、ヌクレオチド６１７（第２４図）（配列認識番
号２８４）およびヌクレオチド１５７０（第２４図）（配列認識番号２８４）でのＢａｍ
ＨＩ部位の近くにエラーを含有する。これらのエラーを訂正するために、以下の操作を行
なった。プラスミドｐＢＳＥＩＶＡ２ＦＨＡ−１９をＢａｍＨＩとＳｐｈＩで切断し、切
除した９００ｂｐの断片を単離した。この断片を、ＨＡコード配列の３′側領域を包含す
る２５０ｂｐ ＳｐｈＩ／ＳｐｅＩ断片とともにＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＢＳ
−ＳＫにともに挿入した。テンプレートとしてのクローン＃７（上記）およびオリゴヌク
レオチドＡ２Ｆ３Ｐ（配列認識番号２８５）とＡ２Ｆ６（配列認識番号２８７）
50
(166)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【化２０１】
を用いて、この２５０ｂｐ ＰＣＲ断片を誘導した。産生したプラスミドをｐＥＩＶＨ３
３Ｐと称する。
【０６４４】
ＥＩＶ ＨＡのＨＡコード配列の５′側６１６ｂｐを以下の方法により産生した。最初に
、第１の鎖ｃＤＮＡを上述したように産生した。次いでこの第１の鎖ｃＤＮＡ標品をテン
プレートとして用い、オリゴヌクレオチドＡ２Ｆ５Ｐ（配列認識番号２８８）
【化２０２】
10
とＡ２ＦＢＡＭ１（配列認識番号２８９）
【化２０３】
を用いたＰＣＲによりこれらの配列を増幅した。この断片をＨｉｎｃＩＩ切断したｐＢＳ
−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、シスラタジェネ）に挿入し、産生したプラスミドをｐＥＩＶＨ
３５Ｐと称した。
【０６４５】
20
ワクシニアウイルスＨ６プロモーター配列（ゲーベルら、１９９０ａ、ｂ）およびＨＡコ
ード配列の５′側領域を、以下のように増幅し、融合せしめた。ｐＢＳＨ６ＩＩＩＢＥと
称するＨ６プロモーターに正確に連結したＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）ｅｎｖ遺伝子を含有す
るｐＢＳベースのプラスミドからＨ６配列を誘導した。これらの配列を、オリゴヌクレオ
チドＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６４）
【化２０４】
およびＨ６３Ｐ（配列認識番号２９１）
【化２０５】
30
を用いたＰＣＲにより増幅した。オリゴヌクレオチドＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６４）
およびＥＩＶ５ＰＡＣＣ（配列認識番号２９２）
【化２０６】
40
とともに１２０ｂｐのＨ６断片をテンプレートとして用い、Ｈ６プロモーターおよびＨＡ
コード配列の最初の４１ｂｐからＡｃｃＩ制限部位を含有する１６１ｂｐ断片を産生した
。この断片をＨｉｎｄＩＩＩとＡｃｃＩで切断し、ｐＥＩＶＨ３５Ｐからの５５０ｂｐ ＡｃｃＩ／ＢａｍＨＩ断片とともにＨｉｎｄ／ＢａｍＨＩで切断したｐＢＳ−ＳＫにとも
に挿入した。産生したプラスミドをｐＨ６ＥＩＶＨ３５Ｐと称した。
【０６４６】
ｐＨ６ＥＩＶＨ３５Ｐからの７１０ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ断片およびｐＥＩ
ＶＨ３３Ｐからの１２００ｂｐ ＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩ断片をＨｉｎｄとＳｐｅＩで切断
したｐＢＳ−ＳＫにともに挿入することにより、全縁ＨＡ発現カセットを誘導した。誘導
50
(167)
JP 3602844 B2 2004.12.15
プラスミドをｐＢＳＡ２ＦＨＡＢと称した。
【０６４７】
ヌクレオチド位置６１７でのＢａｍＨＩ部位の近くの上述した塩基変化を訂正するために
、マンデッキ方法（マンデッキ、１９８６）を用いた。ｐＢＳＡ２ＦＨＡＢをＢａｍＨＩ
で線状化し、オリゴヌクレオチドＡ２Ｆ７（配列認識番号２９３）
【化２０７】
10
を用いて突然変異誘発方法を行なった。ＨＡの訂正変形を含有するプラスミドをｐＢＳＡ
２ＦＨＡと称した。
【０６４８】
実施例４４−それぞれｖＣＰ１２８およびｖＰ９６１を産生するのに使用する挿入プラス
ミドｐＥＩＶＣ５ＬおよびｐＥＩＶＨＡＶＱＶＶの構築
プラスミドｐＣ３ＥＩＶＡＩＰＨＡをＮｒｕＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｈ６プロモー
ターの３′側２６ｂｐおよび全縁ＥＩＶ（Ａ１／プラハ／５６）ＨＡコード配列を含有す
る１．７ｋｂの断片を切除した。クレノウによるブラントエンドの後に、この断片を、Ｎ
ｒｕＩ／ＥｃｏＲＩで切断しクレノウでブラントエンドしたプラスミドｐＲＷ８３８に挿
入してプラスミドｐＣ５ＡＩＰＨＡを産生した。プラスミドｐＲＷ８３８は、カナリヤポ
20
ックス挿入プラスミド（Ｃ５座）中のワクシニアＨ６プロモーターに融合された狂犬病Ｇ
遺伝子（キエニーら、１９８４）を含有する。ＮｒｕＩとＥｃｏＲＩによる切断により、
Ｈ６プロモーターの５′側１００ｂｐとＣ５フランキングアームを残して狂犬病Ｇ遺伝子
を切除した。
【０６４９】
プラスミドｐＣ５ＡＩＰＨＡをＳｍａＩとＳａｃＩで切断し、Ｈ６プロモーターとＥＩＶ
（Ａ１／プラハ／５６）コード配列の５′側６４５ｂｐを含有する８２０ｂｐ断片を切除
した。この断片を、ＨＡコード配列の残りを含有するｐＣ３ＥＩＶＡＩＰＨＡらの１．１
ｋｂ ＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片とともに、ＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩで切断したｐ
ＢＳ−ＳＫに挿入した。産生したプラスミドをｐＢＳＡＩＰＨＡＶＱと称した。
30
【０６５０】
次いでプラスミドｐＢＳＡＩＰＨＡＶＱを、ＳｐｅＩとＳｍａＩで線状化した。この４．
７ｋｂの断片をｐＢＳＡ２ＦＨＡから誘導した１．８ｋｂ ＳｐｅＩ／部分的ＨｉｎｃＩ
Ｉ断片に連結した。ＥＩＶ（Ａ１／プラハ／５６）および（Ａ２／フォンテインブルー／
７９）ＨＡ遺伝子を頭対頭の配置で含有する、産生したｐＢＳベースのプラスミドを、ｐ
ＢＳＡＩＰＡ２ＦＨＡＱと称した。
【０６５１】
２つのＨＡ遺伝子を含有するｐＢＳＡＩＰ２ＦＨＡＶＱから誘導したＮｏｒＩ／ＸｈｏＩ
断片（３．５ｋｂ）を単離し、ｐＳＤ５４２（ＥＩＶ（Ａ２／サフォーク／８９）に関し
て以下に記載する）とｐＣ５Ｌに挿入し、それぞれ挿入プラスミドｐＥＩＶＨＡＶＱＶＶ
40
およびｐＥＩＶＣ５Ｌを産生した。
【０６５２】
Ｃ５Ｌ挿入プラスミドは以下のように誘導した。コスミドベクターｐＶＫ１０２（ノフお
よびネスター、１９８２）を用いて、ｖＣＰ６５のゲノムライブラリー（Ｃ５座に狂犬病
を有するＡＬＶＡＣベースの狂犬病Ｇ組換え体）を構築した。このライブラリーに、ｐＲ
Ｗ７６４．５（Ｃ５座）内に含有される０．９ｋｂのＰｖｕＩＩカナリヤポックスウイル
スゲノム断片をプローブした。これらのカナリヤポックスＤＮＡ配列は、起点挿入座を含
有している。２８ｋｂの挿入物を含有するクローンが増殖せしめられ、ｐＨＣＯＳ１と称
した。Ｃ５配列を含有するこのコスミドから３．３ｋｂのＣｌａ断片をサブクローンした
。このＣｌａＩ断片らの配列分析を用いて、１−１３７２のＣ５座の遺伝子地図を延長し
50
(168)
JP 3602844 B2 2004.12.15
た。
【０６５３】
Ｃ５挿入ベクター、ｐＣ５Ｌを、２段階で構築した。オリゴヌクレオチドＣ５Ａ（配列認
識番号２９４）
【化２０８】
およびＣ５Ｂ（配列認識番号２９５）
【化２０９】
10
を用いたＰＣＲ増幅により、１５３５ｂｐの左側アームを産生した。テンプレートＤＮＡ
はｖＣＰ６５ゲノムＤＮＡであった。この断片をＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ切断ｐＵＣ８にク
ローニングした。標準塩基配列決定プロトコルにより配列を確認した。オリゴヌクレオチ
ドＣ５Ｃ（配列認識番号２９６）
【化２１０】
およびＣ５ＤＡ（配列認識番号２９７）
【化２１１】
20
を用いたＰＣＲ増幅により、４０４ｂｐの右側アームを産生した。次いでこの断片を、以
前に産生し、ＳｍａＩ／ＰｓｔＩで切断した左側アームを含有するベクターにクローニン
グした。全縁構成を、標準配列分析により確認し、ｐＣ５Ｌと称した。この挿入プラスミ
ドは異種遺伝子のＣ５座への挿入を可能にする。
【０６５４】
実施例４５−インフルエンザウイルス（Ａ２／サフォーク／８９）血球凝集素遺伝子を発
現するＡＬＶＡＣ−およびＮＹＶＡＣベースの組換え体を産生する挿入プラスミドの構築
30
ウマインフルエンザウイルス（Ａ２／サフォーク／８９）からの血球凝集素（ＨＡ）遺伝
子を過含有するＭ１３クローンをＤｒ．Ｍ．ビンス（イギリス、ＣＢ８ ７ＤＷ、サフォ
ーク、ニューマーケット、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ５、アニマルヘルストラスト）から得た。この
クローンは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位によりＭ１３ベクターに挿入されたこのＨＡＳ遺伝子を
含有する全長１．７ｋｂ ｃＤＮＡ断片を含有する。
【０６５５】
最初に、オリゴヌクレオチドＥＩＶＳ１（配列認識番号２９８）
【化２１２】
40
およびＥＩＶＳ２（配列認識番号２９９）
【化２１３】
を用いたＰＣＲにより上述したＭ１３クローンからウマインフルエンザウイルス（ＥＩＶ
）ＨＡ遺伝子を増幅した。この１．７ｋｂの断片を、ＳｍａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ（
ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結した。２つの陽性クローンを誘導し、ヌクレオ
チド配列分析により分析した（ゲーベルら、１９９０ａ）。クローンＡは１つの非保存塩
基変化を含有し、一方クローンＢは、第２５図に示した配列と比較した３つの変化を含有
した（配列認識番号３００）。ＥＩＶＨＡ遺伝子の全長訂正変形を産生するために、クロ
50
(169)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ーンＢをＳａｃＩとＭｓｃＩで切断し、３９０ｂｐの断片を切除した。この断片をクロー
ンＡから誘導した４．３ｋｂのＭｓｃＩ／部分的ＳａｃＩ断片に連結した。これにより訂
正されたＥＩＶＨＡが得られ、ｐＢＳＥＩＶＨＳと称した。
【０６５６】
ＥＩＶＨＡコード配列の５′側３６０ｂｐを、オリゴヌクレオチドＩ３Ｌ５ＥＩＶ（配列
認識番号３０１）
【化２１４】
およびＥＩＶＰＶＵ（配列認識番号３０２）
10
【化２１５】
を用いたＰＣＲにより、ｐＢＳＥＩＶＨＳから誘導した。オリゴヌクレオチドＩ３Ｌ５Ｂ
５（配列認識番号３０３）
【化２１６】
およびＥＩＶ５Ｉ３Ｌ（配列認識番号３０４）
【化２１７】
20
を用いたＰＣＲにより全縁Ｉ３Ｌプロモーター領域（ゲーベルら、１９９０ａ、ｂ）をｐ
ＭＰＩ３Ｌ１０１から誘導した。オリゴヌクレオチドＩ３Ｌ５Ｂ５（配列認識番号３０３
）およびＥＩＶＰＶＵ（配列認識番号３０２）によるＰＣＲによって、オリゴヌクレオチ
ドＩ３Ｌ５ＥＩＶ（配列認識番号３０１）およびＥＩＶ５Ｉ３Ｌ（配列認識番号３０４）
による操作により協議された相補にしたがってこれらの断片を融合し、４８０ｂｐの断片
を産生した。
【０６５７】
プラスミドｐＭＰＩ３Ｌ１０１は、Ｉ３Ｌプロモーターの制御下で狂犬病糖タンパク質を
30
コードする遺伝子からなる発現カセットを含有し、全てはＯＲＦ Ｃ６Ｌ−Ｋ１Ｌが欠損
したワクシニア挿入プラスミドに挿入された（ゲーベルら、１９９０ａ、ｂ）。Ｉ３Ｌプ
ロモーターは、ＯＲＦ Ｉ３Ｌの開始コドンから直ちに上流の１０１塩基（ｎｔ ６４，
９７３−６５，０７４ ゲーベルら、１９９０ａ、ｂ）からなる。
【０６５８】
Ｉ３ＬプロモーターをＥＩＶＨＡコード配列の５′領域に正確に連結せしめる上述のよう
に誘導した融合断片をＢａｍＨＩ（５′末端）とＡｃｃＩ（３′末端）で切断し、４００
ｂｐの断片を単離した。この断片をｐＢＳＥＩＶＨＳから誘導した４．６ｋｂのＢａｍＨ
Ｉ／部分的ＡｃｃＩ断片に連結し、産生したプラスミドをｐＢＳＥＩＶＨＳＩ３Ｌと称し
た。
40
【０６５９】
ＥＩＶＨＡ発現カセットを含有する１．８ｋｂ ＳｍａＩ／ＸｈｏＩ断片をｐＢＳＥＩＶ
ＨＳＩ３Ｌから誘導した。この断片をＳｍａＩ／ＸｈｏＩ切断ｐＳＤ５４２（実施例３２
に記載した）挿入ベクターに挿入し、ｐＴＫＥＩＶＨＳＩ３Ｌを産生した。
【０６６０】
ｐＢＳＥＩＶＨＥＩ３Ｌ（上記）からの１．８ｋｂ ＳｍａＩ／ＸｈｏＩ断片を、Ｓｍａ
Ｉ／ＸｈｏＩで切断した、ＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）挿入プラスミド、ＶＱＣＰ３Ｌに挿入
した。産生したプラスミドをｐＣ３ＥＩＶＨＳＩ３Ｌと称した。
【０６６１】
挿入プラスミドＶＱＣＰ３Ｌを以下のように誘導した。ＸｍａＩによる切断と、線状化し
50
(170)
JP 3602844 B2 2004.12.15
たプラスミドのホスファターゼ処理と、アニールし、キナーゼしたオリゴヌクレオチドＣ
Ｐ２３（配列認識番号３０５）
【化２１８】
およびＣＰ２４（配列認識番号３０６）
【化２１９】
10
に連結することにより、ＶＱＣＰＣＰ３ＬをｐＳＰＣＰ３Ｌから誘導した。
【０６６２】
実施例４６−ＡＬＶＡＣウマインフルエンザウイルス組換え体の発生
プラスミドｐＥＩＶＣ５Ｌは、ウマ−１、Ａ１／プラハ／５６（Ｈ７）およびウマ−２、
Ａ２／フォンテインブルー／７９（Ｈ３）の血球凝集素コード配列を含有する。両方の遺
伝子をワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結し、ｄｅ−ｏｒｆｅｄ Ｃ５座に挿入
する。ＡＬＶＡＣウイルスは、生体外組換えにおいて治療ウイルスとして用い、挿入され
20
たＤＮＡを治療した。Ｈ７およびＨ３コード配列に対するハイブリダイゼーションに基づ
いて陽性プラークを選択した。両方の異種遺伝子を含有する純粋な個体群が得られるまで
、組換え体プラークにプラーク精製した。この時点で組換え体はｖＣＰ１２８と判明し、
株ウイルスを設立した。ウマからの多クローン性抗Ｈ７血清およびＨ３血球凝集素に特異
的な単クローン性抗体を用いて、蛍光抗体法を行なった。両方の試薬を用いてｖＣＰ１２
８感染ベロ細胞に表面蛍光が検出され、両方の抗原が感染細胞表面に適切に存在すること
が示された。
【０６６３】
Ｈ３特異的単クローン性抗体を用いた免疫沈降分析により、ｖＣＰ１２８感染ＣＥＦ細胞
中に約７５ｋｄのタンパク質の存在が示された。これは潜在的にＨＡ前駆体糖タンパク質
30
を表すものである。切断産生物は検出されなかった。Ｈ７特異的多クローン性血清を用い
た免疫沈降分析により、約７５ｋｄの前駆体糖タンパク質の存在が示された。それぞれ約
４５および３０ｋｄの分子量を有するＨＡ１ およびＨＡ２ 切断産生物もまた視覚化さ
れた。
【０６６４】
プラスミドｐＣ３ＥＩＶＨＳ１３Ｌは、ウマ−２ Ａ２／サフォーク／８９亜型の血球凝
集素コード配列を含有する。遺伝子は、ワクシニアウイルスＩ３Ｌプロモーターに連結さ
れ、ｄｅ−ｏｒｆｅｄＣ３挿入部位に挿入される。生体外組換えにおいて、ＡＬＶＡＣウ
イルスは治療ウイルスとして用いられ、異種遺伝子を治療する。Ｈ３特異的放射線標識プ
ローブに対するハイブリダイゼーションに基づいて組換え体プラークを選択した。純粋な
40
組換え体個体群となるまで、陽性プラークをプラーク精製した。この時点で、組換え体は
ｖＣＰ１５９であると判明し、ウイルス株を設立した。鶏からのＨ３特異的血清多クロー
ンを用いたｖＣＰ１５９感染ＣＥＦ細胞への蛍光抗体法により、免疫学的に認識したタン
パク質が感染細胞表面に発現されたことが示された。
【０６６５】
実施例４７−ウマインフルエンザウイルス亜型の血球凝集素糖タンパク質を含有するＮＹ
ＶＡＣ組換え体の発生
プラスミドｐＥＩＶＨＡＶＱＶＶは、ウマ−１、Ａ１／プラハ／５６（Ｈ７）およびウマ
−２、Ａ２／フォンテインブルー／７９（Ｈ３）をコードする配列を含有する。両方の遺
伝子をワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結し、ＴＫ部位に挿入する。ＮＹＶＡＣ
50
(171)
JP 3602844 B2 2004.12.15
（ｖＰ８６６）を生体外組換えにおいて治療ウイルスとして用い、異種遺伝子を治療する
。放射線標識したＨ３およびＨ７特異的タンパク質に対するハイブリダイゼーションに基
づいて組換えプラークを選択した。純粋な個体群が得られるまで、組換え後代ウイルスを
プラーク精製した。この時点で組換え体はｖＰ９６１であると判明し、ウイルス株を設立
した。Ｈ３特異的単クローン性行為およご多クローン性抗Ｈ７血清を用いた蛍光抗体法に
より、両方の糖タンパク質が感染細胞表面に発現されたことが分かった。同一の試薬によ
る免疫沈降分析により、Ｈ３糖タンパク質は、約７５ｋｄの分子量を有する前駆体糖タン
パク質として発現されたことが示された。切断産生物は証明されなかった。Ｈ７糖タンパ
ク質は、約７５ｋｄの前駆体糖タンパク質として証明され、ＨＡ１ およびＨＡ２ 切断
産生物はそれぞれ約４５および３０ｋｄの分子量を有した。
10
【０６６６】
プラスミドｐＴＫＥＩＶＨＳＩ３Ｌは、ウマ−２ Ａ２／サフォーク／８９血球凝集素糖
タンパク質のコード配列を含有する。コード配列を、Ｉ３Ｌプロモーターに連結し、ＴＫ
部位に挿入する。ＮＹＡＶＣ（ｖＰ８６６）を治療ウイルスとして用い、組換え体プラー
クは、Ｈ３特異的放射線標識したプローブに対するハイブリダイゼーションに基づいて選
択した。純粋な個体群が得られるまで、組換え体プラーク後代をプラーク精製した。この
時点で組換え体はｖＰ１０６３であることが判明し、ウイルス株を設立した。鶏からの多
クローン性抗Ｈ３を用いた蛍光抗体法により、免疫的に認識されたタンパク質が感染細胞
表面に発現された子とが分かった。
【０６６７】
20
実施例４８−ワクシニアウイルス／ＦＥＬＶ挿入プラスミドの構築
ＦｅＬＶ（ネコ白血病ウイルス）ｅｎｖ ＤＮＡ配列を、Ｍ１３ｍｐ（ベクターに挿入さ
れた２．４ｋｂｐ ＦｅＳＶ−ＳＭ ＤＮＡ（ギルホットら、１９８７）の形状でＤｒ．
Ｆ．ゲイルバート（フランス、パリ、セントルイス、血液実験病院の研究所）から得た（
メシング、１９８３）。全縁読取り枠を含有するこの２．４ｂｐ ＰｓｔＩ／ＫｐｎＩ断
片（ＦｅＬＶ ｐ７０＋ｐ１３Ｅ）を単離し、都合よくｐＵＣ１８に挿入した（メシング
、１９８３）。ｅｎｖ配列の３′末端でのＫｐｎＩ部位をＰｓｔＩ部位に変換し、２．４
ｋｂｐ ＰｓｔＩ断片を単離してＰｓｔＩ切断したｐＴｐ１５に連結した（グオら、１９
８９）。産生したプラスミドをｐＦｅＬＶ１Ａと称した。
【０６６８】
30
生体外突然変異誘発を用いて（マンデッキら、１９８６）、ｐＦｅＬＶ１ＡをｐＦｅＬＶ
１Ｂに変換した。これは、オリゴヌクレオチドＳＰＢＧＬＤ（配列認識番号３０７）
【化２２０】
を用いて行なった。このオリゴヌクレオチドにより突然変異誘発により、Ｈ６プロモータ
ーの境界でのＢｇｌＩＩ部位およびＨＡ配列を除去することができた。これにより、ウイ
ルス中に発見されたこれらのＤＮＡ断片の実際の配列が提供される。
40
【０６６９】
次いでプラスミドｐＦｅＬＶ１Ｂを、オリゴヌクレオチドＦｅＬＶ５Ｐ（配列認識番号３
０８）
【化２２１】
で突然変異誘発せしめ、ｐＦｅＬＶ１Ｃを産生した。以下の改変に関して、生体外突然変
異誘発をマンデッキ（１９８６）に記載されたように行なった。特有のＳｍａＩ部位での
50
(172)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ｐＦｅＬＶ１Ｂの切断後、ＤＮＡをＢａｌ３１で切断した。５秒、１０秒、２０秒、４０
秒および８０秒の時間に、アリコートを採取し、ＥＧＴＡを２０ｍＭの最終濃度に加える
ことにより、反応を終了せしめた。アリコートを採取し、突然変異誘発反応に用いた。産
生したプラスミド、ｐＦｅＬＶ１Ｃは、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの３′で隣
接したＦｅＬＶ ｅｎｖ遺伝子およびＡＴＧ：ＡＴＧ置換を含有した。プラスミドｐＦｅ
ＬＶ１Ｃを、治療ウイルスとしてのｖＰ４２５とともに生体外組換え試験に用い、全縁Ｆ
ｅＬＶエンベロープ糖タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルス（ｖＰ４５３）を
産生した。
【０６７０】
プラスミドｐＦｅＬＶ１Ｃを試薬として用いてｐＦｅＬＶ１Ｄを産生した。この組換えプ
10
ラスミドは、推定免疫抑制領域を欠如することを除いては全縁ＦｅＬＶ ｅｎｖ遺伝子を
含有する（シアンシオロら、１９８５；マセスら、１９７８）。免疫抑制領域をコードす
る配列（ギホットら、１９８７におけるヌクレオチド２２５２−２３３２の配列）を以下
の方法により生体外突然変異誘発により欠損せしめた（マンデッキ、１９８６）。プラス
ミドｐＦｅＬＶ１ＣをＢｓｍＩで線状化した。線状化したプラスミドをＢａｌ３１で処理
し、１分、２分、４分および８分でアリコートを採取し、突然変異誘発反応の使用のため
に採取した。オリゴヌクレオチドＦｅＬＶ１ＳＤ（配列認識番号３０９）
【化２２２】
20
を用いて生体外突然変異誘発を行なった。産生したプラスミド、ｐＦｅＬＶ１Ｄを、治療
ウイルスとしてのｖＰ４１０とともに生体外組換え試験に用いて、ｖＰ４５６を産生した
。このワクシニアウイルス組換え体は、推定免疫抑制領域が欠如した全縁エンベロープ糖
タンパク質を発現するように産生された。
【０６７１】
実施例４９−アビポックスウイルス／ＦｅＬＶ挿入プラスミドの形成
ＦＰ−１組換え体の構築のために、２．４ｋｂｐのＨ６／ＦｅＬＶ ｅｎｖ配列を、Ｂｇ
ｌＩＩの切断とＰｓｔＩの部分的な切断により、ｐＦＥＬＶ１Ａ（上記）から切除した。
30
ＢｇｌＩＩ部位は、Ｈ６プロモーター配列の５′境界にある。ＰｓｔＩ部位は、エンベロ
ープ糖タンパク質読取り枠の翻訳終止シグナルから４２０ｂｐ下流に位置する。
【０６７２】
２．４ｋｂｐ Ｈ６／ＦｅＬＶ ｅｎｖ配列をＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切断したｐＣＥ１
１に挿入した。多重クローニング部位を不可欠ＨｉｎｄＩＩ部位に挿入することにより、
ＦＰ−１挿入ベクターｐＣＥ１１をｐＲＷ７３１．１３から誘導した。この挿入ベクター
により、ＦＰ−１ゲノムが産生される。次いで組換え体ＦＰ−１／ＦｅＬＶ挿入プラスミ
ドをｐＦｅＬＶＦ１で切断した。この構成では、ＡＴＧ置換のための正確なＡＴＧが提供
されない。
【０６７３】
40
正確なＡＴＧ：ＡＴＧ構成を達成するために、約１．４ｋｂｐのＮｒｕＩ／ＳｓｔＩＩ断
片をワクシニアウイルス挿入ベクターｐＦｅＬＶ１Ｃ（上述）から誘導した。ＮｒｕＩ部
位は、ＡＴＧから２４ｂｐ下流の位置にあるＨ６プロモーター内に生じる。ＳｓｔＩＩ部
位は、ＡＴＧから１．４ｋｂｐ下流で、翻訳終止コドンから１ｋｂｐ上流に位置する。ｐ
ＦｅＬＶＦ１のＳｓｔＩＩによる切断とＮｒｕＩによる部分的な切断によって産生された
９．９ｋｂｐの断片に、ＮｒｕＩ／ＳｓｔＩＩ断片を連結した。この９．９ｋｂｐの断片
は、５．５ｋｂｐ ＦＰ−１フランキングアーム、ｐＵＣベクター配列、ｅｎｖ遺伝子の
下流部分に対応する１．４ｋｂｐのＦｅＬＶ配列、およびＨ６プロモーターの５′側部分
（約１００ｂｐ）を含有する。産生したプラスミドをｐＦｅＬＶＦ２と称した。ヌクレオ
チド配列分析により、正確なＡＴＧ：ＡＴＧ構成が確認された。
50
(173)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０６７４】
推定免疫抑制領域（上述）に対応するＦｅＬＶ ｅｎｖ配列を序供することにより、Ｆｅ
ＬＶＦ２からさらなるＦＰ−１挿入ベクター、ｐＦｅＬＶＦ３を誘導した。これは、ワク
シニアウイルス挿入ベクター、ｐＦｅＬＶ１Ｄ（上述）から得た約１ｋｂｐのＰｓｔＩ／
ＳｓｔＩＩ断片を単離し、この断片を、ｐＦｅＬＶＦ２のＰｓｔＩとＳｓｔＩＩによる切
断によって誘導された残りのＨ６／ＦｅＬＶ ｅｎｖ遺伝子を含有する１０．４ｋｂｐ ＰｓｔＩ／ＳｓｔＩＩ断片に挿入することにより行なった。
【０６７５】
挿入プラスミド、ｐＦｅＬＶＦ２およびｐＦｅＬＶＦ３を、治療ウイルスとしてのＦＰ−
１とともに、生体外組換え試験に用いた。後代ウイルスを、生後１０日の感染幼虫包蔵卵
10
から得た初代鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）単層に塗布し、ＣＥＦ単層のプラークハイブリダ
イゼーションにより組換えウイルスをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションによ
り同定した組換え体後代を選択し、４回のプラーク精製を行なって均質な個体群を得た。
全縁ＦｅＬＶ ｅｎｖ遺伝子をハーバリング（ｈａｒｂｏｒｉｎｇ）するＦＰ−１組換え
体は、ｖＦＰ２５と称し、それを含有するＦＰ−１組換え体は、ｖＦＰ３２と称した。
【０６７６】
ＣＰ組換え体を構築するために、Ｈ６／ＦｅＬＶ ｅｎｖ遺伝子配列を含有する２．２ｂ
ｐ断片を、ＫｐｎＩとＨｐａＩでの切断によりｐＦｅＬＶＦ２とｐＦｅＬＶＦ３から切除
した。ＫｐｎＩ部位は、Ｈ６プロモーター配列の５′境界にある。ＨｐａＩ部位は、エン
ベロープ糖タンパク質読取り枠の翻訳終止シグナルから１８０ｂｐ下流にある。これらの
20
単離した断片をブラントエンドした。これらの２．２ｋｂｐ Ｈ６／ＦｅＬＶ ｅｎｖ配
列を挿入プラスミドｐＲＷ７６４．２の不可欠ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、次いでＥｃｏＲ
Ｉ部位でブラントエンドした。これらの挿入ベクターにより、ＣＰゲノムのＣ３座におい
て異種遺伝子をハーバリングするＣＰ組換え体が産生できる。次いで組換え体ＣＰ挿入プ
ラスミドをそれぞれｐＦｅＬＶＣＰ２とｐＦｅＬＶＣＰ３と称した。
【０６７７】
挿入プラスミド、ｐＦｅＬＶＣＰ２とｐＦｅＬＶＣＰ３を、治療ウイルスとしてのＣＰと
ともに生体外組換え試験に用いた。組換え体の後代を、生後１０日の感染幼虫包蔵卵（Ｃ
Ｔ、ストー、ＳＰＡＦＡＳ）から得た初代鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）単層に塗布し、プロ
ーブとしての放射線標識したＦｅＬＶ ＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションにより組
30
換えウイルスを選択した。陽性雑種形成プラークを選択し、４回のプラーク精製を施し、
均質な個体群を得た。全縁ＦｅＬＶ ｅｎｖ遺伝子を発現する組換え体をｖＣＰ３５と称
し、免疫抑制領域を欠いて全縁ｅｎｖ遺伝子を発現する組換え体をｖＣＰ３７と称した。
【０６７８】
実施例５０−ＦｅＬＶ−Ｂ ｅｎｖ遺伝子を含有するＡＬＶＡＣベースの組換え体の産生
プラスミドｐＦｅＬＶ ｅｎｖ２４は、ローンメリクス（フランス、リヨン）から得て、
これはＦｅＬＶ−Ｂ ｅｎｖ遺伝子を含有する。このプラスミドは、ＮＣＥ１６１ Ｆｅ
ＬＶ菌株から誘導した４．２ｋｂのｃＤＮＡ誘導断片を含有する。プラスミドｐＦｅＬＶ
ｅｎｖ３４は、ｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）のＳｍａＩ部位に４．
２ｋｂのＦｅＬＶ−Ｂ特異的挿入物を含有する。ＦｅＬＶ−Ｂ ｅｎｖ遺伝子の配列を第
40
２６図に示す（配列認識番号３１０）。この配列において、開始コドン（ＡＴＧ）と終止
コドン（ＴＧＡ）に下線が引いてある。
【０６７９】
ＦｅＬＶ−Ｂ ｅｎｖの発現カセットは、以下のようにして構築した。オリゴヌクレオチ
ドＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６４）
【化２２３】
およびＨ６３ＰＦＢ（配列認識番号３１１）
【化２２４】
50
(174)
JP 3602844 B2 2004.12.15
を用いたＰＣＲによりプラスミドｐＩ４ＬＨ６ＨＩＶ３Ｂ（ＨＩＶに関して上述した）か
ら、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターを誘導した。これらのオリゴヌクレオチドによ
るこれらの配列の増幅は、最初の２０ｂｐのＦｅＬＶ−Ｂ ｅｎｖコード配列を含有する
３′末端と５′ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するＨ６プロモーターを産生した。
【０６８０】
オリゴヌクレオチドＦＢ５Ｐ（配列認識番号３１２）
【化２２５】
10
およびＦＢ５ＰＡ（配列認識番号３１３）
【化２２６】
を用いたＰＣＲによりｐＦｅＬＶ−Ｂ ｅｎｖ３４からＦｅＬＶ−Ｂ ｅｎｖ遺伝子の５
′部分を誘導した。このＰＣＲ誘導断片は、Ｈ６プロモーターの３′側２３ｂｐの相同性
（５′末端）および位置５４６での特有のＡｐａＩ部位を含有する。テンプレートとして
上記のように定義した２つのＰＣＲ断片と、オリゴヌクレオチドＦＢ５ＰＡ（配列認識番
号３１３）およびＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６４）を用いたＰＣＲにより、Ｈ６プロモ
20
ーターをＦｅＬＶ−Ｂ ｅｎｖ遺伝子に融合した。ＰＣＲ融合断片をＨｉｎｄＩＩＩとＡ
ｐａＩで切断し、６８０ｂｐ断片を産生した。
【０６８１】
プラスミドｐＦｅＬＶ−Ｂ ｅｎｖ３４をＡｐａＩとＮｃｏＩで切断し、ｅｎｖ遺伝子の
中間部分を含有する７４０ｂｐの断片を離生した。テンプレートとしてｐＦｅＬＶ−ｂ ｅｎｖ３４およびオリゴヌクレオチド（配列認識番号３１４）
【化２２７】
30
とＦＢ３ＰＸ（配列認識番号３１５）
【化２２８】
を用いたＰＣＲにより、遺伝子の３′末端を誘導した。これらのオリゴヌクレオチドによ
るｅｎｖ遺伝子の３′末端のＰＣＲ増幅により、位置１３２６−１３３２でのＴ５ＮＴ要
素を除去した。位置１３２９でのＴからＣの置換を行なうことにより、この配列を改変し
た（第２６図）。このＰＣＲ誘導断片の５′末端はまた、特有のＮｃｏＩ部位を含有する
（位置１２９８での部位に一致する；第２６図）。この断片をＮｃｏＩとＸｂａＩで切断
40
し、７０７ｂｐの断片を産生した。
【０６８２】
７４０ｂｐのＮｃｏＩ／ＡｐａＩ断片と７０７ｂｐのＮｃｏＩ／ＸｂａＩ断片をともに、
ＡｐａＩとＸｂａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに挿入した。産生したプラスミドをｐＢＳＦ
Ｂ３Ｐと称した。次いでｐＢＳＦＢ３Ｐからの１．５ｋｂのＡｐａＩ／ＸｂａＩ断片を、
ＦｅＬＶ−Ｂ ｅｎｖ遺伝子（上述）のＨ６プロモートした５′末端を含有する６８０ｂ
ｐのＰＣＲ断片とともに、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに挿入した
。産生したプラスミドをｐＢ５ＦＥＢと称した。
【０６８３】
Ｈ６プロモートしたＦｅＬＶ−Ｂ ｅｎｖ遺伝子を含有する、ｐＢ５ＦＥＢからの２．２
50
(175)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ断片を単離し、クレノウ断片でブラントエンドした。こ
のブラントエンドした断片を、ＳｍａＩで切断したｐＣ５Ｌ（ここのＨＩＶに関する議論
を参照）に挿入し、ｐＣ５ＬＦＥＢを産生した。
【０６８４】
プラスミドｐＣ５ＬＦＥＢを、治療ウイルスとしてのＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）とともに、
標準生体外組換えアッセイに用いた。ＦｅＬＶ−Ｂ ｅｎｖ特異的ＤＮＡプローブを用い
て、組換え体プラークを同定した。３回のプラーク精製後、ウイルスを繁殖せしめ、ｖＣ
Ｐ１７７と称した。
【０６８５】
実施例５１−ＡＬＶＡＣ−ＦｅＬＶ−Ａ ＥＮＶ組換えウイルスの産生
10
ＦｅＬＶ−Ａ ｅｎｖ配列を誘導したプラスミドｐＦＧＡ−５はＤｒ．Ｊ．ネイル（グラ
スゴー大学）から得て、以前に記載したものである（スチュワートら、１９８６）。最初
に、ヌクレオチド１から５３１ｂｐに対応する５３１ｂｐ ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断
片（スチュワートら、１９８６）を切除して、ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＣ
ＰＣＶ１に連結し、ｐＣ３ＦＡ−１と称した。このプラスミドｐＣＰＣＶ１は以下のよう
に誘導した。プラスミドｐＦｅＬＶ１ＡをＰｓｔＩで切断し、ＦｅＬＶ配列を切除して再
度連結し、プラスミドｐＦｅＬＶＦ４を産生した。ワクシニアウイルスＨ６プロモーター
要素（テイラーら、１９８８）と続くポリリンカー領域を、ＫｐｎＩとＨｐａＩでの切断
により、ｐＦｅＬＶＦ４から離生した。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて１５０ｂｐの
断片をブラントエンドし、カナリヤポックスＤＮＡの３．３ｋｂ ＰｖｕＩＩゲノム断片
20
を含有するプラスミド、ｐＲＷ７６４．２に挿入した。カナリヤポックス配列内で特有の
ＥｃｏＲＩ部位を認識するＥｃｏＲＩでｐＲＷ７６４．２を線状化し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｄ
ＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。産生したプラスミドは、
ｐＣＰＣＶ１と称した。このプラスミドは、ポリリンカー領域が続き、側腹にカナリヤポ
ックスウイルス相同配列を有する、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターを含有する。
【０６８６】
プラスミドｐＣ３ＦＡ−１を、ＰｓｔＩで線状化し、オリゴヌクレオチドＦＥＮＶＡＨ６
−１（配列認識番号３１６）
【化２２９】
30
を用いたマンデッキ法（１９８６）により生体外組換えにおいて突然変異誘発を行なった
。生体外突然変異誘発により、ワクシニアＨ６プロモーター要素の正確なＡＴＧ：ＡＴＧ
配列となる異種５′非コード配列およびＦｅＬＶ−Ａ ｅｎｖ配列を除去した。産生した
プラスミドをｐＨ６ＦＡ−１と称した。
【０６８７】
注文合成したオリゴヌクレオチド（ＣＡ、サンラファエル、アプライドバイオシステムス
）を用いた標準ＰＣＲによりＦｅＬＶ−Ａ ｅｎｖ遺伝子の残りをｐＦＧＡ−５から誘導
した。テンプレートとしてのｐＦＧＡ−５およびオリゴヌクレオチドＦＥＮＶＡ−２（配
列認識番号３１７）
40
【化２３０】
とＦＥＮＶＡＨ（配列認識番号２３１）
【化２３１】
を用いて、８３６ｂｐ ＰＣＲ断片を誘導した。この断片は、ＦｅＬＶ−Ａ ｅｎｖ遺伝
子のヌクレオチド４８８から１３２７と一致する（スチュワートら、１９８６）。オリゴ
50
(176)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ヌクレオチドＦＥＮＶＡ−２（配列認識番号３１７）の使用により、位置１３０１から１
３０９でのヌクレオチド配列をＧＡＴ５ ＧＴをＧＡＡＴＴＣＴＧＴに改変する。この改
変により、ポックスウイルス初期転写終止シグナル（ユエンとモス、１９８７）として認
識されるＴ５ＮＴ配列モチーフを除去し、この位置でのＥｃｏＲＩ制限部位を導入する。
これらのヌクレオチド操作は、グルタミン酸からアミノ酸４１４を保存アミノ酸アスパラ
ギン酸に変化せしめる（スチュワートら、１９８６）。これらのヌクレオチド変化により
アミノ酸４１５は改変されない。この８３６ｂｐの断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで
切断し、ＦｅＬＶ−Ａ ｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド５３２から１３０２に対応する７７
０ｂｐの断片を産生した。テンプレートとしてのｐＦＧＡ−５およびオリゴヌクレオチド
ＦＥＮＶＡ−３（配列認識番号３１９）
10
【化２３２】
とＦＥＮＶＡ−４（配列認識番号３２０）
【化２３３】
を用いて、７０９ｂｐのＰＣＲ断片を誘導した。この断片は、ＦｅＬＶ−Ａ ｅｎｖ遺伝
子のヌクレオチド１２８１から１９９０と一致する（スチュワートら、１９８６）。この
断片を増幅するためにオリゴヌクレオチドＦＥＮＶＡ−３（配列認識番号３１９）を用い
20
て、Ｔ５ＮＴ要素を改変し、上述したように、８３６ｂｐＰＣＲ誘導断片のためにＥｃｏ
ＲＩ部位を導入する。７０９ｂｐの断片をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、産生し
たプラスミドを、８３６ｂｐ断片（上記）から誘導した７７０ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｅ
ｃｏＲＩ断片とともに、ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、スト
ラタジェネ）に挿入した。産生したプラスミドをｐＦ３ＢＳ１−Ｂと称し、ＦｅＬＶ ｅ
ｎｖ配列をヌクレオチド配列分析により確認した。
【０６８８】
ワクシニアウイルスＨ６プロモーターに正確に連結した全縁ＦｅＬＶ−Ａ ｅｎｖ遺伝子
を再構築するために、１．５ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＦ３ＢＡ１−Ｂから単離した
。この断片は、ＦｅＬＶ−Ａ ｅｎｖのヌクレオチド５３２から１９９０と一致する（ス
30
チュワートら、１９８６）。１．５ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片をＨｉｎｄＩＩＩで切断し
たｐＨ６ＦＡ−１に連結した。１．５ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含有するプラスミド構
築物を、制限分析により適切な配向でスクリーニングし、Ｈ６プロモーターに連結した全
縁無傷ＦｅＬＶ−Ａ ｅｎｖ遺伝子を含有するプラスミドクローンをｐＨ６ＨＡ−３と称
した。
【０６８９】
２．２ｋｂ Ｈ６／ＦｅＬＶ−Ａ ｅｎｖ発現カセットを、ＥｃｏＲＩでの部分的な切断
と、ＨｉｎｄＩＩＩでの部分的な切断によりｐＨ６ＦＡ−３から切除した。この断片を、
ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＲＷ８３１に挿入した。産生したプラスミドを
ｐＣ５ＦＡと称した。
40
【０６９０】
ｐＲＷ８３１は、異種遺伝子をＣ５読取り枠に挿入させるＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）挿入プ
ラスミドを指す。この領域への挿入工程において、ｐＲＷ８３１の使用により、Ｃ５読取
り枠のほとんどが欠損せしめられる。ｐＲＷ８３１を産生するために、以下の操作を行な
った。カナリヤポックスウイルスゲノムからの８８０ｂｐ ＰｖｕＩＩゲノム断片をｐＵ
Ｃ９のＰｖｕＩＩ部位の間に挿入した。産生したプラスミド、ｐＲＷ７６４．５内に含有
されたカナリヤポックスウイルス配列をヌクレオチド配列分析により分析し、Ｃ５読取り
枠を定義した。この座で組換え体を操作するために、事前に、Ｃ５ ＯＲＦ内に位置する
１対のＢｇｌＩＩ部位の間の挿入を用いた（テイラーら、１９９２）。全縁領域の配列を
第１６図に示す（配列認識番号２２０）。ヌクレオチド配列（配列認識番号２２０）はＰ
50
(177)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ｖｕＩＩ部位で開始する。Ｃ５ ＯＲＦは位置１６６で開始し、ヌクレオチド４８７で終
止する。これらの配列の正確な操作により、ヌクレオチド１６７から４５５の欠損をする
ことができる。そのような欠損は、他のウイルス遺伝子の発現を妨害しないように行なっ
た。
【０６９１】
ｐＲＷ８３１を誘導する方法を以下のように行なう。ｐＲＷ７６４．５をＲｓａＩで部分
的に切断し、線状化された断片を単離する。ＲｓａＩ線状断片をＢｇｌＩＩＩで再切断し
た。産生した２．９ｋｂ ＲｓａＩ／ＢｇｌＩＩ断片（ヌクレオチド１５６から４６２が
欠損した）を単離し、アニールしたオリゴヌクレオチドＲＷ１４５（配列認識番号１０７
）およびＲＷ１４６（配列認識番号１０８）に連結した。産生したプラスミドはｐＲＷ８
10
３１と称し、Ｃ５配列の場所に、特有のＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、およびＥｃｏＲＩ部
位を有する配列を含有する。
【０６９２】
プラスミドｐＣ５ＦＡを、治療ウイルスとしてのＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）とともに生体外
組換え実験に用いた。放射線標識したＦｅＬＶ−Ａ ｅｎｖ特異的プローブを用いた現場
でのプラークハイブリダイゼーションにより組換えウイルスを同定した。３回のプラーク
精製と続いてのハイブリダイゼーション確認後、組換え体をｖＣＰ８３と称した。
【０６９３】
実施例５２−ｐ１５Ｅの推定免疫抑制領域が欠如したＡＬＶＡＣ−ＦｅＬＶ−Ａ
ＥＮＶ組換えウイルスの産生
20
推定免疫抑制領域は、ＦｅＬＶエンベロープ糖タンパク質のｐ１５Ｅ膜貫通領域内に位置
する（シアンシオロら、１９８６；マセスら、１９７８）。この領域は以下の方法により
欠損せしめた。ヌクレオチド１２８２から１６０２のＦｅＬＶ−Ａ ｅｎｖ配列（スチュ
ワートら、１９８６）は、オリゴヌクレオチドＦＥＮＶＡ−３（配列認識番号３２０）お
よびＩＳ−Ａ（配列認識番号４６８）
【化２３４】
を用いたＰＣＲによりｐＦＧＡ−５から増幅した。ヌクレオチド１６８４から１９９０の
ｅｎｖ配列（スチュワートら、１９８６）は、オリゴヌクレオチドＦＥＮＶＡ−４（配列
30
認識番号３２０）およびＩＳ−Ｂ（配列認識番号３２３）
【化２３５】
を用いたＰＣＲによりｐＦＧＡ−５から増幅した。前者のＰＣＲ誘導断片は、ＥｃｏＲＩ
で切断し、後者はＨｉｎｄＩＩＩで切断し、続いてＡＴＰとＴ４キナーゼでキナーゼした
。これらの断片を、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＢＳ−ＳＫにともに連結し
た。産生したプラスミドは、ヌクレオチド配列分析により確認し、ｐＢＳＦＡＩＳ
− と
称した。上述した断片の連結は、配列５′および３′を、推定免疫抑制領域をコードする
８１ｂｐのＤＮＡ断片に結合させ、それゆえ、免疫抑制ペプチドをコードする配列を欠損
40
せしめる。
【０６９４】
免疫抑制領域をコードする領域が欠如したＦｅＬＶ−Ａ配列をＳｓｔＩＩ／ＡｐａＩでの
切断によりｐＣ５ＦＡから切除した。この３８１ｂｐの断片をｐＢＳＦＡＩＳ
− からの
３００ｂｐ ＳｓｔＩＩ／ＡｐａＩ断片により置換した。行なった連結は、ｐＣ５ＦＡか
らの４．８ｋｂ ＳｓｔＩＩ／ＡｐａＩ断片と上述した３００ｂｐ断片によるものであっ
た。産生したプラスミドをｐＣ５ＦＡＩＳＤと称した。
【０６９５】
プラスミドｐＣ５ＦＡＩＳＤは、治療ウイルスとしてのＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）とともに
組換え実験に用いた。放射線標識したＦｅＬＶ−Ａ ｅｎｖ特異的プローブを用いた現場
50
(178)
JP 3602844 B2 2004.12.15
でのハイブリダイゼーションにより組換えウイルスを同定した。３回のプラーク精製後、
組換え体をｖＣＰ８７と称した。この組換え体は、推定２７アミノ酸免疫抑制領域をコー
ドする領域が欠如したＦｅＬＶ−Ａ ｅｎｖ遺伝子を含有する。この遺伝子をＣ５座に挿
入した。
【０６９６】
実施例５３−ＡＬＶＡＣ−ＦｅＬＶ−Ａ ｇａｇ組換えウイルスの産生
ＦｅＬＶ−Ａ ｇａｇ／ｐｏｌ配列をプラスミドｐＦＧＡ−２ ｇａｇから誘導した。こ
のプラスミドは、ＬＴＲ（６５１ｂｐ）配列の部分、全縁ｇａｇ遺伝子、およびｐｏｌ遺
伝子の１２７２ｂｐを含有する３．５ｋｂ ＰｓｔＩサブ断片をサブクローニングするこ
とによりＦｅＬＶ−Ａ感染クローンｐＦＧＡ−２（スチュワートら、１９８６）から誘導
10
した。３．５ｋｂ断片をＰｓｔＩで切断したｐＵＣ８（ＭＤ、ゲイサースブルグ、ベセス
ダリサーチラボラトリーズ）に挿入した。最初にこの３．５ｋｂ ＰｓｔＩ ＦｅＬＶ−
Ａ ＤＮＡ断片を単離し、ｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に挿入した
。産生したプラスミドをｐＢＳＧＡＧと称した。ヌクレオチド配列（配列認識番号３２４
）（第２７図）分析により全縁３．５ｋｂ挿入物を分析し、開始コドン（第２７図に下線
を引いたヌクレオチド６５２から６５４）およびＦｅＬＶ−Ｂ（レプロベッテら、１９８
４）に関して以前に記載したｇａｇ領域のヌクレオチド配列内に定義された関連制限部位
の位置を確認した。
【０６９７】
プラスミドｐＦＧＡ−２ ｇａｇをＢｇｌＩＩとＰｓｔＩで切断し、２．５ｋｂ断片を離
20
生した。ＢｇｌＩＩは、ヌクレオチド位置１０７６（配列認識番号３２４）での部位を認
識し、一方ＰｓｔＩは、ＦｅＬＶ−Ａ挿入物の末端での部位を認識する。２．５ｋｂ団便
を単離し、共移動プラスミド配列内の部位を認識するＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで再切断
した。これにより、プラスミド配列の続いての連結反応を競合する能力が除去された。
【０６９８】
ＰＣＲを用いてＦｅＬＶ−Ａ ｇａｇコード配列の５′末端を誘導した。プラスミドｐＦ
ＧＡ２ ｇａｇは、オリゴヌクレオチドＦＧＡＧＢＧＬ（配列認識番号３２５）
【化２３６】
30
およびＦＧＡＧＡＴＧ（配列認識番号３２６）
【化２３７】
とともにテンプレートとして用いた。オリゴヌクレオチドＦＧＡＧＡＴＧ（配列認識番号
３２６）は、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの３′側の２５ヌクレオチドを含有し
、その５′末端でのＮｒｕＩ部位の３′側３ｂｐを含有する。これらのＨ６配列は、ＡＴ
Ｇ（開始コドン）で正確に結合し、ヌクレオチドはｇａｇコード配列の最初の１６ヌクレ
オチドに一致する。オリゴヌクレオチドＦＧＡＧＢＧＬ（配列認識番号３２５）は、ｇａ
ｇ配列中の特有のＢｇｌＩＩ部位から５９ｂｐ下流の配列の逆補体と一致する（レプレボ
40
ッテら、１９８４）。これらの試薬を用いたＰＣＲにより、続いてＢｇｌＩＩで切断され
て４５０ｂｐ断片を産生する５００ｂｐ断片を産生した。
【０６９９】
４５０ｂｐ ＢｇｌＩＩ切断ＰＣＲ誘導断片を、ｇａｇ遺伝子の残りとｐｏｌ遺伝子の部
分を含有する２．５ｋｂ ＢｇｌＩＩ／ＰｓｔＩ断片、およびＮｒｕＩとＰｓｔＩで切断
したｐＣＰＣＶ１（上記ｅｎｖ構造）と共連結した。ｐＣＰＣＶ１（ＮｒｕＩ／ＰｓｔＩ
）は、ＮｒｕＩ認識シグナルの５′側の３ｂｐを含有するワクシニアウイルスＨ６プロモ
ーターの５′部分を含有する。産生したプラスミドをｐＣ３ＦＧＡＧと称した。
【０７００】
プラスミドｐＣ３ＦＧＡＧを、ＰｓｔＩで線状化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼでブラン
50
(179)
JP 3602844 B2 2004.12.15
トエンドし、ｐＳＤ５１３（実施例７に定義した）から切除した１００ｂｐ ＳｓｐＩ／
ＳｍａＩ断片に連結した。１００ｂｐのＳｓｐＩ／ＳｍａＩ断片により、ＦｅＬＶ−Ａ ｇａｇ／ｐｏｌ配列の３′末端で終止コドンが提供される。産生したプラスミドをｐＣ３
ＦＧＡＧＶＱと称した。
【０７０１】
ＦｅＬＶ−Ａ ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットを、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでの切断に
よりｐＣ３ＦＧＡＧＶＱから切除した。産生した３．４ｋｂ断片を単離し、ＥｃｏＲＩと
ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＣ３Ｉ（実施例３２に定義した）に連結し、ｐＣ３Ｄ０ＦＧ
ＡＦＶＱを産生した。
【０７０２】
10
プラスミドｐＣ３Ｄ０ＦＧＡＧＶＱを、治療ウイルスとしてのｖＣＰ８３とｖＣＰ８７と
ともに生体外組換え実験に用いた。ＦｅＬＶ−Ａ ｇａｇ／ｐｏｌ配列および全縁ＦｅＬ
Ｖ−Ａ ｅｎｖ遺伝子を含有する組換え体はｖＣＰ９７と称し、一方同一のｇａｇ／ｐｏ
ｌ配列および免疫抑制領域が欠如した全縁ＦｅＬＶ−Ａ ｅｎｖを含有する組換え体をｖ
ＣＰ９３と称した。
【０７０３】
実施例５４−ＦｅＬＶ−Ａ ｇａｇのワクシニアウイルスバックグラウンドへの挿入
ｐＣ３ＦＧＡＧ（上記）からの３．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＳＤ５
５３のＳｍａＩ部位にクローニングすることにより、挿入プラスミドｐＣＥＮ１５１を産
生した。２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断
20
片によりその断片をブラントエンドした後に、この挿入を行なった。
【０７０４】
プラスミドｐＳＤ５５３は、ＣＯＰＡＫシリーズのワクシニア欠損／挿入プラスミドであ
る。このプラスミドは、フランキングコペンハーゲンワクシニアアーム内のワクシニアＫ
１Ｌ宿主域遺伝子（ギラードら、１９８６；パーカスら、１９９０）を含有し、ＡＴＩ領
域（ＯＲＦ Ａ２５Ｌ、Ａ２６Ｌ；ゲーベルら、１９９０ａ、ｂ）を置換する。ｐＳＤ５
５３は以下のようにして構築した。プラスミドｐＳＤ５４１のワクシニアＡＴＩ欠損座に
位置するポリリンカー領域（実施例１０に定義した）を以下のように拡張した。ｐＳＤ５
４１をＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩで切断し、アニールした相補合成デオキシオリゴヌクレオチ
ドＭＰＳＹＮ３３３（配列認識番号３２９）
30
【化２３８】
およびＭＰＳＹＮ３３４（配列認識番号３３０）
【化２３９】
に連結し、プラスミドｐＳＤ５５２を産生した。Ｋ１Ｌ宿主域遺伝子を、プラスミドｐＳ
40
Ｄ４５２からの１ｋｂ ＢｇｌＩＩ（部分的）／ＨｐａＩ断片として単離した（パーカス
ら、１９９０） 。ｐＳＤ５５２を、ＢｇｌＩＩ／ＨｐａＩで切断し、断片を含有するＫ
１Ｌに連結し、ｐＳＤ５５３を産生した。
【０７０５】
プラスミドｐＣＥＮ１５１を、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６とともに生体外組換え実
験に用いてｖＰ１０１１を産生した。
【０７０６】
実施例５５−ＡＬＶＡＣ組換えウイルスにおけるＦｅＬＶ ＥＮＶおよびｇａｇ遺伝子の
蛍光抗体法および免疫沈降分析
免疫沈降
50
(180)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ベロ細胞単層を、１０ｐｆｕ／細胞に等しいｍ．ｏ．ｉ．で親または組換えウイルスに感
染せしめた。感染から１時間後、接種物を吸引し、（
３ ５
Ｓ）−メチオニン（ＭＡ、ボス
トン、デュポン；１０００ Ｃｉ／ｍモル）、２０μＣｉ／ｍｌを補給したメチオニン不
含有培地を加え、さらに感染から１８時間後までインキュベーションした。ウシ抗ＦｅＬ
Ｖ血清（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）またはｐ２７コアタンパク質に特異的な単ク
ローン性抗体（ＧＡ、アテネ、ローンメリクスから得た）を用いて、免疫沈降および蛍光
抗体法分析を前述したように行なった。
【０７０７】
ＦｅＬＶウイルスの単離
１日目に、３×１０
４ ＱＮ１０細胞／ウェルを、ＨＥＦＰＥＳ緩衝液（ＤＦＢ）、１０
10
％のＦＢＳ、および４μｇ／ｍｌのポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）を含有する１ｍｌ
のダルベッコＭＥＭ中の１２ウェル板に展開した。細胞を３７℃で一晩インキュベーショ
ンした。培地を取り除くことなく、２００μｌの試料（ネコ血漿）を各ウェルに加えた。
３７℃の２時間のインキュベーション後、培地を１．５ｍｌ新鮮なのＤＦＢと置き換えて
、さらに３７℃でシンキュベーションした。５日目に、板を転換に関して検査した。陰性
の場合には、培地を１．５ｍｌの新鮮なＤＦＢと置き換えて、さらに３７℃でシンキュベ
ーションした。８日目に、板を転換に関して再検査した。陰性の場合には、トリプシン−
ＥＤＴＡでの２回の洗浄により細胞を分散せしめ、５ｃｍの板への接種のための４ｍｌの
ＤＦＢ中に配することにより、細胞を５ｃｍの板に継代培養せしめた。転換の検査の前に
、細胞を３７℃で４時間に亘りインキュベーションせしめた。
20
【０７０８】
蛍光抗体法によるＦｅＬＶ抗原の検出
血液スミアを−２０℃で５分間ＭｅＯＨ中に固定し、ｄＨ２ Ｏ中で洗浄し、次いで空気
乾燥せしめた。２４μｌのウサギ抗ＦｅＬＶ抗体を、ダイアモンドペンでスミア上に記し
た円内に血液スミアを施した。ＰＢＳで３回、ｄＨ２ Ｏで１回の洗浄の前に、抗体の存
在下で加湿器中、１時間、３７℃でスミアをインキュベーションした。次いでスミアを空
気感想せしめた。２５μｌのヒツジ抗ネコＩｇＧ−ＦＩＴＣを円に施し、第１抗血清とと
もに上述したようにインキュベーションした。紫外線光源での顕微鏡による蛍光抗体法の
検査の前に、試料を洗浄し、第１抗血清について上述したように乾燥せしめた。
【０７０９】
30
ＦｅＬＶ抗体中和アッセイ
１日目に、５×１０
４ ＱＮ１０細胞／ウェルを、１ｍｌのＤＦＢと４μｇ／ｍｌのポリ
ブレン中の１２ウェル板に展開した。細胞を３７℃でインキュベーションした。５０μｌ
のレイボウィッツ培地を用いて、１：２から１：２５６までの血清希釈物を丸底９６ウェ
ル板中に調製した。１ｍｌ当たり４×１０
５ フォーカス形成単位（ｆｆｕ）での５０μ
ｌのＦｅＬＶ−Ａを加えた。２つのウェルをウイルス対照として血清のない培地とともに
インキュベーションした。板を３７℃で２時間インキュベーションした。２時間の吸着期
間後、２５μｌの各希釈物をＱＮ１０細胞のウェル中に配した。ＱＮ１０細胞への２５μ
ｌの接種の前に、９６ウェル板中のレイボウィッツ培地の５０μｌ中で１：２、１：４、
１：８および１：６で希釈することによりウイルス対照を滴定した。３日間、３７℃で板
40
をインキュベーションした。１日目に培地を１ｍｌのＤＦＢ／ウェルと置き換えた。２日
後に、フォーカスを顕微鏡で数えた。ウイルス対照と比較したフォーカスの数が７５％減
少した血清の希釈物として、中和抗体抗体滴定を評価した。
【０７１０】
ｖＣＰ８３およびｃＣＰ８７により発現されたｅｎｖ遺伝子産生物が感染細胞の形質膜に
運搬されたか否かを決定するために、前述したように蛍光抗体法実験を行なった（テイラ
ーら、１９９０）。初代ＣＥＦ単層を、親（ＡＬＶＡＣ）または組換えウイルス、ｖＣＰ
８３およびｖＣＰ８７に感染せしめ、感染から２４時間後に、ウシ抗ＦｅＬＶ血清を用い
て蛍光抗体法を行なった。結果により、ｖＣＰ８３に感染した細胞は、強い表面蛍光着色
を示し、ｖＣＰ８７または親ＡＬＶＡＣに感染した細胞は著しい表面着色は示さなかった
50
(181)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ことが分かった。
【０７１１】
ウシ抗ＦｅＬＶ血清を用いて、免疫沈降分析により、ＦｅＬＶ ｅｎｖ遺伝子産生物の発
現もまた分析した。未感染ＣＥＦまたは親ＡＬＶＡＣウイルスに感染したＣＥＦから誘導
した溶解産物からはＦｅＬＶ特異的タンパク質種は沈殿しなかった。ｖＣＰ８３感染細胞
からは、８５ｋＤａ、７０ｋＤａ、および１５ｋＤａの見かけの分子量を有する３つのＦ
ｅＬＶ特異的タンパク質が沈殿した。この結果は、前駆体ｅｎｖ遺伝子産生物（８５ｋＤ
ａ）および熟成切断産生物ｐ７０およびｐ１５Ｅの発現と一致するものである。ｖＣＰ８
８感染細胞から誘導した溶解産物からの免疫沈降により、８３ｋＤａの見かけの分子量を
有する１つのＦｅＬＶ特異的タンパク質種が示された。これは、推定免疫抑制領域の欠損
10
後に予期されたサイズの非タンパク質分解加工ｅｎｖ遺伝子産生物の発現に一致するもの
である。手短にいうと、免疫抑制領域の欠如したｅｎｖの発現は、感染細胞の表面には明
らかに適切には運搬されず、または熟成ｅｎｖ特異的タンパク質形状にはタンパク質分解
的に切断されない。
【０７１２】
ｐ２７コアタンパク質（Ｄ５）内のエピトープに特異的な単クローン性抗体およびウシ抗
ＦｅＬＶ血清を用いた免疫沈降により、ＦｅＬＶ ｇａｇ特異的遺伝子産生物の発現を分
析した。未感染細胞または親ウイルスに感染した細胞から誘導した溶解産物からは、Ｆｅ
ＬＶ特異的タンパク質は沈殿しなかった。Ｄ５およびウシ抗ＦｅＬＶ血清により、ｖＰ１
０１１、ｃＣＰ９３、およびｖＣＰ９７に感染した細胞からは、５５ｋＤａのＦｅＬＶ特
20
異的タンパク質種が沈殿した。これらの見かけの分子量のタンパク質種は、ｇａｇ特異的
前駆体形状と一致する。熟成ｐ２７コアタンパク質のサイズに一致する低水準の２７ｋＤ
ａタンパク質種もまた明確であった。
【０７１３】
実施例５６−ｖＣＰ９３およびｖＣＰ９７の体内評価
組換えウイルスの２回の接種後のネコの生ＦｅＬＶ抗原投与によりｖＣＰ９３およびｖＣ
Ｐ９７の防御効果を評価した。０日と２８日の皮下経路の１０
８ ＰＦＵにより、ＡＬＶ
ＡＣベースのＦｅＬＶ組換え体を投与した。追加抗原投与接種後から７日目に、相同Ｆｅ
ＬＶ−Ａ菌株（グラスゴー１）を口鼻投与によりネコに抗原投与した。ＦｅＬＶ抗原血症
（ｐ２７検出）、ＦｅＬＶ単離、蛍光抗体法による白血球（ＷＢＣ）スミア中のＦｅＬＶ
30
抗原の存在、およびＦｅＬＶ中和活性の誘発の評価のために、抗原投与の前と後に、血液
試料を得た。
【０７１４】
ＡＬＶＡＣ（カナリヤポックスウイルス）ベースの組換えウイルス、ｖＣＰ９３およびｖ
ＣＰ９７によるワクチン接種後には、副作用は観察されなかった。６つの非ワクチン接種
対照の全ては、ＦｅＬＶ抗原投与のために死亡し、抗原投与の露出後３週間で持続性のウ
イルス血症を発達せしめた。これは、血液中のｐ２７抗原の検出、ＦｅＬＶの単離および
ＷＢＣスミアの蛍光抗体法によるＦｅＬＶ抗原の検出により証拠付けられた（表３２）。
非ワクチン接種の対照は、研究の残りの期間に亘り感染し続けた（抗原投与後１２週間ま
で）。
40
【０７１５】
持続性のウイルス血症は、抗原投与から３週間後にｖＣＰ９３をワクチン接種した６匹の
ネコのうち３匹に発達した。この時点で、これらの３匹のネコからの血液のサンプリング
により、ｐ２７抗原および／または生ＦｅＬＶを含有することが示された（表３２）。こ
れらのネコのうち１匹（２番）は、感染から６週間後にこの感染から解放され、抗原投与
から１２週間後までウイルス血症のないままでいた。他の２匹のネコ（１番と５番）は、
３つの分類基準、ｐ２７抗原血症、ＦｅＬＶの単離、およびＷＢＣ中のＦｅＬＶ抗原検出
により持続的に感染したままであった。ｖＣＰ９３をワクチン接種した６匹のネコのうち
３匹（３番、４番、および６番）は、抗原投与から９週間に亘り持続性ウイルス血症には
感染しないままでいた（表３２）。これらのネコのうち２匹（３番と６番）は、抗原投与
50
(182)
JP 3602844 B2 2004.12.15
後から１２週間に亘り循環ウイルスのないままであったが、一方で１匹のネコ（４番）は
、１２週間目に突然感染した。ｖＣＰ９３でのワクチン接種により、持続性ウイルス血症
に対して部分的な防御（６匹のネコのうち３匹）が与えられた。
【０７１６】
最も印象的なことには、ｖＣＰ９７をワクチン接種した６匹のネコ全てが、ＦｅＬＶ−Ａ
（グラスゴー１）による相同抗原投与に対して完全に防御された。これらのネコのうち１
匹のみ（１２番）が、持続性ウイルス血症の様子を示した。ｐ２７抗原が血液試料中に検
出された（表３２）抗原投与から３週間後に生じた。抗原投与後に、このネコの血液から
は生ＦｅＬＶは決して単離されなかった。他のネコは、抗原投与露出から１２週間に亘り
、ｐ２７抗原血症がなく、生ＦｅＬＶがなく、ＷＢＣスミア中にＦｅＬＶ抗原を決して示
10
さなかった（表３２）。
【０７１７】
ＦｅＬＶ中和抗体の進化
ＦｅＬＶ感染に対する防御における中和抗体の潜在的な役割のために（ラッセルおよびジ
ャレット、１９７８；ラッツら、１９８０）、そのような応答の発生は抗原投与の前後に
監視された。ｖＣＰ９３またはｖＣＰ９７のいずれかでワクチン接種された研究における
ネコは、ＦｅＬＶ抗原投与前には、中和抗体力価を示さなかった（表３３）。抗原投与後
に、持続性ウイルス血症を発達せしめたどのネコも、検出可能な中和抗体力価を示したも
のはいなかった。驚くべきことに、持続性感染に対して防御されたネコは、ＦｅＬＶ特異
的血清中和力価を発達せしめた（表３３）。これらの力価は、抗原投与後に防御された全
てのネコにおいて著しく増大し、研究の終止時点である抗原投与から１２週間後に、高水
準であることが観察された（表３３）。
【０７１８】
【表３２】
20
(183)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
(184)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表３３】
30
(185)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
実施例５７−ＦＨＶ−１ ｇＤ糖タンパク質を発現するＡＬＶＡＣベースの組換え体の産
40
生
ワクシニアウイルスＩ３Ｌプロモーターの制御下で、ＦＨＶ−１ ｇＤ相同遺伝子のＡＬ
ＶＡＣベクターへの挿入により、１型ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ−１） ｇＤ糖タン
パク質の発現を行なった。カセットＩ３Ｌ−ＦＨＶ−１ ｇＤをＡＬＶＡＣに挿入するの
に必要とされる供与体プラスミドを以下のように産生した。
【０７１９】
ＦＨＶ−１ Ｃ０菌株ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで完全に切断し、断片Ｍ（４４８０ｂｐ
）をアガロースゲルから切除し（遺伝子洗浄方法）、ＥｃｏＲＩで切断してホスファター
ゼしたベクターｐＢＳ−ＳＫ
＋ にクローニングした。ＦＨＶ−１ ＥｃｏＲＩ Ｍ断片
を含有する、産生したプラスミドをｐＨＦｅＭ２と称した。修飾Ｔ７酵素シーケナーゼ（
50
(186)
JP 3602844 B2 2004.12.15
米国バイオケミカル社）を用いて、両鎖のＦＨＶ−１ ＥｃｏＲＩ Ｍ断片完全ヌクレオ
チド配列を、ベクターｐＢＳ−ＳＫ
＋ に挿入されたＦＨＶ−１ ＥｃｏＲＩ Ｍ断片の
いくつかのサブクローンから得た（テイバーおよびリチャードソン、１９８７）。０．４
Ｍ−ＮａＯＨ中で変性せしめられた二本鎖テンプレートを用いて、標準ジデオキシヌクレ
オチド鎖終止反応（サンガーら、１９７７）を行なった（ハットリおよびササキ、１９８
６）。Ｍ１３順および逆プライマーを用いて、各クローンの最初の配列を得た。標準化学
種（バイオリサーチ８７００およびアプライドバイオシステム３８０Ｂ）を用いて合成し
た、注文プライマー（１８ｍｅｒ）を続いての配列反応に用いた。続発性断片間の接合の
配列を、最初のクローン、ｐＨＦｅＭ２で確認した。全ての配列データ分析に、ＰＣ＼Ｇ
ＥＮＥ（インテリジェネティックス）およびＩＢＩパステルソフトウェアーパッケージを
10
用いた。スイスプロトリリース１８．０（インテリジェネティックス）に対するＰＡＳＴ
Ｐプログラム（リップマンおよびペアーソン、１９８５）に関して、相同探求を行なった
。ＦＨＶ−１ Ｃ０菌株ｇＤ相同遺伝子の全配列を第２８図に示す（配列認識番号２９０
）。
【０７２０】
テンプレートとしてのプラスミドｐＨＦｅＭ２およびオリゴヌクレオチドＪＣＡ２３４（
配列認識番号３３１）
【化２４０】
20
とＪＣＡ２３５（配列認識番号３３２）
【化２４１】
を用いて、ＦＨＶ−１ ｇＤコード配列の１８５ｂｐ ５′側領域を誘導し、ＢａｍＨＩ
で切断した。この１８５ｂｐ断片を、プラスミドｐＭＰ６９１（Ｉ３Ｌ１０１ＲＡＢ）お
よびオリゴヌクレオチドＭＰ２８７（配列認識番号２２６）
【化２４２】
30
とＪＣＡ１５８（配列認識番号２２５）
【化２４３】
を用いて得たＩ３Ｌプロモーター要素を含有する１２０ｂｐのＰＣＲ誘導断片に融合し、
ＸｂａＩで切断した。１８５ｂｐおよび１２０ｂｐ断片を、ＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断
したベクターｐＢＳ−ＳＫ
＋ 中にともに連結し、プラスミドｐＪＣＡ０７１を産生した
。接合部Ｉ３Ｌ−ＡＴＧおよびＦＨＶ−１ ｇＤ ５′側領域のＩ３Ｌプロモーターの配
列を、ｐＪＣＡ０７１の直接塩基配列決定法により確認した。プラスミドｐＪＣＡ０６７
は、ＦＨＶ−１ ＥｃｏＲＩ Ｍ断片のサブクローンである。以下のようにしてそのプラ
スミドは産生された。プラスミドｐＨＦｅＭ２をＢａｍＨＩで切断し、１８５０ｂｐ Ｂ
ａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片をアガロースゲルから切除し、ＢａｍＨＩで切断したｐＢＳ−
ＳＫ
＋ に連結した。このクローンは、ＦＨＶ−１ ｇＤの３′領域およびさらなる下流
の配列を含有する。プラスミドｐＪＣＡ０６７をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断し、１２７
０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＦＨＶ−１ ｇＤ ３′−領域−ｇＩ ５′領域−ＸｈｏＩ断片を
切除した。この断片をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断したベクターｐＢＳ−ＳＫ
＋ に連結
し、ｐＪＣＡ０７２を産生した。テンプレートとしてのプラスミドｐＨＦｅＭ２およびオ
リゴヌクレオチドＪＣＡ２３７（配列認識番号３３３）
【化２４４】
40
(187)
JP 3602844 B2 2004.12.15
とＪＣＡ２４２（配列認識番号３３４）
【化２４５】
を用いたＰＣＲにより３′側２９０ｂｐのＦＨＶ−０１ ｇＤコード配列を誘導した。こ
れら注文合成したオリゴヌクレオチドによるこの断片の合成は、１）ＦＨＶ−１ ｇＤの
３′側の配列および５′末端でのＸｂａＩ部位を含有し、２）ＦＨＶ−１ ｇＤコード配
10
列の３′末端に、Ｔ５ ＮＴ要素および特有のＨｐａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ並びにＸｈｏＩ
部位を加える。この断片をＸｂａＩとＸｈｏＩで切断し、ＸｂａＩとＸｈｏＩで切断した
プラスミドｐＪＣＡ０７２から得た３５７５ｂｐ ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ断片により連結し
た。産生したプラスミドをｐＪＣＡ０７３と称した。
【０７２１】
ＦＨＶ−１ ｇＤの２９０ｂｐ ＸｂａＩ−−＞ＸｈｏＩ部分の配列を、ｐＪＣＡ０７３
の直接塩基配列決定法により確認した。プラスミドｐＪＣＡ０７１をＳｍａＩとＢａｍＨ
Ｉで切断し、３０５ｂｐ ＳｍａＩ−Ｉ３Ｌ−ＦＨＶ−１ ｇＤ ５′側領域−ＢａｍＨ
Ｉ断片を切除した。プラスミドｐＪＣＡ０７３をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断し、９７０
ｂｐのＢａｍＨＩ−ＦＨＶ−１ ｇＤ ３′領域−ＸｈｏＩ断片を切除した。ＳｍａＩ−
20
ＢａｍＨＩ ３０５ｂｐ断片とＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ ９７０ｂｐ断片を最終的にベクタ
ーｐＣＰＣ６Ｌ（Ｃ６ ｄｅｏｒｆｅｄ座；ｐＣＰＣ６Ｌの産生の他のＡＬＶＡＣ Ｃ６
供与体プラスミドを参照）中にともに連結し、ＳａｍＩとＸｈｏＩで切断した。この連結
により産生したプラスミドをｐＪＣＡ０８４と称した。
【０７２２】
プラスミドｐＪＣＡ０８４を、治療ウイルスとしてのＣＰｐｐとともに初代鶏胚繊維芽細
胞での生体外組換え実験に用いてｖＣＰ１６２を産生した。放射線標識ＦＨＶ−１ ｇＤ
特異的プローブを用いた標準方法（ピッチーニら、１９８７）にしたがった現場でのハイ
ブリダイゼーションにより組換えウイルスを同定した。組換え体プラークを３回のプラー
ク精製により精製し、さらなる分析のために増幅した。組換えウイルスｖＣＰ１６２は、
30
カナリヤポックスウイルスのＣ６座にＦＨＶ−１ ｇＤコード配列を含有する。
【０７２３】
実施例５８−ｖＣＰ１６２の発現分析
フランス、ローンメリクス、Ｄ．ファーギュードから得たヒツジ抗ＦＨＶ−１ｇＤ多クロ
ーン性血清を用いて前述したように（テイラーら、１９９０）、蛍光抗体法アッセイを行
なった。組換え体ｖＣＰ１６２は、強烈な内部並びに表面蛍光を示し、感染細胞の表面に
ＦＨＶ−１ ｇＤ糖タンパク質の発現を示した。
【０７２４】
同一の抗血清を用いて免疫沈降を行ない、発現されたＦＨＶ−１ ｇＤ産生物の真正を決
定した。この方法は、前述した方法にしたがって行なった（テイラーら、１９９０）。ヒ
40
ツジ抗ＦＨＶ−１ ｇＤ血清は、組換えウイルスｖＣＰ１６２に感染した細胞から誘導し
た溶解産物から、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルシステム上で６０ｋＤａの見かけの分子質量を有
する産生物を沈殿せしめた（ドリファスら、１９８４）。未感染細胞または親カナリヤポ
ックスウイルス（ＣＰｐｐ）に感染した細胞からはタンパク質はまったく沈殿しなかった
。
【０７２５】
実施例５９−ＨＡＮＴＡＡＮウイルスＧ１およびＧ２糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣ
およびＡＬＶＡＣベースの組換え体の産生
昆虫ポックスウイルス４２ｋＤａプロモーターの制御下で、Ｍ断片をＮＹＶＡＣとＡＬＶ
ＡＣベクターに挿入することにより、ハンターン（Ｈａｎｔａａｎ）ウイルスＧ１および
50
(188)
JP 3602844 B2 2004.12.15
Ｇ２糖タンパク質の発現を行なった。これらのウイルスベクターに挿入するポックスウイ
ルス発現カセットは以下のようにして産生した。
【０７２６】
ハンターンウイルスＭ断片のｃＤＮＡクローンをシュマルジョンらにより記載されたよう
に（１９８７）誘導し、Ｄｒ．Ｊ．ダルリンプル（ＭＤ、フレデリック、感染病の米国陸
軍医療研究所、ウイルス学部門）から得て、プラスミドベクターｐＴＺ１９Ｒ（ＮＪ、ピ
スキャタウェイ、ファーマシア）に挿入した。ｃＤＮＡの全配列は、以前にシュマルジョ
ンらにより示した（１９８７）。テンプレートとしてＭ断片ｃＤＮＡを含有するプラスミ
ドｐＴＺ１９ＲおよびオリゴヌクレオチドＨＭ５Ｐ（配列認識番号３３５）
【化２４６】
10
とＨＭ３Ｐ（配列認識番号３３６）
【化２４７】
を用いて、Ｍ断片コード配列の３２６ｂｐ ５′側領域を誘導した。この３２６ｂｐ断片
を、テンプレートとしてのｐＡＭ１２およびオリゴヌクレオチドＲＧ２７３（配列認識番
号１４２）
【化２４８】
20
とＲＧ２７４（配列認識番号１４３）
【化２４９】
を用いて得た４２ｋＤａプロモーター要素を含有する１０７ｂｐ ＰＣＲ誘導断片に融合
した。テンプレートとしての１０７ｂｐと３２６ｂｐの断片およびオリゴヌクレオチドＲ
Ｇ２７３（配列認識番号１４２）とＨＭ３Ｐ（配列認識番号３３６）の等モル混合物を用
いて、ＰＣＲ融合を行なった。融合断片をＨｉｎｄＩＩＩ（５′末端）とＢｃｌＩ（３′
30
末端）で切断し、３４３ｂｐ断片を産生した。
【０７２７】
プラスミドｐＡＭ１２を以下のように誘導した。Ａｍｓａｃｔａ ｍｏｏｒｅｉ昆虫ポッ
クスウイルス（ＡｍＩＰＶ）から単離したゲノムＤＮＡをＣｌａＩで切断し、アガロース
ゲル電気泳動により断片を分離した。高度に転写されたＡｍＥＰＶ遺伝子を含有すること
が以前に同定された２．６ｋｂ断片をゲルから精製し、ｐＢＳ−ＳＫ
＋ のＣｌａＩ部位
にクローニングし、ｐＡＭ１２を産生した。この断片のＤＮＡ配列分析により、４２ｋＤ
ａの完全ＯＲＦが明らかになった。この遺伝子からの５′未翻訳配列（ＡｍＥＰＶ ４２
ｋＤａプロモーター）は、ワクシニアとアビポックスウイルスにおける強い、初期プロモ
ーターとして機能することが続いて示された。
【０７２８】
Ｍ断片コード配列の３′側７４８ｂｐを、テンプレートとしてｐＴＺ１９Ｒ中に得られた
ｃＤＮＡクローンおよびオリゴヌクレオチドＨＭＴＳ−５（配列認識番号３３７）
【化２５０】
とＨＭＴＳ−３（配列認識番号３３８）
【化２５１】
40
(189)
JP 3602844 B2 2004.12.15
を用いたＰＣＲにより誘導した。これらの注文合成オリゴヌクレオチドによるこの断片の
合成は、１）５′末端でのＥｃｏＲＶ部位と３′側配列を含有し、２）ヌクレオチド位置
２６７８−２６９３でＴ５ ＮＴ配列モチーフを分断し（ユエンおよびモス、１９８７）
、３）コード配列の３′末端部位でＥｏＲＩ部位およびＴ５ ＮＴ要素を加える。この断
片をＥｃｏＲＩで切断し、７４１ｂｐ ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ断片を産生した。７４１
ｂｐ ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）
に挿入し、プラスミドｐＢＳＨＶＭ３Ｐを産生した。
10
【０７２９】
ｐＴＺ１９Ｒ中にＭ特異的ｃＤＮＡクローンを含有するプラスミドを用いて、ＧＭ４８（
Ｄａｍ
− ）細菌細胞（ＭＤ、ゲイサースブルグ、ＢＲＬ）を転換した。この細菌菌株か
ら誘導したプラスミドＤＮＡをＢｃｌＩとＥｃｏＲＶで切断し、２３６２ｂｐ断片を産生
した。この２３６２ｂｐ断片を、コード配列の５′側領域に融合された４２ｋＤａプロモ
ーターを含有する３４３ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｃｌＩ断片とともに、ＨｉｎｄＩＩＩ
とＥｃｏＲＶで切断したｐＢＳＨＶＭ３Ｐに挿入した。全縁Ｍ断片発現カセットを含有す
る産生したプラスミドをｐＢＳＨＶＭと称した。制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ
およびＥｃｏＲＩを用いて、ｐＢＳＨＶＭから全縁Ｍ断片カセットを切除した。３５０８
ｂｐ誘導断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉのクレノウ断片でブラントエ
20
ンドした。ブラントエンドした断片をｐＳＤ５５０に挿入して、ｐＨＶＭＶＣを産生した
。
【０７３０】
プラスミドｐＳＤ５５０を以下のように誘導した。プラスミドｐＳＤ５４８（タータグリ
アら、１９９２）は、Ｉ４Ｌ ＯＲＦ（ゲーベルら、１９９０ａ、ｂ）がＢｇｌＩＩとＳ
ｍａＩ部位からなるクローニング領域により置換されたワクシニアベクタープラスミドで
ある。多重クローニング領域を延長するために、ｐＳＤ５４８をＢｇｌＩＩとＳｍａＩで
切断し、アニールした補体合成オリゴヌクレオチド５３９Ａ（配列認識番号３３９）
【化２５２】
30
および５３９Ｂ（配列認識番号３４０）
【化２５３】
40
に連結した。産生したプラスミド、ｐＳＤ５５０において、多重クローニング領域は、Ｂ
ｇｌＩＩ、ＳｍａＩ、ＸｈｏＩ、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を含有する。
【０７３１】
プラスミドｐＨＶＭＶＣを治療ウイルスとしてのｖＰ８０４（タータグリアら、１９９２
）とともにベロ細胞において生体外組換え実験に用いて、ｖＰ８８２を産生した。放射線
標識したＭ特異的ＤＮＡプローブを用いた標準方法（ピッチーニら、１９８７）にしたが
って、現場でのハイブリダイゼーションにより、組換えウイルスを同定した。３回のプラ
ーク精製により、組換えプラークを精製し、さらなる分析のために増幅した。組換えウイ
ルス、ｖＰ８８２は、ワクシニアウイルスのＩ４Ｌ座にハンターンＭ断片を含有する。Ｉ
４Ｌ読取り枠とｖＰ８０４バックグラウンド中のＭ断片カセットとの置換により、ＮＹＶ
50
(190)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ＡＣ−等量ウイルスバックグラウンドが作られる（タータグリアら、１９９２）。
【０７３２】
Ｍ断片カセット（上述）を含有する、ｐＢＳＨＶＭから誘導した３５０８ｂｐＨｉｎｄＩ
ＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＣ４Ｉに挿入した。
プラスミドｐＣ４Ｉを以下のように誘導した。ＣＰｐｐからの６．５ｋｂ ＮｓｉＩ断片
をｐＢＳ−ＳＫ
＋ のＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ｐＸＸ−４を産生した。ＤＮＡ
配列分析により、座中のＣ４挿入物を含有した完全読取り枠ＯＲＦを同定した。Ｃ４ Ｏ
ＲＦが欠損した供与体プラスミドを構築するために、オリゴヌクレオチドＲＧ２８７（配
列認識番号３４１）
【化２５４】
10
ＲＧ２９３（配列認識番号３４２）
【化２５５】
ＲＧ２８９（配列認識番号３４３）
【化２５６】
20
およびＲＧ２９０（配列認識番号３４４）
【化２５７】
をプライマーとして用い、ｐＸＸ４からのＣ４ ＯＲＦの５′および３′未翻訳領域を増
幅した。精製したＰＣＲ断片をＫｐｎＩ−ＳａｃＩ部位でのｐＢＳ−ＳＫ
＋ に挿入した
。産生したプラスミド、ｐＣ４Ｉは、完全ＯＲＦが翻訳およびワクシニア初期転写終止シ
グナルを側腹に有する多重クローニング部位と置換されたＣ４の５′および３′未翻訳領
30
域（各２０１ｂｐ）を含有する（ユエンおよびモス、１９８７）。
【０７３３】
Ｍ断片カセットのｐＣ４Ｉへの挿入により、プラスミドｐＣ４ＨＶＭが産生した。ｐＳＤ
５１３から誘導した１００ｂｐのＳｓｐＩ／ＳｍａＩ断片の挿入のために、プラスミドｐ
Ｃ４ＨＶＭをＳｍａＩで線状化した（実施例７に定義した）。産生したプラスミドをｐＣ
４ＨＶＭＶＱと称した。プラスミドｐＣ４ＨＶＭＶＱをＳｍａＩで切断し、続いて部分的
なＨｉｎｄＩＩＩでの切断により、Ｍ断片カセットを含有する３．６ｋｂ断片を回収した
。この断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノ
ウ断片を用いてブラントエンドした。このブラントエンドした断片を、ＳｍａＩ切断した
ｐＳＰＣＰＣ３Ｌに挿入し、ｐＣ３ＨＶＭＶＱ（実施例３２に定義した）を産生した。
40
【０７３４】
供与体プラスミドとしてｐＣ３ＨＶＭＶＱおよび治療ウイルスとしてＣＰｐｐ（ＡＬＶＡ
Ｃ）を用いて、初代鶏胚繊維芽細胞に、生体外組換え実験を行なった。標準プロトコルを
用いて組換えウイルスを同定し、精製した（上述；ピッチーニら、１９８７）。ハンター
ンウイルスＭ断片を含有するＡＬＶＡＣベースの組換え体をｖＣＰ１１４と称した。
【０７３５】
実施例６０−ハンターンウイルスＳコード配列を含有するＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣ
−ベースの組換え体の産生
ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの制御下で、Ｓ断片をＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ
ベクターに挿入することにより、ハンターンウイルス核タンパク質の発現を行なった（ゲ
50
(191)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ーベルら、１９９０ａ、ｂ）。これらのウイルスベクター中に挿入したポックスウイルス
発現カセットは以下のように構築した。
【０７３６】
ハンターンウイルスＳ断片のｃＤＮＡクローンをシュマルジョンらにより記載されたよう
に（１９８７）誘導し、Ｄｒ．ジョエル ダルリンプル（ＭＤ、フレデリック、Ｆｔ、デ
トリック、感染病の米国陸軍医療研究所、ウイルス学部門）から得て、プラスミドベクタ
ーｐＧＥＭ−１（ＷＩ、マジソン、プロメガバイオテック）に挿入した。Ｓ断片の全縁配
列は以前に記載している（シュマルジョンら、１９８６）。
【０７３７】
テンプレートとしてプラスミドｐＩ４ＬＨ６ＨＩＶ３ＢおよびオリゴヌクレオチドＨ６５
10
ＰＨ（配列認識番号１６４）
【化２５８】
とＨＴＨ６３Ｐ（配列認識番号３４６）
【化２５９】
20
を用いたＰＣＲにより、Ｈ６プロモーター要素を増幅した。この１５０ｂｐ ＰＣＲ誘導
断片は、５′末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有し、Ｓ断片コード配列の５′側領域を含有
する３′末端での２８ｂｐの延長部を有する。
【０７３８】
オリゴヌクレオチドＨＴＳ５Ｐ（配列認識番号３４７）
【化２６０】
およびＧＰＳ５ＰＮＣＩ（配列認識番号３４８）
【化２６１】
30
並びにテンプレートとしてのＳ特異的ｃＤＮＡクローンでのＰＣＲにより、Ｓ断片コード
配列の５′末端を合成した。５６０ｂｐのＰＣＲ誘導断片を、オリゴヌクレオチドＨ６５
ＰＨ（配列認識番号１６４）およびＨＴＳ５ＰＮＣＩ（配列認識番号３４８）を用いたＰ
ＣＲにより融合した。ＰＣＲ誘導融合産生物をＨｉｎｄＩＩＩとＮｃｉＩで切断した。
【０７３９】
オリゴヌクレオチドＴ５ＨＴ３ＰＰＳ（配列認識番号３４９）
【化２６２】
40
およびＨＰＳ５５ＰＮ（配列認識番号３５０）
【化２６３】
並びにテンプレートとしてのＳ特異的ｃＤＮＡクローンを用いたＰＣＲにより、ハンター
ンウイルスＳ断片の中央領域を産生した。５８１ｂｐ断片は、その３′末端でＰｓｔＩ部
位を含有し、５′末端はＳ断片の位置４９９のＮｃｉＩ部位を含有する（シュマルジョン
ら、１９８６）。さらに、オリゴヌクレオチドＴ５ＨＴ３ＰＰＳ（配列認識番号３４９）
を使用することにより、アミノ酸配列を改変することなく、位置１０２９から１０３５ま
50
(192)
JP 3602844 B2 2004.12.15
でのＴ５ ＮＴ要素を除去する。次いでこの断片をＮｃｉＩとＰｓｔＩで切断した。Ｈ６
プロモーターに融合されたコード配列の５′末端を含有するＰＣＲ断片（上述のようにＨ
ｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｉＩ切断した）を、Ｓ断片の中央領域を含有する５８１ｂｐ Ｎｃｉ
Ｉ／ＰｓｔＩ断片とともにＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに連結した
。産生したプラスミドをｐＢＳＨＴＳＨ６５Ｐと称した。
【０７４０】
オリゴヌクレオチドＨＴＳ３ＰＸＢＡ（配列認識番号３５１）
【化２６４】
10
およびＴ５ＨＴ５ＰＳＰ（配列認識番号３５２）
【化２６５】
並びにテンプレートとしてのＳ特異的ｃＤＮＡクローンを用いたＰＣＲによりＳ断片の３
′側４３８ｂｐを誘導した。この断片の５′末端は、Ｓ断片コード配列の位置１０３９に
位置するＰｓｔＩ部位を含有し（シュマルジョンら、１９８６）、３′末端は、Ｔ５ Ｎ
Ｔ配列モチーフおよび特有ＸｂａＩ部位を含有する。ＰｓｔＩ／ＸｂａＩで切断したｐＢ
Ｓ−ＳＫへの挿入の前に、この断片をＰｓｔＩとＸｂａＩで切断し、ｐＢＳＨＴＳ３Ｐを
産生した。
20
【０７４１】
全縁Ｓ断片発現カセットを産生するために、１１２２ｂｐ ＰｓｔＩ／部分的ＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片をｐＢＳＨＴＳＨ６５Ｐから誘導した。この断片を、ｐＢＳＨＴＳ３Ｐからの２
９０ｂｐ ＰｓｔＩ／ＸｂａＩ断片とともにＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ切断ｐＢＳ−ＳＫ
に挿入した。産生したプラスミドを、ＸｂａＩで線状化し、続いて部分的なＨｉｎｄＩＩ
Ｉでの切断し、ｐＢＳＨＶＳと称した。この断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃ
ｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドし、次いでｐＳＤ５
４１のＳｍａＩ部位に挿入して、ｐＡＴＩＨＶＳを産生した。
【０７４２】
プラスミドｐＡＴＩＨＶＳを、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とｖＰ８
30
８２とともにベロ細胞での生体外組換え実験に用いた。これは、標準プロトコルにより行
なった（ピッチーニら、１９８７）。放射線標識したＳ断片特異的ＤＮＡプローブを用い
た前述したプラークハイブリダイゼーション方法（ピッチーニら、１９８７）により組換
えウイルスから誘導したプラークを同定した。それぞれ治療ウイルスｖＰ８６６およびｖ
Ｐ８８２を用いて回収したウイルスに関して、産生した組換え体をｖＰ９５０およびｖＰ
９５１と称した。組換えウイルス、ｖＰ９５０は、ＡＴＩ部位にＳ断片発現カセットを含
有し、ｖＰ９５１は、同一の座にこのカセットを含有するが、ｖＰ８８２を含有するＭ断
片による治療のために、Ｉ４Ｌ座にもＭ断片を含有する。
【０７４３】
プラスミドｐＢＳＨＶＭをＳａｌＩで線状化し、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌ
40
ｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。このプラスミドを
、ハンターンＳ断片発現カセットを含有するｐＢＳＨＶＳから誘導した１．４ｋｂ Ｘｂ
ａＩ／部分的ＨｉｎｄＩＩＩ（上述したようにクレノウでブラントエンドした）断片に連
結した。誘導したプラスミドをｐＢＳＨＶＭＳと称した。このプラスミドは、頭対頭（ｈ
ｅａｄ ｔｏ ｈｅａｄ）の配置でＭおよびＳカセットを含有した。プラスミドｐＢＳＨ
ＶＭＳをＸｈｏＩで線状化し、クレノウでブラントし（上述したように）、ｐＳＤ５１３
（実施例７で定義した）からの１００ｂｐ ＳｓｐＩ／ＳｍａＩ断片に連結し、ｐＢＳＨ
ＶＭＳＶＱを産生した。
【０７４４】
プラスミドｐＢＳＨＶＭＳＶＱをＳｌａＩ／Ａｓｐ７１８で切断し、Ｓ断片発現カセット
50
(193)
JP 3602844 B2 2004.12.15
を含有する１．５ｋｂの断片を離生した。この断片を２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃ
ｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドし、ｐＳＰＣＰ３Ｌ
（実施例３２に定義した）のＳｍａＩ部位に挿入し、ｐＣ３ＨＶＳＶＱを産生した。
【０７４５】
プラスミドｐＣ３ＨＶＳＶＱを、治療ウイルスとしてのＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）とともに
初代鶏胚繊維芽細胞での生体外組換え実験に用いた。これは、プラーク同定、プラーク精
製、およびウイルス増幅のような標準方法を用いて行なった（ピッチーニら、１９８７）
。産生した組換え体をｖＣＰ１１９と称した。この組換え体は、ＡＬＶＡＣのＣ３座にＳ
断片を含有する。
【０７４６】
10
実施例６１−ＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣ−ベースのハンターンウイルスＭおよびＳ断
片組換え体の発現分析
Ｇ１、Ｇ２、またはウサギ抗ハンターン多クローン性血清に特異的な単クローン性抗体の
プールのいずれかを用いて、前述したように蛍光抗体法アッセイを行なった（テイラーら
、１９９０）。全ての血清は、Ｄｒ．Ｃ．シュマルジョン（ＭＤ、フレデリック、Ｆｔ．
デトリック、感染病の米国陸軍医療研究所、ウイルス学部門）から得た。Ｍ断片のみ（ｖ
Ｐ８８２、およびｖＣＰ１１４）またはＳ断片との組合せ（ｖＰ９５１）を含有する組換
えウイルスは、上述した抗血清のいずれを用いても強い表面蛍光を示し、感染細胞の表面
にＧ１およびＧ２の糖タンパク質の両方の発現を示した。核タンパク質が感染細胞の表面
には現れないので、Ｓ断片のみを含有する組換え体（ｖＰ９５０およびｖＣＰ１１９）を
20
用いては、表面蛍光は観察されなかった。しかしながら、ウサギ抗ハンターン血清を用い
ての組換え体、ｖＰ９５０およびｖＣＰ１１９に関しては、内部蛍光が観察された。
【０７４７】
同一の抗血清を用いて免疫沈降を行なって、発現したＧ１、Ｇ２、およびＳ遺伝子産生物
の真正を測定した。この方法は、前述した方法にしたがって行なった（テイラーら、１９
９０）。Ｇ１に特異的な単クローン性抗体プールは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルシステム上で
、組換えウイルスｖＰ８８２、ｖＰ９５１、およびｖＣＰ１１５４に感染した細胞から誘
導した溶解産物から６４ｋＤａの見かけの分子質量を有するタンパク質を沈殿せしめた（
ドリファスら、１９８４）。未感染細胞、または親（ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ）に感
染した細胞もしくはＳ断片のみを含有する組換えウイルス（ｖＰ９５０およびｖＣＰ１１
30
９）に感染した細胞から誘導した溶解産物からはタンパク質は沈殿しなかった。沈殿した
ポリペプチドが約５０−５５ｋＤａの分子質量を有したことを除いては、Ｇ２に特異的な
単クローン性抗体プールを用いては同様の結果が得られた。これらのサイズのタンパク質
（６４ｋＤａおよび５０−５５ｋＤａ）は、それぞれＧ１およびＧ２タンパク質のサイズ
と一致する（シュマルジョンら、１９９０）。
【０７４８】
ウサギ抗ハンターンは、ｖＰ９５１に感染した細胞から誘導した溶解産物から、Ｇ１、Ｇ
２および核タンパク質の発現と一致する６４ｋＤａ、５０−５５ｋＤａ、および４８ｋＤ
ａの見かけの分子量を有する３つのタンパク質種を沈殿せしめた。同一の血清は特異的に
、ｖＰ８８２およびｖＣＰ１１４感染細胞溶解産物からはＧ１およびＧ２（６４ｋＤａ、
40
５０−５５ｋＤａ）種を、ｖＰ９５０およびｖＣＰ１１９感染細胞溶解産物からは核タン
パク質（４８ｋＤａ）を沈殿せしめた。未感染細胞またはＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ親
ウイルスに感染した細胞から誘導した溶解産物からはそのようなタンパク質は沈殿しなか
った。
【０７４９】
実施例６２−Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）遺伝子のＡＬＶＡＣ挿入プラスミドへの挿入
ＡＬＶＡＣ Ｃ５挿入プラスミドｐＮＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ１８（実施例４４に定義した）
をＢａｍＨＩで切断し、キナーゼしてアニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４
３８／ＭＰＳＹＮ４３９（配列認識番号３５３／３５４）に連結した。
【０７５０】
50
(194)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【化２６６】
産生したプラスミド、ｐＭＰＣ５Ｓｍａは、リンカー領域のＢａｍＨＩ部位の隣にＳｍａ
Ｉ部位を含有する。
【０７５１】
ｐＭＰ５５０Ｅ３１１ｐｓ（ここの他のＨＢＶの実施例に定義した）をＢｇｌＩＩ／Ｂａ
ｍＨＩ（部分的）で切断し、ＥＰＶ４２ｋＤａプロモーターの制御下でＨＢＶ ｌｐｓＡ
ｇを含有する１．２ｋｂの断片を単離し、ＢａｍＨＩで切断したｐＭＰＣ５Ｓｍａに連結
10
し、プラスミドｐＭＰＣ５Ｌを産生した。ｐＭＰＣ５ＬをＳｍａＩ（部分的）で切断し、
単位長さ（４ｋｂ）断片を単離した。この断片をＮｒｕＩで切断し、最大の帯（４ｋｂ）
を単離した。
【０７５２】
ｐＧＪ１５（実施例１３で定義した）をＳｍａＩ（部分的）とＮｒｕＩで切断し、ＨＢＶ
ｓｐｓＡｇおよびＨ６プロモーターの２４ｂｐを含有する０．９ｋｂ断片を単離し、ｐ
ＭＰＣ５Ｌからの４ｋｂ ＳｍａＩ／ＮｒｕＩベクター断片に連結し、プラスミドｐＭＰ
Ｃ５ＬＳを産生した。
【０７５３】
実施例６３−ＳＰＳＡＧおよびＬＰＳＡＧをコードするＨＢＶ遺伝子のＡＬＶＡＣへの挿
20
入
Ｃ５挿入座にＨＢＶ ｌｐｓＡｇおよびｓｐｓＡｇの両方を含有するｐＭＰＣ５ＬＳを、
ＡＬＶＡＣに関する組換え体の供与体プラスミドとして用い、ＡＬＶＡＣ組換え体ｖＣＰ
１５７を産生した。
【０７５４】
ｖＣＰ１５７のＨＢＶタンパク質の発現
ＡＬＶＡＣ−ＨＢＶ二重組換え体ｖＣＰ１５７に感染した細胞からの代謝的に標識した溶
解産物に、ウサギ抗Ｓ２血清を用いて免疫沈降を行ない、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動と続いてのラジオオートグラフにより分析した。ｌｐｓＡｇ（４１ｋＤａ、３
８ｋＤａ）およびｓｐｓＡｇ（３６ｋＤａ、３３ｋＤａ）の正確なサイズのタンパク質を
30
観察した。これらのタンパク質は、対照として用いたｓｐｓＡｇまたはｌｐｓＡｇを発現
するＮＹＶＡＣ単体ＨＢＶ組換え体により産生された同一のタンパク質とともに移動した
。
【０７５５】
実施例６４−ＳＰＳＡＧ、ＬＰＳＡＧおよびＳ１２／コア融合をコードするＨＢＶ遺伝子
のＡＬＶＡＣへの挿入
Ｃ５挿入座にＨＢＶ ｌｐｓＡｇおよびｓｐｓＡｇ遺伝子並びにＳ１２／コア融合を特定
する遺伝子の両方を含有するｐＭＰＣ５ＬＳＣをＡＬＶＡＣに関する組換えの供与体プラ
スミドとして用い、ＡＬＶＡＣ組換え体ｖＣＰ１６９を産生した。
【０７５６】
40
実施例６５−ＨＢＶ遺伝子を発現するＮＹＶＡＣベースの組換え体：ウサギ、マウスおよ
びモルモットからの免疫学的データ
ウサギ、マウスおよびモルモットに、ＮＹＶＡＣベースのＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）組
換え体ｖＰ８５６、ｖＰ９３０、ｖＰ９３２およびｖＰ９７５を接種した（実施例１３）
。ｖＰ８５６は、表面抗原の中間（Ｍ）形状であるｓｐｓＡｇを発現する。ｖＰ９３０は
、表面抗原の大型（Ｌ）形状であるｌｐｓＡｇを発現する。ｖＰ９３２は、ｓｐｓＡｇと
ｌｐｓＡｇの両方を発現する。ｖＰ９７５は、ｓｐｓＡｇ、ｌｐｓＡｇおよびコア抗原に
融合される表面抗原ｐｒｅＳ１＋ｐｒｅＳ２領域からなる融合タンパク質を発現する。Ａ
ＵＳＡＢ試験（アボット）を用いて、ＨＢＶ表面抗原に対する抗体について、およびＣＯ
ＲＡＢ競合ラジオイムノアッセイキット（アボット）を用いて、ＨＢＶコア抗原に対する
50
(195)
JP 3602844 B2 2004.12.15
抗体について、血清を分析した。ＨＢＶ ｐｒｅＳ１およびｐｒｅＳ２領域に対する抗体
をＥＬＩＳＡによりアッセイした。結果を表３４から４０に示す。
【０７５７】
【表３４】
10
20
30
【表３５】
40
(196)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
【表３６】
40
(197)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表３７】
30
(198)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
【表３８】
40
(199)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表３９】
30
(200)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表４０】
30
(201)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
実施例６６−ポックスウイルス中の細菌遺伝子の発現：ポックスウイルス中の破傷風毒素
断片Ｃ（Ｃ．ＴＥＴＡＮＩ）
Ｃ．ｔｅｔａｎｉは、クロストリジウム属、胞子形成嫌気菌の細菌である；Ｃ．ｂｏｔｕ
ｌｉｎｕｍもまたその属に含まれる。Ｃ．Ｔｅｔａｎｉは、感染に観察される麻痺効果に
主に原因となる毒素、テタノスパスミン（ｔｅｔａｎｏｓｐａｓｍｉｎ）（ＴＴ）を産生
40
する。ＴＴは、１本の１５０ｋＤａの軽鎖および細菌から放出された１００ｋＤａの重鎖
である。重鎖は、穏やかなタンパク質分解処理により２つの断片、ＢおよびＣ（４５ｋＤ
ａおよび５５ｋＤａ）を産生する。この実施例は、本発明のウイルスが、Ｃ．ｔｅｔａｎ
ｉの断片Ｃのような免疫原細菌遺伝子産生物を発現するのに用いられることを示す。
【０７５８】
発現カセットは、一連のポリメラーゼ連鎖反応により産生される。この方法は、天然破傷
風毒素配列に存在するＴＴＴＴＴＡＴ初期転写終止シグナル（ユエンおよびモス、１９８
７）を除去するのに必要であった（イーゼルら、１９８６；フェアウェザーおよびリネス
、１９８６）。
【０７５９】
50
(202)
JP 3602844 B2 2004.12.15
プライマーＨ６ＴＥＴＣ（配列認識番号３５５）
【化２６７】
およびＴＥＴＦＩＸ２（配列認識番号３５６）
【化２６８】
を用いてプラスミドｐＳＳ１２６１（ハルパーンら、１９９０）からＰＣＲによりＨ６プ
10
ロモーター連結した断片Ｃを誘導した。構成の残りのコード領域は、プライマーＴＥＴＦ
ＩＸ１（配列認識番号３５７）
【化２６９】
およびＴＥＴＥＮＤ（配列認識番号３５８）
【化２７０】
を用いて、プラスミドｐＳＳ１２６１のＰＣＲ増幅により、構成のコード領域の残りを産
20
生される。これらのコード配列は、プライマーＨ６ＴＥＴＣ（配列認識番号３５５）およ
びＴＥＴＮＤ（配列認識番号３５８）を用いた、これら５５３ｂｐおよび８８１ｂｐ Ｐ
ＣＲ誘導産生物のＰＣＲ増幅により行なわれた。産生した１．４ｋｂのＰＣＲ誘導産生物
をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断した。１．４ｋｂの断片をアガロースゲルから単離して、
同様に単離したｐＢＳ−ＳＫ＋（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結した。ヌクレ
オチド配列分析を行なって、産生したプラスミドｐＢＳＴＥＴＣ中に挿入物を確認した。
ＴからＣのサイレント置換がこのプラスミド中に発見され、これはイーゼルら（１９８６
）の配列における位置３５３５に対応する。
【０７６０】
ｐＣ５Ｌ（実施例４４に定義した）をポリリンカー内のＡｓｐ７１８とＮｒｕＩで切断し
30
、アルカリ性ホスファターゼで処理し、キナーゼしてアニールしたオリゴヌクレオチドＣ
Ｐ２６（配列認識番号３５９）
【化２７１】
およびＣＰ２７（配列認識番号３６０）
【化２７２】
（不能Ａｓｐ７１８部位、６つの読取り枠中の翻訳終止コドン、ワクシニア初期転写終止
シグナル（ユエンおよびモス、１９８７）、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ
、ＣｌａＩ、およびＳｍａＩ制限部位、ワクシニア初期転写終止シグナル、６つの読取り
枠中の翻訳終止コドン、および不能ＮｏｔＩ部位を含有する）に連結し、プラスミドｐＣ
５ＬＳＰを産生した。オリゴヌクレオチドＣＰ３０（配列認識番号３６１）
【化２７３】
40
(203)
JP 3602844 B2 2004.12.15
およびＣＰ３１（配列認識番号３６２）
【化２７４】
を用いて、プロモーターを含有するプラスミドからＰＣＲにより初期／晩期Ｈ６ワクシニ
アウイルスプロモーター（パーカスら、１９８９）を誘導した。このＰＣＲ産生物をＢａ
ｍＨＩとＸｈｏＩ（ＰＣＲにより５′および３′末端で産生した部位）で切断し、同様に
10
切断したｐＣ５ＬＳＰに連結し、ｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰを産生した。ｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳ
ＰをＥｃｏＲＩで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、自己アニールしたオリゴ
ヌクレオチドＣＰ２９（配列認識番号３６３）
【化２７５】
に連結し、ＮｏｔＩで切断し、線状精製して自己連結した。この方法によりｐＶＱＨ６Ｃ
５ＬＳＰにＮｏｔＩ部位を導入し、ｐＮＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ１８を産生した。ｐＢＳＴＥ
ＴＣからの１．４ｋｂ ＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩ断片を単離し、同様に切断したｐＮＶＱＨ
６Ｃ５ＬＳＰ１８に連結し、ｐＣ５ＴＥＴＣを産生した。
20
【０７６１】
ＰＣＲとプライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号３６４）
【化２７６】
およびＨ６ＰＣＲ２（配列認識番号３６５）
【化２７７】
を用いて、合成Ｈ６プロモーター（パーカスら、１９８９）を含有するプラスミドからＥ
30
ｃｏＲＶにつながったＨ６プロモーターを誘導し、５′ＨｉｎｄＩＩＩ部位を産生した。
この１２２ｂｐ ＰＣＲ誘導断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＶで切断し、同様に切断し
たｐＢＳ−ＳＫ＋（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結し、プラスミドｐＢＳＨ６
を産生した。ヌクレオチド配列分析により挿入物を確認した。ｐＣ５ＴＥＴＣからの１．
４ｋｂ ＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩ断片を切除して、同様に切断したｐＢＳＨ６に連結し、ｐ
Ｈ６ＴＥＴＣを産生した。
【０７６２】
次いで全縁Ｈ６断片Ｃカセットを含有するｐＨ６ＴＥＴＣからの１．５ｋｂ ＸｈｏＩ断
片をｐＳＤ５４２（実施例３２に定義した）に連結し、ｐＴＫＴＥＴＣを産生した。
【０７６３】
40
免疫沈降分析を行なって、ｖＣＰ１６１およびｖＰ１０７５が真正断片Ｃを発現するか否
かを測定した。ベロ細胞単層を、親ウイルス、ＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）またはｖＰ８６６
（ＮＹＶＡＣ）に感染せしめたか、または１０ｐｆｕ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．でｖＣＰ１６
６１またはｖＰ１０７５に感染せしめた。細胞を、感染せしめ、［
３ ５
Ｓ］−メチオニン
（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）中でインキ
ュベーションし、溶解せしめ、テイラーらにより記載された（１９９０）ように、マウス
単クローン性抗体（ＩＮ、インディアナポリス、ベーリンガーマンハイム、クローン４９
．４）および第２抗体としてのヤギ抗マウス抗血清を用いて沈殿せしめた。溶解産物を通
常のマウス血清およびタンパク質Ａセファロースで前浄化した。
【０７６４】
50
(204)
JP 3602844 B2 2004.12.15
単クローン性抗体は特異的に、約４７ｋＤａに対応する種をｖＣＰ１６１およびｖＰ１０
７５感染細胞から沈殿せしめた。ＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）またはｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ
）感染細胞からは類似のタンパク質種は沈殿しなかった。４７ｋＤａサイズは、天然破傷
風毒素のパパイン切断により産生された断片Ｃ並びにｖＣＰ１６１およびｖＰ１０７５に
よりコードされたものと同一のＥ．ｃｏｌｉ産生組換え断片ＣＩ関してマコフら（１９８
９）による観察と一致する。
【０７６５】
実施例６７−ブタ中のＮＹＶＡＣベースの仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）組換え体の効果
４匹の子豚の６つの群に、ＮＹＶＡＣベースのｇＩＩ組換え体（ｖＰ８８１）、ｇＩＩＩ
組換え体（ｖＰ８８３）、ｇｐ５０組換え体（ｖＰ９００）、ＮＹＶＡＣ親ウイルス（ｖ
10
Ｐ８６６）、市販の不活性化仮性狂犬病ウイルスワクチン、または仮性ワクチンとしてウ
シ胎仔血清を含有するイーグルＭＥＭのいずれかに感染せしめた。全てのブタに、筋内経
路により２８日の間隔で２回投与した。親または組換えＮＹＶＡＣウイルスを投与された
ブタに、接種当たり約１０
６ ＴＣＩＤ５０で接種した。感染から１２日間に亘り、全て
のブタを体温と臨床の徴候について監視した。組換え体または親ＮＹＶＡＣウイルスでの
ワクチン接種に対しては部分的なまたは全身的な副作用は観察されなかった。
【０７６６】
仮性狂犬病ウイルスに対する血清中和抗体を、接種から１、２、および４週間後に監視し
た。表４１から明確なように、不活化ワクチン標品のみが１回の接種後に著しい仮性狂犬
病ウイルス血清中和力価を誘発できた。しかしながら、２回の接種後では、全ての３つの
20
ＮＹＶＡＣベースの組換え体が識別できる仮性狂犬病ウイルス血清中和力価を誘発するこ
とができた（表４２）。力価は、仮性狂犬病ウイルスｇｐ５０糖タンパク質を発現するＮ
ＹＶＡＣ組換え体について最も著しかった。実際、ＮＹＶＡＣ組換え体を発現するｇｐ５
０により誘発された力価は、市販されている不活化ワクチンの２回の接種に得られた水準
に相当した（表４２）。
【０７６７】
２回の免疫から４週間後、鼻腔内点滴注入により、全てのブタに約１０
５ ＰＦＵの毒性
仮性狂犬病ウイルス菌株を抗原投与した。予期したように、仮性および親ＮＹＶＡＣワク
チン接種対照は全て、最も厳しい臨床症候を示し、鼻と口咽頭スワブにより単離した仮性
狂犬病ウイルスの最高水準は、抗原投与から１４日後までであった。ＮＹＶＡＣベースの
30
仮性狂犬病ウイルス組換えウイルスは、対照と比較して、毒性仮性狂犬病ウイルス抗原投
与の効果（すなわち、臨床症候およびウイルス単離）を減少し、組換えウイルスを発現す
るｇｐ５０が最も有効であった。実際、この組換え体は、市販の不活化仮性狂犬病ウイル
スワクチンと同程度に効果的である。
【０７６８】
他のヘルペスウイルスのようにＰＲＶは、ストレスまたはコルチコステロイドの投与によ
り再活性化される潜伏性感染を発達せしめる可能性を有するので（ホイットマンおよびジ
ハ、１９８９）、そのような感染に対するＮＹＶＡＣ組換え体の防御効果を評価するため
に、２匹のブタの群に関して実験を行なった。プロトコルには、以下のスケジュールにお
いてブタにデキサメタゾンを投与することが必要であった：１日目に静脈経路により１．
２５ｍｇ／ポンドおよび静脈経路により０．２５ｍｇ／ポンド。以後、４日間に亘り約１
２時間ごとにデキサメタゾンの投与（０．５ｍｇ／ポンド）を行なった。鼻（Ｎ）と喉（
Ｔ）のスワブを用いてデキサメタゾン処理後０日から１０日まで、ウイルスの放出（ｓｈ
ｅｄｄｉｎｇ）を評価した。結果を表４３に示す。これらの結果は明らかに、潜伏性ＰＲ
Ｖ感染の成立に対する防御におけるＮＹＶＡＣベースのＰＲＶ組換えウイルスの効果を示
した。この基準により、ＮＹＡＶＣ−ｇＩＩ（ｖＰ８８１）は十分に最も有効である。
【０７６９】
【表４１】
40
(205)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表４２】
30
(206)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表４３】
30
(207)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(208)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
実施例６８−ベクターとしてのＮＹＶＡＣ．１（ｖＰ９５４）の使用
ＮＹＶＡＣ．１（ｖＰ９５４）（実施例１７）において、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）中の
［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠損は、Ｋ３Ｌを通じて、その右側の、欠損がインターフェロンに対
する感度を高める遺伝子まで拡張せしめられる（ビーティーら、１９９１）。狂犬病糖タ
ンパク質の免疫ベクター並びに以下に記載するような麻疹ＨＡおよびＦ遺伝子の免疫ベク
ターとしてＮＹＶＡＣ．１を試験した。
50
(209)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０７７０】
狂犬病糖タンパク質遺伝子のｖＰ９５４への挿入；ワクシニア組換え体ｃＰ１００６の産
生
ＴＫ欠損座に挿入された狂犬病糖タンパク質の発現カセットを含有する、供与体プラスミ
ドｐＲＷ８４２（実施例７）を、治療ウイルスとしてのｖＰ９５４とともに組換えに用い
た。狂犬病糖タンパク質Ｇコード配列に対する
３ ２
Ｐ−標識ＤＮＡプローブを用いたプラ
ークハイブリダイゼーションにより組換えワクシニアウイルスｖＰ１００６を同定した。
【０７７１】
麻疹ＨＡ、Ｆをコードする遺伝子のｖＰ９５４への挿入；ワクシニア組換え体ｖＰ１０１
５の産生
10
ＴＫ挿入座に麻疹Ｆおよび麻疹ＨＡの両方の発現カセットを含有する、ｐＲＷ８５７（実
施例９）を、ｖＰ９５４治療ウイルスとともに組換えのための供与体プラスミドとして用
いた。麻疹ＨＡおよび麻疹Ｆのコード配列の両方に対する
３ ２
Ｐ標識プローブを用いたプ
ラークハイブリダイゼーションにより組換えウイルスｖＰ１０１５を同定した。
【０７７２】
免疫ビヒクルとしてのＫ３ＬのないＮＹＶＡＣ．１ベースのベクターの効能；狂犬病Ｇ組
換え体ｖＰ１００６
生後４から６週間のマウス（ウイルスごとで希釈ごとに１０匹）に、ｖＰ１００６、ｖＰ
９５４（ｖＰ１００６の親）、ｖＰ８７９（ＮＹＶＡＣベースの狂犬病Ｇ、実施例７）、
またはワクシニア狂犬病１８７ ＸＰ１
− ６
２ の未希釈、１０
− ２
、１０
− ４
、または１０
20
のいずれかを接種した。接種は、足のパッドによりマウスごとに５０−１００μｌで
行なった。接種から１４日後に、全てのマウスに、２０ＬＤ５０のＣＶＳ菌株（０．０３
ｍｌ中）を大脳半球間接種により抗原投与した。生存したマウスを数え、防御投与量５０
％（ＰＤ５０）を計算した。
【０７７３】
表４４に示すように、ｖＰ１００６の親ウイルス、ｖＰ９５４は、最高量の接種物でさえ
も生狂犬病抗原投与からマウスを防御しなかった。組換えウイルス１８７ ＸＰ１２（キ
ーニーら、１９８４）、ｖＰ８７９、およびｖＰ１００６は全て、生狂犬病抗原投与から
マウスを防御する能力を示した。しかしながら、この能力におけるこれらのウイルスの相
対的な効能は、ＰＤ５０値により示したように（表４４）異なる。
30
【０７７４】
麻疹ウイルス組換え体ｖＰ１０１５
２匹のウサギに、０日と２８日に皮下経路により８．０ｌｏｇ１０ＰＦＵのｖＰ１０１５
を接種した。０、１４、２１、２８、３５、４２および４９日目に、連続の採血を行なっ
た。アルブレヒトら（１９８１）により記載されたプラーク退行（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）
中和法を用いたウイルス中和抗体の存在に関して血清を分析した。
【０７７５】
この分析により結果を表４５に示す。両方の動物は、１回のｖＰ１０１５の接種後に血清
転化し、動物Ａ１６９は、接種から２週間後に防御水準の抗体を示した。抗体水準におけ
る著しい増加が２回目の接種後に観察された。等しいプロトコルにおける、２匹のウサギ
のＮＹＶＡＣ−ＭＶ（ｖＰ９１３；実施例９）による接種の結果を表４５に示す。この結
果により、Ｋ２ＬとＫ３Ｌの欠損は、効果的な免疫ビヒクルとして機能するウイルスの能
力には影響しないことが示される。
【０７７６】
【表４４】
40
(210)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表４５】
30
(211)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
実施例６９−ベクターとしてのＮＹＶＡＣ．２（ｖＰ９３８）の使用；狂犬病糖タンパク
質Ｇ遺伝子を含有するワクシニア組換え体ＶＰ９９６の産生
ＮＹＶＡＣ．２（ｖＰ９３８）において（実施例１７）、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）中の
［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠損が、３８ ＯＲＦ［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］の合計を含むように両方
向に拡張される。ＴＫ欠損座に挿入された狂犬病糖タンパク質の発現カセットを含有する
40
、供与体プラスミドｐＲＷ８４２（実施例７）を、ｖＰ９３８治療ウイルスとともに組換
えに用いた。狂犬病糖タンパク質Ｇコード配列に対する
３ ２
Ｐ標識ＤＮＡプローブを用い
たプラークハイブリダイゼーションにより組換えワクシニアウイルスｖＰ９９６を同定し
た。
【０７７７】
ベロ細胞およびＭＲＣ−５細胞での改変ＮＹＶＡＣウイルスの増殖
ワクシニアの左側［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］および右側［Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］末端に近い大
型欠損の、組織培養での増殖への効果を実験するために、ＭＲＣ−５細胞とベロ細胞での
複製に関してＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）、ｖＰ９３８、ｖＰ９９６および以下の追加のＮ
ＹＶＡＣベースのウイルスを試験した。
50
(212)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０７７８】
ｖＰ８７９（実施例７）は、ＮＹＶＡＣのＴＫ座に挿入された狂犬病糖タンパク質遺伝子
を含有する。
【０７７９】
ｖＰ９５３（実施例１７）は、ＮＹＶＡＣ欠損およびゲノムの右側末端に近い追加の欠損
［Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］を含有する。
【０７８０】
ｖＰ９９７（実施例１７）は、ＮＹＶＡＣ欠損に加えゲノムの左右の末端の両方に近い追
加の欠損を含有する。
【０７８１】
１．５×１０
10
６ での６０ｍｍディッシュ中の感染の２日前に、ベロ細胞（アフリカグリ
ーンサルの肝臓細胞株、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８１）およびＭＲＣ−５細胞（ヒトの胎児の
肺、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）に接種した。感染時に、全ての細胞は融合性であり、デ
ィッシュは２×１０
６ の細胞を含有した。細胞を、ａｒａ Ｃの有無にかかわらずＭＥ
Ｍ＋２％新生ウシ血清（ＮＣＳ）で希釈された（最終濃度４０μｇ／ｍｌ）、細胞当たり
０．１ｐｆｕの多重度でのウイルス（表４６）に感染せしめた。ときどきロッキング（ｒ
ｏｃｋｉｎｇ）しながら、感染単層を３７℃で６０分間インキュベーションせしめた。１
時間の吸着期間後、細胞をＭＥＭ＋２％ ＮＣＳで２回洗浄し、次いで３ｍｌの、ａｒａ
Ｃの有無にかかわらずＭＥＭ＋２％を添加し、３７℃でインキュベーションした。３回
の凍結と解凍により、感染から１時間後と７２時間後に感染細胞を収集した。各試料を、
20
ベロ細胞において２重に滴定した。
【０７８２】
表４６に示すように、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）は、ヒトＭＲＣ−５細胞において制限さ
れた増殖を行なうことができる。ここに試験した条件下で（０．１ｐｆｕ／細胞のｍｏｉ
、７２時間のインキュベーション）、ＮＹＶＡＣは、約２ｌｏｇの力価の増大を示した。
これらの同一の条件下で、ゲノムの左側（ｖＰ９３８）および右側（ｖＰ９５３）末端の
近くに欠損を含む改変ＮＹＶＡＣウイルスは、約１ｌｏｇの力価の増大を示した。両末端
の近くに欠損を含有する改変ＮＹＶＡＣ（ｖＰ９７７）からの収集は、入力ウイルスと比
較して減少し、ＭＲＣ−５細胞では増幅を示さなかった。これに対して、これらの条件下
では、ベロ細胞で試験した全てのウイルスはほぼ同程度増幅した。表４６に示すように、
様々な改変ＮＹＶＡＣウイルス欠損変異体に関するベロ細胞での収集と比較したＭＲＣ−
５細胞でのワクシニアウイルス収集の百分率は、以下の通りである：ｖＰ８６６（ＮＹＶ
ＡＣ）３．５％；ｖＰ９３８（ＮＹＶＡＣ．２、左末端欠損）１．４２％；ｖＰ９５３（
右末端欠損）０．５％；ｖＰ９７７（左右末端欠損）０．０６％。ＭＲＣ−５細胞でのＮ
ＹＶＡＣベースの狂犬病組換え体ｖＰ８７９およびＮＹＶＡＣ．２ベースの狂犬病組換え
体ｖＰ９９６の収集は、それぞれの親ウイルスに関して実質的に同一であり、異種遺伝子
の発現は、組織培養中の組換えウイルスの増殖には影響しないことを示す。
【０７８３】
【表４６】
30
(213)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
実施例７０−マンプスＦおよびＨＮ遺伝子のｃＤＮＡクローニング
マンプスウイルスのウラベＡＭ−９菌株は、欧州と日本においてワクチンとしての使用が
認可されている生、弱得化ウイルスである。このウイルスは、フランス、マーシールエト
イル、メリクス研究所からワクチン標品（イモバクス オレイロンス）として得た。ウイ
ルスをベロ細胞で増幅させ（２継代）、全ＲＮＡを単離して感染細胞から精製した（チャ
ーグウィンら、１９７９）。ＡＭＶ逆トランスクリプターゼと任意のプライマーを用いて
40
、このＲＮＡから第１の鎖ｃＤＮＡを調製した（ワトソンおよびジャクソン、１９８５）
。ＲＷマンプス菌株からの公表された配列を用いて（ワキサムら、１９８７；ワキサムら
、１９８８）、ＦおよびＨＮ遺伝子の５′および３′未翻訳領域から一連の特異的なプラ
イマーを合成した。これらのプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ
り第１の鎖ｃＤＮＡからウラベＡＭ−９ ＦおよびＨＮ遺伝子を増幅した。合成オリゴヌ
クレオチドＲＧ５０３（配列認識番号３６６）
【化２７８】
およびＲＧ４９４（配列認識番号３６７）
50
(214)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【化２７９】
を用いてＦ遺伝子を増幅した。ＲＧ５００（配列認識番号３６８）
【化２８０】
およびＲＧ５０１（配列認識番号３６９）
【化２８１】
10
を用いてＨＮ遺伝子を増幅した。５′プライマー（ＲＧ５０３およびＲＧ５００）をＳａ
ｃＩ部位で、３′プライマー（ＲＧ４９４およびＲＧ５０１）をＡｓｐ７１８部位で切断
した。増幅したＦおよびＨＮ断片をＳａｃＩとＡｓｐ７１８で切断し、多重クローニング
部位のＳａｃＩとＡｓｐ７１８でのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋にクローニングした
。６つのＦ遺伝子クローンと５つのＨＮ遺伝子クローンをＤＮＡ配列していかなる逆トラ
ンスクリプターゼまたはＰＣＲのエラーも除去した。第２９図はｐＵＲＦ３（配列認識番
号３７０）により示されるコンセンサスＦ配列を提供し、第３０図はｐＵＲＨＮ５（配列
認識番号３７１）により示されるコンセンサスＨＮ配列を提供する。
【０７８４】
20
実施例７１−ＡＬＶＡＣ供与体プラスミドの構築：マンプスＦおよびＨＮ遺伝子マンプス
ＦおよびＨＮ遺伝子を発現するＡＬＶＡＣ組換え体の産生のためのＡＬＶＡＣ供与体プラ
スミドの全体的な設計を以下に示す。マンプスＦ遺伝子は、昆虫ポックス４２Ｋプロモー
ター（実施例５９に記載した）に結合せしめられ、マンプスＨＮ遺伝子はワクシニアＨ６
プロモーターに結合せしめられている（パーカスら、１９８９）。２つのプロモートされ
た遺伝子を５′対５′配向に配置し、ＡＬＶＡＣ Ｃ３座挿入プラスミドに挿入した。構
成の特定の詳細を以下の段落に示す。
【０７８５】
ｐＳＰＣＰ３Ｌの多重クローニング領域（実施例３２に記載した）を、ＥｃｏＲＶ、Ｒｓ
ｒＩＩ、ＳｍａＩおよびＰｓｔＩ制限部位を含有する３１ｂｐリンカー断片を加えること
30
により改変した。アニーリング合成オリゴヌクレオチドＲＧ５６０（配列認識番号３７２
）
【化２８２】
およびＲＧ５６１（配列認識番号３７３）
【化２８３】
によりリンカーを産生し、次いでＥｃｏＲＶとＰｓｔＩで切断した。リンカーをｐＳＰＣ
40
Ｐ３ＬのＥｃｏＲＶとＰｓｔＩ部位にクローニングし、ｐＣ３ＬＲを産生した。
【０７８６】
合成オリゴヌクレオチドＲＧ５６２（配列認識番号３７４）
【化２８４】
およびＲＧ５６３（配列認識番号３７５）
【化２８５】
50
(215)
JP 3602844 B2 2004.12.15
を用いたＰＣＲによりｐＲＷ８２３からＨ６プロモーターを増幅した。ｐＲＷ８２３は、
パーカスら、１９８９により記載したように、Ｈ６プロモーター配列を含有する。精製し
た断片をＥｃｏＲＩとＳｍａＩで切断し、ｐＣ３ＬＲ中のＥｃｏＲＩとＳｍａＩ部位に連
結し、ｐＣ３ＬＲＶＱＨ６を産生した。
【０７８７】
マンプスＦ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｓｐ７１８断片（Ｎ末端から約５０コドンを欠
如したＦ遺伝子ＯＲＦ）としてｐＵＲＦ３から切除した。この断片の末端をクレノウポリ
メラーゼを用いて修復し、ＥｃｏＲＩで切断されクレノウポリメラーゼにより修復された
ｐＣ３ＬＲＶＱＨ６に連結した。正確な配向のスクリーニングにより、ｐＣ３ＬＲＦＶＱ
Ｈ６を産生した。
10
【０７８８】
合成オリゴヌクレオチドＲＧ５６４（配列認識番号３７６）
【化２８６】
およびＲＧ５６５（配列認識番号３７７）
【化２８７】
20
を用いたＰＣＲによりｐＵＲＦ３から、Ｆ遺伝子のＮ末端ｐＵＲＦ３および４２Ｋプロモ
ーター配列を含有する断片を増幅した。精製した断片をＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断し、Ｎ
ｃｏＩとＰｓｔＩで切断したｐＣ３ＬＲＦＶＱＨ６に連結した。産生したプラスミドｐＣ
３ＬＲＦ４２ＫＶＱＨ６を、挿入断片のＤＮＡ配列分析により確認した。
【０７８９】
マンプスＨＮ遺伝子を、ＳｓｐＩ／Ａｓｐ７１８断片（Ｎ末端から約３５コドンの欠如し
たＨＮ遺伝子）としてｐＵＲＨＮ５から切除した。この断片の末端をクレノウポリメラー
ゼを用いて修復し、ＳｍａＩで切断したｐＣ３ＬＲＦ４２ＫＶＱＨ６に結合した。正確な
配向のスクリーニングによりｐＦＲ２Ａ−３０を産生した。Ｈ６プロモーターの３′部分
30
およびＨＮ遺伝子のＮ末端配列を含有する断片を、合成オリゴヌクレオチドＲＧ５６６（
配列認識番号３７８）
【化２８８】
およびＲＧ５６７（配列認識番号３７９）
【化２８９】
40
を用いたＰＣＲによりｐＵＲＨＮ５から増幅した。精製した断片をＮｒｕＩとＢｓｕ３６
Ｉで切断し、ＮｒｕＩとＢｓｕ３６Ｉで切断したｐＦＲ２Ａ−３０に連結した。産生した
ＡＬＶＡＣ供与体プラスミド、ｐＣ３ＵＲＦＨＮを、挿入プラスミドのＤＮＡ配列分析に
より確認した。
【０７９０】
実施例７２−ＡＬＶＡＣ組換え体の産生
供与体プラスミドｐＣ３ＵＲＦＨＮを、ＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）とともにＣＥＦ細胞中の
生体外組換え実験に用いてｖＣＰ１７１を産生した（テイラーら、１９９２）。放射線標
識したＦおよびＨＮ特異的プローブを用いた現場でのハイブリダイゼーション方法（ピッ
チーニら、１９８７）により、組換えウイルスを同定した。３回のプラーク精製により組
50
(216)
JP 3602844 B2 2004.12.15
換えプラークを精製し、発現分析により増幅した。発現分析により、ＦおよびＨＮを発現
した。
【０７９１】
実施例７３−日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）１５ａａＣ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ２１、ＮＳ２Ａ
を含有する挿入ベクターの構築
ｐＲＷ８３８の構築は前述している（実施例１５参照）。
【０７９２】
ｐＲＷ８３８を、狂犬病糖タンパク質遺伝子の３′末端での、Ｈ６プロモーター内のＥｃ
ｏＲＶで切断されたＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片が充填されたＥｃｏＲＩで切断
し、アルカリ性ホスファーゼで処理し、Ｈ６プロモーターの５′の１０３ｂｐ、複製のプ
10
ラスミド起点およびＣ５フランキングアームを含有する３２０３ｂｐ断片を単離した。ワ
クシニアウイルス供与体プラスミド中で１５アミノ酸Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ
をコードするＪＥＶ ｃＤＮＡを含有するプラスミドＪＥＶＬ１４ＶＣ（メイソンら、１
９９１）（ヌクレオチド３３７−４１２５、コニシら、１９９１）をＨ６プロモーター中
のＥｃｏＲＩとＪＥＶ配列中のＳａｃＩ（ヌクレオチド２１２４）で切断し、１８０９ｂ
ｐ断片を単離した。ＪＥＶＬ１４ＶＣを、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片が充填さ
れ、Ｔ５ＡＴの後のＥａｇＩ部位でのＥｃｌＸＩで切断し、ＪＥＶ配列内のＳａｃＩ（ヌ
クレオチド２１２４）で切断し、２０１１ｂｐ断片を産生した。１８０９ｂｐＥｃｏＲＶ
−ＳａｃＩ、２０１１ｂｐ ＳａｃＩ充填ＥｃｌＸＩおよび３２０２ｂｐ ＥｃｐＲＶ充
填ＥｃｏＲＩ断片を連結し、ＪＥＶＣＰ１を産生した。
20
【０７９３】
実施例７４−ＪＲＶ １５ａａＣ、ｐｒＭ、Ｅを含有するＣ５挿入ベクターの構築
プラスミドＪＥＶ３６を、Ｈ６プロモーター内のＥｃｏＲＶとＪＥＶ配列内のＳｐｈＩ（
ヌクレオチド２３８０）で切断し、２０６５ｂｐの断片を単離した。プラスミドＶＱＨ６
Ｃ５ＬＳＰ（実施例４４で定義した）を、Ｈ６プロモーター内のＥｃｏＲＶとポリリンカ
ー内のＸｂａＩで切断し、２０６５ｂｐ断片とアニールしたオリゴヌクレオチドＳＰ１３
１（配列認識番号３８２）およびＳＰ１２３（配列認識番号３８３）（ＳｐｈＩ付着末端
、Ｅコード領域を補充したＴヌクレオチド、翻訳終止、ワクシニア初期転写終止シグナル
（ＡＴ５ＡＴ；ユエンおよびモス、１９８７）、第２の翻訳終止、およびＸｂａＩ付着末
端）に連結し、Ｃ５フランキングアームの間のＨ６プロモーターの制御下で１５アミノ酸
30
Ｃ、ｐｒＭおよびＥをコードするプラスミドＪＥＶＣＰ５を産生した。
【０７９４】
実施例７５−ＡＬＶＡＣベースのＪＥＶ組換え対の構築
ＪＥＶＣＰ１をＡＬＶＡＣ感染初代ＣＥＦ細胞にトランスフェクションし、１５アミノ酸
Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａをコードするカナリヤポックス組換え体ｖＣＰ１０７
を産生した。ＪＥＶＣＰ５をＡＬＶＡＣ感染初代ＣＥＦ細胞にトランスフェクションし、
ＪＥＶ１５ ａａＣ、ｐｒＭおよびＥをコードするカナリヤポックス組換え体ｖＣＰ１４
０を産生した。
【０７９５】
【化２９０】
40
実施例７６−組換え体感染細胞中のＪＥＶタンパク質の免疫沈降
前述したように免疫沈降実験を行なった（コニシら、１９９１）。ｖＣＰ１０７およびｖ
ＣＰ１４０感染細胞中に産生したＥタンパク質を、真正Ｅタンパク質を産生することが示
されているＪＥＶ−ワクシニア組換え体により産生されたＥタンパク質とともに移動する
（コニシら、１９９１）。ｖＣＰ１０７は、真正ＮＳ１タンパク質を産生することが示さ
れているＪＥＶ−ワクシニア組換え体により産生されたＮＳ１タンパク質とともに移動す
50
(217)
JP 3602844 B2 2004.12.15
る（コニシら、１９９１）。
【０７９６】
実施例７７−マウスのｃＣＰ１０７による免疫
腹腔注射により、生後３週間のスイスマウスを１０
７ ＰＦＵのｖＣＰ１０７で免疫し、
３週間後に選択したマウスから血清を採取した。マウスの半分にｖＣＰ１０７を再接種せ
しめ、３週間後に血清を採取した。前述したように、中和（Ｎｅｕｔ）および血球凝集阻
害抗体（ＨＡＩ）について血清をアッセイした（コニシら、１９９１）。ｖＣＰ１０７で
１度または２度免疫したマウスは、高い力価のＮｅｕｔおよびＨＡＩ抗体を発達せしめ、
両方の力価は２度目の免疫により増大した。親ＡＬＶＡＣを投与したマウスは抗体力価を
発達せしめなかった。ｖＣＰ１０７免疫マウスに得た抗体水準は、ＪＥＶ−ワクシニア組
10
換え体での免疫により達成された水準と匹敵した（コニシら、１９９１）。
【０７９７】
実施例７８−ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ（ｖＦＰ９６）への効能研究
特定病原体感染防止条件（ＳＰＦ）の鶏と市販のブロイラーの鶏におけるＴＲＯＶＡＣ−
ＮＤＶ（ｖＦＰ９６）（実施例８）のＮＤＶ（ニューカッスル病ウイルス）に対する防御
効能を測定するために、数多くの研究を行なった。
【０７９８】
研究Ａ．
生後１日のＳＰＦ鶏の４つの群に、０．３から６．３ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０の投与量の
範囲のＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ（ｖＦＰ９６）または親ＴＲＯＶＡＣウイルスを足に筋内経
20
路により接種した。接種部位での反応について鳥を監視し、抗ＮＤＶ血清中和抗体および
血球凝集素抑制抗体の存在の分析のために、接種から１４日後に血清試料を採取した。接
種から２１日後に、鳥に５．０ｌｏｇ１０５０％卵感染量の短潜伏期性ＮＤＶ菌株テキサ
スＧＢを筋内接種により抗原投与した。健康な鳥が防御されたと考えられる抗原投与から
１４日間に亘り鳥を保持した。６．３または２．６ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０のＴＲＯＶＡ
Ｃ−ＮＤＶ（ｖＦＰ９６）またはＴＲＯＶＡＣ親ウイルスの筋内接種により、接種の時点
で、ある場合には死亡する皮膚の病害となることが分かった。病害の酷さには特定の投与
量効果があり、これは、１．１から１．４ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０の投与量で、接種の時
点でのわずかな炎症反応に限られる。全ての場合において、病害は接種の点に限定され、
鶏の他の部分には広がらない。効果はＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ中のＮＤＶ ＦおよびＨＮ遺
30
伝子の発現によるものではなく、同様の効果が親ウイルスにも観察された。他の接種経路
が用いられた場合に、高い投与量のＴＲＯＶＡＣまたはＴＲＯＶＡＣベースの組換え体の
接種では有害な副作用が見られるので、反応はこの接種経路に特異的である。
【０７９９】
血清学分析と防御効能の結果を表４７に示す。ＴＲＯＶＡＣ親ウイルスを接種した全ての
鳥は、致死量抗原投与のために死亡した。１．１および２．６ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０の
ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ（ｖＦＰ９６）をワクチン接種した全ての鳥は、抗原投与に生き残
り、一方０．３ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０を投与した鳥の８２％が生存した。これにより、
この経路によるこの組換え体の５０％の防御投与量（ＰＤ５０）は０．３ＴＣＩＤ５０で
あることが分かった。
【０８００】
【表４７】
40
(218)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
研究Ｂ．
市販のブロイラー鶏の２つの供給源とＳＰＦ鶏におけるＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ（ｖＦＰ９
６）の防御効能を評価した。生後１日の鳥の３つの群について研究した。群１：鶏痘ウイ
ルスによりワクチン接種した経験のないふ化場から得た卵から鶏をふ化させた。群２：鶏
痘ウイルスによりワクチン接種した経験のあるふ化場から得た卵から鶏をふ化させた。群
３：特定病原体感染防止条件鶏を得た。
【０８０１】
50
(219)
JP 3602844 B2 2004.12.15
２．０または４．０ｌｏｇ１０ＥＩＤ５０のいずれかのＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶを皮下で鳥
にワクチン接種した。ワクチン接種から２１および２８日後に鳥から採血し、ＮＤＶ Ｈ
Ｉ抗体の存在を評価した。また、アガーゲル沈降試験を用いてワクチン接種後の鶏痘抗体
の存在について血清を評価した。ワクチン接種から２８日後、各群の１０匹の鳥と１０匹
の対照に、４．２ｌｏｇ１０ＥＩＤ５０の短潜伏期性のＮＤＶ菌株テキサスＧＢを筋内接
種により抗原投与し、生存した鳥を評価した。また、各群の１０匹の鳥と１０匹の対照に
、鶏痘ウイルスのＮＶＳＬ菌株を翼に刺す接種により抗原投与した。鶏痘抗原投与からの
防御を、接種部位での病害または生着（ｔａｋｅ）の欠如に基づいて評価した。この実験
結果を表４８に示す。
【０８０２】
10
この結果により、市販のブロイラー鶏はＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶにより発現されたＮＤＶ抗
原に対する検出可能な免疫応答を発達させず、一方ＳＰＦ鶏は免疫応答を示したことが分
かる。市販の鳥には特異的抗ＮＤＶ抗体の欠如にもかかわらず、短潜伏期性ＮＤＶ抗原投
与後に見られた防御水準には差はなかった。アガーゲル沈降試験により検出可能な鶏痘ワ
クチン接種に対する免疫応答は、どの鳥も示さなかった。検出可能な抗鶏痘抗体の欠如に
もかかわらず、全てのワクチン接種した鳥は、鶏痘抗原投与から防御され、一方ワクチン
未接種の鳥は死亡した。これらの結果により、雄鳥の鶏痘ウイルスへの先の露出では、鶏
痘ベースのＮＤＶ組換え体をワクチン接種した鶏におけるＮＤＶまたは鶏痘に対する防御
免疫の誘発を妨げないことが分かる。
【０８０３】
【表４８】
20
(220)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
ヒト組換え体免疫不全ウイルス−ＮＹＶＡＣまたは−ＡＬＶＡＣウイルス；細胞株に関す
る以下の実施例７９から８１のための材料および方法
Ｐ８１５マウス肥満細胞種細胞（Ｈ−２
ｄ ）をアメリカ型培養コレクションから得て、
１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン並びに１００μｇ
／ｍｌのストレプトマイシンを補給したイーグルＭＥＭ中に保持した。
【０８０４】
マウス
雌ＢＡＬＢ／ｃＪ（Ｈ−２
ｄ ）マウスをジャクソン研究所（ＭＥ、バーハーバー）から
40
購入し、任意に餌と水を与え続けた。全て生後６から１５週間のマウスを用いた。
【０８０５】
接種
外側尾静脈により０．１ｍｌの食塩加リン酸緩衝液中の５×１０
７ プラーク形成単位（
ｐｆｕ）を、マウスに静脈接種した。
【０８０６】
血清
マウスをエーテルで軽く麻酔して、レトロオービタル（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ）叢か
ら採血した。実験群よりなるマウスから採血し、凝固せしめた。血清を採取し、使用まで
−７０℃で貯蔵した。
50
(221)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０８０７】
細胞傷害性Ｔリンパ球のアッセイおよび細胞傷害性Ｔリンパ球の記憶前駆体の生体外刺激
生後６週間の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０
７ ｐｆｕのワクシニアウイルス（ＮＹ
ＶＡＣ）、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ） ｅｎｖを発現する組換えワクシニアウイルス（ｖＰ
９１１）、カナリヤポックスウイルス（ＡＬＶＡＣ）、またはＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ） ｅｎｖを発現する組換えカナリヤポックスウイルス（ｖＣＰ１１２）を静脈接種した。７
日後、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）ｇｐ１２０の超可変Ｖ３ループ領域に対応するペプチドで
一晩インキュベーションしたＰ８１５細胞または非改変Ｐ８１５細胞に対する一次ＣＴＬ
活性に関して、脾臓細胞をアッセイした。最初の免疫から２２日後、実験マウスの脾臓細
胞をポックスウイルス感染スティミュレーター脾臓細胞でインキュベーションし、前述の
10
ようにペプチド瞬間標識した標的に対する記憶ＣＴＬ活性に関してアッセイした。二次Ｃ
ＴＬ活性を測定するために、最初の接種から２９日後、初回免疫マウスに最初と同量で同
成分の２回目の接種を行なった。５日後、ペプチド瞬間標識標的に対する細胞傷害性活性
に関して脾臓細胞をアッセイした。細胞傷害性アッセイに関して、Ｈ−２
ｄ Ｐ８１５マ
ウス肥満細胞種細胞を、２０μｇ／ｍｌのＶ３ペプチド（ＣＮＴＲＫＲＩＲＩＱＲＧＰＧ
ＲＡＦＶＴＧＫ、アメリカンバイオテクノロジー社）（配列認識番号４５７）の有無のか
かわらず培地中（アール塩を含有し、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬグルタミン、１
００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補給した）
で一晩インキュベーションした。次の朝、遠心分離によりＰ８１５細胞を洗浄し、２×１
０
６ の細胞当たり１００μＣｉのＮａ２ ５ １
ＣｒＯ４ 中３７℃で１時間標識した。
20
無傷脾臓を、安楽死させたマウスから除去して、氷冷したハンクス平衡塩溶液中に入れ、
ストマッチャーブレンダーを用いて１つの細胞懸濁液に粉砕した。脾臓細胞懸濁液を低速
遠心分離により数回洗浄し、アッセイ培地（１０％のウシ胎仔血清、２０ｍＭのＨＥＰＥ
Ｓ、２ｍＭのＬグルタミン、５×１０
− ５
Ｍの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍ
ｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６
４０）中に再懸濁せしめた。記憶ＣＴＬ活性に関して、免疫したマウスからの脾臓細胞を
刺激培地中に再懸濁せしめ（１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬグルタミン、１０
− ４
Ｍ
の２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌの
ストレプトマイシンを含有するアール塩を有するＭＥＭ）、ポックスウイルスまたはポッ
クスウイルス組換え体の１つに感染した未経験同系スティミュレーター脾臓細胞により、
直立させた２５ｃｍ
２ 細胞を洗浄し、数え、アッセイ培地中に再懸濁した。
の
５ １
30
組織培養フラスコ中で生体外刺激した。３７℃での５日間の後、
５ １
クロム標識標的細胞を、４時間
Ｃｒ放出アッセイのための９６ウェルマイクロタイタ板中の滴定したエフェクター
細胞に加えた。３つのアッセイに見られた標的細胞に対するエフェクターの比率（Ｅ：Ｔ
）は、１００：１（一次）、２０：１（記憶）、および５０：１（二次）であった。細胞
傷害性のパーセントは、（実験
出−自発的
５ １
５ １
Ｃｒ放出−自発的
５ １
Ｃｒ放出）／（最大
５ １
Ｃｒ放
Ｃｒ放出）×１００により計算した。最大放出は、５％のドデシル硫酸ナ
トリウムを標的細胞に加えることにより測定し、一方自発的放出は、エフェクター細胞の
不在下で標的細胞をインキュベーションすることにより測定した。どの実験においても、
最大
５ １
Ｃｒ放出の２０％を超える標的細胞からの
５ １
Ｃｒの自発的な放出は存在しなか
40
った。誤差のバーは、平均からの１標準偏差を示す。（＊）Ｐ＜０．０５、スチューデン
トｔ検定を適切なワクシニアまたはカナリヤワクシニア免疫マウスと比較した。
【０８０８】
細胞傷害性エフェクター細胞の細胞表面発現型
方法は実質的に、ワクシニアウイルス、カナリヤポックスウイルスベクター（ＮＹＶＡＣ
、ＡＬＶＡＣ）またはＨＩＶ ＩＩＩＢ ｅｎｖを発現するワクシニアウイルスまたはカ
ナリヤポックスウイルス組換え体（ｖＰ９１１、ｖＣＰ１１２）で免疫したマウス脾臓細
胞に関して行なった。２回目の接種は、最初の接種から３０日後に行なった。Ｖ３ペプチ
ド瞬間標識した標的に添加する前に、脾臓細胞を、２段階プロトコルにおいてマウスＴリ
ンパ球表面抗原に対する単クローン性抗体または同種異系抗血清で処理した。手短にいう
50
(222)
JP 3602844 B2 2004.12.15
と、脾臓細胞を、同種異系Ｔｈｙ１．２（セダーレーン）、単クローン性抗ＣＤ−４（１
７２．４、デューク大学医療センター、Ｋ．Ｊ．ワインホールドからのギフト）、または
単クローン性抗Ｌｙｔ２．２（セダーレーン）が加えられる細胞傷害性培地（０．２％の
ＢＳＡおよび５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ１６４０）に１ｍｌ当たり１０
７ の生存可能細胞で再懸濁せしめた。５℃での３０分後、細胞を洗浄し、補体（セダーレー
ン、ウサギ ロートクスＭ）の有無にかかわらず２つの等しい部分に分けた細胞傷害性培
地の元の容積に再懸濁せしめ、３７℃で４５分間インキュベーションした。次いで細胞を
アッセイ培地中で洗浄し、前処理細胞密度に基づいて、５時間の
５ １
Ｃｒ放出アッセイに
添加する前に、１００：１（一次）、１０：１（記憶）、または８０：１（二次）の標的
細胞に対するエフェクターの比率を近似するアッセイ培地の容積中に再懸濁した。誤差の
10
バーは平均からの１標準偏差を示す。
【０８０９】
ＨＩＶ ＩＩＩＢ ｇｐ１２０のＶ３ループ領域のＣＴＬ抗原受容体認識の特異性
細胞傷害性Ｔリンパ球および細胞傷害性Ｔリンパ球の記憶前駆体を、前述したようにマウ
スのｖＣＰ１１２による接種により産生した。Ｐ８１５標的細胞を、ＨＩＶ−１ ＩＩＩ
Ｂ（ＣＮＴＲＫＲＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＧＫ）（配列認識番号３８４）、ＭＮ（Ｃ
ＮＫＲＫＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮ）（配列認識番号３８５）、またはＳＦ２（Ｃ
ＮＴＲＫＳＩＹＩＧＰＧＲＡＦＨＴＴＧＲ）（配列認識番号３８６）からのＶ３ペプチド
で一晩瞬間標識したことを除いては、上述したように、細胞傷害性Ｔリンパ球のアッセイ
を行なった。標的細胞に対するエフェクターの比率は、１００：１（一次）、２０：１（
20
記憶）、および５０：１（二次）であった。
【０８１０】
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ） ｇｐ１２０に対する抗体応答
ＥＬＩＳＡ板のウェル（イムロンＩＩ）を、炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６中の０．５μｇの
部分的に精製したＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ） ｇｐ１２０（ＮＣＩ−ＮＩＨ、Ｄｒ．Ｇ．フ
ランチーニ）により４℃で一晩被膜した。次いでその板を０．０５％のトイーン２０（Ｐ
ＢＳＴ）を含有する食塩加リン酸緩衝液で洗浄した。次いで板を、１％のウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳＴにより３７℃で２時間遮断した。ＰＢＳＴにより洗浄
後、最初に血清を、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴ（希釈緩衝液）で１：２０に希
釈した。さらに血清をＥＬＩＳＡ板のウェル中で２倍に連続的に希釈した。この板を３７
30
℃で２時間インキュベーションし、ＰＢＳＴで洗浄した。ウサギ抗マウスムノグロブリン
（ダコ）に接合されたホースラディッシュペルオキシダーゼを希釈緩衝液中で１：２００
０に希釈して、ＥＬＩＳＡ板のウェルに加え、３７℃で１時間インキュベーションした。
ＰＢＳＴでの洗浄後、基体緩衝液中のＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライ
ド）を加え、周囲温度で約２０分間に亘り呈色せしめた。反応を、２．５ＭのＨ２ ＳＯ
４ の添加により停止せしめた。４９０ｎｍでの吸収を、バイオテックＥＬ−３０９ＥＬ
ＩＳＡリーダーで測定した。０．４の吸収値を与えた希釈の逆数として血清の終点を定義
した。
【０８１１】
実施例７９−ＨＩＶ ｅｎｖを発現する組換え体カナリヤポックスウイルスはＨＩＶ特異
40
的細胞傷害性Ｔリンパ球活性を誘発する
ＨＩＶカナリヤポックスウイルス組換え体（ｖＣＰ１１２；実施例１８で定義した）での
最初の接種から７日後、ＨＩＶ Ｖ３ペプチド瞬間標識標的細胞に対する脾臓細胞の細胞
傷害性応答を、同一の投与量、５×１０
７ ｐｆｕの同一のＨＩＶ ｅｎｖ遺伝子を発現
するワクシニアウイルス組換え体（ｖＰ９１１）（実施例１８）により誘発した細胞傷害
性応答に粗く等しくした（第３１図）。適切な生体外刺激または２回目の接種後に、カナ
リヤポックスウイルス組換え体を与えたマウスの脾臓細胞の細胞傷害性の水準は増大し、
同様にワクシニアウイルス組換え体を投与したマウスからの脾臓細胞と一致した。それぞ
れ、非組換えワクシニアウイルスまたはカナリヤポックスウイルスベクター、ＮＹＶＡＣ
およびＡＬＶＡＣを接種したマウスの脾臓細胞からはそのような細胞傷害性応答は検出さ
50
(223)
JP 3602844 B2 2004.12.15
れず、ＨＩＶ ｅｎｖ遺伝子を発現するポックスウイルス組換え体での免疫の必要性を確
認した。さらに、接種養生にもかかわらず、どのようなマウスからの脾臓細胞からの非改
変Ｐ８１５細胞に対しては細胞傷害性反応性は検出されなかった。それゆえ、組換えワク
シニアウイルスまたは、より著しくは、ＨＩＶ−１からのｅｎｖコード配列を発現する組
換えカナリヤポックスウイルスを接種したマウスのみが、Ｖ３特異的細胞傷害性応答を示
した。
【０８１２】
実施例８０−細胞傷害性エフェクター細胞の特徴付け
ＨＩＶ−１ Ｖ３ペプチド瞬間標識標的の溶菌に関する脾臓細胞の同一性を測定するため
に、マウスをｖＣＰ１１２で免疫した。それぞれを免疫した後に、または最初の接種から
10
２１日後に生体外刺激したときに、２段階枯渇方法を行ない、脾臓細胞を、Ｖ３ペプチド
瞬間標識Ｐ８１５細胞に対する細胞傷害性に関して評価した。カナリヤポックスベクター
ＡＬＶＡＣを接種したマウスは、ペプチド瞬間標識標的を殺すことのできる脾臓細胞を産
生しなかった。１回の免疫後、ｖＣＰ１１２は、Ｖ３ペプチド瞬間標識標的を殺すことの
できる脾臓細胞を誘発した。溶菌エフェクター細胞は、抗マウスＴｈｙ１．２またはＬｙ
ｔ２．２および補体による処理に感度があり、第３２図に示すように抗ＣＤ４に対して抵
抗があった。この図は、細胞傷害性Ｔリンパ球細胞表面抗原Ｔｈｙ１．２およびＬｙｔ２
．２に対する抗体に対しての、ｖＣＰ１１２で免疫した脾臓細胞からの細胞傷害性エフェ
クター細胞の感度を示す。補体またはいずれの単クローン性抗体または同種異系抗血清の
みのどれもこれらの細胞の細胞溶解性作用に影響しなかった。３０日目に投与した２回目
20
の免疫から５日後にも同様の結果が得られた。１回目の接種から２１日後、ｖＣＰ１１２
感染同系脾臓細胞による生体外刺激により、抗Ｔｈｙ１．２に部分的に感度があるが、抗
Ｌｙｔ２．２に完全に感度があり。抗ＣＤ４には抵抗がある溶菌エフェクター細胞となる
。ｖＣＰ１１２を接種したマウスからの脾臓細胞のｖＰ９１１による生体外刺激後には、
これらのＴｈｙ１．２−、ＣＤ４−、Ｌｙｔ２．２＋エフェクター細胞は見られない。い
うまでもなく、ＨＩＶ Ｖ３ループ特異的細胞傷害性は、ＣＤ４ではなくＴｈｙ１．２お
よびＬｙｔ２．２を発現するＴリンパ球の個体群により媒介されたことが明確である。
【０８１３】
実施例８１−ＨＩＶ ｇｐ１２０のＶ３ループ領域のＣＴＬ抗原受容体の特異性Ｔリンパ
球抗原受容体は、エピトープ断片の主要アミノ酸配列中の小さな改変に対して精巧に感度
30
がある。ＨＩＶ ｇｐ１２０のＶ３ループ領域は超可変性であり、ＨＩＶ単離体の中で免
疫学的に異なる。超可変性は、置換といくつかのアミノ酸の添加にある。ＨＩＶカンリヤ
ポックスウイルス組換え体により産生された細胞傷害性細胞の特異性を試験するために、
ＣＴＬ活性に対する感受性は、ＨＩＶ単離体ＩＩＩＢ、ＭＮ、またはＳＦ２のｇｐ１２０
のＶ３ループ領域に対応するペプチドで瞬間標識したＰ８１５標的細胞の中で比較した。
ＨＩＶ特異的一次ＣＴＬ活性は、第３３図に示したように、ＨＩＶ単離体ＭＮまたはＳＦ
２のｇｐ１２０のＶ３ループ領域に対応するペプチドで瞬間標識した標的細胞ではなく、
ＨＩＶ単離体ＩＩＩＢのＶ３ループに対応するペプチドで瞬間標識したＰ８１５標的細胞
のみに限定された。第３３図は、ＨＩＶ ＭＮまたはＳＦ２のＶ３ループのではなく、ｇ
ｐ１２０のＨＩＶ ＩＩＩＢ超可変Ｖ３ループの細胞傷害性Ｔリンパ球抗原受容体の特異
40
性を説明するものである。生体外刺激された、ＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬ活性およびカナリ
ヤポックスウイルス組換え体ｖＣＰ１１２による免疫により誘発された二次ＣＴＬ活性に
関して、同様の結果が得られた。それゆえ、ＨＩＶ単離体ＩＩＩＢのｅｎｖ遺伝子を発現
する組換えカナリヤポックスウイルスにより誘発されたＨＩＶ特異的ＣＴＬは、同一の抗
原単離体から誘導された標的エピトープのみを認識する。これらの結果は明確に、ＨＩＶ
カナリヤポックスウイルス組換え体により産生されたリンパ球エフェクター細胞の精巧な
特異性を示し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性としての非特異的エフェクター機構を
除外する。これらの結果は、ＨＩＶ Ｖ３特異的マウス細胞傷害性Ｔリンパ球によるエピ
トープ認識の正確さを特徴付ける他の報告と完全に一致する。
【０８１４】
50
(224)
JP 3602844 B2 2004.12.15
実施例８２−ＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣベースのＨＩＶ組換え体を接種したマウスの
抗体応答
ＨＩＶに対する液性免疫応答を評価するために、０日にワクシニアウイルスＨＩＶ組換え
体またはカナリヤポックスウイルス組換え体でマウスを免疫し、４週間目に２回目の免疫
を行なった。最初の免疫から２０週間に亘り、様々な間隔でマウスを採血した。各処理群
から採取した血清を、抗原として精製したｇｐ１２０を使用したＥＬＩＳＡによりＨＩＶ
に対する抗体に関してアッセイした；ベクター（ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ）またはワクシ
ニアウイルス組換え体ｖＰ９１１またはＨＩＶ−１ ｅｎｖを発現するカナリヤポックス
組換え体（ｖＣＰ１１２）で免疫したマウスのＨＩＶ ＩＩＩ Ｂ ｇｐ１２０に対する
抗体応答を提供する第３４図に結果を示す。ここで逆三角形は、２回目の接種の投与時間
10
を示す。一次抗体応答は、一般的に穏やかであったが検出可能であった。２回目の接種後
に、ｖＰ９１１およびｖＣＰ１１２の両方で免疫したマウスの抗体力価は増大し、６週目
に１０，０００を超える力価でピークとなった。これらの抗体力価は、研究の期間に亘り
ほぼ同一の水準で保持された。それゆえ、カナリヤポックスウイルスＨＩＶ組換え体、ｖ
Ｐ１１２は、著しい抗体応答を誘発することができた。
【０８１５】
ＨＩＶ−１のｅｎｖ遺伝子を発現するカナリヤポックスウイルスによるマウスの接種によ
り、細胞傷害性Ｔリンパ球の特徴：免疫の必要条件、細胞表面発現型、記憶、および簡潔
なエピトープ特異性を有する脾臓細胞活性を誘発する。さらに、この組換えカナリヤポッ
クスウイルスの接種によりＨＩＶ−１ ｇｐ１２０にいする抗体応答が誘発される。
20
【０８１６】
実施例８３−ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣによるＨＩＶ−１（ＭＮ） ｅｎｖを発現する
ＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣベースＨＩＶ−１組換え体の誘導
ＨＩＶ−１（ＭＮ） ｅｎｖ配列を、それぞれ、ＨＩＶ−１（ＭＮ）のゲノムｃＤＮＡか
らの１７７４ｂｐおよび１８０３ｂｐサブ断片を含有するプラスミドｐＭＮ１．８−９お
よびｐＭＮ１．８−１０から誘導した。これらのプラスミドは、Ｄｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ（Ｎ
ＣＩ−ＮＩＨ）の研究所から得た。オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ６（配列認識番号３８
７）
【化２９１】
30
およびＨＩＶ３Ｂ２（配列認識番号１５１）を用いたＰＣＲによりｐＭＮ１．８−９から
のこれらの配列を増幅し、続いてＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩによる切断により、１，０２６ｂ
ｐ ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩ断片を誘導した。この断片をＫｐｎＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ
に挿入し、ｐＢＳＭＩＤＭＮを産生した。
【０８１７】
オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ５（配列認識番号３８８）
【化２９２】
40
およびＨＩＶＭＮ３Ｐ（配列認識番号３８９）
【化２９３】
を用いたＰＣＲと、続いてのＳａｃＩとＸｂａＩによる切断により、ｐＭＮ１．８−１０
から１，０２８ｂｐ ＳａｌＩ／ＸｂａＩ断片を誘導した。この断片を、４０４ｂｐ Ｅ
ｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片とともに、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに連結
した。テンプレートとしてのｐＭＮ１．８−９およびオリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（
配列認識番号１４４）並びにＨＩＶＭＮ４（配列認識番号３９０）
【化２９４】
50
(225)
JP 3602844 B2 2004.12.15
を用いたＰＣＲにより、４０４ｂｐ断片を誘導した。産生したプラスミドをｐＢＳ３ＭＮ
と称した。
【０８１８】
ｐＢＳＭＩＤＭＮからの１，０２６ｂｐ ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ断片を、ＥｃｏＲＩ／Ｋ
ｐｎＩで切断した４，３１５ｂｐ ｐＢＳ３ＭＮに挿入した。このプラスミドは、５′側
領域を除いたｅｎｖ遺伝子のほとんどを含有する。ｐＨ６ＨＩＩＩＢＥ（実施例１８に定
義した）から３１８ｂｐ ＫｐｎＩ断片を単離することにより、ワクシニアウイルスＨ６
プロモーター（ゲーベルら、１９９０ａ、ｂ）およびｅｎｖ遺伝子の５′側領域を得た。
10
この断片を、ｐＢＳＭＩＤ３ＭＮからの２．９ｂｐ ＫｐｎＩ／ＸｂａＩ断片とともに、
ＫｐｎＩ／ＸｂａＩ切断ｐＢＳ−ＳＫに連結した。産生したプラスミドをｐＨ６ＨＭＮＥ
と称した。
【０８１９】
Ｈ６プロモーターの３′側の２６ｂｐに３′が隣接した全縁ＨＩＶ−１（ＭＮ） ｅｎｖ
遺伝子を含有する、ｐＨ６ＨＭＮＥからの２．７ｂｐ ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片をブラン
トエンドし、ＮｒｕＩ／ＳｍａＩ切断ｐＳＰＨＡＨ６に挿入した。これによりプラスミド
ｐＨＡＨＩＶＭＮＥを産生した。プラスミドｐＳＰＨＡＨ６を以下のように誘導した。
【０８２０】
プラスミドｐＭＰ２ＶＣＬ（Ｋ１Ｌ宿主域遺伝子の上流のワクシニア配列内にポリリンカ
20
ー領域を含有する）を、ポリリンカー内のＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで切断し、アニール
したオリゴヌクレオチドＳＰＨＰＲＨＡ ＡからＤまでに連結し、
【化２９５】
30
ＨｉｎｄＩＩＩ部位、Ｈ６プロモーター−１２４から−１（パーカスら、１９８８９ ）
およびＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩ並びにＥｃｏＲＩ部位を含有するｐＳＰ
１２６を産生した。
【０８２１】
プラスミドｐＳＤ５４４（ポリリンカー領域で置換したＨＡ遺伝子の部位を囲むワクシニ
ア配列および６つの読取りワクシニア中の翻訳終止コドンを含有する）をポリリンカー内
のＸｈｏＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼ Ｉのクレノウ断片で充填し、アルカリホスフ
40
ァターゼで処理した。ＳＰ１２６をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、クレノウで処理し、Ｓｍａ
Ｉでの切断によりＨ６プロモーターを単離した。ｐＳＤ５５４へのＨ６プロモーター断片
の連結により、ポリリンカー領域（ＨＡ転写の方向）内にＨ６プロモーターを含有したｐ
ＳＰＨＡＨ６を産生した。この挿入プラスミドにより、ワクシニアＨＡ遺伝子（Ａ５６；
ゲーベルら、１９９０ａ、ｂ）の異種遺伝子材料による置換が可能になった。
【０８２２】
ｐＨ６ＨＭＮＥからの２．８ｋｂ ＸｂａＩ／部分的ＫｐｎＩ断片を単離し、ＸｂａＩと
ＫｐｎＩで切断したｐＣ５Ｌ（実施例４４に定義した）に挿入した。産生したプラスミド
をｐＣ５ＨＩＶＭＮＥと称した。
【０８２３】
50
(226)
JP 3602844 B2 2004.12.15
プラスミドｐＨＡＨＩＶＭＮＥおよびｐＣ５ＨＩＶＭＮＥを、治療ウイルスとしての、そ
れぞれＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）およびＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）とともに生体外組換え実
験に用いた。これらは、標準方法により行なった（ピッチーニら、１９８７）。組換えウ
イルスから誘導したプラークを、放射線標識したｅｎｖ特異的ＤＮＡプローブを用いたハ
イブリダイゼーションにより同定した（ピッチーニら、１９８７）。３回のプラーク精製
後、組換えウイルスを増幅した。ＮＹＶＡＣ−ベースのＨＩＶ−１（ＭＮ） ｅｎｖ組換
え体をｖＰ１００８と称し、ＡＬＶＡＣベースの組換え体ｖＣＰ１２５と称した。
【０８２４】
組換えウイルス、ｖＣＰ１２５およびｖＰ１００８を、前述した方法を用いて蛍光抗体法
および免疫沈降によりＨＩＶ−１（ＭＮ） ｅｎｖ遺伝子の発現に関して分析した（テイ
10
ラーら、１９９０）。ＨＩＶ血清陽性個体から採取したヒトの血清（ＣＡ、エメリービル
、シロン社、Ｄｒ．Ｋ．ステイマーから得た）をこれらのアッセイに用いた。蛍光抗体法
からの結果により、ｖＣＰ１２５またはｖＰ１００８に感染した細胞は、その表面にＨＩ
Ｖ−１（ＭＮ）遺伝子産生物を発現することが示された。ｖＰ１００８およびｖＣＰ１２
５感染細胞から調製した溶解産物からの免疫沈降は、それぞれ約１６０ｋＤａ、１２０ｋ
Ｄａ、および４１ｋＤａの見かけの分子質量を有する３つの主要ＨＩＶ−１−特異的タン
パク質を示した。これらは、前駆体エンベロープ糖タンパク質（１６０ｋＤａ）およびタ
ンパク質分解により誘導した熟成形状（１２０ｋＤａおよび４１ｋＤａ）の発現と一致す
る。
【０８２５】
20
実施例８４−ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣによるりＨＩＶ−１（ＭＮ） ｇｐ１２０の発
現
オリゴヌクレオチドＴ７（配列認識番号３９５）
【化２９６】
およびＨＩＶＭＮ１２０（配列認識番号３９６）
【化２９７】
30
を用いてｐＢＳ３ＭＮから３９１ｂｐ ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片を増幅し、続いてＥｃ
ｏＲＩとＸｂａＩで切断した。この断片をｐＨ６ＨＭＮＥ（実施例８３で定義した）から
誘導した４．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片に連結した。産生したプラスミドは、ｐ
ＢＳ−ＳＫ中のＨＩＶ−１（ＭＮ） ｇｐ１２０のポックスウイルス発現カセットを含有
し、ｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０と称した。
【０８２６】
１．７ｋｂ ＸｂａＩ／部分的ＫｐｎＩ断片を単離し、ＫｐｎＩ／ＸｂａＩで切断したｐ
Ｃ５Ｌに挿入した。産生したプラスミドをｐＣ５ＨＩＶＭＮ１２０と称した。ＨＩＶ−１
（ＭＮ） ｇｐ１２０をＮＹＶＡＣへ組み込む挿入プラスミドは、最初にｐＢＳＨＩＶＭ
40
Ｎ１２０から１．６ｋｂ ＮｒｕＩ／ＳｍａＩ断片を単離することにより得た。この断片
をＮｒｕＩとＳｍａＩで切断したｐＳＰＨＡＨ６に挿入し、ｐＨＡＨＩＶＭＮ１２０を得
た。
【０８２７】
挿入プラスミド、ｐＣ５ＨＩＶＭＮ１２０およびｐＨＡＨＩＶＭＮ１２０を、治療ウイル
スとしてのＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）およびＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）とともに組換え実験
に用いた。これらのアッセイおよびプラーク同定と精製は標準方法により行なった（ピッ
チーニら、１９８７）。放射線標識したＨＩＶ−１（ＭＮ） ｇｐ１２０特異的プローブ
に関してハイブリダイゼーション分析を行なった。ＡＬＶＡＣベースのＨＩＶ−１（ＭＮ
） ｇｐ１２０組換え体をｖＣＰ１２４と称し、ＮＹＶＡＣベースのＨＩＶ−１（ＭＮ）
50
(227)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ｇｐ１２０組換え体をｖＰ１００４と称した。
【０８２８】
ｖＣＰ１２４およびｖＰ１００４に感染した細胞を、蛍光抗体法および免疫沈降により、
ＨＩＶ−１（ＭＮ） ｇｐ１２０を発現した組換え体の存在に関して分析した。これらの
アッセイは、前述したように（テイラーら、１９９０）、ＨＩＶ−血清陽性個体から採取
したヒトの血清（ＣＡ、エメリービル、シロン社、Ｋ．ステイマーから得た）を用いて行
なった。これらの研究からの結果により、ｖＣＰ１２４およびｖＰ１００４のいずれかに
感染した細胞は、ＨＩＶ−１（ＭＮ）ｇｐ１２０を含有したことが分かり、一方ｇｐ１２
０は、親ウイルス、ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣに感染した細胞および未感染細胞には観
察されなかった。
10
【０８２９】
実施例８５−ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣによるＨＩＶ−１ ｇｐ１６０の非切断形状の
発現
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ） ｇｐ１６０の非切断形状を発現するために、スレオニン突然変
異に対するアルギニンをグオらにより示されたように（１９９０）、アミノ酸５１１で操
作した（ラトナーら、１９８５）。感染細胞の表面からのｇｐ１２０の放出を減少するた
めにこれらの改変を行なった。これらの操作を以下のように行なった。オリゴヌクレオチ
ド（配列認識番号３９７）
【化２９８】
20
およびＨＩＶＥＣＢ（配列認識番号３９８）
【化２９９】
を用いてｐＨ６ＨＩＩＩＢＥからの配列を増幅し、続いてＰｓｔＩとＸｂａＩでの切断に
より３７６ｂｐ ＰｓｔＩ／ＸｂａＩ断片を得た。この断片を、ｐＨ６ＨＩＩＩＢＥから
の４．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片と１，０６１ｂｐ ＰｓｔＩ／ＸｂａＩ断片に
連結し、ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣを産生した。
【０８３０】
30
ｇｐ１６０カセットに連結したＨ６プロモーターの３′側２６ｂｐを含有する、ｐＢＳＨ
ＩＶ３ＢＥＥＣからの２．６ｋｂ ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片を単離し、ｐＢＳＨＶＳ（実
施例６０で定義した）の３．０ｋｂ ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片に連結し、ｐＢＳＨＩＶ３
ＢＥＥＣＭを産生した。ＮｒｕＩとＸｂａＩでの切断により、Ｈ６プロモーターの３′側
２６ｂｐおよびハンターンウイルスＳ配列を切除した。３．０ｋｂ ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ
断片は、ｐＢＳ−ＳＫプラスミド中にＨ６プロモーターの５′側１００ｂｐを含有する。
【０８３１】
ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣＭからの２．８ｋｂ ＸｂａＩ／部分的ＫｐｎＩ断片をＸｂａＩ
／ＫｐｎＩで切断したｐＣ５Ｌに連結し、ｐＣ５ＨＩＶ３ＢＥＥＣを産生した。ｐＢＳＨ
ＩＶ３ＢＥＥＣＭからの２．７ｋｂ ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片をＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポ
40
リメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドし、ＮｒｕＩ／ＳｍａＩで切断したｐＳＰＨ
ＡＨ６に挿入し、ｐＨＡＨＩＶ３ＢＥＥＣを産生した。
【０８３２】
治療ウイルスとしての、それぞれＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）およびＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６
）を用いた標準方法（ピッチーら、１９８７）により、挿入プラスミド、ｐＣ５ＨＩＶ３
ＢＥＥＣおよびｐＨＡＨＩＶ３ＢＥＥＣを生体外組換え実験に用いた。ＨＩＶ−１ ｅｎ
ｖ遺伝子に特異的な放射線標識プローブを用いた標準プラークハイブリダイゼーション分
析（ピッチーニら、１９８７）により組換えプラークを同定した。３回の精製後に、組換
えウイルスを増幅した。ＡＬＶＡＣベースのＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ） ｇｐ１６０（非切
断可能）をｖＣＰ１２６と称し、ＮＹＶＡＣベースのものをｖＰ１０２０と称した。
50
(228)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０８３３】
ＨＩＶ血清陽性個体から採取したヒトの血清（ＣＡ、エメリービル、シロン社、Ｋ．ステ
イマーから得た）を用いてｖＰ１０２０およびｖＣＰ１２６感染細胞について、前述した
方法（テイラーら、１９９０）により、蛍光抗体法および免疫沈降分析を行なった。蛍光
抗体法の結果により、ｖＣＰ１２６またはｖＰ１０２０のいずれからに感染した細胞の表
面上のＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ） ｇｐ１６０（非切断可能形状）の表面発現が示された。
さらに、免疫沈降の結果により、熟成ｇｐ１２０およびｇｐ４１フレームにタンパク質分
解的に切断されなかったこれらの感染細胞中にＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ） ｇｐ１６０の存
在が示された。
【０８３４】
10
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ） ｇｐ１６０の非切断可能形状を追跡し、組換えウイルスを以下
のようにして得た。
【０８３５】
オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ３Ｐ（配列認識番号３８９）
【化３００】
およびＨＩＶＥＣＡ（配列認識番号３９９）
【化３０１】
20
を用いたｐＨ６ＨＭＮＥからのＰＣＲ増幅と続いてのＰｓｔＩとＸｂａＩでの切断により
、ＰｓｔＩ／ＸｂａＩ断片を得た。１０６１ｂｐ断片を、ｐＢＳＨＩＶＮＮＴからの３９
１ｂｐ ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ形状（下記）およびｐＨ６ＨＭＮＥからの４．２ｋｂ Ｅ
ｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片（実施例８３に記載した）に連結した。産生したプラスミドをｐ
ＢＳＨＩＶＭＮＥＥＣ１と称した。ＨＩＶ ｅｎｖ挿入物の配列分析により、１つのヌク
レオチドが失われたことが示された。これを訂正するために、以下の操作を行なった。ｐ
Ｈ６ＨＭＮＥからの４．６ｋｂ ＳａｃＩ／ＸｂａＩによりｐＢＳＨＩＶＭＮＥＥＣが形
成された。
【０８３６】
30
ｐＢＳＨＩＶＭＮＥＥＣからの２．６ ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片を挿入し、クレノウでブ
ラントエンドし、ＮｒｕＩ／ＳｍａＩで切断したｐＳＰＨＡＨ６（実施例８３で定義した
）に挿入した。産生したプラスミドをｐＨＡＨＩＶＭＮＥＥＣと称した。ｐＢＳＨＩＶＭ
ＮＥＥＣからの２．６ｋｂ ＮｒｕＩ／ＸｂａＡＩ断片もＮｒｕＩ／ＸｂａＩで切断した
ｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ６（下記）に挿入し、ｐＣ５ＨＩＶＭＮＥＥＣを産生した。
【０８３７】
挿入プラスミド、ｐＨＡＨＩＶＭＮＥＥＣおよびｐＣ５ＨＩＶＭＮＥＥＣを、治療ウイル
スとしての、それぞれＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）およびＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）とともに
、標準組換え実験（ピッチーニら、１９８７）に用いた。放射線標識したＨＩＶ ｅｎｖ
特異的ＤＮＡプローブを用いた標準プラークハイブリダイゼーション（ピッチーニら、１
40
９８７）より、組換えウイルスを同定し、プラーク精製した。次いで精製した組換えウイ
ルスを増幅した。ＨＩＶ−１（ＭＮ）非切断可能ｇｐ１６０を含有するＮＹＶＡＣベース
の組換え体をｖＰ１０７８と称し、ＡＬＶＡＣのものをｖＣＰ１４４と称した。
【０８３８】
ｖＣＰ１２６およびｖＰ１０７８の発現分析を上述したように行なった。これらの結果に
より、発現は、質的にＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）対照物、ｖＰ１０２０およびｖＣＰ１２６
と等しいことが分かった。
【０８３９】
実施例８６−ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣによるＨＩＶ−１ ｅｎｖの非切断可能分泌形
状の発現
50
(229)
JP 3602844 B2 2004.12.15
タンパク質分解的に切断されず、遺伝子産生物のカルボキシ末端の近くの膜貫通配列の除
去により分泌されるＨＩＶ−１（ＭＮ） ｅｎｖを発現するＡＬＶＡＣ−およびＮＹＶＡ
Ｃベースの組換えウイルスを産生した。最初にｐＨ６ＨＭＮＥ（実施例８３に定義した）
からのこれらの配列をオリゴヌクレオチドＨＩＶＥＣＡ（配列認識番号３９９）およびＨ
ＩＶＭＮＴ１（配列認識番号４００）
【化３０２】
を用いて増幅し、続いてＰｓｔＩ（５′末端）およびＸｂａＩ（３′末端）での切断によ
10
り５０２ｂｐ ＰｓｔＩ／ＸｂａＩ断片を得た。この断片は、ヌクレオチド７２１９から
７８０８に対応する（ラトナーら、１９８５）。この断片は、ｅｎｖ発現カセットの３′
末端として作用する。それ自体、ｅｎｖ遺伝子産生物は、膜貫通領域が欠如し、オリゴヌ
クレオチド（配列認識番号４００）により提供される終止コドンにより終止せしめられ、
オリゴヌクレオチドＨＩＶＥＣＡ（配列認識番号３９９）を用いて提供された５１１（上
記）でのアミノ酸変化により切断されない。この５０２ｂｐ断片を、オリゴヌクレオチド
ＨＩＶ３Ｂ１（配列認識番号１４４）およびＨＩＶＥＣＢ（配列認識番号３９８）、並び
にｐＨ６ＨＭＮＥに対する４．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片を用いたＰＣＲにより
ｐＨ６ＨＭＮＥから誘導した３９１ｂｐ ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片に、この５０２ｂｐ
断片を連結した。産生したプラスミドをｐＢＳＨＩＶＭＮＴと称した。
20
【０８４０】
ｐＢＳＨＩＶＭＮＴからの２．２ｋｂ ＸｂａＩ／部分的ＫｐｎＩ断片を単離し、Ｘｂａ
ＩとＫｐｎＩで切断したｐＣ５Ｌに挿入した。産生したプラスミドをｐＣ５ＨＩＶＭＮＴ
と称した。ｐＢＳＨＩＶＭＮＴから２．１ｋｂ ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片を単離すること
により、ＮＹＶＡＣ挿入プラスミドを誘導した。次いで、この断片を２ｍＭのｄＮＴＰの
存在下でＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片によりブラントエンドし、Ｎ
ｒｕＩとＳｍａＩで切断したｐＳＰＨＡＨ６に挿入し、ｐＨＡＨＩＶＭＮＴを産生した。
【０８４１】
挿入プラスミド、ｐＣ５ＨＩＶＭＮＴおよびｐＨＡＨＩＶＭＮＴを、治療ウイルスとして
の、それぞれＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）およびＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）とともに標準組換
30
え実験（ピッチーニら、１９８７）に用いた。放射線標識したＨＩＶ ｅｎｖ特異的プロ
ーブを用いた標準プラークハイブリダイゼーション（ピッチーニら、１９８７）により組
換えウイルスを同定した。増幅の前に、組換えウイルスに３回の精製を行なった。ＡＬＶ
ＡＣベースのＨＩＶ−１（ＭＮ） ｅｎｖ（非切断可能；分泌）をｖＣＰ１２０と称し、
ＮＹＶＡＣのものをｖＰ９４４と称した。
【０８４２】
前述した方法により（テイラーら、１９９０）、ＨＩＶ血清陽性個体から採取したヒト血
清を用いて、ｖＣＰ１２０およびｖＰ９９４感染細胞に関して免疫沈降を行なった。ｖＣ
Ｐ１２０およびｖＰ９９４の両者は、非切断可能、切形遺伝子産生物と一致する分子量を
有するＨＩＶ−１（ＭＮ）ｅｎｖ特異的遺伝子産生物を発現した。さらに、ｖＣＰ１２０
およびｖＰ９９４感染細胞培養からの細胞不含有培地の免疫沈降により、このｅｎｖ遺伝
子産生物の分泌が示された。
【０８４３】
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ） ｅｎｖに関して同様の構成を操作した。これを行なうために、
以下の操作を行なった。最初にｐＨ６ＨＩＩＩＢＥ（実施例１８に定義した）からのこれ
らの配列を、オリゴヌクレオチドＨＩＶＥＣＡ（配列認識番号３９９）およびＨＩＶ３Ｂ
Ｔ（配列認識番号４０１）
【化３０３】
40
(230)
JP 3602844 B2 2004.12.15
を用いて増幅し、続いてＰｓｔＩとＸｂａＩでの切断により４８７ｂｐ ＰｓｔＩ／Ｘｂ
ａＩ断片を得た。ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣから３９７ｂｐ ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片を
単離して、ｐＨ６ＨＩＩＩＢＥＭから４．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片を単離した
。これの３つの断片をともに連結し、ｐＢＳＨＩＶ３ＢＴ１を産生した。
【０８４４】
ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣＭのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ切断により誘導した２．１ｋｂお
よび２．９ｋｂ断片をｐＢＳＨＩＶ３ＢＴ１からの１０５ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｂａ
10
Ｉ断片に連結し、ｐＢＳＨＩＶ３ＢＴを産生した。このプラスミドをＮｒｕＩとＸｂａＩ
で切断し、２．１ｋｂ断片を切除した。この断片をブラントエンドし、ＮｒｕＩとＳｍａ
Ｉで切断したｐＳＰＨＡＨ６に挿入し、ｐＨＡＨＩＶ３ＢＴを産生した。
【０８４５】
プラスミドｐＨＡＨＩＶ３ＢＴを、治療ウイルスとしてのＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）とと
もに、上述したように組換え実験に用いた。組換えウイルスを同定し、上述したように精
製し、産生した組換え体をｖＰ１０３６と称した。この組換え体はｖＣＰ１２０およびｖ
Ｐ９９４に関して上述した発現特徴全てを有した。
【０８４６】
実施例８７−ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣにより膜貫通配列により固定されたＨＩＶ−１
20
（ＭＮ）の発現
ｇｐ１２０をコードするｅｎｖ領域を親水性膜貫通配列をコードする領域に融合するため
に、以下の操作を行なった。オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列認識番号１４４）お
よびＨＩＶＭＮ１８（配列認識番号４０２）
【化３０４】
を用いてｐＨ６ＨＭＮＥからＰＣＲにより、ｇｐ１２０コード配列の３′側領域に対応す
る２００ｂｐ断片を誘導した。オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列認識番号１４４）
30
およびＨＩＶＴＭ３（配列認識番号４０５）
【化３０５】
をも用いて、ＰＣＲによりこの断片を、アニールしたオリゴヌクレオチドＨＩＶＴＭ１（
配列認識番号４０３）
【化３０６】
40
およびＨＩＶＴＭ２（配列認識番号４０４）
【化３０７】
に融合した。オリゴヌクレオチドＨＩＶＴＭ１（配列認識番号４０３）およびＨＩＶＴＭ
２（配列認識番号４０４）は、ヌクレオチド７８５０から７９３４に対応し（ラトナーら
、１９８５）、ＨＩＶ ｅｎｖ親水性固定配列をコードする領域を示す。ＨＩＶＴＭ３（
50
(231)
JP 3602844 B2 2004.12.15
配列認識番号４０５）による融合は、終止コドンおよび３′ＸｂａＩ部位を有する最後の
カセットの３′末端を操作する。誘導断片をＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで切断し、ＥｃｏＲＩ
とＸｂａＩで切断したｐＨ６ＨＭＮＥに連結し、ｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔを産生した。
【０８４７】
Ｈ６プロモーターの３′側の２６ｂｐおよび全縁ＨＩＶ−１カセットを含有する、１．７
ｋｂ ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片を単離し、ｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ６からの５．１ｋｂ Ｎ
ｒｕＩ／ＸｂａＩ断片に挿入し、ｐＣ５ＨＩＶＭＮ１２０Ｔを単離した。ｐＶＱＨ６Ｃ５
ＬＳＰ６を以下のように誘導した。
【０８４８】
ｐＣ５ＬＳＰ（実施例６６で定義した）をＢａｍＨＩで切断し、アニールしたオリゴヌク
10
レオチドＣＰ３２（配列認識番号４０６）
【化３０８】
およびＣＰ３３（配列認識番号４０７）
【化３０９】
20
に連結してｐＶＱＣ５ＬＳＰ６を産生した。
【０８４９】
ｐＢＳＨＩＮＭＮ１２０Ｔからの１．７ｋｂ ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片もまたブラントエ
ンドし、ＮｒｕＩとＳｍａＩで切断したｐＳＰＨＡＨ６に挿入した。産生したプラスミド
をｐＨＡＨＩＶＭＮ１２０Ｔと称した。
【０８５０】
挿入プラスミド、ｐＣ５ＨＩＶＭＮ１２０ＴおよびｐＨＡＨＩＶＭＮ１２０Ｔを、治療ウ
イルスとして、それぞれＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣとともに、標準組換え実験（ピッチ
ーニら、１９８７）に用いた。放射線標識したＨＩＶ−１ ｇｐ１２０特異的ＤＮＡプロ
ーブを用いた標準プラークハイブリダイゼーション（ピッチーニら、１９８７）により、
30
組換えウイルスを同定し、精製した。純粋な個体群を増幅し、ＡＬＶＡＣベースの固定し
た（ａｎｃｈｏｒｅｄ）ＨＩＶ−１（ＭＮ） ｇｐ１２０組換え体をｖＣＰ１３８と称し
た。ＮＹＶＡＣベースのものをｖＰ１０３５と称した。
【０８５１】
標準方法により（テイラーら、１９９０）、蛍光抗体法および免疫沈降分析を行ない、ｖ
Ｐ１３８およびｖＰ１０３５感染細胞中のＨＩＶ−１（ＭＮ）固定ｇｐ１２０の発現を評
価した。ＨＩＶ血清陽性個体から採取したヒト血清（ＣＡ、エメリービル、シロン社、Ｄ
ｒ．Ｋ．ステイマーから得た）を用いて、アッセイを行なった。
【０８５２】
表面蛍光抗体法の探求により、ｖＣＰ１３８およびｖＰ１０３５感染細胞が形質膜中にＨ
40
ＩＶ−１（ＭＮ） ｇｐ１２０を含有したことが分かった。特に、ｖＣＰ１３８およびｖ
Ｐ１０３５感染細胞の表面染色は、ｇｐ１６０または非固定ｇｐ１２０を発現する組換え
ウイルス（すなわち、ｖＣＰ１２５、ｖＣＰ１２４、ｖＰ１００４、およびｖＰ１００８
）に感染した細胞と比較して、著しく増大した。免疫沈降分析からの結果により、ｖＣＰ
１３８およびｖＰ１０３５感染細胞の発現、および発現された産生物が予期した分子質量
であったことが確認された。
【０８５３】
実施例８８−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ ＧＡＧ（プロテアーゼ
− ）組換え体の産生
１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミド、ｐＨＸＢ
２ＤはＤｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝
50
(232)
JP 3602844 B2 2004.12.15
子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクロ
ーニングした。これは、ｇａｇ遺伝子の５′末端を含有する、ｐＨＸＢ２Ｄの１，６２５
ｂｐ ＢｇｌＩＩ断片をｐＳＤ５４２（実施例３２に定義した）の４，０７５ｂｐ Ｂｇ
ｌＩＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生されたプラスミ
ドをｐＨＩＶＧ２と称した。
【０８５４】
次いでｇａｇ遺伝子の３′末端をｇａｇ遺伝子の残りの下流にクローニングした。これは
、ｇａｇ遺伝子の３′末端を含有する２８０ｂｐ ＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ ＰＣＲ断片を
、ｐＨＩＶＧ２の５，６２０ｂｐ ＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることに
より行なった。このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチドＨＩＶＰ５（配列認識番号４０８
10
）
【化３１０】
およびＨＩＶＰ６（配列認識番号４０９）
【化３１１】
を有するプラスミド、ｐＨＸＢ２Ｄから産生した。この操作により産生したプラスミドを
ｐＨＩＶＧ３と称した。
20
【０８５５】
次いでＩ３Ｌプロモーターをｇａｇ遺伝子の上流にクローニングした。これは、ワクシニ
アウイルスＩ３Ｌプロモーターおよびｇａｇ遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌクレ
オチド、ＨＩＶＬ１７（配列認識番号４１０）
【化３１２】
およびＨＩＶＬ１８（配列認識番号４１１）
30
【化３１３】
を、ｐＨＩＶＧ３の５，５４０ｂｐ部分的ＢｇｌＩＩ−ＣｌａＩ断片にクローニングする
ことにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧ４と称した。
【０８５６】
ｐＨＩＶＧ４を、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに組換え実験に
用いてｖＰ９６９を産生した。免疫沈降分析を行なって、ｖＰ９６９が真正ＨＩＶ−１ 40
ｇａｇ前駆体タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞単層を、疑似感染したか
、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．で親ウイルスに感染せしめたか、またはｖＰ９６９に
感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清およ
び［
３ ５
Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（
メチオニンを含まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍ
Ｍのトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ Ａｚｉｄｅおよび０
．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）の添加と続いて細胞単層の削り取りにより、細胞を感染から
１８時間後に収集した。
【０８５７】
ＨＩＶ−１血清陽性個体から採取した血清（ＣＡ、エメリービル、シロンから得た）を用
50
(233)
JP 3602844 B2 2004.12.15
いて、感染細胞からの溶解産物をＨＩＶ−１ ｇａｇ前駆体発現について分析した。血清
を、ｖＰ８６６感染ベロ細胞で前吸着した。前吸着した血清を、４℃での一晩のインキュ
ベーションによりタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーション期
間後、材料を４回１×の緩衝液Ａで洗浄した。次いで、通常ヒト血清およびタンパク質Ａ
セファロースで前洗浄した溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合したＨＩＶ−１
血清陽性ヒト血清とともに４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーショ
ン期間後、試料を１×緩衝液Ａで４回、ＬｉＣｌ２ ／尿素緩衝液で２回洗浄した。２×
のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセ
ロール、１０％の２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により、沈殿したタ
ンパク質を免疫複合体から分離した。タンパク質を１０％のドリファスゲルシステム（ド
10
リファスら、１９８４）で分画し、固定し、フルオログラフィーのために１ＭのＮａ−サ
リチル酸塩で処理した。
【０８５８】
ＨＩＶ−１血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＰ９６９感染細胞からのＨＩＶ−１ ｇａ
ｇ前駆体タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ感染細胞
からはＨＩＶ−１特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
【０８５９】
実施例８９−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ ｇａｇ／ｐｏｌ組換え体の産生
ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウイルスｔｋフランキングアー
ムの間にクローニングした。このは、ｇａｇ遺伝子の５′末端を含有する、ｐＨＸＢ２Ｄ
20
の１，６２５ｂｐ ＢｇｌＩＩ断片をｐＳＤ５４２（実施例３２に定義した）の４，０７
５ｂｐ ＢｇｌＩＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生し
たプラスミドをｐＨＩＶＧ２と称する。
【０８６０】
次いでｇａｇ遺伝子の３′末端をｐＨＩＶＧ２にクローニングした。これは、ｇａｇ遺伝
子の３′末端を含有する、２８０ｂｐ ＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ ＰＣＲ断片をｐＨＩＶＧ
２の５，６２０ｂｐ ＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった
。このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＰ５（配列認識番号４０８）およびＨ
ＩＶＰ６（配列認識番号４０９）を有するプラスミド、ｐＨＸＢ２Ｄから産生した。この
操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧ３と称する。
30
【０８６１】
次いでＩ３Ｌプロモーターをｇａｇ遺伝子の上流にクローニングした。これは、ワクシニ
アウイルスＩ３Ｌプロモーターおよびｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする、オリゴヌク
レオチド、ＨＩＶＬ１７（配列認識番号４１０）およびＨＩＶＬ１８（配列認識番号４１
１）をｐＨＩＶＧ３の５，５４０ｂｐ部分的ＢｇｌＩＩ−ＣｌａＩ断片にクローニングす
ることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧ４と称する。
【０８６２】
次いでｐ２４、ｐ２、ｐ７およびｐ６をコードするｇａｇ遺伝子の部分を除去した。これ
は、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ１９（配列認識番号４１２）
【化３１４】
40
およびＨＩＶＬ２０（配列認識番号４１３）
【化３１５】
をｐＨＩＶＧ４の４，４５０ｂｐ部分的ＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングする
ことにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧ５と称した。
50
(234)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【０８６３】
ｐｏｌ遺伝子と同様に、ｇａｇ遺伝子の残りをｐ１７「遺伝子」の下流にクローニングし
た。これは、ｇａｇ遺伝子のほとんどおよびｐｏｌ遺伝子の全てのを含有する、ｐＨＸＢ
２Ｄの４，９５５ｂｐ ＣｌａＩ−ＳａｌＩ断片をｐＨＩＶＧ５の４，１５０ｂｐ Ｃｌ
ａＩ−ＳａｃＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプ
ラスミドをｐＨＩＶＧ６と称する。
【０８６４】
次いで外来３′非コード配列を除去した。これは、ｐｏｌ遺伝子の３′末端を含有する、
３６０ｂｐ ＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩ ＰＣＲ断片を、ｐＨＩＶＧ６の８，０３０ｂｐ ＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。このＰＣＲ断片は
10
、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＰ７（配列認識番号４１４）
【化３１６】
およびＨＩＶＰ８（配列認識番号４１５）
【化３１７】
を有するプラスミドｐＨＸＢ２Ｄから産生した。この操作により産生したプラスミドをｐ
ＨＩＶＧ７と称する。
20
【０８６５】
ｐＨＩＶＧ７を、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに組換え実験に
用いてｖＰ９８９を産生した。
【０８６６】
上述したように、ＨＩＶ−１ ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９８９感染
細胞に免疫沈降を行なった。疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からはＨＩＶ−
１特異的種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９８９感染細胞からの溶解産物からは
、ｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間帯と熟成ｇａｇ切
断産生物が沈殿した。
【０８６７】
30
実施例９０−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１２０）組換
え体の産生
ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアーム
の間にクローニングした。これは、最初に、前述したようにプラスミドｐＨＩＶＧ７を調
製することにより行なった（実施例８９参照）。
【０８６８】
ｐＨＩＶＧ７を、治療ウイルスとしてのｖＰ９２１とともに組換え実験に用いて、ｖＰ９
９１を産生した。
【０８６９】
ＨＩＶ ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、前述したように、ｖＰ９９１感染細胞
40
の免疫沈降を行なった。疑似感染ベロ細胞からはＨＩＶ特異的種は沈殿しなかった。しか
しながら、ｖＰ９９１感染細胞の溶解産物からは、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質
に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿した。
【０８７０】
実施例９１−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１６０）組換
え体の産生
ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアーム
の間にクローニングした。これは、最初に、前述したように、プラスミドｐＨＩＶＧ７を
産生することにより行なった（実施例８９参照）。
【０８７１】
50
(235)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ｐＨＩＶＧ７を治療ウイルスとしてのｖＰ９１１（上記）とともに組換え実験に用いてｖ
Ｐ９９０を産生した。
【０８７２】
前述したように、ＨＩＶ−１ ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９９０感染
細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞からはＨＩＶ０１特異種は沈殿しなか
った。しかしながら、ｖＰ９９０感染細胞の溶解産物からは、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体
タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿
した。
【０８７３】
実施例９２−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ ｐ１７、ｐ２４組換え体の産生
10
ＨＩＶ−１ ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＨＸＢ２ＤをＤｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ（Ｎ
ＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウイ
ルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、最初に、前述したように
ｐＨＩＶＧ５を調製することにより行なった（実施例８９参照）。
【０８７４】
次いでｐ２４「遺伝子」の３′末端をｐＨＩＶＧ５にクローニングした。これは、ｐ２４
「遺伝子」の３′末端を含有する、６６０ｂｐのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ ＰＣＲ断片をｐ
ＨＩＶＧ５の４，４５０ｂｐ ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより
行なった。このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＰ２５（配列認識番号４１６
）
20
【化３１８】
およびＨＩＶＰ２６（配列認識番号４１７）
【化３１９】
を有する、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄから産生した。この操作により産生したプラスミドを
ｐＨＩＶＧ８と称した。
【０８７５】
30
次いで昆虫ポックス４２ｋｄプロモーターをｐ２４「遺伝子」の上流にクローニングした
。これは、昆虫ポックス４２ｋｄプロモーターおよびｐ２４「遺伝子」の５′末端をコー
ドする、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ２１（配列認識番号４１８）
【化３２０】
およびＨＩＶＬ２２（配列認識番号４１９）
【化３２１】
40
をｐＨＩＶＧ８の５，０７０ｂｐ ＸｈｏＩ−ＮｓｉＩ断片に挿入した。この操作により
産生したプラスミドをｐＨＩＶＧ９と称する。
【０８７６】
ｐＨＩＶＧ９を、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに組換え実験に
用いてｖＰ９７０を産生した。
【０８７７】
前述したように、ＨＩＶ−１ ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９７０感染
50
(236)
JP 3602844 B2 2004.12.15
細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からは
、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９７０感染細胞の溶解産物か
らはｐ２４に対応するタンパク質種が沈殿した。
【０８７８】
実施例９３−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ ｐ１７、ｐ２４およびｅｎｖ（ｇｐ１２０）組換
え体の産生
ＨＩＶ−１ ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２ＤをＤｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ（
ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウ
イルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、最初に、前述したよう
にｐＨＩＶＧ９を調製することにより行なった（実施例９２参照）。
10
【０８７９】
ｐＨＩＶＧ９を、治療ウイルスとしてのｖＰ９２１とともに組換え実験に用いてｖＰ９７
３を産生した。
【０８８０】
前述したように、ＨＩＶ−１ ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９７３感染
細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞からは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しな
かった。しかしながら、ｖＰ９７３感染細胞の溶解産物からはｐ２４に対応するタンパク
質種が沈殿した。
【０８８１】
実施例９４−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ ｐ１７、ｐ２４およびｅｎｖ（ｇｐ１６０）組換
20
え体の産生
ＨＩＶ−１ ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２ＤをＤｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ（
ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウ
イルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、最初に、前述したよう
にｐＨＩＶＧ９を調製することにより行なった（実施例９２参照）。
【０８８２】
ｐＨＩＶＧ９を、治療ウイルスとしてのｖＰ９１１とともに組換え実験に用いてｖＰ９７
１を産生した。
【０８８３】
前述したように、ＨＩＶ−１ ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９７１感染
30
細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞からは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しな
かった。しかしながら、ｖＰ９７１感染細胞の溶解産物からはｅｎｖおよびｐ２４に対応
するタンパク質種が沈殿した。
【０８８４】
実施例９５−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ ｇａｇ（プロテアーゼ
− ）およびｅｎｖ（切形
の）組換え体の産生
ＨＩＶ−１ ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＨＸＢ２ＤをＤｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ（Ｎ
ＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウイ
ルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、最初に、前述したように
ｐＨＩＶＧ９を調製することにより行なった（実施例８９参照）。
40
【０８８５】
次いでＨ６プロモートした切形ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子をｐＨＩＶＧ４に挿入した
。これは、Ｈ６プロモートした切形ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶ
Ｅ１０のＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）充填１，６００ｂｐ Ｘ
ｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を、ｐＨＩＶＧ４の充填ＢａｍＨＩ部位にクローニングすることに
より行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１１と称する。
【０８８６】
ｐＢＳＨＩＶ３ＢＣＤＴ１からのＳａｃＩ／部分的ＫｐｎＩ断片をｐＩＢＩ２５（ＣＴ、
ニューハブン、ＩＢＩ）の多重クローニング領域に挿入することとによりプラスミドｐＨ
ＩＶＥ１０を誘導した。プラスミドｐＢＳＨＩＶ３ＢＣＤＴ１は、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ
50
(237)
JP 3602844 B2 2004.12.15
）エンベロープ（アミノ酸１から４４７；ラトナーら、１９８５）の著しく切形された形
状を発現するＨ６プロモートされたカセットを含有する。Ｖ３ループ領域とＴ１エピトー
プを保持しながらＣＤ４結合を除去するために、このカセットの発現を評価した。
【０８８７】
ｐＢＳＨＩＶ３ＢＣＤＴ１を構築するために、以下の操作を行なった。オリゴヌクレオチ
ドＨＩＶ３Ｂ２Ａ（配列認識番号３９７）およびＨＩＶＣＤ４Ａ（配列認識番号４２０）
【化３２２】
を用いてｐＨ６ＨＩＩＩＢＥ（実施例１８で定義した）から２００ｂｐのＰＣＲ誘導断片
10
を増幅した。オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ２Ａ（配列認識番号３９７）およびＨＩＶＴ
Ｍ３（配列認識番号４０５）を用いてＰＣＲにより、この断片を、アニールしたオリゴヌ
クレオチドＨＩＶＴＭ１（配列認識番号４０３）およびＨＩＶＴＭ２（配列認識番号４０
４）に融合した。ＨＩＶ−１ ｅｎｖ膜貫通アンカー（アミノ酸６９１から７１８；ラト
ナーら、１９８５）、翻訳終止コドン（ＴＡＡ）、および３′ＸｂａＩ部位をコードする
配列を配することにより、これらの操作で切形ｅｎｖカセットの３′末端を産生した。こ
のＰＣＲ融合産生物をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断し、２４３ｂｐの断片を産生した。こ
の断片をｐＨ６ＨＩＩＩＢＥの４．５ｂｐ ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片に連結し、ｐＢＳ
ＨＩＶ３ＢＣＤＴ１を産生した。
【０８８８】
20
ｐＨＩＶＧＥ１１を、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに組換え実
験に用いてｖＰ９７９を産生した。
【０８８９】
前述したように、ＨＩＶ−１ ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９７９感染
細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からは
、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９７９感染細胞の溶解産物か
らはｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種が沈殿した。
【０８９０】
実施例９６−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（切形）組換え体の
産生
30
ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアーム
の間に挿入した。これは、前述したように最初にプラスミドｐＨＩＶＧ７を調製すること
により行なった（実施例８９参照）。
【０８９１】
次いでＨ６プロモートした切形ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子をｐＨＩＶＧ７に挿入した
。これは、Ｈ６プロモートした切形ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶ
Ｅ１０（実施例９５に定義した）のＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片
）充填１，６００ｂｐ ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を、ｐＨＩＶＧ７の充填ＢａｍＨＩ部位
にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶ
ＧＥ１２と称する。
40
【０８９２】
ｐＨＩＶＧＥ１２を、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに組換え実
験に用いてｖＰ９７８を産生した。
【０８９３】
前述したように、ＨＩＶ−１ ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９７８感染
細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からは
、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９７８感染細胞の溶解産物か
らはｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体
と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿した。
【０８９４】
50
(238)
JP 3602844 B2 2004.12.15
実施例９７−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１２０）組換
え体の産生
ｇａｇ遺伝子をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間に挿入
した。これは、前述したように最初にプラスミドｐＨＩＶＧ７を調製することにより行な
った（実施例８９参照）。
【０８９５】
次いでＩ３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をカナリヤポックス挿入ベクター
に挿入した。これは、Ｉ３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨ
ＩＶＧ７の４，３６０ｂｐ 部分的ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＶＱＨ６ＣＰ３Ｌの
ＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラス
10
ミドをｐＨＩＶＧＥ１４と称する。
【０８９６】
次いでＨ６プロモートしたＨＩＶ−１（ＭＮ）エンベロープ（ｇｐ１２０）遺伝子をｐＨ
ＩＶＧＥ１４に挿入した。これは、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ２９（配列認識番号４
２１）
【化３２３】
およびＨＩＶＬ３０（配列認識番号４２２）
【化３２４】
20
並びにＨ６プロモートしたｇｐ１２０遺伝子を含有する、ｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０の１，
６００ｂｐ ＮｒｕＩ−ＮｏｔＩ断片を、ｐＨＩＶＧＥ１４の１１，５００ｂｐ Ｎｒｕ
Ｉ−ＮｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラ
スミドをｐＨＩＶＧＥ１５と称する。
【０８９７】
次いで、Ｈ６プロモートしたエンベロープ（ｇｐ１２０）遺伝子およびＩ３Ｌプロモート
したｇａｇとｐｏｌ遺伝子をワクシニアウイルス挿入ベクターに挿入した。これは、Ｈ６
プロモートしたｇｐ１２０遺伝子およびＩ３Ｌプロモートしたｇａｇとｐｏｌ遺伝子を含
30
有する、ｐＨＩＶＧＥ１５の６，４００ｂｐ ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＳＤ５４２
ＶＣＶＱの４，０００ｂｐ ＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩ断片にクローニングすることにより行
なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１６と称する。
【０８９８】
ｐＨＩＶＧＥ１６を、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに組換え実
験に用いてｖＰ９８８を産生した。
【０８９９】
前述したように、ＨＩＶ−１ ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９８８感染
細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からは
、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９８８感染細胞の溶解産物か
40
らはｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体
と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿した。
【０９００】
実施例９８−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１６０）組換
え体の産生
ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアーム
の間にクローニングした。これは、前述したように最初にプラスミドｐＨＩＶＧＥ１６を
調製することにより行なった（実施例９７参照）。
【０９０１】
次いでｇｐ１６０遺伝子により、ｇｐ１２０遺伝子を置換した。これは、全縁ＨＩＶ−１
50
(239)
JP 3602844 B2 2004.12.15
（ＭＮ）エンベロープ（ｇｐ１６０）遺伝子を含有する、ｐＨ６ＨＭＮＥの２，６００ｂ
ｐ ＮｒｕＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＨＩＶＧＥ１６の８，０００ｂｐ 部分的ＮｒｕＩ−Ｎ
ｏｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミド
をｐＨＩＶＧＥ１９と称する。
【０９０２】
ｐＨＩＶＧＥ１９を、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組
換え実験に用いてｖＰ１００９を産生した。
【０９０３】
前述したように、ＨＩＶ−１ ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ１００９感
染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞から
10
はＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ１００９感染細胞からは、ｅ
ｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成
ｇａｇ切断産生物が沈殿した。
【０９０４】
実施例９９−ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１ ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ＧＰ１２０）組換
え体の産生
ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアーム
の間にクローニングした。これは、前述したように最初にプラスミドｐＨＩＶＧＥ１５を
調製することにより行なった（実施例９７参照）。
【０９０５】
20
ｐＨＩＶＧＥ１５を治療ウイルスとしてのＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）とともに組換え実験に
用いてｖＣＰ１１７を産生した。
【０９０６】
免疫沈降分析を行なって、ｖＣＰ１１７が真正ＨＩＶ−１ ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子産
生物を発現するか否かを測定した。ＣＥＦ細胞単層を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ
／細胞のｍ．ｏ．ｉ．で親ウイルスに感染せしめたか、またはｖＣＰ１１７に感染せしめ
た。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［
３ ５
Ｓ
］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（メチオニン
を含まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス
（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／
30
ｍｌのＰＭＳＦ）と続いての細胞単層の削り取りにより、細胞を感染から１８時間後に収
集した。
【０９０７】
ＨＩＶ−１血清陽性個体からの血清（ニューヨーク州保険省から得た）を用いてＨＩＶ ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子発現に関して感染細胞から溶解産物を分析した。血清をＣＰｐ
ｐ感染ＣＥＦ細胞で前吸着せしめた。前吸着した血清を４℃で一晩のインキュベーション
によりタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーション期間後、材料
を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通常のヒト血清とタンパク質Ａセファロースで前
浄化した溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合したＨＩＶ−１血清陽性ヒト血清
により４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション後、試料を１×緩
40
衝液Ａで４回、ＬｉＣｌ２ ／尿素緩衝液で２回洗浄した。２×ラエムリ緩衝液（１２５
ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メル
カプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により免疫複合体から沈殿したタンパク質を分
離した。タンパク質を１０％のドリファスゲルシステム（ドリファスら、１９８４）で分
画し、固定し、フルオログラフィーのために１Ｍ Ｎａ−サリチル酸塩で処理した。
【０９０８】
ＨＩＶ−１血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＣＰ１１７感染細胞からはＨＩＶ−１ ｇ
ａｇおよびｅｎｖタンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＣＰｐｐ感
染細胞からはＨＩＶ−１特異的タンパク質は沈殿せしめなかった。
【０９０９】
50
(240)
JP 3602844 B2 2004.12.15
実施例１００−ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１ ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１６０）組
換え体の産生
ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアーム
の間にクローニングした。これは、前述したように最初にプラスミドｐＨＩＢＧＥ１５を
調製することにより行なった（実施例９７参照）。
【０９１０】
次いでｇｐ１２０をｇｐ１６０で置換した。これは、全縁ＨＩＶ−１（ＭＮ）エンベロー
プ（ｇｐ１６０）遺伝子を含有する、ｐＨ６ＨＭＮＥの２，６００ｂｐ ＮｒｕＩ−Ｎｏ
ｔＩ断片をｐＨＩＶＧＥ１５の９，８００ｂｐ ＮｒｕＩ−ＮｏｔＩ断片にクローニング
することにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１８と称す
10
る。
【０９１１】
次いで前の工程で欠損したカナリヤポックスフランキングアームをｐＨＩＶＧＥ１８にク
ローニングした。これは、Ｃ３フランキングアームを含有する、ｐＨＩＶＧＥ１５の１，
５００ｂｐ ＮｏｔＩ断片を、ｐＨＩＶＧＥ１８の１２，４００ｂｐ ＮｏｔＩ断片にク
ローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧＥ
２０と称する。
【０９１２】
ｐＨＩＶＧＥ２０を治療ウイルスとしてのＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）とともに組換え実験に
用いてｖＣＰ１３０を産生した。
20
【０９１３】
免疫沈降分析を行なって、ｖＣＰ１３０がＨＩＶ−１ ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子産生物
を発現するか否かを測定した。ＣＥＦ細胞単層を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細
胞のｍ．ｏ．ｉ．で親ウイルスに感染せしめたか、またはｖＣＰ１３０に感染せしめた。
１時間の吸着時間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清と［
３ ５
Ｓ］−メチ
オニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（メチオニンを含まな
い）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７
．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰ
ＭＳＦ）の添加と続いての細胞単層の削り取りにより、細胞を感染から１８時間後に収集
した。
30
【０９１４】
ＨＩＶ−１血清陽性個体から採取した血清（ＣＡ、エメリービル、シロンから得た）を用
いて、感染細胞からの溶解産物を、ＨＩＶ−１ ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子発現に関して
分析した。血清をＣＰｐｐ感染ＣＥＦ細胞で前吸着せしめた。前吸着した血清を４℃での
一晩のインキュベーションによりタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキ
ュベーション期間後、物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで、通常のヒト血清とタ
ンパク質Ａセファロースで前浄化した溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合した
ＨＩＶ−１血清陽性ヒト血清により４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュ
ベーション期間後、試料を１×緩衝液Ａで４回、ＬｉＣｌ２ ／尿素緩衝液で２回洗浄し
た。２×ラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％の
40
グリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）の添加および５分間の沸騰により、
沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。１０％のドリファスゲルシステム（ドリ
ファスら、１９８４）で分画し、固定し、フルオログラフィーのために１ＭのＮａ−サリ
チル酸塩で処理した。ＨＩＶ−１血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＣＰ１３０感染細胞
からＨＩＶ−１ ｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を沈殿せしめたが、疑似感染細胞または
ＣＰｐｐ感染細胞からはＨＩＶ−１特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
【０９１５】
実施例１０１−ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１ ｇａｇ／ｐｏｌ組換え体の産生
ＨＩＶ−１ ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄを、Ｄｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ
（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウ
50
(241)
JP 3602844 B2 2004.12.15
イルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、前述したように最初に
プラスミドｐＨＩＶＧ７を調製することにより行なった（実施例８９参照）。
【０９１６】
次いで、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をカナリヤポックスフランキングアームの間にクロー
ニングした。これは、Ｉ３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子、並びにオリゴヌ
クレオチド、ＨＩＶ２Ｌ６（配列認識番号４２３）
【化３２５】
とＨＩＶ２Ｌ７（配列認識番号４２４）
10
【化３２６】
を含有する、ｐＨＩＶＧ７の４，４００ｂｐ ＳｍａＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＳＰＣＰ３Ｌ
のＳｍａＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生
したプラスミドをｐＨＩＶＧ２４と称する。
【０９１７】
ｐＨＩＶＧ２４を、治療ウイルスとしてのＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）とともに組換え実験に
用いてｖＣＰ１５２を産生した。
【０９１８】
20
前述したようにＨＩＶ−１ ｇａｇおよびｅｎｖタンパク質の発現に関して、ｖＣＰ１５
２感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染またはＡＬＶＡＣ感染細胞からは、ＨＩ
Ｖ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＣＰ１５２感染細胞の溶解産物からは
、ｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切
断産生物が沈殿した。
【０９１９】
実施例１０２−ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１ ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（切形）組換え体
の産生
ＨＩＶ−１ ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄを、Ｄｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ
（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウ
30
イルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、前述したように、最初
にプラスミドｐＨＩＶＧ２４を調製することにより行なった（実施例１０１参照）。
【０９２０】
ｐＨＩＶＧ２４を、治療ウイルスとしてのｖＣＰ１２０とともに組換え実験に用いてｖＣ
Ｐ１５５を産生した。
【０９２１】
前述したようにＨＩＶ−１ ｇａｇおよびｅｎｖタンパク質の発現に関して、ｖＣＰ１５
５感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染細胞からは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿し
なかった。しかしながら、ｖＣＰ１５５感染細胞の溶解産物からは、ｅｎｖおよびｇａｇ
前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物
40
が沈殿した。
【０９２２】
実施例１０３−ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１ ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（膜貫通アンカー
を有するｇｐ１２０）組換え体の産生
ＨＩＶ−１ ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄを、Ｄｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ
（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウ
イルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、前述したように、最初
にプラスミドｐＨＩＶＧ２４を調製することにより行なった（実施例１０１参照）。
【０９２３】
ｐＨＩＶＧ２４を、治療ウイルスとしてのｖＣＰ１３８とともに組換え実験に用いてｖＣ
50
(242)
JP 3602844 B2 2004.12.15
Ｐ１５６を産生した。
【０９２４】
前述したようにＨＩＶ−１ ｇａｇおよびｅｎｖタンパク質の発現に関して、ｖＣＰ１５
６感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染細胞からは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿し
なかった。しかしながら、ｖＣＰ１５６感染細胞の溶解産物からは、ｅｎｖおよびｇａｇ
前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物
が沈殿した。
【０９２５】
ＨＩＶ−１ ｇａｇ特異的遺伝子産生物単体またはワクシニアウイルスによりｅｎｖとの
組合せのいずれかの発現は、非感染ウイルス状粒子の産生となることが示されている（ハ
10
ッファーら、１９９０；フーら、１９９０）。このバックグラウンドに関して、ＨＩＶ−
１ ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を発現するＡＬＶＡＣベースの組換え体に感染し
た細胞もまたそのような粒子を産生するか否かを探求した。さらにこれらのＡＬＶＡＣベ
ース組換え体から非アビアン細胞（すなわち、ベロ、ＭＲＣ−５、等）を感染せしめるの
に用いられる場合、いかなるＨＩＶ−１ウイルス状粒子がポックスウイルスビリオン不純
物もなく精製できた。
【０９２６】
ｖＣＰ１５６に感染したベロ細胞を用いた粒子形成を評価するために、以下の実験を行な
った。ベロ細胞を約５ｐｆｕ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．で感染せしめた。２４感染期間後、上
澄みを収集し、２０００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離により浄化した。次いで上澄みを
20
、３０，０００ｋＤａの分子量をカットオフするフィルターを通じて回転せしめた。それ
ゆえ、小さな分子はこれらのフィルターを通過する。ＨＩＶ血清陽性個体から採取したヒ
ト血清（ニューヨーク州、保険省、Ｄｒ．Ｊ．コーニーから得た）を用いて、標準ウエス
タンブロット分析により、フィルターに保持された物質を分析した。ウエスタンブロット
分析の結果により、フィルターに保持された物質中に主要コアタンパク質ｐ２４およびＨ
ＩＶ−１（ＭＮ）固定ｇｐ１２０の存在が示された。上述したサイズ排除に関して、ｐ２
４が高等構造立体配置（すなわち、ウイルス状粒子）になければ、ｐ２４はそのフィルタ
ーを通過する。それゆえ、これらの結果は強く、ｇｐ１２０エンベロープ成分を含有する
ＨＩＶ−１ウイルス状粒子はｖＣＰ１５６感染細胞中で産生されることを示唆している。
【０９２７】
30
実施例１０４−ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ中のＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子のＴ１、Ｔ２
，、およびＴＨ４．１エピトープの発現
組換えポックスウイルスｖＰ１０６２およびｖＣＰ１４６を産生して、個々のペプチドと
してＨＩＶ−１ ｅｎｖのＴ１、Ｔ２、およびＴＨ４．１エピトープを発現した（ホスマ
リンら、１９９１）。
【０９２８】
プラスミドｐ７３１Ｔ１の構築
プラスミドｐＭＰＩ３Ｈは、ｐＵＣ８バックグラウンド中にワクシニアＩ３Ｌ初期／中間
プロモーター要素（シュミットおよびスタネンベルグ、１９８８；ホスおよびスタネルベ
ルグ、１９８８）を含有する。テンプレートとしてのｐＭＰＶＣ１、ワクシニアＨｉｎｄ
40
ＩＩＩ Ｉのサブクローンおよびプライマーとして、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ
２８３（配列認識番号４２５）
【化３２７】
とＭＰＳＹＮ２８７（配列認識番号４２６）
【化３２８】
を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、プロモーター要素を合成した。この反
50
(243)
JP 3602844 B2 2004.12.15
応からのＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩとＲｓａＩで切断し、プロモーター要素を含有する０．
１ｋｂ断片を精製した。補体合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ３９８（配列認識番号４
２７）
【化３２９】
とＭＰＳＹＮ３９９（配列認識番号４２８）
【化３３０】
10
をアニーリングすることにより、リンカー領域を組み立てた。ＰＣＲ誘導プロモーター要
素およびポリリンカー領域を、ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで切断したベクタープラスミド
ｐＵＣ８と連結した。産生したプラスミド、ｐＭＰＩ３Ｈは、開始コドンに対して位置−
１００から−６までのＩ３Ｌプロモーター領域と続いての、ＨｐａＩ、ＰｓｔＩ、Ｓａｌ
Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ部位を含有するポリリンカー領域を含有する
。ＨｐａＩでの切断により、プロモーター中の位置−６で線状化されたブラントエンドの
ＤＮＡが産生される。
【０９２９】
補体オリゴヌクレオチドＴ１Ｃ（配列認識番号４２９）
【化３３１】
20
およびＴ１Ｎ（配列認識番号４３０）
【化３３２】
をＨｐａＩとＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＭＰＩ３Ｈに連結することにより、ワク
シニアＩ３Ｌプロモーターに誘導されたＴ１ペプチドを含有するカセットを産生した。こ
30
の連結は、プロモーターの最後の５塩基対を再構築し、Ｔ１ペプチドの完全コード配列を
提供し、終止コドンとＢａｍＨＩ部位の間にＸｈｏＩ部位を産生する。これがプラスミド
ｐ７３１Ｔ１である。ヌクレオチド配列分析により断片の配列を確認した。
【０９３０】
プラスミドｐＨ６Ｔ２の構築
ワクシニアＨ６プロモーターによりドライブされたＴ２ペプチドを含有するカセットを２
工程で産生した：ＰＣＲおよびプライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号３６４）とＨ６Ｐ
ＣＲ２（配列認識番号３６５）を用いて、合成Ｈ６プロモーター（パーカスら、１９８９
）を含有するプラスミドからＥｃｏＲＶ部位を通じるＨ６プロモーターを誘導し、５′Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ部位を産生した。この１２２ｂｐＰＣＲ誘導断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏ
40
ＲＶで切断し、続いて同様に切断したｐＢＳ−ＳＫ＋（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ
）に連結し、プラスミドｐＢＳＨ６を産生した。ＥｃｏＲＶ部位からのＨ６プロモーター
の３′末端を完全にし、Ｔ２ペプチドをコードし、遺伝子の３′末端にＢａｍＨＩ部位を
産生する補体オリゴヌクレオチドＴ２Ｃ（配列認識番号４３１）
【化３３３】
およびＴ２Ｎ（配列認識番号４３２）
【化３３４】
50
(244)
JP 3602844 B2 2004.12.15
をアニールし、ＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで切断したｐＢＳＨ６に連結した。このプラスミ
ドをｐＨ６Ｔ２と称し、ヌクレオチド配列分析により断片を確認した。
【０９３１】
プラスミドｐＶＱ４２ＫＴＨ４．１の産生
持続性ＰＣＲ反応により、ＡｍＥＰＶ ４２ＫプロモーターによりドライブされたＴＨ４
．１ペプチドを含有するカセットを産生した：プライマー４２ＫＶＱ１（配列認識番号４
10
３３）
【化３３５】
および４２ＫＶＱ２（配列認識番号４３４）
【化３３６】
20
を用いて、４２Ｋプロモーターの制御下で狂犬病糖タンパク質の遺伝子を含有するプラス
ミドである、プラスミドｐ４２ＫＲＡＢＩからＰＣＲにより５′ＰｓｔＩとＳｍａＩ部位
を有する１０７ｂｐ ４２Ｋプロモーターを誘導した。このＰＣＲ誘導断片の１０７ｂｐ
プロモーター領域の配列は（配列認識番号４３５）
【化３３７】
30
である。この断片と、テンプレートとしての、ＴＨ４．１ペプチドＴＨ４１Ｃ（配列認識
番号４３６）
【化３３８】
およびＴＨ４１Ｎ（配列認識番号４３７）
【化３３９】
40
をコードする合成オリゴヌクレオチドと、プライマー４２ＫＴＨ４１（配列認識番号４３
８）
【化３４０】
および４２ＫＶＱ１（配列認識番号４３３）とを用いて１５９ｂｐ ＰＣＲ誘導断片を、
第２のＰＣＲでＴＨ４．１のコード配列に融合した。プライマー４２ＫＴＨ４１（配列認
50
(245)
JP 3602844 B2 2004.12.15
識番号４３８）およびＢＡＭＶＱ（配列認識番号４４１）
【化３４１】
を用いた第３のＰＣＲのためにテンプレートとして合成オリゴヌクレオチドＶＱＣ（配列
認識番号４３９）
【化３４２】
10
およびＶＱＮ（配列認識番号４４０）
【化３４３】
並びに断片を用いて、５′末端でＢａｍＨＩ部位を包含して、この２１０ｂｐ ＰＣＲ誘
導断片を５′末端に伸長した。続いてのヌクレオチド配列分析により、４２ＫＴＨ４１の
上記配列の下線により示したような位置２４後に外来の塩基（Ａ）が挿入されているよう
20
なオリゴヌクレオチド４２ＫＴＨ４１（配列認識番号４３８）の配列中のエラーが示され
た。これは、テンプレートとしてのＢＡＭＶＱ入れ４４１）および４２ＫＴＨ４１Ａ（配
列認識番号４４２）
【化３４４】
による第３のＰＣＲから誘導した２７２ｂｐ断片を用いて最終ＰＣで訂正した。最終ＰＣ
Ｒ後、カセットは、ＸｈｏＩとＢａｍＨＩ部位３′を有する４２Ｋ−ＴＨ４．１に対して
ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、およびＳｍａＩ部位５′を含有した。この２７１ｂｐ ＰＣＲ誘
導断片をＢａｍＨＩで切断し、ｐＢＳ−ＳＫ＋（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）のＢ
30
ａｍＨＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＶＱ４２ＫＴＨ４．１を産生した。このプ
ラスミドのヌクレオチド配列分析により、プロモーターとコード領域の配列を正確であっ
たことが確認された。しかしながら、３ｂｐの欠損が生じ、３′ＢａｍＨＩ部位の損失と
なった。
【０９３２】
プラスミドｐＴ１Ｔ２ＴＨ４．１の構築
これらの３つのカセットを、Ｉ３Ｌ−Ｔ１が以下の方法の他の２つの遺伝子に対して反対
方向となるように特異プラスミドｐＴ１Ｔ２ＴＨ４．１に結合した：１７０ｂｐ Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ断片をｐ７３１Ｔ１から単離し、同様に切断したｐＨ６Ｔ２に連結し
、ｐＴ１Ｔ２を産生した。ｐＶＱ４２ＫＴＨ４．１からの２９０ｂｐ ＢａｍＨＩ／Ｓａ
40
ｃＩ断片を同様に切断したｐＴ１Ｔ２に連結し、ｐＴ１Ｔ２ＴＨ４．１を産生した。挿入
物の配列をヌクレオチド配列分析により確認した。
【０９３３】
ｐＣ５ＬＳＰ（実施例６６に定義した）をＥｃｏＲＩで切断し、アルカリホスファターゼ
で処理し、ＮｏｔＩで切断し線状精製して自己連結した自己アニールしたオリゴヌクレオ
チドＣＰ２９（配列認識番号３６３）
【化３４５】
に連結した。この方法によりＮｏｔＩ部位をｐＣ５ＬＳＰに導入し、ｐＮＣ５ＬＳＰ５を
50
(246)
JP 3602844 B2 2004.12.15
産生した。
【０９３４】
それぞれのプロモーターによりドライブされたエピトープの遺伝子を含有されるｐＴ１Ｔ
２ＴＨ４．１からの６０２ｂｐ ＸｈｏＩ断片を、供与体プラスミドｐＮＣ５ＬＳＰ５お
よびｐＳＤ５５０（実施例５９で定義した）のＸｈｏＩ部位にクローニングした。ヌクレ
オチド配列分析を用いて挿入物の配列と配置を確認した。産生したプラスミドｐＣ５Ｔ１
Ｔ２ＴＨ４．１およびｐＩ４Ｔ１Ｔ２ＴＨ４．１を、ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣととも
に生体外組換え実験に用いて、それぞれ組換えウイルスｖＣＰ１４６およびｖＰ１０６２
を産生した。これらの組換えウイルスは、ウイルスプラークに対する特異的ＤＮＡプロー
ブのハイブリダイゼーションにより所望の遺伝子を含有することが示された。
10
【０９３５】
実施例１０５−ＨＩＶ−１ ｅｎｖからの形質膜アンカードメイン有するものと有さない
ＨＩＶ−１ ｅｎｖのＴ１、Ｔ２、およびＴＨ４．１エピトープを含有する２つの融合ペ
プチドの発現
組換えポックスウイルスｖＰ１０６０、ｖＰ１０６１、ｖＣＰ１５４およびｖＣＰ１４８
を産生し、切断可能リンカー領域によるＨＩＶ−１ ｅｎｖのＴ１、Ｔ２、およびＴＨ４
．１に対応する配列に結合したＨＩＶ−１ ｅｎｖからのシグナル配列からなる融合ペプ
チドを発現した。ｖＰ１０６０およびｖＣＰ１５４は、ｖＰ１０６１およびｖＣＰ１４８
とは異なり、これは前者の組換えウイルスがＨＩＶ−１ ｅｎｖの形質膜領域に対応する
配列とともに融合ペプチドを発現する点からである。
20
【０９３６】
両方の融合ペプチドは、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）ｅｎｖの５１アミノ酸Ｎ末端部分、ラト
ナーら（１９８５）に基づく残留物１−５０（開始Ｍｅｔを加える）を含有する。このシ
グナル領域（配列認識番号４４３）のアミノ酸配列は、
【化３４６】
である。これには、互いにシグナルから離れたＴ１、Ｔ２、およびＴＨ４．１エピトープ
（ホスマリンら、１９９１）、および存在する場合にはアンカー配列が続き、長さで５の
アミノ酸までの切断可能リンカー領域が続く。ペプチド（配列認識番号４４４）のこの領
30
域のアミノ酸配列は、
【化３４７】
である。アンカードメインは、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）ｅｎｖの２８アミノ酸形質膜領域
、残留物６９１−７１８である。この領域（配列認識番号４４５）のアミノ酸配列は、
【化３４８】
40
である。
【０９３７】
融合ペプチドの両方のバージョンに関して、プライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号３６
４）およびＰＣＲＳＩＧＴ１（配列認識番号４４６）
【化３４９】
を用いてプラスミドｐＨ６ＨＩＩＩＢＥＭ（実施例１８で定義した）からＰＣＲによりＨ
６プロモーターおよびＨＩＶ−１ ｅｎｖシグナル配列を誘導した。この３１４ｂｐ Ｐ
50
(247)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ＣＲ誘導断片は、５′ＨｉｎｄＩＩＩ部位と続くＨ６プロモーターおよびシグナル、リン
カー、並びにＴ１ペプチドの最初の６アミノ酸のコード配列からなる。
【０９３８】
プライマーＰＣＲＴ１Ｔ２（配列認識番号４４９）
【化３５０】
およびＰＣＲＴ４ＥＮＤ（配列認識番号４５０）
【化３５１】
10
を用いてオリゴヌクレオチドＴ２Ｔ４Ａ（配列認識番号４４７）
【化３５２】
およびＴ２Ｔ４ＴＢ（配列認識番号４４８）
【化３５３】
20
のＰＣＲ増幅により、形質膜領域のない構成のコード領域の残りを産生した。この１７７
ｂｐ ＰＣＲ誘導断片は、Ｔ１ペプチド、リンカー領域、Ｔ２ペプチド、別のリンカー領
域、およびＴＨ４．１ペプチド、それに続く３′ＸｂａＩ部位をコードする。この断片を
、プライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号３６４）およびＰＣＲＴ４ＥＮＤ（配列認識番
号４５０）のＰＣＲによりプロモーターおよびシグナル配列を含有する３１４ｂｐ ＰＣ
Ｒ誘導断片と融合した。この４７３ｂｐ ＰＣＲ誘導断片のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで
の切断の後、４５５ｂｐの断片をアガロースゲルから単離し、同様に切断したｐＢＳ−Ｓ
30
Ｋに連結し、ヌクレオチド配列分析により挿入物の配列を確認した。産生したプラスミド
をｐＢＳＴ１Ｔ２ＴＨ４．１と称した。
【０９３９】
プライマーＰＣＲＴ１Ｔ２（配列認識番号４４９）およびＰＣＲＴ４ＴＭ（配列認識番号
４５１）
【化３５４】
を用いてオリゴヌクレオチド、Ｔ２Ｔ４Ａ（配列認識番号４４７）およびＴ２Ｔ４ＴＢ（
40
配列認識番号４４８）のＰＣＲ増幅により、形質膜アンカーを有するバージョンのコード
領域の残りを産生し、３′末端を改変して形質膜領域を収容した。この１９５ｂｐ ＰＣ
Ｒ誘導断片を、プライマーＰＣＲＴ１Ｔ２（配列認識番号４４９）およびＰＣＲＴＭＥＮ
Ｄ（配列認識番号４５０）を用いてアンカーからなるオリゴヌクレオチド、ＨＩＶＴＭ１
（配列認識番号４０３）およびＨＩＶＴＭ２（配列認識番号４０４）のＰＣＲにより融合
した。この２７６ｂｐ ＰＣＲ誘導断片を、プライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号３６
４）およびＰＣＲＴＭＥＮＤ（配列認識番号４５０）のＰＣＲによりプロモーターおよび
シグナル配列を含有する３１４ｂｐ ＰＣＲ誘導断片と融合した。この５７２ｂｐ ＰＣ
Ｒ誘導断片のＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩでの切断後、５５４ｂｐの断片をアガロース
ゲルから単離し、同様に切断したｐＢＳに連結し、ヌクレオチド配列分析により挿入物の
50
(248)
JP 3602844 B2 2004.12.15
配列を確認した。産生したプラスミドをｐＢＳＴ１Ｔ２ＴＨ４．１Ａと称した。
【０９４０】
ｐＣ５ＬＳＰ（実施例６６に定義した）をＢａｍＨＩで切断し、アニールしたオリゴヌク
レオチドＣＰ３２（配列認識番号４０６）およびＣＰ３３（配列認識番号４０７）に連結
し、ｐＶＱＣ５ＬＳＰ６を産生した。ｐＶＱＣ５ＬＳＰ６をＥｃｏＲＩで切断し、アルカ
リホスファターゼで処理し、ＮｏｔＩで切断し線状精製して自己連結した自己アニールし
たオリゴヌクレオチドＣＰ２９（配列認識番号３６３）に連結した。この方法によりＮｏ
ｔＩ部位をｐＶＱＣ５ＬＳＰ６に導入し、ｐＮＶＱＣ５ＬＳＰ７を産生した。
【０９４１】
両カセットを挿入プラスミドｐＮＶＱＣ５ＬＳＰ７のＸｈｏＩとＸｂａＩ部位の間にそれ
10
ぞれ配した。これらのプラスミドｐＣ５ＳＴ１Ｔ１ＴＨ４．１およびｐＣ５ＳＴ１Ｔ２Ｔ
Ｈ４．１Ａを用いて、それぞれＣ５座中にカナリヤポックスウイルス組換え体、ｖＣＰ１
４８およびｖＣＰ１５４を産生した。ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片をｐＣ５ＳＴ１Ｔ１ＴＨ
４．１およびｐＣ５ＳＴ１Ｔ２ＴＨ４．１Ａから切除し、同様に切断したｐＳＤ５５０（
実施例５９に定義した）に連結し、それぞれプラスミドｐＩ４ＳＴ１Ｔ２ＴＨ４．１およ
びｐＩ４ＳＴ１Ｔ１ＴＨ４．１Ａを産生した。これらのプラスミドをＮＹＶＡＣのＩ４座
のＩＶＲに用いて、それぞれ組換え体ｖＰ１０６１およびｖＰ１０６０を産生した。これ
らの組換え体は、ウイルスプラークに対する特異的ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーシ
ョンにより所望の遺伝子を含有することが示された。
【０９４２】
20
実施例１０６−ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ、およびＮＹＶＡＣ中のＨＩＶ−１ ｎｅｆの
発現
ＨＩＶ−１ ｎｅｆ（ＭＮ）を発現する、組換えポックスウイルスｖＰ１０８４、ｖＦＰ
１７４、およびｖＣＰ１６８を以下のように産生した：
プライマーＩ３ＰＣＲ１（配列認識番号４５２）
【化３５５】
およびＰＩ３ＮＥＦ２（配列認識番号４５３）
【化３５６】
30
を用いて、プラスミドｐＭＰＩ３ＨからＰＣＲによりＩ３Ｌプロモーターを誘導した。プ
ライマーＰＩ３ＮＥＦ１（配列認識番号４５４）
【化３５７】
およびＰＮＥＦＢＡＭ（配列認識番号４５５）
【化３５８】
40
を用いて、ｐＭＮ１．８−１０（７７９２と９５９５でのＳｓｔＩ部位の間のＭＮゲノム
のその部分のクローン）のＰＣＲ増幅により、ｎｅｆのコード領域を産生した。コード領
域とプロモーターとの融合は、プライマー（配列認識番号４５２）およびＰＮＥＦＢＡＭ
（配列認識番号４５５）を用いて、以前のＰＣＲ産生物の増幅により行なった。この産生
物のＢａｍＨＩでの切断後に、０．７ｋｂの断片をアガロースゲルから単離し、同様に切
断したｐＢＳ−ＳＫ＋（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結し、プラスミドｐＩ３
ＮＥＦを産生した。配列異常が最初に観察されたのがこの時点であった。プラスミドｐＭ
Ｎ１．８−１０における異常のために、カセットの配列は公表された配列（ガーゴら、１
50
(249)
JP 3602844 B2 2004.12.15
９８８、ゲンバンク承認番号Ｍ１７４４９）とは異なると決定した。これらの違いは、公
表された配列と比較して以下のように要約する。
【０９４３】
【化３５９】
10
カセット中の２つのサイレント突然変異（位置８８３４と９１２７で）はＰＣＲ中で明確
な誤差である。コードしたタンパク質には効果がないので、これらは存続し続けた。９９
３０でのフレームシフトにより、他のＨＩＶ−１単離体をより密接に組み立てる伸長した
読取り枠が生じる。ＮＭ単離体からのｎｅｆの公表されたサイズのままでいるには、この
カセットにはコード領域の切形３′末端を産生する第４のＰＣＲが必要である。
【０９４４】
位置９９３０での余分な塩基の除去は、プライマーＩ３ＰＣＲ１（配列認識番号４５２）
およびＰＮＥＦＦＩＸ１（配列認識番号４５６）
20
【化３６０】
によるｐＩ３ＮＥＦ中の挿入物のＰＣＲ増幅により行なった。この６７８ｂｐ ＰＣＲ誘
導断片のＢａｍＨＩでの切断後、６６０ｂｐの断片をアガロースゲルから単離して、同様
に切断したｐＢＳに連結し、プラスミドｐＢＳＩ３ＮＥＦを産生した。この挿入物をヌク
レオチド配列分析により確認した。
【０９４５】
ｎｅｆ遺伝子を含有するｐＢＳＩ３ＮＥＦからの６６０ｂｐ ＢａｍＨＩ断片を、挿入プ
30
ラスミドｐＮＶＱＣ５ＬＳＰ７（実施例１０５で定義した）のＢａｍＨＩ部位に配した。
産生したプラスミドｐＣ５Ｉ３ＮＥＦを、ＡＬＶＡＣのＣ５座へのＩＶＲに用いて、組換
え体ｖＣＰ１６８を産生した。また同一の６６０ｂｐ ＢａｍＨＩ断片を、挿入プラスミ
ドｐＳＤ５５０ＶＣ（実施例５９で定義した）のＢａｍＨＩ部位に配し、プラスミドｐＩ
４Ｉ３ＮＥＦを産生した。ＮＹＶＡＣを有するこのプラスミドに関するＩＶＲにより組換
え体ｖＰ１０８４を産生した。
【０９４６】
ＴＲＯＶＡＣのＦ１６座の挿入プラスミドを以下のように誘導した。７．３ｋｂ Ｎａｅ
Ｉ／ＮｄｅＩ断片を、タータグリアら（１９９０）により記載された鶏痘ウイルスの１０
．５ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含有するプラスミドから単離し、同様に切断したｐＵＣ
40
９に連結し、プラスミドｐＲＷ８６６を産生した。
【０９４７】
ｐＵＣ９をＰｖｕＩＩで切断し、ＥｃｏＲＩリンカーをＰｖｕＩＩ部位の間に連結し、プ
ラスミドｐＲＷ７１５を産生した。鶏痘配列を側腹に有するクローニング部位を、プライ
マーＲＷ２６４（配列認識番号４５７）
【化３６１】
およびＲＷ２６７（配列認識番号４５８）
50
(250)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【化３６２】
を有する１０．５ｋｂ断片の部分のＰＣＲ増幅により産生した。隣接した領域もまた、プ
ライマーＲＷ２６６（配列認識番号４５９）
【化３６３】
およびＲＷ２６５（配列認識番号４６０）
【化３６４】
10
を用いたＰＣＲにより増幅した。これらのＰＣＲ誘導断片を、プライマーＲＷ２６６（配
列認識番号４５９）およびＲＷ２６７（配列認識番号４５８）を用いた第３のＰＣＲによ
り融合した。産生したＰＣＲ誘導断片は、５′ＥｃｏＲＩ部位および３′ＮｄｅＩ部位を
側腹に有する鶏痘配列からなる。この断片の中央は、ＮｏｔＩ部位および６つの読取り枠
中の翻訳終止コドンを側腹に有し、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を
含有するポリクローニング領域である。初期転写終止シグナル（ユエンおよびモス、１９
８７）は３′ＮｏｔＩ部位に隣接している。ＥｃｏＲＩとＮｄｅＩで切断した、このＰＣ
20
Ｒ誘導断片を、同様に切断したｐＲＷ７１５に連結し、プラスミドｐＲＷ８６４を産生し
た。１１ｋプロモートしたｌａｃ Ｚ遺伝子を、部分的なＢａｍＨＩの切断と全体的なＰ
ｓｔＩの切断によりｐＡＭ１から切除した。この断片をクレノウポリメラーゼでブラント
エンドし、ＳｍａＩ切断したｐＲＷ８６４に連結し、ｐＲＷ８６７Ａを産生した。Ｎｏｔ
Ｉ部位が、ＦｓｐＩ部位に連結される場合に再産生されるように、ｐＲＷ８６７Ａからの
ＮｏｔＩ断片を、ｄＮＴＰの存在下でクレノウポリメラーゼでブラントエンドし、挿入が
タータグリアら（１９９０）により記載された位置１９５５に対応して行なわれるように
部分的にＦｓｐＩで切断されたｐＲＷ８６６に連結した。次いで産生したプラスミドｐＲ
Ｗ８６８をＮｏｔＩで切断し、ｌａｃ Ｚカセットを除去し、ＮｏｔＩ切断により切除さ
れたｐＲＷ８６４からの６６ｂｐ ポリリンカーに連結した。産生したプラスミドをｐＲ
30
Ｗ６７３と称した。８１ｂｐ ＳｍａＩ断片をｐＶＱ４２ＫＴＨ４．１（実施例１０４で
定義した）から誘導し、ＳｍａＩ切断したｐＲＷ８７３に挿入し、プラスミドｐＶＱ８７
３を産生した。
【０９４８】
ｎｅｆカセットを、ｐＶＱ８７３および続いてＩＶＲによるＴＲＯＶＡＣのＦ１６座への
挿入のための６８４ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてｐＢＳＩ３ＮＥＦから切除し、ｖＦ
Ｐ１７４を産生した。
【０９４９】
実施例１０７−ＮＹＶＡＣ中のＨＩＶ−２遺伝子の発現
ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ２ ｇａｇ／ｐｏｌ組換え体の産生
２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ２）ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、プラスミ
ド、ｐＩＳＳＹＥＧＰをＤｒ．Ｇ．フランチーニ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプラ
スミドからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を、Ｉ３Ｌプロモーターの下流とワクシニアウイ
ルスｔｋフランキングアームの間に挿入した。これは、ＨＩＶ２ ｇａｇおよびｐｏｌ遺
伝子を含有するｐＩＳＳＹＥＧＰの４，４４０ｂｐ ＢｓｔＵＩ−ＢｇｌＩＩ断片、およ
びＩ３Ｌプロモーターを含有するオリゴヌクレオチドＨＩＶ２Ｌ１（配列認識番号４６１
）
【化３６５】
40
(251)
JP 3602844 B2 2004.12.15
とＳＩＶＬ１（配列認識番号１８１）を、ｐＳＤ５４２（実施例３２に定義した）の４，
０７０ｂｐ ＸｈｏＩ−ＢｇｌＩＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操
作により産生したプラスミドをｐＨＩＶ２１と称する。
【０９５０】
次いで外来３′非コード配列を除去した。これは、ｐｏｌ遺伝子の３′末端を含有する２
８０ｂｐ ＢｃｌＩ−ＳｍａＩ ＰＣＲ断片をｐＨＩＶ２１の８，１００ｂｐ ＢｃｌＩ
−ＳｍａＩ断片にクローニングすることにより行なった。このＰＣＲ断片を、オリゴヌク
10
レオチド、ＨＩＶ２Ｐ２（配列認識番号４６２）
【化３６６】
およびＨＩＶ２Ｐ３（配列認識番号４６３）
【化３６７】
を有する、プラスミドｐＩＳＳＹＥＧＰから産生した。この操作により産生したプラスミ
ドをｐＨＩＶ２２と称する。
20
【０９５１】
ｐＨＩＶ２２を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに組換え実験に用
いてｖＰ１０４５を産生した。
【０９５２】
免疫沈降分析を行なって、ｖＰ１０４５が真正ＨＩＶ２ ｇａｇ遺伝子産生物を発現する
か否かを測定した。ベロ細胞単層を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．
ｉ．で親ウイルスに感染せしめたか、またはｖＰ１０４５に感染せしめた。１時間の吸着
時間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［
３ ５
Ｓ］−メチオニン（
２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）を添
加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％ ＮＰ−４０、３０ｍＭ トリス（ｐＨ７．４）、
30
３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０３％ Ｎａ Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ）
の添加と続いての細胞単層の削取りにより感染から１８時間後に細胞を収集した。
【０９５３】
ＨＩＶ２血清陽性個体から採取した血清（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ、Ｄｒ．Ｇ．
フランチーニ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た）を用いて、感染細胞からの溶解産物をＨＩＶ
２ ｇａｇ発現に関して分析した。血清をｖＰ８６６感染ベロ細胞で前吸着した。前吸着
した血清を４℃で一晩タンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーショ
ン期間後、物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通常ヒト血清とタンパク質ＡＡセ
ファロースで前浄化した溶解産物をタンパク質Ａセファロースに結合したＨＩＶ２血清陽
性での４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション期間後、試料を１
40
×緩衝液Ａで４回、２×ＬｉＣｌ２ ／尿素緩衝液で２回洗浄した。２×のラエムリ緩衝
液（１２５ｍＭ トリス（ｐＨ６．８）、４％ ＳＤＳ、２０％ グリセロール、１０％
２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により、免疫複合体から沈殿したタン
パク質を分離した。タンパク質を１０％ドリファスゲルシステム（ドリファスら、１９８
４）で分画し、固定し、フルオログラフィーのために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理し
た。
【０９５４】
ＨＩＶ２血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＰ１０４５感染細胞からＨＩＶ２ｇａｇ前駆
体タンパク質、並びに様々な中間体および熟成ｇａｇ切断タンパク質産生物を特異的に沈
殿せしめたが、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ感染細胞からはＨＩＶ２特異的タンパク質
50
(252)
JP 3602844 B2 2004.12.15
を沈殿せしめなかった。
【０９５５】
実施例１０８−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ２ ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１６０）組換
え体の産生
ＨＩＶ２ ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有するプラスミド、ｐＩＳＳＹＥＧＰをＤｒ．
Ｇ．フランチーニ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐｏ
ｌ遺伝子をＩ３Ｌプロモーターの下流とワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間
にクローニングした。これは、上述したように最初にプラスミドｐＨＩＶ２２を調製する
ことにより行なった（実施例１０７参照）。
【０９５６】
10
ｐＨＩＶ２２を治療ウイルスとしてのｖＰ９２０とともに組換え実験に用いて、ｖＰ１０
４７を産生した。
【０９５７】
上述したように、ＨＩＶ２ ｇａｇタンパク質の発現に関してｖＰ１０４７感染細胞の免
疫沈降実験を行なった。疑似感染細胞からはＨＩＶ２特異種は沈殿しなかった。しかしな
がら、ｖＰ１０４７感染細胞の溶解産物からは、ＨＩＶ２ ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タ
ンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿し
た。
【０９５８】
実施例１０９−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ２ ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１２０）組換
20
え体の産生
ＨＩＶ２ ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有するプラス
ミド、ｐＩＳＳＹＥＧＰをＤｒ．Ｇ．フランチーニ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプ
ラスミドからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をＩ３Ｌプロモーターの下流とワクシニアウイ
ルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、上述したように最初にプ
ラスミドｐＨＩＶ２２を調製することにより行なった（実施例１０７参照）。
【０９５９】
ｐＨＩＶ２２を治療ウイルスとしてのｖＰ９２２とともに組換え実験に用いて、ｖＰ１０
４４を産生した。
【０９６０】
30
上述したように、ＨＩＶ２ ｇａｇタンパク質の発現に関してｖＰ１０４４感染細胞の免
疫沈降実験を行なった。疑似感染細胞からはＨＩＶ２特異種は沈殿しなかった。しかしな
がら、ｖＰ１０４４感染細胞の溶解産物からは、ＨＩＶ２ ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タ
ンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿し
た。
【０９６１】
実施例１１０−ＡＬＶＡＣ中のＨＩＶ２遺伝子の発現
ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ２ ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１６０）組換え体の産生
プラスミド、ｐＢＳＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶはＨ６プロモートしたＨＩＶ２ ｅｎｖ（ｇｐ１
６０）遺伝子を含有する。このプラスミドからのＨ６プロモートしたｅｎｖ遺伝子をカナ
40
リヤポックスフランキングアームの間にクローニングした。これは、Ｈ６プロモートした
ｅｎｖ遺伝子を含有する、ｐＢＳＨ６ＨＩＶ３ＥＮＶの２，７００ｂｐ ＸｈｏＩ−Ｓａ
ｃＩＩ断片、およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ４（配列認識番号４６４）
【化３６８】
とＨＩＶ２Ｌ５（配列認識番号４６５）
【化３６９】
50
(253)
JP 3602844 B2 2004.12.15
を、ｐＣ６ＬのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングすることにより行なった。この
操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶ２３と称する。
【０９６２】
次いでＨＩＶ２ ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をｐＨＩＶ２３にクローニングした。これは
、Ｉ３ＬプロモートしたＨＩＶ２ ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶ２２
の４，４５０ｂｐ ＸｍａＩ−ＮｏｔＩ断片、およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ６
（配列認識番号４２３）とＨＩＶ２Ｌ７（配列認識番号４２４）を、ｐＨＩＶ２３の７，
０００ｂｐ ＸｍａＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作
により産生したプラスミドをｐＨＩＶ２５と称する。
【０９６３】
10
ｐＨＩＶ２５を治療ウイルスとしてのＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）とともに組換え実験に用い
てｖＣＰ１５３を産生した。
【０９６４】
免疫沈降分析を行なって、ｖＣＰ１５３が真正ＨＩＶ２ ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子産生
物を発現するか否かを測定した。ＣＥＦ細胞単層を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／
細胞のｍ．ｏ．ｉ．で親ウイルスに感染せしめたか、またはｖＣＰ１５３に感染せしめた
。１時間の吸着時間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［
３ ５
Ｓ］
−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（メチオニンを
含まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％ ＮＰ−４０、３０ｍＭ トリス（
ｐＨ７．４）、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０３％ Ｎａ Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍ
20
ｌ ＰＭＳＦ）の添加と続いての細胞単層の削取りにより感染から１８時間後に細胞を収
集した。
【０９６５】
ＨＩＶ２血清陽性個体から採取した血清（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ、Ｄｒ．Ｇ．
フランチーニ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た）を用いて、感染細胞からの溶解産物をＨＩＶ
２ ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子発現に関して分析した。血清をＣＰｐｐ感染ＣＥＦ細胞で
前吸着した。前吸着した血清を４℃で一晩タンパク質Ａセファロースに結合せしめた。こ
のインキュベーション期間後、物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通常ヒト血清
とタンパク質ＡＡセファロースで前浄化した溶解産物をタンパク質Ａセファロースに結合
したＨＩＶ２血清陽性での４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーショ
30
ン期間後、試料を１×緩衝液Ａで４回、２×ＬｉＣｌ２ ／尿素緩衝液で２回洗浄した。
２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭ トリス（ｐＨ６．８）、４％ ＳＤＳ、２０％ グ
リセロール、１０％ ２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により、免疫複
合体から沈殿したタンパク質を分離した。タンパク質を１０％ドリファスゲルシステム（
ドリファスら、１９８４）で分画し、固定し、フルオログラフィーのために１ＭのＮａ−
サリチル酸塩で処理した。
【０９６６】
ＨＩＶ２血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＣＰ１５３感染細胞からＨＩＶ２ｅｎｖおよ
びｇａｇ前駆体タンパク質、並びに様々な中間体および熟成ｇａｇ切断タンパク質産生物
を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＣＰｐｐ感染細胞からはＨＩＶ２特異的
40
タンパク質を沈殿せしめなかった。
【０９６７】
実施例１１１−ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ ｅｎｖ（ｇｐ１２０−ｇｐ２８）およびｇａｇ（プ
ロテアーゼ
− ）組換え体のＮＹＶＡＣ産生におけるＳＩＶ 遺伝子の発現
免疫沈降分析を行なって、ｖＰ９４８（実施例２１で定義した）が真正ＳＩＶｇａｇおよ
びｅｎｖ遺伝子産生物を発現するか否かを測定した。ベロ細胞単層を、疑似感染せしめた
か、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．で親ウイルスに感染せしめたか、またはｖＰ９４８
に感染せしめた。１時間の吸着時間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清お
よび［
３ ５
Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地
（メチオニンを含まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％ ＮＰ−４０、３０
50
(254)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ｍＭ トリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０３％ Ｎａ Ａｚｉｄｅおよび
０．６ｍｇ／ｍｌＰＭＳＦ）の添加と続いての細胞単層の削取りにより感染から１８時間
後に細胞を収集した。
【０９６８】
ＳＩＶ血清陽性マカク（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ、Ｄｒ．Ｇ．フランチーニ（Ｎ
ＣＩ−ＮＩＨ）から得た）を用いて、感染細胞からの溶解産物をＳＩＶｇａｇおよびｅｎ
ｖ前駆体発現に関して分析した。血清をｖＰ８６６´ＮＹＶＡＣ）感染ベロ細胞で前吸着
した。前吸着した血清を４℃で一晩タンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このイン
キュベーション期間後、物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通常ヒト血清とタン
パク質ＡＡセファロースで前浄化した溶解産物をタンパク質Ａセファロースに結合したＳ
10
ＩＶ血清陽性マカクでの４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション
期間後、試料を１×緩衝液Ａで４回、２×ＬｉＣｌ２ ／尿素緩衝液で２回洗浄した。２
×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭ トリス（ｐＨ６．８）、４％ ＳＤＳ、２０％ グリ
セロール、１０％ ２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により、免疫複合
体から沈殿したタンパク質を分離した。タンパク質を１０％ドリファスゲルシステム（ド
リファスら、１９８４）で分画し、固定し、フルオログラフィーのために１ＭのＮａ−サ
リチル酸塩で処理した。
【０９６９】
ＳＩＶ血清陽性個体からのカマクは、ｖＰ９４８感染細胞からはＳＩＶ ｇａｇ前駆体タ
ンパク質およびエンベロープ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞から
20
はＳＩＶ特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
【０９７０】
実施例１１２−ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌ組換え体の産生
ＳＩＶＭＡＣ１４２ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミド、ｐＳＩＶＧＡＧＳＳ１１ＧをＤ
ｒ．Ｇ．フランチーニ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよび
ｐｏｌ遺伝子をＩ３Ｌプロモーターの下流およびワクシニアウイルスｔｋフランキングア
ームの間にクローニングした。これは前述したようにプラスミドｐＳＩＶＧ５を調製する
ことにより行なった（実施例２１参照）。
【０９７１】
次いで外来の３′非コード配列を除去した。これは、ｐｏｌ遺伝子の３′末端を含有する
30
、１，０００ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＨｐａＩ ＰＣＲ断片を、ｐＳＩＶＧ１の７，４００ｂ
ｐ 部分的ＢａｍＨＩ−ＨｐａＩ断片にクローニングすることにより行なった。このＰＣ
Ｒ断片を、オリゴヌクレオチド、ＳＩＶＰ５（配列認識番号１８３）およびＳＯＶＰ６（
配列認識番号１８４）を有するプラスミド、ｐＳＩＶＧＡＧＳＳ１１Ｇから産生した。こ
の操作により産生したプラスミドをｐＳＩＶＧ４と称する。
【０９７２】
配列分析により、ｐＳＩＶＧ４がｐｏｌ遺伝子内に単一の塩基対欠損を含有することが分
かった。この誤差を訂正するために、ｐＳＩＶＧ１の２，３２０ｂｐＢｇｌＩＩ−Ｓｔｕ
Ｉ断片をｐＳＩＶＧ４の６，１００ｂｐ 部分的ＢｇｌＩＩ−ＳｔｕＩ断片にクローニン
グした。この操作により産生したプラスミドをｐＳＩＶＧ５と称する。
40
【０９７３】
ｐＳＩＶＧ５を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに組換え実験に用
いてｖＰ１０４２を産生した。
【０９７４】
ＳＩＶ ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に関して前述したように、ｖＰ１０４２感
染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞から
はＳＩＶ特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ１０４２感染細胞の溶解産物から
は、ｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ
切断産生物が沈殿した。
【０９７５】
50
(255)
JP 3602844 B2 2004.12.15
実施例１１３−ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１２０−ｇｐ４
１）組換え体の産生
ｐＳＩＶＧ５（実施例２１）を治療ウイルスとしてのｖＰ１０５０とともに組換え実験に
用いてｖＰ１０７１を産生した。
【０９７６】
ｖＰ１０７１感染細胞の免疫沈降実験によりＳＩＶ遺伝子の発現が示される。
【０９７７】
実施例１１４−ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１２０−ｇｐ２
８）組換え体の産生
ｐＳＩＶＧ５（実施例２１）を治療ウイルスとしてのｖＰ８７４とともに組換え実験に用
10
いてｖＰ９４３を産生した。ＳＩＶ ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関し
て、前述したようにｖＰ９４３感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞か
らはＳＩＶ特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９４３感染細胞からは、ｅｎｖ
およびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａ
ｇ切断産生物が沈殿した。
【０９７８】
実施例１１５−ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ ｐ１６、ｐ２８組換え体の産生
ＳＩＶ ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、上述したようにｖＰ９４
２（実施例２１）感染細胞の免疫沈降実験を行なった。しかしながら、ｖＰ９４２感染細
胞の溶解産物からは、ｐ１６およびｐ２８に対応するタンパク質種が沈殿した。
20
【０９７９】
実施例１１６−ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ ｐ１６、ｐ２８およびｅｎｖ（ｇｐ１２０−ｇｐ２
８）組換え体の産生
ＳＩＶ ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、上述したようにｖＰ９５
２（実施例２１）感染細胞の免疫沈降実験を行なった。しかしながら、ｖＰ９５２感染細
胞の溶解産物からは、ｅｎｖ、ｐ１６およびｐ２８に対応するタンパク質種が沈殿した。
【０９８０】
実施例１１７−ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ ｅｎｖ（ｇｐ１２０−ｇｐ４１）組換え体の産生
プラスミド、ｐＳＩＶＥＭＶＣは、Ｈ６プロモートしたＳＩＶＭＡＣ１４２エンベロープ
遺伝子（生体外選択切形バージョン）を含有する。未熟終止コドンを含有するエンベロー
30
プ遺伝子の領域をｐＢＳＫ＋にクローニングした。これは、ｐＳＩＶＥＭＶＣの１，１２
０ｂｐ ＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＳＫ＋のＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニ
ングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＳＩＶ１０と称す
る。
【０９８１】
次いで上流の終止コドン、ＴＡＧを起点ＣＡＧコドンに改変した。これは、オリゴヌクレ
オチド、ＳＩＶＬ２０（配列認識番号４６６）
【化３７０】
40
およびＳＩＶＬ２１（配列認識番号４６７）
【化３７１】
を、ｐＳＩＶ１０の４，０００ｂｐ ＮｈｅＩ−ＰｐｕＭＩ断片にクローニングすること
により行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＳＩＶ１１と称する。
【０９８２】
次いで改変コドンを含有する領域をｐＳＩＶＥＭＶＣにクローニングした。これは、終止
50
(256)
JP 3602844 B2 2004.12.15
コドンを含有する、ｐＳＩＶ１１の３８０ｂｐ ＢｇｌＩＩ−ＮｈｅＩ断片をｐＳＩＶＥ
ＭＶＣの５，６００ｂｐ 部分的ＢｇｌＩＩ−ＮｋｈｅＩ断片にクローニングすることに
より行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＳＩＶ１２と称する。
【０９８３】
ｐＳＩＶ１２を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実
験に用いてｖＰ１０５０を産生した。
【０９８４】
ＳＩＶ ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、前述したようにｖＰ１０
５０感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細
胞からはＳＩＶ特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ１０５０感染細胞の溶解産
10
物からは、ｅｎｖに対応するタンパク質種が沈殿した。
【０９８５】
実施例１１８−ＡＬＶＡＣ中のＳＩＶ遺伝子の発現
ＡＬＶＡＣ／ＳＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌ組換え体の産生
ＳＩＶＭＡＣ１４２ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミド、ｐＳＩＶＧＡＧＳＳ１１Ｇは
、Ｄｒ．Ｇ．フランチーニ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプラスミドからのｇａｇお
よびｐｏｌ遺伝子を、Ｉ３Ｌプロモーターの下流とワクシニアウイルスフランキングアー
ムの間にクローニングした。これは、前述したように最初にプラスミドｐＳＩＶＧ５を調
製することにより行なった（実施例２１参照）。
【０９８６】
20
次いでｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子をカナリヤポックスフランキングアームの間にクローニング
した。Ｉ３Ｌプロモートしたｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＳＩＶＧ５の４，５０
０ｂｐ ＳｍａＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＣ５Ｌ（実施例４４で定義した）のＳｍａＩ−Ｎｏ
ｔＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドを
ｐＳＩＶＧＣ１３と称する。
【０９８７】
ｐＳＩＶＧＣ１３を治療ウイルスとしてのＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）とともに組換え実験に
用いてｖＣＰ１７２を産生した。
【０９８８】
ｖＣＰ１７２感染細胞の免疫沈降実験によりＳＩＶ遺伝子の発現が示される。
30
【０９８９】
実施例１１９−狂犬病糖タンパク質を発現するカナリヤポックスを用いてヒトの免疫（Ａ
ＬＶＡＣ−ＲＧ；ｖＣＰ６５）
実施例１５および第１７図に記載したように、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ＶＣＰ６５）を産生し
た。拡張とワクチン製造のために、特定病原体感染防止条件卵から誘導した初代ＣＥＦに
おいてＡＬＶＡＣ−ＥＧ（ｖＣＰ６５）を増殖させた。０．０１の多重度で細胞を感染せ
しめ、３７℃で３日間インキュベーションした。
【０９９０】
感染細胞の血清不含有培地中の超音波分裂により、ワクチンウイルス懸濁液を得た；次い
で細胞デブリを遠心分離と濾過により除去した。産生した浄化懸濁液に、１回の投与量の
40
ガラスびんに分配され凍結乾燥せしめられた凍結乾燥安定剤（アミノ酸の混合物）を補給
した。凍結乾燥の前に、血清不含有培地と凍結乾燥安定剤の混合物中のウイルス懸濁液を
連続の１０倍希釈により、力価を減少させる３つのバッチを調製した。
【０９９１】
細胞基質、培地およびウイルス種並びに、外来剤の探求と研究所のげっ歯動物の無害性に
重点を置いた最終産生物に品質管理試験を施した。所望の特徴は見られなかった。
【０９９２】
前臨床データ
生体外研究により、ＶＥＲＯまたはＭＲＣ−５細胞はＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の
増殖を指示しないこと；一連の８（ＶＥＲＯ）および１０（ＭＲＣ）ブラインド血清継代
50
(257)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ではこれらの非アビアン系において増殖するウイルスの適応は検出可能とはならなかった
ことが示された。ヒト細胞株の分析（ＭＣＲ−５、ＷＩＳＨ デトロイト５３２、ＨＥＬ
、ＨＮＫまたはＥＢＣ転換リンパ球幼若化ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５））は、これら
の細胞中で複製のブロックがＤＮＡ合成の前に生じることを示唆するウイルス特異的ＤＮ
Ａの蓄積を示さなかった。しかしながら、試験した全ての細胞株の狂犬病ウイルス糖タン
パク質遺伝子の発現は、カナリヤポックス複製サイクルの不完全工程がウイルスＤＮＡ複
製の前に生じることを明らかに示している。
【０９９３】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の安全性および効能を動物の一連の実験に報告した。カ
ナリヤ、鶏、アヒル、ガチョウ、研究所のげっ歯動物（乳獣と成長したマウス）、ハムス
10
ター、モルモット、ウサギ、ネコおよびイヌ、リスサル、アカゲサルマカク、およびチン
パンジーを含む多くの種に１０
５ から１０
８ ｐｆｕの範囲の投与量で接種した。様々
な経路を用いたが、通常は皮下、筋内および皮内であるが、または口頭（サルとマウス）
および大脳内（マウス）もまた用いた。
【０９９４】
カナリヤにおいて、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）は、病気または死の徴候を示さず乱
切の部位で「生着」外傷を生じた。ウサギの皮内接種は、広がらず７日から１０日で直っ
た典型的なポックスウイルス接種反応となった。どの動物試験においても、カナリヤポッ
クスのための副作用は生じなかった。急速蛍光焦点阻害試験（Ｒａｐｉｄ Ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｔ Ｆｏｃｕｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ；ＲＦＦＩＴ）により測定し
20
たように、げっ歯動物、イヌ、ネコ、および霊長目動物へのＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６
５）の接種後、抗狂犬病抗体の発達により、免疫抗原性を証明した。また、ＡＬＶＡＣ−
ＲＧ（ｖＣＰ６５）で免疫したマウス、イヌ、およびネコにおける狂犬病ウイルス抗原投
与実験により防御を証明した。
【０９９５】
志願者
狂犬病免疫の前歴のない２０−４５才の２５人の大人を登録した。志願者の健康状態を、
完全な医学経歴、物理試験、血液学的および血液化学分析により評価した。除外基準は、
妊娠、アレルギー、あらゆる種類の免疫低下、慢性衰弱病、癌、過去３か月の免疫グロブ
リンの注射、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはＢ型肝炎ウイルス表面抗原に
30
対する血清陽性を含んだ。
【０９９６】
研究設計
標準ディプロイド細胞狂犬病ワクチン（ＨＤＣ）バッチＥ０７５１番（フランス、リヨン
、パスチュアーメリクス血清＆ワクチン）または研究ワクチンＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ
６５）のいずれかを接種するように、参加者を任意に分配した。
【０９９７】
その試みを投与量段階的拡大研究と称した。実験ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の３つ
のバッチを、各段階の間が２週間の間隔で、志願者の３つの群（Ａ、Ｂ、およびＣ群）に
連続的に使用した。３つのバッチの濃度は、投与量当たり、それぞれ１０
４ ． ５ 、１０
５ ． ５ ３ ． ５ 、１０
40
組織培養感染投与量（ＴＣＩＤ５０）であった。
【０９９８】
各志願者に、４週間の間隔で三角領域に皮内に同一のワクチンを２回接種した。注射した
ワクチンの性質は、最初の注射のときには参加者には知られていないが、試験者は知って
いた。
【０９９９】
２回目の注射の時に即座の超感受性の危険を最小限にするために、中間投与量の実験ワク
チンを分配したＢ群の志願者に、１時間前に低い投与量を注射し、高い投与量（Ｃ群）を
分配した志願者には、１時間の間隔で低い投与量と中間の投与量を連続して接種した。
【１０００】
50
(258)
JP 3602844 B2 2004.12.15
６か月後、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）（Ｃ群）とＨＤＣワクチンの最高の投与量を
接種した者は、３回目のワクチン投与を受けた；次いでその参加者には前と同一のワクチ
ンたまは改変ワクチンのいずれかを任意に接種した。結果として、以下の免疫計画に対応
して、４つの群を形成した：１．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＨＤＣ；２．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＡＬＶ
ＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）；３．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（
ｖＣＰ６５）−ＨＤＣ；４．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣ
Ｐ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）。
【１００１】
副作用の監視
注射後１時間に亘り全ての被実験者を監視し、次の５日間毎日再検査した。被実験者は、
10
次の３週間に亘り局部的および全身的反応を記録するように求められ、週に２回電話で質
問された。
【１００２】
研究所の研究者
登録の前と、各注射の２、４、および６日後に血液を採取した。分析は、完全血球細胞算
定、肝臓酵素およびクレアチニンキナーゼアッセイを含んだ。
【１００３】
抗体アッセイ
最初の注射の７日前と、研究の７、２８、３５、５６、１７３、１８７、および２０８日
後に、抗体アッセイを行なった。
20
【１００４】
急速蛍光焦点抑制試験（ＲＦＦＩＴ）（スミス＆イエーガー、狂犬病の研究所技術）を用
いて、狂犬病に対する中和抗体の水準を測定した。直接ＥＬＩＳＡによりカナリヤポック
ス抗体を測定した。抗原である、０．１％のトリトンＸ１００により分断された精製カナ
リヤポックスウイルスの懸濁液をマイクロ板に被膜した。固定化した血清の希釈物を室温
で２時間反応せしめ、反応抗体は抗ヒトＩｇＧヤギ血清を標識したとが示された。結果を
４９０ｍｎでの光学密度リードとして示した。
【１００５】
分析
２５人の対象を登録し、研究を完了した。この対象は、１０人の男性と１５人の女性であ
30
り、平均年齢は３１．９（２１から４８）才であった。３人を除いた全ての対象は、前の
天然痘ワクチン接種の形跡があった；残りの３人は典型的な跡およびワクチン接種の経歴
がなかった。３人の対象に、低い投与量（１０
３ ． ５ ）の実験ワクチンを投与し、９人の対象には１０
および１０
５ ． ５ ４ ． ５ ＴＣＩＤ５０
ＴＣＩＤ５０を投与し、１０人
の対象にＨＤＣワクチンを投与した。
【１００６】
安全性（表４９）
最初の一連の免疫中、注射から２４時間以内に、１人のＨＤＣ接種者（３７．８℃）およ
び１人のｖＣＰ６５ １０
５ ． ５ ＴＣＩＤ５０接種者（３８℃）では３７．７℃より高
い熱が測定された。ワクチン接種に帰する他の全身的な反応はどの参加者にも見られなか
40
った。
【１００７】
皮内にＨＤＣを注射した接種者の９／１０と、それぞれｖＣＰ６５ １０
４ ． ５ 、１０
５ ． ５ ３ ． ５ 、１０
ＴＣＩＤ５０の接種者の０／３、１／３および９／９に局部的な
反応が見られた。
【１００８】
テンダネス（ｔｅｎｄｅｒｎｅｓｓ）が最も一般的な症状であり、通常は軽かった。他の
局部的な症状は、赤味（ｒｅｄｎｅｓｓ）および軽く一時的な硬化（ｉｎｄｕｒａｔｉｏ
ｎ）を含んだ。全ての症状は、通常２４時間以内にやわらぎ、７２以上は持続しなかった
。
50
(259)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【１００９】
血球細胞算定、肝臓酵素またはクレアチニンキナーゼ値には、著しい変化はなかった。
【１０１０】
免疫応答；狂犬病に対する中和抗体（表５０）
最初の注射から２８日後、全てのＨＤＣ接種者が防御力価（≧０．５ＩＵ／ｍｌ）を有し
た。これに対して、ＡおよびＢ群（１０
誰もその値に達せず、Ｃ群（１０
３ ． ５ ５ ． ５ および１０
４ ． ５ ＴＣＩＤ５０）では
ＴＣＩＤ５０）における２／９のＡＬＶＡＣ−
ＲＧ（ｖＣＰ６５）接種者のみがこの防御力価に達した。
【１０１１】
５６日目に（すなわち、２回目の接種から２８日後）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）
10
ワクチンの接種者のＡ群の０／３、Ｂ群の２／３およびＣ群の９／９において、防御力価
が達成され、１０人のＨＤＣ接種者全てに保持された。
【１０１２】
５６日での幾何学的平均力価は、Ａ、Ｂ、ＣおよびＨＤＣ群においてそれぞれ０．０５、
０．４７、４．４および１１．５ ＩＵ／ｍｌであった。１８０日目には、狂犬病抗体力
価は全ての対象において実質的に減少したが、５／１０のＨＣＤ接種者と５／９のＡＬＶ
ＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ５６）接種者においては０．５ＩＵ／ｍｌの最小防御力価より上の値
を保持した；ＨＣＤおよびＣ群における幾何学平均力価は、それぞれ０．５１および０．
４５ ＩＵ／ｍｌであった。
【１０１３】
20
カナリヤポックスウイルスに対する抗体（表５１）
高い力価を有するそれらの対象におけるカナリヤ鳥との前の接触の欠如にもかかわらず、
観察された前免疫力価は、０．２２から１．２３ Ｏ．Ｄ．単位に変化する力価とともに
大きく変化した。前免疫と２回目の注射力価の間で２倍より大きい増加と定義した場合、
血清転化はＢ群の１／３およびＣ群の９／９に達成されたが、ＡまたはＨＤＣ群において
は血清転化された対象はいなかった。
【１０１４】
追加抗原投与注射
追加抗原投与注射のときに、ワクチンは６か月後に同様に良好に耐性があった：２／９の
ＨＤＣ追加抗原投与接種者および１／１０のＡＬＶＡＣ／ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加抗原投
30
与接種者が熱を生じた。５／９のＨＤＣ追加抗原投与接種者と６／１０のＡＬＶＡＣ−Ｒ
Ｇ（ｖＣＰ６５）追加抗原投与接種者には、局部的反応が存在した。
【１０１５】
観察
第３５図は、狂犬病中和抗体力価のグラフを示すものである（急速蛍光焦点抑制試験また
はＲＦＦＩＴ、ＩＵ／ｍｌ）：同一または改変ワクチンのいずれかで以前に免疫した志願
者におけるＨＤＣおよびｖＣＰ６５（１０
５ ． ５ ＴＣＩＤ５０）の追加抗原投与効果。
ワクチンは０、２８および１８０日に与えた。抗体力価は、０、７、２８、３５、５６、
１７３、および１８７と２０８日に測定した。
【１０１６】
40
第３５図に示すように、与えられた追加抗原投与量により、どのような免疫計画の対象全
てにおいても、狂犬病抗体力価がさらに増大することとなった。しかしながら、ＡＬＶＡ
Ｃ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加抗原投与は全体的に、ＨＤＣ追加抗原投与およびＡＬＶＡＣ
−ＲＧ（ｖＣＰ６５）より低い免疫応答を誘発し、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−Ａ
ＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）群は他の３つの群よりも著しく低い力価を有した。同様に
、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加抗原投与注射により、３／５の以前にＨＤＣワク
チンを接種した対象、および以前にＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）で免疫した５人全て
の対象において、カナリヤポックス抗体力価の増大となった。
【１０１７】
一般的に、ｖＣＰ６５の投与からの局部的などの副作用も、ウイルスの局部的な複製を示
50
(260)
JP 3602844 B2 2004.12.15
さなかった。特に、ワクチンの注射後に観察されたような皮膚の外傷はなかった。ウイル
スの複製の明確な欠如にもかかわらず、注射により志願者に、カナリヤポックスベクター
および発現された狂犬病糖タンパク質の両方に対する著しい量の抗体を産生させた。
【１０１８】
マウスにおける血清中和化試験と良好に相関することが知られている急速蛍光焦点抑制試
験（ＲＦＦＩＴ）により、狂犬病中和抗体をアッセイした。１０
５ ． ５ ＴＣＩＤ５０の
９人の接種者のうち、５人は最初の投与の後に低水準の応答を有した。試験した最高投与
量の接種者全て、および中間の投与量の３人のうち２人の接種者において、２回目の注射
後には、狂犬病抗体の防御力価が得られた。この研究において、両方のワクチンは、生ワ
クチンに通常推奨されているが、不活化ＨＤＣワクチンに推奨されない皮内に与えられた
10
。注射のこの経路は、注射部位の注意深い実験となるように選択されたが、これは、ＨＤ
Ｃ接種者における抗体の遅い発生となる：実際、どのＨＤＣ接種者も７日目荷は抗体の増
加とはならず、一方ＨＤＣワクチンが筋内に与えられる研究のほとんどの場合、対象の著
しい比率が抗体を増加させる（クレイトマンら、Ｉｎｔ′ｌ グリーンクロス−ジェネバ
、１９８１；クワートら、Ｉｎｔ′ｌ グリーンクロス−ジェネバ、１９９１）。しかし
ながら、本発明は必ずしも皮下経路の接種に限られたものではない。
【１０１９】
狂犬病中和抗体のＧＭＴ（幾何学的平均力価）は、ＨＤＣ対照ワクチンによるものよりも
、本発明のワクチンによるもののほうが低いが、防御に要する最小力価よりはまだ十分に
高い。本研究に用いた３回の投与により得られた明確な投与量効果応答は、より高い投与
20
量はより強い応答を誘発することを示唆する。この開示から、当業者は所定の患者に適切
な投与量を選択することができる。
【１０２０】
抗体応答を増加せしめる能力はこの実施例の別の重要な結果である；実際、狂犬病抗体力
価の増大は、免疫計画がどのようなものであろうとも、投与から６か月後に全ての対照に
達成され、カナリヤポックスベクターまたは狂犬病糖タンパク質のいずれかにより誘発さ
れた前から存在する免疫性が、組換えワクチン候補または従来のＨＤＣ狂犬病ワクチンで
の追加免疫への遮断効果を有さないことが示された。これは、免疫応答が前から存在する
免疫性により遮断されるというヒトのワクシニア組換え体に関する他者の発見と対照的で
ある（コーニーら、ランセット１９９１、３３７：５６７−７２；エトリンガーら、ワク
チン１９９１、９：４７０−７２）。
【１０２１】
それゆえ、この実施例は明確に、非複製ポックスウイルスは、複製剤が免疫応答に与える
全ての長所を有するが、完全許容ウイルスにより生じた安全性問題なく、ヒトにおいて免
疫ベクターとして機能できることを示している。
【１０２２】
【表４９】
30
(261)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【表５０】
10
(262)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
【表５１】
50
(263)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
実施例１２０−ＮＹＶＡＣ−ＪＥＶ組換え体（ｖＰ９０８、ｖＰ９２３）による日本脳炎
ウイルスに対する防御
ＮＹＶＡＣ−ＪＥＶ組換え体を用いて、日本脳炎ウイルスに対する防御を提供した。ＮＹ
ＶＡＣ ｖＰ８６６、ＮＹＶＡＣ組換え体ｖＰ９０８とｖＰ９２３、およびワクシニア組
20
換え体ｖＰ５５５とｖＰ８２９をここに記載したように産生した。
【１０２３】
マウス防御実験
マウス防御実験を前述したように行なった（メイソンら、１９９１）。手短にいうと、生
後４週間の非近交スイスマウスの１０から１２匹の群を、１０
７ ＰＦＵのｖＰ８２９、
ｖＰ８６６、ｖＰ９０８またはｖＰ９２３で腹腔（ｉ．ｐ．）注射により免疫し、血清を
３週間後に採取した。マウスに、ＪＥＶのベイジン（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｐ３菌株をｉ．ｐ
．注射により抗原投与した。抗原投与後、３週間後に実験が完了するまで毎日観察した。
実験動物の同腹子を用いて致死量滴定を行なった。
【１０２４】
30
ブタの防御実験
約２５ｋｇの体重のランドレース交雑去勢ブタを用いた。５匹のブタの群を、食塩加リン
酸緩衝液（ＰＢＳ）、または２ｍｌのＰＢＳで希釈された１×１０
８ ＰＦＵのｖＰ８６
６、ｖＰ９０８またはｖＰ９２３で皮下（ｓ．ｃ．）注射により免疫した。接種から２８
日後、上述したのと同じ方法で注射により追加抗原投与し、最初の接種から５６日後に、
２×１０
５ ＰＦＵのＪＥＶのＢ−２３５８／８４菌株をｓ．ｃ．注射により抗原投与し
た。０（免疫前）、７、１４、２８（追加抗原投与前）、３１、３５、４２、５６（抗原
投与前）、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４および７６（抗原投与後）
日に、全ての群の動物から血清を採取した。
【１０２５】
40
免疫応答の評価
抗ブタイムノグロブリン（Ｉｇ）Ｇで被膜した固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕ
ｒｅｕｓ細菌（カリフォルニア、カーピンテリア、ダコー社）を使用したことを除いては
、ボニシら（１９９１）に記載されているように、［
３ ５
Ｓ］Ｍｅｔ−標識ＪＥＶ感染細
胞から得た培養液または洗浄剤処理細胞溶解産物から、ＪＥＶタンパク質を沈殿せしめる
能力に関して、ブタの血清を検定した。クラーケおよびカサルス（１９５８）の方法の修
正方法により、ブタとマウスの前抗原投与血清のＨＡＩ検定を行なった。ブタの血清を検
定するのに新鮮に解凍したヒトの血清を使用しなかったことを除いては、実質的にメイソ
ンら（１９９１）に記載されたように、ＮＥＵＴ検定を行なった。
【１０２６】
50
(264)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ウイルス血症
ＪＥＶ抗原投与から８日後に採取した脊椎血清の新鮮に解凍したアリコートを、６ウェル
マイクロ板中のＶＥＲＯ単層細胞上の感染ＪＥＶに関してプラーク滴定した。ウイルス吸
着後、細胞単層に、１％のカルボキシメチルセルロースを含有する培地を添加し、２０％
エタノール中に溶解せしめた０．１％のクリスタル紫の染色により感染から５日後にプラ
ークを視覚化した。３つ以下のプラークが３００μｌの血清でインキュベーションしたウ
ェル中に観察された場合には、力価は＜１０ＰＦＵ／ｍｌと記録した。
【１０２７】
組換えワクシニアウイルスの構造
本研究において構築したワクシニア組換え体に含有されたＪＥＶ ｃＤＮＡ配列を第３６
10
図に示す。これらの組換えウイルスにおいて、ＪＥＶ ｃＤＮＡの血清ストランドを初期
／晩期Ｈ６プロモーターの後ろに配した。組換え体ｖＰ９０８（およびｖＰ５５５；メイ
ソンら、１９９１）は、ｐｒＭ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１およびＮＳ２ＡのＮ末端に選考する
推定１５アミノ酸シグナル配列を含有する。組換え体ｖＰ９２３（およびｖＰ８２８；コ
ニシら、１９９１）は、ｐｒＭ、ｐｒＭ、およびＥの推定シグナル配列をコードする。
【１０２８】
組換えワクシニアウイルスによるＥおよびＮＳ１の合成
ＥまたはＮＳ１遺伝子の免疫沈降を、ＥまたはＮＳ１に特異的な単クローン性抗体を用い
て行なった。ｖＰ５５５、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３に感染した細胞中でＥ ＭＡｂに
反応性のあるタンパク質を合成し、ｖＰ９２３に感染した細胞中ではなくｖＰ５５５およ
20
びｖＰ９０８に感染した細胞中で、ＮＳ１ ＭＡｂに反応性のあるタンパク質を合成した
。ｖＰ５５５感染細胞は、細胞の内側と外側でＥおよびＮＳ１の正確な形状を産生した。
ｖＰ９０８およびｖＰ９２３により産生されたタンパク質は、ｖＰ５５５により産生され
たタンパク質のサイズと等しかった。ＥおよびＮＳ１に関して、細胞外形状は、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ中の細胞内形状より遅く移動し、これは、細胞からの放出に直ちに先行するＮ連
結グリカンの成熟と一致する。加えて、ｖＰ９０８感染細胞は、ＮＳ１、ＮＳ１′の高分
子量形状を産生し、これはＪＥＶゲノムのＮＳ２Ａ領域によりコードされた配列のプロセ
シングにより誘導される（メイソンら、１９８７）。Ｍ（およびｐｒＭ）に特異的なＭＡ
ｂを用いて放射線標識ワクシニア組換え体感染細胞から調製した免疫沈殿物（ｉｍｍｕｎ
ｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｓ）により、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３に感染した細胞中で
30
ｐｒＭが合成されたことが分かった。
【１０２９】
ｖＰ９０８およびｖＰ９２３感染ＨｅＬａ細胞の細胞外液体は、ｖＰ８６６感染細胞の培
養液中では検出不可能なＨＡ活性を示した。データにより、ｖＰ８２９はｖＰ５５５より
も約８倍多い細胞外血球凝集素の合成を誘発したことが分かった。その差異に対応して、
ｖＰ９２３に感染した細胞は、ｖＰ９０８に感染した細胞よりも約８倍のＨＡ活性を産生
した。これらの結果により、ｖＰ９８０およびｖＰ９２３により産生されたＪＥＶタンパ
ク質の組換え体形状は、それぞれｖＰ５５５およびｖＰ８２９により産生されたものと等
しいことが示された。
【１０３０】
40
マウスの免疫および抗原投与
ＮＹＶＡＣベースの組換えウイルスの防御免疫を誘発する能力をマウスで実験した。前抗
原投与血清のＮＥＵＴおよびＨＡＩデータにより、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３は、ｖＰ
８２９と同水準の抗体を産生した（コニシら、１９９１）（表５２）。これらの血清学的
データと一致して、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３は、ＪＥＶの病原体Ｐ３菌株による致死
量ＪＥＶ感染からの防御をマウスに提供することができた（表５２）。防御の水準は、ｖ
Ｐ８２９での免疫により達成された水準と同様であった（表５２）（コニシら、１９９１
）。これらの研究により、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３の２つのＮＹＶＡＣベースの組換
え体は、前述した水準（コニシら、１９９１）と同様の水準でマウスに免疫原性であった
ことが確認された。
50
(265)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【１０３１】
組換えワクシニアウイルスによるブタのＪＥＶ抗原に対する免疫応答の導入
７日ごとに収集した各群の全てのブタから採取した前抗原投与血清を、抗ＪＥＶ ＮＥＵ
ＴおよびＨＡＩ活性に関して検定した。第３７図に示すように、ｖＰ９０８およびｖＰ９
２３で免疫したブタ中にはＮＥＵＴとＨＡＩ活性の両者が観察されたが、ＰＢＳまたはｖ
Ｐ８６６を接種したブタには観察されなかった。ｖＰ９０８およびｖＰ９２３免疫ブタの
両者には、１回目と２回目の接種から７日後に比較的高水準のＮＥＵＴ抗体が観察された
が、２１日後にわずかに検出可能な水準まで減少した。第１の接種と追加抗原投与の両方
に関して、ＨＡＩは、ＮＥＵＴ抗体よりもゆっくりと減少した（第３７図）。ｖＰ９０８
は、ｖＰ９２３よりもやや高い水準のＨＡＩおよびＮＥＵＴ抗体を提供した。両方の組換
10
え体のＨＡＩ力価は、１回の接種後に達成されたものよりも、２回目の接種後に達成され
たほうが大きかった。ｖＰ９２３は、１回の接種よりも２回目の接種後のほうが高いＮＥ
ＵＴ力価を提供し、一方ｖＰ９０８は、１回または２回目の接種後には等量のＮＥＵＴ力
価を誘発した。
【１０３２】
ブタを０日と２８日に免疫し、ＰＢＳまたはｖＰ８６６で免疫したブタから５６日目に血
清を採取し、ｖＰ９０８またはｖＰ９２３で免疫したブタからは０、７、２８、３５およ
び５６日目に血清を採取した。５の各群の全ての動物から採取した血清を、ＪＥＶ感染細
胞の培養液から収集した放射線標識したタンパク質を免疫沈降する能力に関して検定した
。
20
【１０３３】
Ｅに対する免疫応答は、ＮＥＵＴおよびＨＡＩ検定の結果と良好に相関性があった。ｖＰ
９２３で免疫したブタに観察された３５日目のＥに対するＲＩＰ応答は、ｖＰ９０８で免
疫したブタ中のＥに対するＲＩＰ応答よりも高かったが、３５日目のＨＡＩ力価は、２つ
の群と等しかった。しかしながら、ｖＰ９２３で免疫したブタにおける３５日目のＮＥＵ
Ｔ力価は、ｖＰ９０８で免疫したブタよりも高かった。ＮＥＵＴまたはＨＡＩに関わる抗
体以外の抗体が誘発されるが、ＲＩＰ分析の量に関する面はさらには確認できなかった。
比較的高いＮＥＵＴ抗体力価にもかかわらず、７日目にＥに対する血清の弱いＲＩＰ応答
が、免疫後の初期のＩｇＭ抗体により説明できた。ＪＥＶ特異的ＩｇＭの水準はさらには
分析しなかった。どの採取した血清もＮＳ１に対する免疫応答を示さなかった。
30
【１０３４】
組換えワクシニアウイルスで免疫したブタ中のウイルス血症
対照ブタ［ＰＢＳ（４／５）またはｖＰ８６６（５／５）］からの抗原投与後の血清中に
、＞１０ＰＦＵ／ｍｌのＪＥウイルス力価が検出され、一方ｖＰ９２３を接種した５匹の
ブタのうち２匹のみが＞１０ＰＦＵ／ｍｌのウイルス血症を示した（第３８図）。目だっ
たことには、ｖＰ９０８で免疫した５匹のブタのうちどれも、＞１０ＰＦＵ／ｍｌの測定
可能なウイルス血症を示さなかった。ＰＢＳおよびｖＰ８６６（１．２×１０
３ ＰＦＵ
／ｍｌ）で免疫した群の個々のブタの最大ウイルス力価の幾何学平均は、ｖＰ９０８およ
びｖＰ９２３（１．９×１０
１ ＰＦＵ／ｍｌ；スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０
０１；＜１０ＰＦＵ／ｍｌのウイルス血症を有する全てのブタに関して、１０ＰＦＵ／ｍ
40
ｌの力価であると推定する）で免疫した群の平均より著しく高かった。さらに、＞１０Ｐ
ＦＵ／ｍｌの細胞を示すブタのウイルス血症の平均期間は、ＰＢＳおよびｖＰ８６６に関
しては２．７日であり、＞１０ＰＦＵ／ｍｌの力価を有する２つのｖＰ９２３免疫ブタで
は２．０日であった。これらの結果により、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３の免疫は、抗原
投与後にＪＥＶウイルス血症を著しく減少したことが示される。
【１０３５】
ＪＥＶ抗原投与に対する免疫応答を評価するために、抗原投与後２０日目に硝石した個々
の血清をＪＥＶに対する抗体に関して検定した。ｖＰ９０８またはｖＰ９２３をワクチン
接種したブタは、ＰＢＳまたはｖＰ８６６を接種したブタよりも高いＥに対する応答を有
し、抗原投与前に存在したＥに対する抗体活性をＪＥＶ感染により追加抗原投与したこと
50
(266)
JP 3602844 B2 2004.12.15
が示された。組換えワクシニアウイルス中で発現されなかったＪＥＶタンパク質、ＮＳ３
およびＮＳ５に対する応答が抗原投与後の血清全ての検出され、ある水準のＪＥＶ複製が
、＜１０ＰＦＵ／ｍｌのウイルス血症を有したブタでさえも生じたことを示した。それゆ
え、ＮＳ３に対する抗原投与後の血清の反応性と血清ＪＥＶ力価により測定された感染の
欠乏との間の予期された逆数の関係は観察されなかった。これは、抗原投与後のＮＳ３に
対する採取しマウスの血清の反応性の欠乏が防御と相関するという、マウスに得られた以
前のデータと対照的である（コニシら、１９９１）。
【１０３６】
防御実験中、抗原投与から１２日後に親ワクシニア（ｖＰ８６６）群の１匹のブタが死亡
した。この動物は、抗原投与後の期間に亘り、他のブタより高い体温を示し、３日間に亘
り＞１，０００ＰＦＵのＪＥＶ血清力価を有する唯一の動物であった。検死時にサンプリ
ングした脳検体からはＪＥＶは検出されなかったけれども、ＪＥＣ感染により生じた病気
により動物は死亡した。
【１０３７】
観察
実施例は、ＮＹＶＡＣ−ＪＥＶがＪＥＶウイルス血升対する効果的な防御を提供すること
を示し；それゆえ、ＮＹＡＶＣ−ＪＥＶは有用であり、獣医用途に安全である。
【１０３８】
【表５２】
10
(267)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
実施例１２１−ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）およびＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）の評価
免疫沈降
アビアンまたは非アビアン細胞の前形成した単層に、細胞当たり１０ｐｆｕの親ＮＹＶＡ
Ｃ（ｖＰ８６６）まはＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）ウイルスを接種した。接種は、メ
チオニンを含まず、２％の透析ウシ胎仔血清を補給したＥＭＥＭ中で行なった。１時間の
インキュベーション後、接種物を除去して、培地を２０μＣｉ／ｍｌの
３ ５
Ｓ−メチオニ
ンを含有するＥＭＥＭ（メチオニンを含まない）と置き換えた。約１６時間の一晩のイン
キュベーション後、緩衝液Ａ（１％ノニデットＰ−４０、１０ｍＭ トリス ｐＨ７．４
40
、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ アジ化ナトリウム、１ｍｌ当
たり５００単位のアプロチニン、および０．０２％ フェニルメチルスルホニルフッ化物
）の添加により、細胞を溶解せしめた。ニューヨーク州、アルバニー、ニューヨーク州保
険省、グリフィス研究所、Ｄｒ．Ｃ．トリナーチにより提供された２４−３Ｆ１０と称す
る狂犬病糖タンパク質特異的単クローン性抗体、およびベーリンガーマンハイム社（ネコ
．６０５−５００）から得たラット抗マウス複合体を用いて、免疫沈降を行なった。ニュ
ージャージー州、ピスキャタウェイ、ファーマシアＬＫＢバイオテクノロジー社から得た
タンパク質ＡセファロースＣＬ−４８を、支持マトリックスとして用いた。免疫沈殿物を
、ドリファスら（１９８４）の方法にしたがって、１０％のポリアクリルアミドゲルで分
画した。ゲルを固定し、フルオログラフィーのために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で１時間
50
(268)
JP 3602844 B2 2004.12.15
処理し、コダックＸＡＲ−２フイルムに露出して免疫沈殿したタンパク質種を視覚化した
。
【１０３９】
動物の供給源
ニュージーランド白ウサギをヘアマーランド（ニュージャージー、ヘウィット）から得た
。生後３週間の雄のスイスウェブスター非近交マウス、妊娠時期の雌のスイスウェブスタ
ー非近交マウス、および生後４週間のスイスウェブスターヌード（ｎｕ
＋ ｎｕ
＋ ）マ
ウスをタコニックファーム社（ニューヨーク、ジャーマンタウン）から得た。ＮＩＨガイ
ドラインにしたがって、全ての動物を保持した。全ての動物のプロトコルは、ＩＡＣＵＣ
協会により認可された。必要と思われる場合、明らかに末期の病気であるマウスを安楽死
10
させた。
【１０４０】
ウサギの病害の評価
２匹のウサギのそれぞれに、様々な部位に、１０
または１０
８ ４ 、１０
５ 、１０
６ 、１０
７ 、
ｐｆｕの各試験ウイルスを含有する０．１ｍｌのＰＢＳまたＰＢＳ単体を
皮内に接種した。病害が解決されるまで、４日目から毎日ウサギを観察した。硬結および
潰瘍を測定し、記録した。
【１０４１】
接種部位からのウイルスの回収
１匹のウサギに、様々な部位に、１０
６ 、１０
７ 、または１０
８ ｐｆｕの各試験ウ
20
イルスを含有する０．１ｍｌのＰＢＳまたＰＢＳ単体を皮内に接種した。１１日後、ウサ
ギを安楽死させ、ウイルス回収のために機械的な分断と間接超音波処理により、各接種部
位から採取した皮膚の生検材料を無菌の状態に調製した。ＣＥＦ単層のプラーク滴定によ
り感染ウイルスをアッセイした。
【１０４２】
マウスの毒性
１０匹のマウスの群または５匹のヌードマウスの群に、０．５ｍｌの無菌ＰＢＳ中のウイ
ルスのいくつかの希釈の１つをｉｐにより接種した。実施例２４を参照のこと。
【１０４３】
シクロホスファミド（ＣＹ）処理
30
ｉｐ経路により、２日前に４ｍｌ（０．２ｍｌ）のＣＹ（シグマ）をマウスに注射し、０
日にウイルスを注射した。感染から以下の日に、マウスにＣＹをｉｐにより注射した：１
日目に４ｍｇ；４、７および１１日に２ｍｇ；１４、１８、２１、２５および２８日に３
ｍｇ。１１日目にカルターカウンターで白血球を数えることにより免疫抑制を間接的にモ
ニタした。平均の白血球数は、未処理マウスでは１μｌ当たり１３，５００細胞（ｎ＝４
）であり、ＣＹ処理対照マウスでは１μｌ当たり４，２２０細胞（ｎ＝５）であった。
【１０４４】
ＬＤ５０の計算
５０％の死亡率（ＬＤ５０）となるのに必要な致死量を、リードおよびミュンヒ（リード
およびミュンヒ、１９３８）の比率方法により測定した。
40
【１０４５】
マウスのＮＹＶＡＣ−ＲＧの効能検定
生後４から６週間のマウスには、５０から１００μｌの希釈範囲（２．０−８．０ ｌｏ
ｇ１０組織培養感染投与量５０％（ＴＣＩＤ５０））のＶＶ−ＲＧ（キーニーら、１９８
４）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（テイラーら、１９９１ｂ）、またはＮＹＶＡＣ−ＲＧのいずれ
かをフットパッドで接種した。各群は８匹のマウスからなる。ワクチン接種から１４日後
、頭蓋内接種により、１５ＬＤ５０の狂犬病ウイルスＣＶＳ菌株（０．０３ｍｌ）をマウ
スに抗原投与した。２８日目に、生存したマウスを数え、防御投与量５０％（ＰＤ５０）
を計算した。
【１０４６】
50
(269)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）の誘導
コペンハーゲンワクチン菌株のプラーククローン単離体である、ＶＣ−２から、ワクシニ
アウイルスのＮＹＶＡＣ菌株を産生した。ＶＣ−２からＮＹＶＡＣを産生するために、毒
性に関連する多くのウイルス機能を含む、１８のワクシニアＯＲＦは、この開示の最初の
ほうに記載したような一連の配列操作で正確に欠損せしめた。新たな望ましくない読取り
枠の状況を避けるために設計した方法で、これらの欠損を構築した。第３９図は、ＮＹＶ
ＡＣを産生するために欠損したＯＲＦを模式的に描いたものである。第３９図の上部には
、ワクシニアウイルスゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ制限地図（ＶＣ−２プラーク単離体、コペ
ンハーゲン菌株）が描かれている。ＮＹＶＡＣの産生において続発的に欠損せしめられた
ＶＣ−２の６つの領域が伸長している。欠損は、この開示の最初のほうに記載した（実施
10
例１から６）。その座から欠損され、その遺伝子産生物の分子量および機能または相同性
を伴ってＯＲＦがそのような欠損座の下に列記されている。
【１０４７】
ヒト組織細胞株のＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの複製研究
ヒト起源の細胞中のワクシニアウイルス（ｖＰ８６６）のＮＹＶＡＣ菌株の複製水準を測
定するために、６つの細胞株を、液体培養下で細胞当たり０．１ｐｆｕの入力多重度で接
種し、７２時間インキュベーションした。コペンハーゲン親クローン（ＶＣ−２）を平行
して接種した。全てのウイルスの許容細胞基質を代表するために、初代鶏胚繊維芽細胞（
ＣＥＦ）（ＣＴ、スパラス社、ＳＰＦ期限の生後１０−１１日の感染細胞包蔵卵から得た
）を含む。２つの基準に基づいて培養を分析した：生産的ウイルス複製の発生および外因
20
性抗原の発現。
【１０４８】
多くのヒト誘導細胞中のＮＹＶＡＣの複製能力を表５３に示す。ＶＣ−２およびＮＹＶＡ
Ｃの両者は、ＣＥＦ細胞中で生産的な複製ができるが、ＮＹＶＡＣは、やや減少した産生
となる。ＶＣ−２はまた、ＥＢＶ転換リンパブラストイド（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉ
ｄ）細胞株ＪＴ−１（エプスタインバーウイルスで転換したヒトリンパブライトイド細胞
株、リキンソンら、１９８４参照）を除いて、匹敵する産生物で処理した６つのヒト誘導
細胞株において生産的複製ができる。これに対して、ＮＹＶＡＣは、検定したヒト誘導細
胞株のいずれにでも生産的複製能力においては高度に弱毒化されている。ＮＹＶＡＣ感染
ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ１７１、ヒト胚肺起源）、デトロイト５３２（ＡＴＣＣ
30
＃ＣＣＬ５４、ヒト包皮、ダウン症候群）、ＨＥＬ ２９９（ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ１３
７、ヒト胚肺起源）、およびＨＮＫ（ヒト新生児腎臓、ＭＤ、ウォーカースビル、ウィチ
カーバイオプロダクツ社、ネコ＃７０−１５１）細胞から、残留ウイルス水準より高い感
染細胞の少量の増加が達成された。ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞または親ＶＣ−２感染ＣＥ
Ｆ細胞から得られたウイルス産生物と比較した場合、これらの細胞株の複製は著しく少な
い（表５３）。ＮＹＶＡＣおよびＶＣ−２両者のＣＥＦ細胞中の２４時間での産生は、７
２時間の産生と等しい。それゆえ、ヒト細胞株培養を追加に４８時間に亘りインキュベー
ションすると（さらなる２つのウイルス増殖サイクル）、達成された相対ウイルス産生を
増幅させる。
【１０４９】
40
ヒト誘導細胞株、ＭＲＣ−５およびデトロイト５３２に得られた低水準のウイルス産生と
一致して、検出可能であるがわずかな水準のＮＹＶＡＣ特異的ＤＮＡ蓄積が認められた。
ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞中に観察されたＤＮＡ蓄積の水準と相対的なＭＲＣ−５および
デトロイト５３２ＮＹＶＡＣ感染細胞株中のＤＮＡ蓄積の水準は、相対的なウイルス産生
と匹敵する。ＮＹＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ蓄積は、いずれの他のヒト誘導細胞にも観
察されなかった。
【１０５０】
アビポックスウイルス、ＡＬＶＡＣを用いて、同様の実験を行なった。ウイルス複製の結
果を表５３に示す。どの後代ウイルスも、アビアン種に対するカナリヤポックスウイルス
の宿主範囲制限と一致してヒト細胞株のいずれにも検出不可能であった。いずれのヒト誘
50
(270)
JP 3602844 B2 2004.12.15
導細胞株にもＡＬＶＡＣ特異的ＤＮＡ蓄積が検出不可能であったことは、これらのヒト誘
導細胞中のＡＬＶＡＣの生産的複製の欠如と一致する。
【１０５１】
ヒト細胞におけるＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）による狂犬病糖タンパク質の発現
異種遺伝子の能率的な発現が、生産的ウイルス複製水準が著しく欠如した状態で得られる
か否かを決定するために、同一の細胞株に、
３ ５
Ｓ−メチオニンの存在下で狂犬病ウイル
ス糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣ組換え体（ｖＰ８７９、実施例７）を接種した。狂
犬病糖タンパク質に特異的な単クローン性抗体を用いて放射線標識した培養溶解産物から
、狂犬病糖タンパク質の免疫沈降を行なった。狂犬病糖タンパク質の完全グリコシル化形
状と一致する６７ｋＤａタンパク質の免疫沈降が検出された。どの血清学的交差反応性産
10
生物も、未感染または親ＮＹＶＡＣ感染細胞溶解産物中には検出されなかった。分析した
全ての他のヒト細胞株にも同様の結果が得られた。
【１０５２】
ウサギの皮膚への接種
皮内接種後のウサギへの皮膚の外傷の性質と誘発を、枠ウイルス菌株の病原性の尺度とし
て以前から用いている（バラーら、１９８８；チルドら、１９９０；フェナーら、１９５
８；フレクスナーら、１９８７；ゲンドンおよびチャーノス、１９６４）。それゆえ、ワ
クシニア菌株ＷＲ（パニカリら、（１９８１）に記載されたような、ＡＴＣＣ＃ＶＲ１１
９ ＣＶ−１細胞において精製したプラーク、ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ７０、およびＬバリア
ントと称するプラーク単離体、選択したＡＴＣＣ ＃ＶＲ２０３５）、ＷＹＥＴＨ（ＰＡ
20
、マリエッタ、エスラボラトリーズによりＤＲＹＶＡＣとして市販されているＡＴＣＣ ＃ＶＲ３２５）、コペンハーゲン（ＶＣ−２）、およびＮＹＶＡＣによるｉｄ接種に関連
する外傷の性質を、２匹のウサギの接種により評価した（Ａ０６９およびＡ１２８）。２
匹のウサギは、ウイルスに対して全体的に異なる感度を示した。すなわち、ウサギＡ１２
８は、ウサギＡ０６９よりも強烈ではない反応を示した。ウサギＡ１２８において、外傷
は比較的小さく、接種から２７日後に消散した。ウサギＡ０６９では、外傷は酷く、ＷＲ
接種部位では特に酷く、４９日後に消散した。外傷の酷さはまた、リンパ液排液網に関連
する接種部位の位置に依存した。特に、背の脊椎（ｂａｃｋｓｐｉｎｅ）より上に位置す
る全ての部位は、より酷い外傷を示し、側腹部に位置する外傷を消散するのにより長い時
間が必要であった。全ての外傷を、４日目から最後の外傷が消えるまで毎日測定し、最大
30
外傷サイズと消散までの日数の平均を計算した（表５４）。対照ＰＢＳを注射した部位か
らは局部的な反応は観察されなかった。ＷＲ、ＶＣ−２、およびＷＹＥＴＨワクシニアウ
イルス菌株を注射した部位では潰瘍外傷が観察された。特に、ＮＹＶＡＣを接種した部位
では、硬結または潰瘍外傷は観察されなかった。
【１０５３】
接種部位での感染細胞の残存率
接種部位でのこれらのウイルスの相対的残存率を評価するために、ウサギに、１０
１０
７ または１０
８ ６ 、
ｐｆｕのＶＣ−２、ＷＲ、ＷＹＲＴＨまたはＮＹＶＡＣを含有す
る０．１ｍｌのＰＢＳを様々な部位に皮内に接種した。各ウイルスに関して、背の脊椎の
上の位置に１０
７ ｐｆｕの投与量と、その側腹に１０
６ および１０
８ の投与量を与
40
えた。１１日間に亘り、接種部位を毎日観察した。ＷＲは、最も強烈な応答を誘発し、次
にはＶＣ−２とＷＹＥＴＨが続いた（表５５）。ＷＲとＷＹＥＴＨに関しては、９日目に
、ＶＣ−２に関しては１０日目に、潰瘍が観察された。ＮＹＶＡＣまたは対照ＰＢＳを接
種した部位は、硬結また潰瘍を示さなかった。接種から１１日目に、接種の部位から皮膚
の試料を切除し、機械的に分断し、ウイルスをＣＥＦ細胞において滴定した。その結果を
表５５に示す。この時点で、投与したよりも回収したウイルスが多いことはなかった。投
与したウイルスの量にかかわりなく、カーワクシニア菌株ＷＲの回収は、各部位で約１０
６ ｐｆｕであった。ワクシニア菌株ＷＹＥＴＨおよびＶＣ−２の回収は、投与量にかか
わらず１０
３ から１０
４ イルスは回収されなかった。
ｐｆｕであった。ＮＹＶＡＣを接種した部位からは、感染ウ
50
(271)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【１０５４】
遺伝子的または化学的免疫不全マウスの接種
多量の投与量のＮＹＶＡＣ（５×１０
８ ｐｆｕ）またはＡＬＶＡＣ（１０
９ ｐｆｕ）
のヌードマウスへの腹腔内接種では、１００日間の観察期間に亘り、死亡、外傷、およ明
らかな疾病とはならなかった。これに対して、ＷＲ（１０３から１０４ｐｆｕ）、ＷＹＥ
ＴＨ（５×１０７または５×１０８ｐｆｕ）またはＶＣ−２（１０４から１０９ｐｆｕ）
を接種したマウスは、最初に爪先、次いで尾のポックスウイルスに典型的な広がった外傷
を示し、続いてある動物ではこう丸炎を示した。ＷＲまたはＷＹＥＴＨに感染したマウス
において、広がった外傷は一般的に、最終的には死亡を導き、一方ほとんどのＶＣ−２に
感染したマウスは最終的には回復した。計算したＬＤ５０値を表５６に示す。
10
【１０５５】
特に、ＶＣ−２を接種したマウスは、爪先に外傷を示し始め（赤い丘疹）、１から２日後
、１０
７ および
ｐｆｕ）を与えたマウスでは接種後（ｐｉ）１１と１３日の間、１０
５ ｐｆｕ
には尾に示した。これらの外傷は、最高の投与量（１０
１０
６ を与えたマウスではｐｉ１６日目、そして１０
目に生じた。１０
３ および１０
２ は、外傷は観察されなかった。１０
察された。こう丸炎は、１０
、１０
８ ｐｆｕを与えたマウスではｐｉ２１日
ｐｆｕを接種したマウスには１００日の観察期間中
９ から１０
日目に、こう丸炎が観察され、他の群（１０
９ ４ ９ と１０
８ ７ ８ ｐｆｕを与えたマウスにはｐｉ２３
から１０
４ ｐｆｕ）では約７日後に観
ｐｆｕの群に特に強烈であったが、１００日
の観察期間の終りには、減退が観察された。数匹のマウスの皮膚には、痘状の外傷がいく
20
つか観察され、これはｐｉ３０−３５日辺りに生じた。ほとんどの痘外傷は、通常ｐｉ６
０−９０日の間に直った。１０９ｐｆｕを接種した群では１匹のマウスが死亡し（ｐｉ３
４日）、１０８ｐｆｕを接種した群では１匹のマウスが死亡した（ｐｉ９４日）。ＶＣ−
２接種マウスでは他には死亡は観察されなかった。
【１０５６】
１０
４ ｐｆｕのワクシニアのＷＲ菌株を接種したマウスをｐｉ１７日目に痘外傷を示し
始めた。これらの外傷は、ＶＣ−２注射マウス（膨れた爪先、尾）により示された外傷と
同一であった。１０
３ ｐｆｕのＷＲ菌株を接種したマウスは、ｐｉ３４日目まで外傷を
示さなかった。ＷＲの最高投与量（１０
４ ｐｆｕ）を接種したマウスのみにこう丸炎が
観察された。観察期間の後半の段階に亘り、外傷が口の回りに発生し、マウスは餌を食べ
るのをやめた。１０
４ 30
ｐｆｕのＷＲを接種した全てのマウスは死亡したか、またはｐｉ
２１と３１日の間に必要な場合には安楽死させた。１０
３ ｐｆｕのＷＲを接種した５匹
のマウスのうち４匹は死亡したか、またはｐｉ３５と５７日の間に必要な場合には安楽死
させた。低い投与量（１から１００ｐｆｕ）のＷＲを接種したマウスには死亡したものは
なかった。
【１０５７】
より多量（５×１０
７ および５×１０
８ ｐｆｕ）の投与量のワクシニアウイルスのＷ
ＹＥＴＨ菌株を接種したマウスは、爪先と尾に外傷を示し、こう丸炎を発達させ、死亡し
た。５×１０６ｐｆｕまたはそれ未満のＷＹＥＴＨを接種したマウスは、疾病または外傷
の徴候を示さなかった。
40
【１０５８】
表５６に示すように、ＣＹ処理マウスは、ヌードマウスよりもポックスウイルスの毒性を
アッセイするのにより感度のあるモデルを提供した。このモデル系において、ＷＲ、ＷＹ
ＥＴＨ、およびＶＣ−２ワクシニアウイルス菌株のＬＤ５０値は、ヌードマウスモデルよ
りも著しく低かった。加えて、以下に記載するように、ＷＹＥＴＨ、ＷＲおよびＶＣ−２
ワクシニアウイルスを接種したマウスには外傷が発達し、各ウイルスの投与量が多ければ
多いほど、外傷の形成が急速であった。ヌードマウスに見られるように、ＮＹＶＡＣまた
はＡＬＶＡＣを接種したＣＹ処理マウスは外傷を発達せしめなかった。しかしながら、ヌ
ードマウスのようではなく、投与量にかかわらず、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを抗原投
与したＣＹ処理マウスはその何匹かが死亡した。これらの偶発的な発生は、死因に関して
50
(272)
JP 3602844 B2 2004.12.15
は、疑わしい。
【１０５９】
全ての投与量のＷＹＥＴＨ（９．５×１０
４ から９．５×１０
８ ｐｆｕ）を接種した
マウスは、尾におよび／または爪先にｐｉ７と１５日の間に痘外傷を示した。加えて、尾
と爪先は膨れた。尾の外傷の展開は、丘疹、潰瘍および最終的にかさぶたの形成とともに
痘外傷の典型であった。全ての投与量のＶＣ−２（１．６５×１０
０
９ ５ から１．６５×１
）を接種したマウスもまた、尾および／または爪先に、ＷＹＥＴＨ接種マウスの外
傷と相同な痘外傷を発達させた。これらの外傷は、接種から７−１２日後に観察された。
低い投与量のＷＲウイルスを接種したマウスには外傷は観察されなかったが、これらの群
には死亡したマウスがいた。
10
【１０６０】
ＮＹＶＡＣ−ＲＧの効力検定
産生したＮＹＶＡＣ菌株が有用なベクターとなる能力を著しく変更することなく、ワクシ
ニアウイルスのコペンハーゲン菌株の弱毒化が行なわれたことを決定するために、比較効
力検定を行なった。ウイルスを弱毒化するために行なった連続遺伝子操作に間にベクター
の免疫原をモニターするために、レポーター外因抗原として狂犬病ウイルス糖タンパク質
を用いた。狂犬病糖タンパク質遺伝子を発現するベクターの防御効能を狂犬病の標準ＮＩ
Ｈマウス効力検定により評価した（セリグマン、１９７３）。表５７は、高度に弱毒化さ
れたＮＹＶＡＣベクターに得られたＰＤ５０値は、ｔｋ座に狂犬病糖タンパク質遺伝子を
含有するコペンハーゲンベースの組換え体を用いて得られたものと同一であり（キーニー
20
ら、１９８４）、アビアン種への複製に制限されたカナリヤポックスベースのベクター、
ＡＬＶＡＣ−ＲＧに得られたＰＤ５０値と同様である。
【１０６１】
観察
既知の毒性遺伝子が欠損し、制限された生体外増殖特性を有する、ＮＹＶＡＣを、動物モ
デル系で分析し、その弱毒化特性を評価した。神経毒性ワクシニアウイルス研究所菌株、
ＷＲ、２つのワクシニアウイルスワクチン菌株、ＷＹＥＴＨ（ニューヨーク市保険局）お
よびコペンハーゲン（ＶＣ−２）、並びにカナリヤポックスウイルス菌株、ＡＬＶＡＣと
の比較で、これらの研究を行なった（実施例２４参照）。これらのウイルスは、マウス抗
原投与モデルとウサギ皮膚モデルにおける相対病原能力の範囲を提供し、ＷＲは最も毒性
30
のある菌株であり、ＷＹＥＴＨおよびコペンハーゲン（ＶＣ−２）は報告した特性を有す
る、以前に使用した弱毒化したワクシニア菌株を提供し、ＡＬＶＡＣは複製がアビアン種
に制限されるポックスウイルスの実施例を提供した。これらの体内分析からの結果は、ワ
クシニアウイルス菌株、ＷＲ、ＷＹＥＴＨおよびコペンハーゲン（ＶＣ−２）に関連する
ＮＹＶＡＣの高度に弱毒化された特性を明確に示す（表２８−２９、５３−５７）。特に
、ＮＹＶＡＣのＬＤ５０値は、アビアン宿主制限アビポックスウイルス、ＡＬＶＡＣに観
察された値と一致した。ＮＹＶＡＣ、並びにＡＬＶＡＣにより死亡は、頭蓋内経路により
非常に多量の投与量のウイルスが投与されたときのみに、観察された（実施例２４、表２
８、２９、５６）。それでも、これらの死亡が高いタンパク質質量の接種の非特異的な結
果によるものであるかどうかは分かっていない。免疫無防備状態のマウスモデル（ヌード
40
およびＣＹ処理）の分析結果は、ＷＲ、ＷＹＥＴＨおよびコペンハーゲン菌株と比較して
、ＮＹＶＡＣの比較的高度に弱毒化された特性を示す（表５４および５５）。著しくは、
ＮＹＶＡＣ接種動物またはＡＬＶＡＣ接種動物には、観察期間に亘り、広がったワクシニ
ア感染または接種の疾病の証拠は観察されなかった。ＮＹＶＡＣの多重毒性感染遺伝子の
欠損は、病原性に関して相乗効果を示す。ウサギの皮膚への皮膚内投与により、ＮＹＶＡ
Ｃの無害性の別の測定を提供した（表５４および５５）。非アビアン種中では複製できな
いウイルスであるＡＬＶＡＣに関する結果を考慮すると、接種部位での複製能力は、ＡＬ
ＶＡＣの皮内接種が投与量依存方法において硬結の領域を生じるので（未公表の観察）、
反応性に相関する唯一のものではない。それゆえ、ウイルスの複製容量以外の要因が外傷
の形成に帰すると言えそうである。ＮＹＶＡＣ中の遺伝子の欠損は、外傷の発生を妨げる
50
(273)
JP 3602844 B2 2004.12.15
。
【１０６２】
これとともに、この実施例と、実施例２４を含む前述した実施例の結果は、ＷＲ、および
以前に用いたワクシニアウイルスワクチン菌株、ＷＹＥＴＨとコペンハーゲンに対するＮ
ＹＶＡＣの高度に弱毒化された性質を示す。実際、検定した動物モデル系における、ＮＹ
ＶＡＣの病原プロファイルは、アビアン種のみにおいて生産的複製をすることが知られて
いるポックスウイルス、ＡＬＶＡＣのプロファイルと同様であった。ヒトおよび、マウス
、ブタ、イヌおよびウマを含む他の種から誘導した細胞において生産的に複製するＮＹＶ
ＡＣの明確に制限された容量により、ワクチン未接種接触または一般的な環境への潜在的
な伝染を制限または妨げる重要なバリアを提供し、加えて、ワクチン接種した個体内の減
10
少した繁殖の可能性を有するベクターを提供する。
【１０６３】
特に、ＮＹＶＡＣベースのワクチン候補は、有効であることが分かった。多くの病原から
異種遺伝子産生物を発現するＮＹＶＡＣ組換え体は、霊長類を含むいくつかの動物種中の
異種遺伝子産生物に対する免疫応答を誘発した。特に、狂犬病糖タンパク質を発現するＮ
ＹＶＡＣベースの組換え体は、致死量狂犬病抗原投与に対してマウスを防御することがで
きた。ＮＹＶＡＣベースの狂犬病糖タンパク質組換え体の効力は、ｔｋ座に狂犬病糖タン
パク質を過含有するコペンハーゲンベースの組換え体のＰＤ５０値に匹敵した（表５７）
。ＮＹＶＡＣベースの組換え体はまた、ウサギの麻疹ウイルス中和抗体およびブタの仮性
狂犬病ウイルスと日本脳炎ウイルス抗原投与に対する防御を誘発することが示された。高
20
度に弱毒化されたＮＹＶＡＣ菌株には、ヒトと獣医用途について安全性の利点がある（タ
ータグリアら、１９９０）。さらに、一般的な研究所発現ベクター系としてのＮＹＶＡＣ
の使用は、ワクシニアウイルスのしように関する生物学的危険を著しく減少する。
【１０６４】
以下の基準により、この実施例および実施例２４を含む、前述した実施例の結果により、
ＮＹＶＡＣが高度に弱毒化されていることが分かる：ａ）接種部位に硬結または潰瘍が検
出不可能（ウサギの皮膚）；ｂ）接種の皮内部位からの感染ウイルスの急速な除去（ウサ
ギの皮膚）；ｃ）精巣炎症がない（ヌードマウス）；ｄ）著しく低減した毒性（頭蓋内抗
原投与、生後３週間と新生マウスの両者）；ｅ）著しく提言した病原性および免疫不全対
象で伝染しないこと（ヌードおよびシクロホスファミド処理したマウス）；およびｆ）著
しく低減した様々なヒト組織培養細胞での複製能力。それでも、高度に弱毒化されている
にもかかわらず、ベクターとしてのＮＹＶＡＣは、外因抗原に対して強い免疫応答を誘発
する能力を保持している。
【１０６５】
【表５３】
30
(274)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
【表５４】
50
(275)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
【表５５】
40
(276)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表５６】
30
(277)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
【表５７】
30
40
それゆえ、本発明の好ましい実施態様を詳細に記載したが、添付した請求の範囲により定
義された本発明は、多くの様々な変更が本発明の意図と範囲から逸脱することなく可能で
あるので、上記記載に述べた特定の詳細に限定されるものではないことが理解されよう。
【１０６６】
50
(278)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【参考文献】
10
20
30
40
(279)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(280)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(281)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(282)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(283)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(284)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(285)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(286)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(287)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(288)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(289)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(290)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(291)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(292)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(293)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(294)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(295)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(296)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(297)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(298)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(299)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(300)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(301)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(302)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(303)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
40
(304)
JP 3602844 B2 2004.12.15
10
20
30
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、チミジンキナーゼ遺伝子の欠損したプラスミドｐＳＤ４６０の構築方法
と組換えワクシニアウイルスｖＰ４１０の産生方法を模式的に示すものである
【図２】図２は、出血性領域の欠損したプラスミドｐＳＤ４８６の構築方法と組換えワク
シニアウイルスｖＰ５５３の産生方法を模式的に示すものである
【図３】図３は、ＡＴＩ領域の欠損したプラスミドｐＳＤ４９４Δの構築方法と組換えワ
クシニアウイルスｖＰ６１８の産生方法を模式的に示すものである
【図４】図４は、血球凝集素の欠損したプラスミドｐＳＤ４６７の構築方法と組換えワク
シニアウイルスｖＰ７２３の産生方法を模式的に示すものである
【図５】図５は、遺伝子クラスター［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］の欠損したプラスミドｐＭＰＣＳ
40
Ｋ１Δの構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ８０４の産生方法を模式的に示すもの
である
【図６】図６は、巨大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼの欠損したプラスミ
ドｐＳＤ５４８の構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ８８６（ＮＹＶＡＣ）の産生
方法を模式的に示すものである
【図７】図７は、狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子をＴＫ欠損座中に挿入したプラスミドｐＲ
Ｗ８４２の構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ８７９の産生方法を模式的に示すも
のである
【図８】図８は、ＥＢＶトリプル１プラスミド中に挿入されたＥＢＶコード領域の遺伝子
地図である
50
(305)
JP 3602844 B2 2004.12.15
【図９Ａ】図９Ａは、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１４）を有する改変合成ワクシ
ニアウイルスＨ６初期／晩期プロモーターおよび合成ｓｐｓＡｇ遺伝子のＤＮＡ配列（配
列認識番号２１３）を示すものである
【図９Ｂ】図９Ｂは図９Ａの続きである
【図１０Ａ】図１０Ａは、組換えワクシニアウイルスｖＰ８５６の構築方法を模式的に示
すものである
【図１０Ｂ】図１０Ｂは図１０Ａの続きである
【図１１Ａ】図１１Ａは、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１６）を有するｕプロモー
ター／ｌｐｓＡｇ遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号２１５）を示すものである
【図１１Ｂ】図１１Ｂは図１１Ａの続きである
10
【図１２Ａ】図１２Ａは、組換えワクシニアウイルスｖＰ８９６の構築方法を模式的に示
すものである
【図１２Ｂ】図１２Ｂは図１２Ａの続きである
【図１３Ａ】図１３Ａは、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１７）を有するＩ３Ｌプロ
モーター／Ｓ１２／コア遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号８７）を示すものである
【図１３Ｂ】図１３Ｂは図１３Ａの続きである
【図１４】図１４は、組換えワクシニアウイルスｖＰ９１９の構築方法を模式的に示すも
のである
【図１５Ａ】図１５Ａは、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１９）を有するＥＰＶ４２
ｋＤａプロモーター／ｌｐｓＡｇ遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号２１８）を示すもの
20
である
【図１５Ｂ】図１５Ｂは図１５Ａの続きである
【図１６】図１６は、Ｃ５ ＯＲＦを含有するカナリヤポックスＰｖｕＩＩ断片のＤＮＡ
配列（配列認識番号２１７）を示すものである
【図１７Ａ】図１７Ａは、組換えカナリヤポックスウイルスｖＣＰ６５（ＡＬＶＡＣ−Ｒ
Ｇ）の構築方法を模式的に示すものである
【図１７Ｂ】図１７Ｂは図１７Ａの続きである
【図１８】図１８は、ワクシニアウイルスｖＰ５５５、ｖＰ８２５、ｖＰ９０８、ｖＰ９
２３、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４に挿入されるＪＥＶコード領域の模式図である
【図１９】図１９は、ワクシニアウイルスｖＰ７６６、ｖＰ７６４、ｖＰ８６９、ｖＰ７
30
２９およびｖＰ７２５に挿入されるＹＦコード領域の模式図である
【図２０】図２０は、ワクシニアウイルスｖＰ８６７、ｖＰ９６２およびｖＰ９５５に挿
入されるＤＥＮコード領域の模式図である
【図２１】図２１は、Ｆ８ ＯＲＦを含有するＴＲＯＶＡＣ ＤＮＡの３６６１塩基対断
片のヌクレオチド配列（配列認識番号２２１）を示すものである
【図２２】図２２は、Ｆ７ ＯＲＦを含有するＴＲＯＶＡＣ ＤＮＡの２３５６塩基対断
片のＤＮＡ配列（配列認識番号２２２）を示すものである
【図２３】図２３は、ＥＩＶ ＨＡ（Ａ１／プラハ／５６）のヌクレオチド配列（配列認
識番号２７９）を示すものである
【図２４】図２４は、ＥＩＶ ＨＡ（Ａ２／フォンテンブルー／７９）のヌクレオチド配
40
列（配列認識番号２８４）を示すものである
【図２５】図２５は、ＥＩＶ ＨＡ（Ａ２／サフォーク／８９）のヌクレオチド配列（配
列認識番号３００）を示すものである
【図２６】図２６は、ＦｅＬＶ−Ｂエンベロープ遺伝子のヌクレオチド配列（配列認識番
号３１０）を示すものである
【図２７】図２７は、ＦｅＬＶ−Ａｑａｑおよび部分的ｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列
（配列認識番号３２４）を示すものである
【図２８】図２８は、ＦＨＶ−１ＣＯ菌株ｇＳホモログ遺伝子のヌクレオチド配列（配列
認識番号２９０）を示すものである
【図２９】図２９は、ｐＵＲＦ３により表されるコンセンサスＦヌクレオチド配列（おた
50
(306)
JP 3602844 B2 2004.12.15
ふくかぜ）（配列認識番号３７０）を示すものである
【図３０】図３０は、ｐＵＨＮ５により表されるコンセンサスＨＮヌクレオチド配列（お
たふくかぜ）（配列認識番号３７１）を示すものである
【図３１】図３１は、免疫したマウスの脾臓細胞の細胞傷害性応答を示すものである
【図３２】図３２は、免疫したマウスの脾臓からの細胞傷害性作動体細胞の感度を示すも
のである
【図３３】図３３は細胞傷害性Ｔリンパ球抗原受容体の特異性を示すものである
【図３４】図３４は免疫したマウスのＨＩＶ ＩＩＩ Ｂ ｇｐ１２０に対する抗体応答
を示すものである
【図３５Ａ】図３５Ａは、狂犬病中和抗体力価（ＲＦＦＩＴ、ＩＵ／ｍｌ）のグラフであ
10
る
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、狂犬病中和抗体力価（ＲＦＦＩＴ、ＩＵ／ｍｌ）のグラフであ
る
【図３５Ｃ】図３５Ｃは、狂犬病中和抗体力価（ＲＦＦＩＴ、ＩＵ／ｍｌ）のグラフであ
る
【図３５Ｄ】図３５Ｄは、狂犬病中和抗体力価（ＲＦＦＩＴ、ＩＵ／ｍｌ）のグラフであ
る
【図３６】図３６はＪＥＶ ｃＤＮＡ配列を示すものである
【図３７】図３７はＮＥＵＴおよびＨＡＩ活性を示すものである
【図３８Ａ】図３８Ａはウイルス血症の時間の経過を示すものである
【図３８Ｂ】図３８Ｂはウイルス血症の時間の経過を示すものである
【図３８Ｃ】図３８Ｃはウイルス血症の時間の経過を示すものである
【図３８Ｄ】図３８Ｄはウイルス血症の時間の経過を示すものである
【図３９】図３９は、ＮＹＶＡＣを産生するのに欠損したＯＲＦを模式的に示したもので
ある
【図１】
【図２】
20
(307)
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
JP 3602844 B2 2004.12.15
(308)
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
JP 3602844 B2 2004.12.15
(309)
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
JP 3602844 B2 2004.12.15
(310)
【図１２Ａ】
【図１３Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
JP 3602844 B2 2004.12.15
(311)
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７Ａ】
JP 3602844 B2 2004.12.15
(312)
【図１７Ｂ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
JP 3602844 B2 2004.12.15
(313)
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２５】
【図２４】
JP 3602844 B2 2004.12.15
(314)
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図３０】
【図２９】
JP 3602844 B2 2004.12.15
(315)
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５Ａ】
JP 3602844 B2 2004.12.15
(316)
【図３５Ｂ】
【図３５Ｄ】
【図３５Ｃ】
【図３６】
【図３７】
JP 3602844 B2 2004.12.15
(317)
【図３８Ａ】
【図３８Ｃ】
【図３８Ｂ】
【図３８Ｄ】
【図３９】
JP 3602844 B2 2004.12.15
(318)
JP 3602844 B2 2004.12.15
フロントページの続き
(72)発明者 マリオン イー パーカス
アメリカ合衆国 ニューヨーク州 １２００９ オルタモント ウェスタン ターンパイク ４９
７１ アールディー ナンバー２ ボックス ２６７エイ
(72)発明者 ジル テイラー
アメリカ合衆国 ニューヨーク州 １２２０３ オルバニー コロニアル アヴェニュー ３３
(72)発明者 ジェームズ タータグリア
アメリカ合衆国 ニューヨーク州 １２３０３ シェネクタディ クリスティーナ ドライヴ ７
(72)発明者 エリザベス ケイ ノートン
アメリカ合衆国 ニューヨーク州 １２１１０ ラサム サリー ヒル ドライヴ ５４
(72)発明者 ミッシェル リヴィエール
フランス国 エフ−６９１３０ エカリー シュマン ド チャンスリー １１
(72)発明者 シャルル ド テーヌ
フランス国 エフ−６９００５ リヨン リュ デュ コマンダン−シャルコ ４８ビス
(72)発明者 キース ジェイ リンバッハ
アメリカ合衆国 ニューヨーク州 １２１８０ トロイ ハンプトン プレイス ３２４
(72)発明者 ジェラルド ピー ジョンソン
アメリカ合衆国 ニューヨーク州 １２１８８ ウォーターフォード デヴィット ロード １０
０
(72)発明者 スティーヴン イー ピンカス
アメリカ合衆国 ニューヨーク州 １２０６１ イースト グリーンブッシュ トロイ ロード ７８
(72)発明者 ウィリアム アイ コックス
アメリカ合衆国 ニューヨーク州 １２１８０ トロイ ワシントン プレイス １
(72)発明者 ジャン−クリストフ フランシス
アメリカ合衆国 ニューヨーク州 １２２０２ オルバニー アパートメント ナンバー６ ウォ
ーレン ストリート ５９６
(72)発明者 ラッセル ロバート ゲティング
アメリカ合衆国 ニューヨーク州 １２０１８ エイヴリル パーク ボックス ４２１シー ア
ールディー ２
審査官 田村 明照
(56)参考文献 特表平２−５００８７９（ＪＰ，Ａ）
Nature, Vol.317, pp.813-815 (1985)
J.Virology, Vol.62, No.12, pp.4474-4480 (1988)
J.Virology, Vol.63, No.9, pp.3829-3836 (1989)
Virology, Vol.152, pp.285-297 (1986)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.86, pp.1287-1291 (1989)
Critical Reviews in Immunology, Vol.10,No.1,pp.13-30 (1990)
Vaccine, Vol.6, pp.466-467 (1988)
Vaccine, Vol.6, pp.497-503 (1988)
7
(58)調査した分野(Int.Cl. ，ＤＢ名)
C12N 15/00
C12N 7/00
BIOSIS/WPI(DIALOG)
MEDLINE(STN)

HIV(エイズ)抗体・ATL(成人T細胞白血病)抗体検査のご案内

AIDS対策の一考察 - 福祉社会開発研究科

世界エイズデーエイズ電話相談チラシ(両面印字用)

PDF版 212KB

5-妊婦検診および検査について

クリック - 津ボーイズ

犯罪捜査における医療費及び死体検案書料に関する公費

ルワンダ国月報（2014年2月） 主な出来事 【外政】 4日、1994年のツチ