JP 3843255 B2 2006.11.8
(57)【 特 許 請 求 の 範 囲 】
【請求項１】
式 Iで 表 さ れ る ( 2R,3S )-1-ハ ロ -2-ヒ ド ロ キ シ -3-(保 護 )ア ミ ノ -4-置 換 ブ タ ン 類 の 立 体 選
択的製造方法であって、
【化１】
（ 式 中 、 Halは ハ ロ ゲ ン 、 Rは ア ル キ ル 、 置 換 ア ル キ ル 、 ア リ ー ル 、 及 び 置 換 ア リ ー ル か ら
な る 群 か ら 選 択 さ れ 、 並 び に R1 は ア ミ ノ 官 能 基 の 保 護 基 で あ る ） 、
式 IIで 表 さ れ る ( 3S )-1-ハ ロ -2-オ キ ソ -3-(保 護 )ア ミ ノ -4-置 換 ブ タ ン を 、
10
(2)
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【化２】
10
（ 式 中 、 Hal、 R及 び R 1 は 上 記 で 定 義 し た と お り で あ る ）
式 IIの 化 合 物 の 立 体 選 択 的 還 元 を 触 媒 し 得 る 微 生 物 （ 前 記 微 生 物 は Rhodococcus erythrop
olis ATCC 4277、 Rhodococcus erythropolis DSM 6971及 び Rhodcoccus sp. ATCC 21227、
Rhodococcus erythropolis ATCC 27854及 び Brevibacterium sp. ATCC 19653か ら な る 群 よ
り 選 択 さ れ る 微 生 物 で あ る ） と 前 記 還 元 に 効 果 の あ る 条 件 下 に 接 触 さ せ 、 式 Iで 表 さ れ る
化合物を回収することを含む、上記方法。
【請求項２】
Halが ク ロ ロ で あ り 、 Rが フ ェ ニ ル で あ り 、 R 1 が t-ブ ト キ シ カ ル ボ ニ ル で あ る 、 請 求 項 １
記載の方法。
【請求項３】
20
微 生 物 が Rhodococcus erythropolis ATCC 4277で あ る 、 請 求 項 １ 記 載 の 方 法 。
【請求項４】
微 生 物 が Rhodococcus erythropolis DSM 6971で あ る 、 請 求 項 １ 記 載 の 方 法 。
【請求項５】
微 生 物 が Rhodococcus species ATCC 21227で あ る 、 請 求 項 １ 記 載 の 方 法 。
【請求項６】
微 生 物 が Rhodococcus species ATCC 27854で あ る 、 請 求 項 １ 記 載 の 方 法 。
【請求項７】
微 生 物 が Rhodococcus sp. ATCC 19653で あ る 、 請 求 項 １ 記 載 の 方 法 。
【請求項８】
30
一段階発酵で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
二段階発酵で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
誘導剤存在下に行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
誘 導 剤 が 式 Iで 表 さ れ る 化 合 物 で あ り 、 そ れ を 微 生 物 が 生 育 す る 間 に 添 加 す る 、 請 求 項
１０記載の方法。
【請求項１２】
式 Iで 表 さ れ る 化 合 物 が 少 な く と も ７ ０ ％ の 収 率 で 得 ら れ 、 か つ 少 な く と も ９ ３ ％ の ジ
アステレマー純度で得られる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
式 Iで 表 さ れ る 化 合 物 が 少 な く と も ９ ５ ％ の 収 率 で 得 ら れ 、 か つ 少 な く と も ９ ９ ％ の ジ
アステレマー純度で得られる、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
下記式で表されるエポキシ化合物を製造する方法であって、
40
(3)
JP 3843255 B2 2006.11.8
【化３】
(式 中 、 Rは ア ル キ ル 、 置 換 ア ル キ ル 、 ア リ ー ル 、 及 び 置 換 ア リ ー ル か ら な る 群 か ら 選 択 さ
れ 、 並 び に R1 は ア ミ ノ 官 能 基 の 保 護 基 で あ る )
下記式で表されるアリールエステルを、
10
【化４】
（ 式 中 、 R及 び R 1 は 上 記 で 定 義 し た と お り で あ り 、 R 2 は 水 素 ま た は ニ ト ロ で あ り 、 及 び フ
20
ェニル環のオルトまたはパラ位で置換されていてもよい）
下記式で表される官能基を有するイオウイリド化合物と反応させ、
【化５】
（ 式 中 、 R3 及 び R4 は 、 ア ル キ ル 、 置 換 ア ル キ ル 及 び ア リ ー ル か ら な る 群 よ り 選 択 さ れ る ）
下記式で表される中間体ケトイリド化合物を製造し、
【化６】
30
（ 式 中 、 R、 R 1 、 R 3 及 び R 4 は 上 記 で 定 義 し た と お り で あ る ）
式 IIIで 表 さ れ る 前 記 化 合 物 を 、 塩 素 源 及 び 有 機 酸 を 用 い て 処 理 し て 、 下 記 式 で 表 さ れ る 1
-置 換 -2-ア ミ ノ -3-オ キ ソ -4-ク ロ ロ ブ タ ン を 形 成 し 、
【化７】
40
（ 式 中 、 R及 び R 1 は 上 記 で 定 義 し た と お り で あ る ）
前 記 化 合 物 を 還 元 し て 、 下 記 式 で 表 さ れ る 1-ク ロ ロ -2-ヒ ド ロ キ シ -3-ア ミ ノ -4-置 換 ブ タ
ン化合物を形成し、
50
(4)
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【化８】
（ 式 中 、 R及 び R 1 は 上 記 で 定 義 し た と お り で あ る ）
10
前記ヒドロキシ化合物を塩基と反応させて前記エポキシ化合物を形成することを含み、前
記 1-ク ロ ロ -2-オ キ ソ -3-ア ミ ノ -4-置 換 ブ タ ン 化 合 物 の 還 元 を 請 求 項 １ に 記 載 の 方 法 で 行
い 、 そ れ に よ り 前 記 1-ク ロ ロ -2-ヒ ド ロ キ シ -3-ア ミ ノ -4-置 換 ブ タ ン 化 合 物 を 少 な く と も
７０％の収率で、かつ少なくとも９３％のジアステレオマー純度で得ることを特徴とする
上記方法。
【請求項１５】
式 Iで 表 さ れ る 化 合 物 が 少 な く と も ９ ５ ％ の 収 率 で 得 ら れ 、 か つ 少 な く と も ９ ９ ％ の ジ
アステレマー純度で得られる、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
20
発明の分野
本 発 明 は ( 2R,3S )-1-ハ ロ -2-ヒ ド ロ キ シ -3-(保 護 )ア ミ ノ -4-置 換 ブ タ ン 類 を 、 相 当 す る
オキソ化合物を立体選択的に還元することにより製造する新規な方法に関する。本発明の
方 法 に よ り 製 造 さ れ た 置 換 ブ タ ン 類 は 、 ア ン ジ オ テ ン シ ン 変 換 酵 素 、 レ ニ ン お よ び HIV-プ
ロテアーゼの阻害剤として治療学的に有用な多数の分子に存在する、ヒドロキシエチルア
ミン生物学的等価体サブユニットの前駆体である。
【０００２】
発明の背景
Bing-nan Zhou et al. J. Am. Chem. Soc., 105, pages 5926-5928, 1983に は 、 ヒ ト の 代
謝 及 び 長 鎖 脂 肪 酸 の 輸 送 に お い て 重 要 な 役 割 を 果 た す L-カ ル ニ チ ン の 化 学 微 生 物 学 的 合 成
30
に つ い て 記 載 さ れ て い る 。 特 に こ の 文 献 に は 、 ベ イ カ ー 酵 素 、 す な わ ち Saccharomyces ce
revisiae に よ り 、 エ チ ル K-ク ロ ロ ア セ ト ア セ テ ー ト を エ チ ル (S)-4-ク ロ ロ -3-ヒ ド ロ キ シ
ブタノエートへ還元することについて記載されている。
【０００３】
Kazutoshi Ushio et al. Tetrahedron Letters, Vol. 27, No. 23, pages 2657-2660, 19
86, に は ベ ー タ -ケ ト エ ス テ ル の メ タ ノ ー ル 生 育 酵 素 に よ る 還 元 に つ い て 記 載 さ れ て い る
。 こ の 文 献 は 、 目 的 の 反 応 に お い て D-異 性 体 が 増 え る 方 向 に 劇 的 に シ フ ト し た エ ナ ン チ オ
マー過剰の生成物が生じることを教示している。この現象は、メタノール中で生育する酵
素を使用して反応を行った場合に生じるが、これはそのような媒体中で生育する酵素の性
質によるものである。
40
【０００４】
Markus Christen et al. J. Chem. Soc. Chem. Commun. pages 264-266, 1988,に は 、 メ
チ ル -6-(p-ク ロ ロ フ ェ ニ ル チ オ )-3,4-ジ ヒ ド ロ ヘ キ サ ノ エ ー ト の ４ 種 類 の 立 体 異 性 体 の 合
成について開示されており、そのキーでありキラリティーの導入は、適する酵素還元によ
り 行 わ れ る 。 前 記 文 献 に は 、 酵 素 に よ る ベ ー タ -ケ ト エ ス テ ル の 還 元 は か な り 研 究 さ れ て
いるが、生成物の絶対立体配置がどちらであるか予測することは依然として困難であり、
特に達成しえるエナンチオマー過剰については困難である。
【０００５】
Antonio Trincone et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 35, pages 559-56
4, 1990に は Sulfolobus solfataricusの 静 止 細 胞 に よ る ケ ト ン の 非 対 称 還 元 に つ い て 記 載
50
(5)
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さ れ て い る 。 こ の 微 生 物 の 静 止 細 胞 の 還 元 能 は 、 細 胞 生 育 の フ ェ ー ズ （ phase） に 強 く 依
存している。
【０００６】
Ramesh Patel et al., Enzyme Microb. Technol., Vol. 13, pages 906-912, 1991に は 4,
5-ジ ヒ ド ロ -4-(4-メ ト キ シ フ ェ ニ ル )-6-(ト リ フ ル オ ロ メ チ ル -1H-1)-ベ ン ズ ア ゼ ピ ン -2オ ン の 立 体 特 異 的 微 生 物 学 的 還 元 に つ い て 記 載 さ れ て い る 。 特 に 、 キ ー 中 間 体 で あ る (3Rcis)-1,3,4,5-テ ト ラ ヒ ド ロ -3-ヒ ド ロ キ シ -4-(4-メ ト キ シ フ ェ ニ ル )-6-(ト リ フ ル オ ロ メ
チ ル )-2H-1-ベ ン ズ ア ゼ ピ ン -2-オ ン を 親 ケ ト ン の 立 体 選 択 的 微 生 物 学 的 還 元 に よ り 製 造 し
た こ と を 記 載 し て い る 。 特 定 の 条 件 を 選 択 す る こ と に よ り 、 4種 類 の 既 知 の 可 能 性 か ら 単
一の異性体を得ることが可能であることを述べている。
10
【０００７】
Ramesh Patel et al., Enzyme Microb. Technol., Vol. 15, pages 1014-1021, 1993, に
は ジ ケ ト 化 合 物 3,5-ジ オ キ ソ -6-(ベ ン ジ ル オ キ シ )ヘ キ サ ン 酸 メ チ ル エ ス テ ル の 、 得 ら れ
たジヒドロキシ化合物の単一エナンチオマーへの立体選択的還元を記載している。
【０００８】
Ramesh Patel et al., Enzyme Microb. Technol., Vol. 14, pages 731-738, 1992に は ベ
ー タ -ケ ト エ ス テ ル の 還 元 か ら 得 ら れ る ヒ ド ロ キ シ 生 成 物 の 光 学 的 純 度 を 改 良 す る 熱 処 理 G
eotrichum candidumの プ ロ セ ス が 記 載 さ れ て い る 。
【０００９】
Kometani et al,, Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 80, No. 2, pag
20
es 208-210, 1995, に は 、 エ タ ノ ー ル を エ ネ ル ギ ー 源 と し て 使 用 す る 酵 素 媒 介 生 物 学 的 還
元について記載されている。ベイカーズ酵素におけるエタノールの消費速度とプロキラル
ケトン還元速度の関係について研究され、プロキラルケトン類からキラルアルコール類の
大量製造にエタノールを適用できると結論された。
【００１０】
Ramesh Patel et al., U.S. Patent No. 5,391,495（ 1995年 2月 21日 発 行 ） に は 、 還 元 を
触媒し得る微生物または酵素を用いた、特定のケト含有スルホンアミド化合物の立体選択
的還元により相当するヒドロキシ基含有化合物を形成することが記載されている。命名さ
れ た 酵 素 は 、 オ キ シ ド 還 元 酵 素 ま た は デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ で あ り 、 微 生 物 は 好 ま し く は Hans
enula、 Rhodococcus、 及 び Norcardia種 か ら 選 択 さ れ る 。
30
【００１１】
発明の要約
本 発 明 は 、 特 定 の 種 の Rhodococcus及 び Brevibacteriumに よ る 、 相 当 す る ケ ト 基 含 有 化
合 物 の 還 元 に よ る ( 2R,3S )-1-ハ ロ -2-ヒ ド ロ キ シ -3-(保 護 )ア ミ ノ -4-置 換 ブ タ ン 類 製 造 の
新規な立体選択的方法に関する。生成物は高収率かつ良好なジアステレオマー純度で得ら
れる。
【００１２】
発明の詳細な説明
本 発 明 は 、 以 下 の 式 で 表 さ れ る ( 2R,3S )-1-ハ ロ -2-ヒ ド ロ キ シ -3-(保 護 )ア ミ ノ -4-置 換
ブタン類の有利な合成方法を提供する。
【００１３】
【化９】
40
(6)
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10
式 中 、 Halは ハ ロ ゲ ン 、 好 ま し く は 塩 素 で あ り 、 Rは ア ル キ ル 、 置 換 ア ル キ ル 、 ア リ ー ル 、
及 び 置 換 ア リ ー ル か ら な る 群 か ら 選 択 さ れ 、 並 び に R1 は ア ミ ノ 官 能 基 の 保 護 基 で あ る 。
【００１４】
式 Ｉ で 表 さ れ る 置 換 ブ タ ン 類 は 、 ACE、 レ ニ ン 及 び HIVプ ロ テ ア ー ゼ の 阻 害 剤 で あ る 分 子
の 合 成 に お け る 中 間 体 と し て 有 用 で あ る 。 HIVプ ロ テ ア ー ゼ に 対 す る そ の よ う な 分 子 の 活
性 は 、 AIDSの よ う な レ ト ロ ウ イ ウ ス 感 染 の 治 療 に 非 常 に 有 効 で あ る 。 そ の よ う な 化 合 物 及
び そ の 使 用 に つ い て は 、 例 え ば 米 国 特 許 第 5,849,911号 明 細 書 に 記 載 さ れ て お り 、 こ れ ら
の 記 載 は 本 明 細 書 に 組 み 込 ま れ る も の と す る 。 米 国 特 許 第 5,849,911号 明 細 書 に 記 載 さ れ
る 特 に 重 要 な AIDS化 合 物 は [3S-(3R*,8R*,9R*,12R*)]-3,12-ビ ス (1,1-ジ メ チ ル エ チ ル )-8ヒ ド ロ キ シ -4,11-ジ オ キ ソ -9-(フ ェ ニ ル メ チ ル )-6{[4-(2-ピ リ ジ ニ ル )フ ェ ニ ル ]メ チ ル }-
20
2,3,6,10,13-ペ ン タ ア ザ レ テ ト ラ デ カ ン 二 酸 ジ メ チ ル エ ス テ ル で あ る 。 こ の 化 合 物 は 、 式
Iの ( 2R,3S )-1-ハ ロ -2-ヒ ド ロ キ シ -3-(保 護 )ア ミ ノ -4-置 換 ブ タ ン 類 か ら 直 接 合 成 し て も よ
い 。 本 発 明 の 方 法 に よ り 非 常 に 高 収 率 に 式 Iで 表 さ れ る 置 換 ブ タ ン 類 の ト ラ ン ス ( 2R,3S )エ
ナンチオマーを製造できるという事実は、上記治療学的化合物の有用な合成に非常に重要
である。
【００１５】
本 明 細 書 に お い て 以 下 の 用 語 は 下 記 の 定 義 を 有 す る 。 用 語 "ア ル キ ル "は １ ∼ ７ 炭 素 原 子 、
好ましくは１∼４炭素原子を有する、任意に置換された直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素
で あ る 。 "低 級 ア ル キ ル "と い う 表 現 は 、 任 意 に 置 換 さ れ た １ ∼ ４ 炭 素 原 子 を 有 す る 置 換 ア
ルキル基を表す。
30
【００１６】
用 語 "置 換 ア ル キ ル "は 、 例 え ば １ ∼ ４ の 置 換 基 （ 例 、 ハ ロ 、 ト リ フ ル オ ロ メ チ ル 、 ト リ フ
ルオロメトキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、シクロアルコキシ、ヘテロシクロオキシ、オ
キソ、アルカノイル、アリール、アリールオキシ、アラルキル、アルカノイルオキシ、ア
ミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、ヘ
テロシクロアミノ及び二置換アミノ）により置換されたアルキル基を意味する。ここでア
ルキル及び置換アルキルに与えられた定義は、アルコキシ基のアルキル部分についても適
用される。
【００１７】
用 語 "ア リ ー ル "は 、 環 部 分 に ６ ∼ １ ２ 炭 素 原 子 を 有 す る 単 環 ま た は 二 環 の 芳 香 族 炭 化 水 素
40
基であり、たとえば、フェニル、ナフチル、ビフェニル及びジフェニル基が挙げられ、各
々は置換されていてもよい。
用 語 "ア ラ ル キ ル "は ア ル キ ル 基 を 介 し て よ り 大 き な 部 分 （ larger entity） に 結 合 し た ア
ルキル基を意味し、例えばベンジル基が挙げられる。
【００１８】
用 語 "置 換 ア リ ー ル "は 、 例 え ば 、 １ ∼ ４ の 置 換 基 (例 、 ア ル キ ル 、 置 換 ア ル キ ル 、 ハ ロ 、
トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、シクロアルキル
オキシ、ヘテロシクロオキシ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルア
ミノ、ジアルキルアミノ、アラルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、ヘテロシクロアミ
ノ、アルカノイルアミノ、チオール、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクロ
50
(7)
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チオ、ウレイド、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルバミル、アル
コキシカルボニル、アルキルチオノ、アリールチオノ、アルキルスルホニル、スルホンア
ミ ド 、 ア リ ー ル オ キ シ 等 )に よ り 置 換 さ れ た ア リ ー ル 基 を 意 味 す る 。 置 換 基 は さ ら に 、 一
つ以上の、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリール、置換アルキル、置換ア
リール及びアラルキルからなる群から選択される基により置換されていてもよい。
用 語 "ハ ロ ゲ ン "ま た は "Hal"は 、 塩 素 、 臭 素 、 フ ッ 素 及 び ヨ ウ 素 を 意 味 し 、 塩 素 が 好 ま し
い。
【００１９】
用 語 "ア ミ ノ 官 能 基 上 の 保 護 基 "は 、 ア ミ ノ 基 が 、 結 合 し た 分 子 上 の い ず れ か で 起 こ る 反
応に関与しないように保護するそのアミノ基に結合し得る当業者が認識する基を意味する
10
。 そ の よ う な 基 の 中 で 好 ま し い の は t-ブ ト キ シ カ ル ボ ニ ル （ BOC） で あ る が 、 当 業 者 が 認
識するアミノ官能基保護基、一般にアルコキシカルボニル基〔例ベンジルオキシカルボニ
ル〕を同様に使用することができる。
式 Iで 表 さ れ る ( 2R,3S )-1-ハ ロ -2-ヒ ド ロ キ シ -3-(保 護 )ア ミ ノ -4-置 換 ブ タ ン 類 を 製 造 す
る本発明の方法の出発物質は、下記式で表される相当するケト基含有化合物である。
【００２０】
【化１０】
20
式 中 、 Hal、 R及 び R 1 は 上 記 で 定 義 し た と お り で あ る 。 式 IIで 表 さ れ る 化 合 物 を 、 文 献 で き
さ い さ れ 、 ま た 当 業 者 に 既 知 の 方 法 に よ り 製 造 す る こ と が で き る 。 式 IIで 表 さ れ る 化 合 物
を 形 成 す る 好 ま し い 方 法 は 、 同 時 継 続 特 許 出 願 Docket GY55に 開 示 さ れ て お り 、 そ の 記 載
30
を本明細書に組み入れるものとする。この方法において、下記式で表されるアリールエス
テル；
【００２１】
【化１１】
（ 式 中 、 R及 び R 1 は 上 記 で 定 義 し た と お り で あ り 、 R 2 は 水 素 ま た は ニ ト ロ で あ り 、 フ ェ ニ
ル基のオルトまたはパラ位で置換されていてもよい）を、イオウイリド、すなわち、下記
式で表される官能基を有する化合物と反応し；
【００２２】
【化１２】
40
(8)
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下記式で表される中間体ケトイリドを生成させる；
【００２３】
【化１３】
10
式 中 、 R及 び R 1 は 上 記 で 定 義 し た と お り で あ り 、 R 3 及 び R 4 は 、 ア ル キ ル 、 置 換 ア ル キ ル 及
びアリールからなる群より選択される。上記式で表されるケトイリド化合物を次に、塩素
源 、 好 ま し く は 塩 基 性 の 塩 素 源 、 最 も 好 ま し く は 塩 化 リ チ ウ ム 及 び 有 機 酸 (例 え ば メ タ ン
ス ル ホ ン 酸 )と 反 応 さ せ る こ と に よ り 、 式 IIで 表 さ れ る ケ ト 基 含 有 化 合 物 に 変 換 す る 。
【００２４】
上 記 式 Iで 表 さ れ る ( 2R,3S )-1-ハ ロ -2-ヒ ド ロ キ シ -3-(保 護 )ア ミ ノ -4-置 換 ブ タ ン 類 は 、
20
ACE、 レ ニ ン 及 び HIVプ ロ テ ア ー ゼ の 阻 害 剤 で あ る 分 子 の 合 成 に お け る 重 要 な 中 間 体 で あ る
。 HIVプ ロ テ ア ー ゼ に 対 す る そ の よ う な 分 子 の 活 性 は 、 AIDSの よ う な レ ト ロ ウ イ ル ス の 治
療 に お い て 非 常 に 有 用 で あ る 。 特 に 、 式 Iで 表 さ れ る ( 2R,3S )-1-ハ ロ -2-ヒ ド ロ キ シ -3-(保
護 )ア ミ ノ -4-置 換 ブ タ ン 類 は 適 す る 塩 基 と 処 理 し て 、 下 記 式 で 示 さ れ る 相 当 す る エ ポ キ シ
ド類に変換する。
【００２５】
【化１４】
30
【００２６】
上 記 式 で 表 さ れ る エ ポ キ シ ド 化 合 物 は 、 米 国 特 許 第 5,849,911号 明 細 書 に 記 載 さ れ る 特 に
重 要 な AIDS化 合 物 、 [3S-(3R*,8R*,9R*,12R*)]-3,12-ビ ス (1,1-ジ メ チ ル エ チ ル )-8-ヒ ド ロ
キ シ -4,11-ジ オ キ ソ -9-(フ ェ ニ ル メ チ ル )-6{[4-(2-ピ リ ジ ニ ル )フ ェ ニ ル ]メ チ ル }-2,3,6,
10,13-ペ ン タ ア ザ レ テ ト ラ デ カ ン 二 酸 ジ メ チ ル エ ス テ ル に 変 換 す る こ と が で き 、 前 記 明 細
書の記載は本明細書に組み入れるものとする。
40
【００２７】
上 記 式 IIで 表 さ れ る ( 3S )-1-ハ ロ -2-オ キ ソ -3-(保 護 )ア ミ ノ -4-置 換 ブ タ ン 類 の 立 体 選 択
的 還 元 に よ る 式 Iで 表 さ れ る ( 2R,3S )-1-ハ ロ -2-ヒ ド ロ キ シ -3-(保 護 )ア ミ ノ -4-置 換 ブ タ ン
類 の 形 成 を 、 本 発 明 に 従 い 、 酸 化 還 元 酵 素 と の 反 応 に よ り 、 ま た は 好 ま し く は 、 式 IIで 表
されるケトンの酵素的還元を触媒することができる酸化還元酵素を供給する微生物との反
応により、行うことができる。微生物の細胞は、無傷の湿潤細胞または凍結乾燥、スプレ
ー乾燥または熱乾燥細胞のような乾燥細胞の形態であってもよく、あるいは破裂細胞また
は細胞抽出物のような処理細胞物質のような形態であってもよい。多数の様々な微生物が
、 い く つ か の 形 態 の 酸 化 還 元 酵 素 を 供 給 す る こ と が 知 ら れ て い る が 、 本 発 明 に お い て 、 Rh
odococcus及 び Brevibacteriumの 選 択 さ れ た 種 の み が 、 式 IIに よ り 表 さ れ る 化 合 物 を 触 媒
50
(9)
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し て 目 的 の ( 2R,3S )-1-ハ ロ -2-ヒ ド ロ キ シ -3-(保 護 )ア ミ ノ -4-置 換 ブ タ ン 類 を 高 定 量 的 に
か つ 高 い エ ナ ン チ オ マ ー 収 率 で 生 成 す る こ と が 見 出 さ れ た 。 こ れ ら の 種 は 、 Rhodococcus
erythropolis ATCC 4277、 Rhodococcus erythropolis DSM 6971及 び Rhodococcus sp. ATC
C 21227、 Rhodococcus erythropolis ATCC 27854及 び Brevibacterium sp. ATCC 19653で
あ る 。 本 明 細 書 に お い て 用 語 "ATCC"は 、 個 々 の 微 生 物 の 寄 託 番 号 、 す な わ ち American Typ
e Culture Collection 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852の 番 号 で あ る
。 用 語 "DSM"は 、 the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Bransc
hweig, Germanyを 意 味 す る 。
【００２８】
本発明の酵素的還元法は、使用する微生物の発酵の次に行ってもよい。すなわち、二段階
10
の発酵及び還元としてもよい。または同時に、すなわち一段階でまたはインシツ発酵及び
還元で行ってもよい。後者において、微生物を適当な媒体中、特に窒素及び炭素源を含む
媒 体 （ medium、 培 地 、 培 養 液 ） 中 で 、 十 分 な 生 育 が 認 め ら れ る ま で 生 育 さ せ て も よ く 、 次
に 式 IIの 化 合 物 か ら 選 択 さ れ る 化 合 物 を そ れ に 添 加 し て も よ い 。 式 IIで 表 さ れ る 化 合 物 の
実質的に完全な変更が得られるまで酵素的還元をその後継続する。
【００２９】
二段階法において、微生物を上述した媒体中で、所定の酵素活性レベルを示すまで生育
し、そのレベルにおいて細胞を従来の分離技術により収穫し、及び適するバッファー剤等
を含有する微生物細胞懸濁液をそれから製造する。適するバッファー剤としては、ホスフ
ェ ー ト バ ッ フ ァ ー 類 、 特 に カ リ ウ ム ホ ス フ ェ ー ト バ ッ フ ァ ー 、 ト リ ス − HCl、 酢 酸 ナ ト リ
20
ウ ム 等 で あ る 。 ま た 、 水 を 用 い て 微 生 物 細 胞 の 懸 濁 液 を 製 造 し て も よ い 。 式 IIで 表 さ れ る
化合物を次にそれに添加して、酵素的還元を、変換が実質的に完了するまで継続する。い
ずれの例においても、適する生育媒体は、既に述べたように、炭素及び窒素源及び微量元
素を含む。誘導剤をまた添加してもよい。当業者が認識するように、誘導剤という用語は
、細胞内での目的の酵素的活性、すなわち酸化還元酵素活性を開始するか若しくは増強す
る い ず れ か の 化 合 物 を 意 味 す る 。 式 IIで 表 さ れ る ( 3S )-1-ハ ロ -2-オ キ ソ -3-(保 護 )ア ミ ノ 4-置 換 ブ タ ン 類 は 、 特 に 微 生 物 の 生 育 中 に 少 量 添 加 し た 場 合 に 誘 導 剤 で あ る と 考 え ら れ る
。
【００３０】
媒体のための適する炭素源としては、マルトース、ラクトース、グルコース、フルクトー
30
ス、グリセロール、ソルビトール、スクロース、スターチ、マンニトール、プロピレング
リコール等の糖類、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸及びその塩、グルタ
ミン酸ナトリウム等のアミノ酸及びその塩、及びエタノール、プロパノール等のアルコー
ル 類 が 挙 げ ら れ る 。 適 す る 窒 素 源 と し て は 、 N-Zア ミ ン A、 ト ウ モ ロ コ シ ス テ ィ ー プ （ stee
p） リ カ ー 、 大 豆 ミ ー ル 、 ビ ー フ 抽 出 物 、 酵 素 抽 出 物 、 糖 蜜 、 ベ イ カ ー ズ 酵 素 、 ト リ プ ト
ン 、 （ nutrisoy） 、 ペ プ ト ン 、 イ ー ス タ ミ ン （ yeastamin） 、 硝 酸 ナ ト リ ウ ム 、 硫 酸 ア ン
モニウム等が挙げられる。適する微量元素としては、ホスフェート類、及びマグネシウム
、マンガン、カルシウム、コバルト、ニッケル、鉄、ナトリウム及びカリウム塩を添加し
てもよい。本発明において使用される適する媒体は、これらのカテゴリーから選択される
複数の成分を含んでいてもよい。代表的な好ましい媒体は、これらに限定する意図ではな
いが、以下を（質量％）含む水性媒体である。
【００３１】
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10
20
30
【００３２】
上 述 し た 媒 体 の pHは 滅 菌 後 の も の で あ る 。 滅 菌 前 に ｐ Hは 約 ６ ∼ ８ に 調 整 す る こ と が 好 ま
しく、最も好ましくは約６．５に調整することが好ましい。媒体を次に、例えば約１２０
℃ で ３ ０ 分 間 加 熱 す る こ と に よ り 、 滅 菌 す る 。 滅 菌 後 、 媒 体 の pHを ６ ． ５ ∼ ７ ． ５ に 調 整
し 、 最 も 好 ま し く は 約 ７ ． ０ に 調 整 す る 。 微 生 物 の 生 育 及 び 還 元 プ ロ セ ス の 間 、 pHは 約 ４
．０∼９．０、好ましくは約６．０∼８．０の間に維持される。上述した成分から適する
塩 基 ま た は 酸 性 塩 を pHの 調 整 の た め に 使 用 す る こ と が で き る 。
【００３３】
40
反応混合物の温度は、還元プロセスに用いることができる熱エネルギーの基準であり、こ
の理由から、適する温度を維持してプロセスが完了するのに用いられる十分なエネルギー
を保証するようにしなければならない。本発明の方法に適する温度範囲は、約１５℃∼約
６０℃、好ましくは約２５℃∼約４０℃である。圧力は、本発明の方法の実行において決
定的な条件ではないことがわかっており、簡便のためには、典型的にほぼ大気圧を維持す
る。
【００３４】
本発明の方法は好ましくは有酸素条件で行う。反応混合物の攪拌及び通気はまた本発明の
方法に有用であり、生体内変換に利用できる酸素量に影響する。本発明の方法は、例えば
振盪フラスコ培養または発酵タンク中で、微生物が生育する間、一段階または二段階法で
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(11)
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上 述 し た よ う に 行 う こ と が 有 利 で あ る 。 約 ５ ０ ∼ １ ０ ０ ０ RPMの 範 囲 の 攪 拌 が 好 ま し く 、
約 ５ ０ ∼ ５ ０ ０ RPMの 範 囲 が 最 も 好 ま し い 。 媒 体 体 積 あ た り 、 か つ 1分 あ た り 約 ０ ． １ ∼ １
０ 体 積 の 空 気 （ ｖ ／ Ｖ ｔ ． ） を 通 気 す る の が 好 ま し く 、 媒 体 体 積 あ た り 、 か つ 1分 あ た り
約５体積の空気（ｖ／Ｖｔ．）を通気するのが特に好ましい。
【００３５】
式 IIで 表 さ れ る 化 合 物 の 完 全 な 変 換 に は 、 式 IIの 化 合 物 を 媒 体 に 添 加 し た 時 間 か ら 測 定 し
て、例えば、約４∼４８時間、典型的には約４∼２４時間必要である。媒体は水性ベース
であることが好ましいが、有機液体または混和性または非混和性、すなわち二相の有機／
水性液体混合物も同様に使用してもよい。
本 発 明 の 立 体 選 択 的 酵 素 還 元 方 法 は 、 ニ コ チ ン ア ミ ド ア デ ニ ン ジ ヌ ク レ オ チ ド （ NADH） の
10
よ う な 補 助 因 子 を 、 特 に 単 離 酵 素 を 用 い る 場 合 に 、 使 用 し て 行 っ て も よ い 。 NADHは 例 え ば
、その後再生して再利用してもよい。ホルメートデヒドロゲナーゼやグルコースデヒドロ
ゲ ナ ー ゼ の よ う な in situで NADHを 再 生 す る 更 な る 酵 素 を 用 い て も よ い 。 適 す る 水 素 ド ナ
ーとしては、分子水素、ホルメート（例、アルカリ金属またはアンモニウムホルメート）
、グルコース、ハイポホスファイト（次亜燐酸塩）、またはメチルビオロゲンを例とする
ビオロゲン存在下の電気化学的還元が挙げられる。また例えばエタノールまたはホルメー
ト を 用 い て 、 更 な る 酵 素 を 用 い ず に NADHを 再 生 す る こ と も で き る 。
【００３６】
式 IIの 化 合 物 を 、 出 発 原 料 と 媒 体 の 混 合 重 量 に 対 し て 約 ０ ． ２ ∼ ５ 質 量 ％ と な る よ う に 反
応媒体に添加することもさらに好ましい。出発原料に対する微生物の接種量は、上述した
20
時 間 で 式 IIの 化 合 物 の 酵 素 的 還 元 を 行 う の に 十 分 な 量 で あ り 、 一 般 的 に 約 ５ ∼ ３ ０ 質 量 ％
の細胞濃度である。所定の微生物に上述した好ましい反応パラメータを用いることにより
、反応収率は７０％より多くなり、最適には９９％を超え、また驚くべきことに、ジアス
テ レ オ マ ー 純 度 は ９ ３ ％ よ り 高 く な り 、 最 適 に は 、 式 Iの 化 合 物 の 目 的 の エ ナ ン チ オ マ ー
が ９ ９ ％ を 超 え る 。 本 発 明 の 還 元 方 法 の 生 成 物 、 す な わ ち 式 Iの 化 合 物 は 、 適 す る い ず れ
の単離および／または精製方法、例えば抽出、蒸留、結晶化、カラムクロマトグラフィー
等の方法、によって回収してもよい。
【００３７】
本発明の実行において、上述した本発明の観点から遊離することなく、様々な実施態様及
び変更が当業者に明らかであり、また当業者により容易に行われることが理解される。従
30
って、請求の範囲の観点は、上述した記載そのものに限定されることなく、むしろ、当業
者に等価なものとして取り扱われる全ての特性及び態様を含み、本発明に存在する特許性
のある新規な性質の全てを包含するように請求の範囲は構成される。以下の実施例を参照
して本発明をさらに説明する。
【００３８】
実施例１
立 体 選 択 的 酵 素 的 還 元 :全 細 胞 の 使 用 − 一 段 階 法
Rhodococcus erythropolis ATCC 4277細 胞 (1 mL)を 、 100 mLの 媒 体 １ に 、 500 mLフ ラ ス
コ 中 で 、 接 種 し 、 振 盪 機 上 で 28℃ で か つ 200 RPMで 22時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 50細 胞 ブ
ロ ス の pHは １ Mリ ン 酸 カ リ ウ ム バ ッ フ ァ ー で 7.0に 調 整 し た 。 グ ル コ ー ス を 細 胞 ブ ロ ス に 25
40
mg/mLで 添 加 し 、 50 mgの (1S)-[N-(1-ベ ン ジ ル -2-オ キ ソ -3-ク ロ ロ )プ ロ ピ ル ]カ ル バ ミ ン
酸 t-ブ チ ル エ ス テ ル （ 基 質 ） を そ れ に 加 え た 。 生 体 内 変 換 (還 元 )を 振 盪 機 上 で 28℃ で か つ
200 RPMで 行 っ た 。 所 定 の 時 間 に 、 反 応 混 合 物 を 60:40の t-ブ チ ル メ チ ル エ ー テ ル 及 び ト ル
エ ン の 混 合 物 の 2倍 体 積 で ク エ ン チ し 、 0.2ミ ク ロ ン フ ィ ル タ ー を 介 し て 分 離 し た 有 機 相 を
ろ 過 し 、 集 め た 。 2 mLの 有 機 相 を 窒 素 気 流 下 蒸 発 さ せ て 乾 燥 し 、 残 渣 を 1 mLの ア セ ト ニ ト
リ ル に と り 、 ろ 過 し て 、 (1S, 2R )-[N-(1-ベ ン ジ ル -2-ヒ ド ロ キ シ -3-ク ロ ロ )プ ロ ピ ル ]カ ル
バ ミ ン 酸 t-ブ チ ル エ ス テ ル （ 生 成 物 ） に つ い て HPLCに よ り 分 析 し た 。 結 果 を 下 記 表 １ に 要
約した。
【００３９】
表１
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10
【００４０】
実施例２
全 細 胞 使 用 :二 段 階 法
本 実 施 例 に お け る 基 質 及 び 生 成 物 は 実 施 例 １ と 同 様 で あ る 。 Rhodococcus erythropolis
ATCC 4277及 び Rhodococcus erythropolis DSM 6971(1 mL)の 細 胞 を そ れ ぞ れ 上 述 し た 100
mLの 媒 体 １ に 500 mLフ ラ ス コ 中 で 接 種 し 、 振 盪 機 上 で 28℃ で か つ 280 RPMで 48時 間 イ ン キ
ュ ベ ー ト し た 。 100 mLの 各 培 養 物 を 、 発 酵 槽 中 で 混 合 し た 15 mLの 媒 体 １ に 接 種 し た 。 発
酵 槽 中 で の 生 育 を 25℃ 、 15 LPM(リ ッ ト ル ／ 分 )の 通 気 及 び 500 RPMの 攪 拌 の 条 件 下 36時 間
20
行 っ た 。 細 胞 を 発 酵 槽 か ら 収 穫 し 、 (1S)-[N-(1-ベ ン ジ ル -2-オ キ ソ -3-ク ロ ロ )プ ロ ピ ル ]
カ ル バ ミ ン 酸 t-ブ チ ル エ ス テ ル (基 質 )か ら (1S, 2R )-[N-(1-ベ ン ジ ル -2-ヒ ド ロ キ シ -3-ク ロ
ロ )プ ロ ピ ル ]カ ル バ ミ ン 酸 t-ブ チ ル エ ス テ ル (生 成 物 )へ の 酵 素 的 変 換 （ 生 体 内 変 換 ） に 使
用 し た 。 細 胞 懸 濁 液 を 、 20グ ラ ム の 細 胞 を 100 mLの 64 mMリ ン 酸 カ リ ウ ム バ ッ フ ァ ー （ pH7
.0） 中 へ 懸 濁 す る こ と に よ り 製 造 し た 。 各 件 濁 液 へ 、 25 mg/mLの グ ル コ ー ス 及 び 所 定 の 基
質 を 添 加 し た 。 基 質 か ら 生 成 物 へ の 生 体 内 変 換 を 28℃ で 160 RPMで 振 盪 機 上 に て 行 っ た 。
所定の時間において、反応混合物をクエンチし、生成物を得て、実施例１と同様に分析し
た。結果を下記の表２に要約した。
【００４１】
表２
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表１及び表２の結果は、目的の生成物が本発明の方法により高収率かつ非常に高いジアス
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テレオマー純度で得られることを示している。
【００４２】
実施例３
生体内変換における種々の微生物種の使用：全細胞
実施例１に記載の方法に従った生体内変換を、一連の微生物を使用して行った。結果を表
３に示す。
【００４３】
表３
10
20
30
【００４４】
表３の結果は本発明の微生物が明らかに許容し得る収率（すなわち、７０％を超える）と
40
許容し得るジアステレオマー純度（すなわち９０％を超える）で生成物を生成することを
示す。
【００４５】
実施例４
細胞抽出物及び補助因子の使用
本 実 施 例 の 方 法 に お け る 基 質 及 び 生 成 物 は 上 述 の 実 施 例 に 記 載 し た も の で あ る 。 Rhodococ
cus erythropolis ATCC 4277の 細 胞 を 上 述 し た よ う に 媒 体 1上 で 生 育 さ せ た 。 細 胞 （ 150グ
ラ ム ） を 100 mLの pH7.0リ ン 酸 カ リ ウ ム バ ッ フ ァ ー 中 に 懸 濁 し た 。 細 胞 懸 濁 液 を 4℃ で 、 13
00psi圧 力 に お い て マ イ ク ロ フ ル イ ダ イ ザ ー （ microfluidizer） で 崩 壊 さ せ た 。 崩 壊 し た
細 胞 懸 濁 液 を 12000RPMで 30分 間 遠 心 分 離 を 行 っ た 。 透 明 な 上 澄 み （ “ 細 胞 抽 出 物 ” ） を 、
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基質の生成物への生体内変換に使用した。
【００４６】
細 胞 抽 出 物 の 一 部 (10 mL)に 10mgの 基 質 、 グ ル コ ー ス デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ （ 35ユ ニ ッ ト ） 、 0
.7 mM NAD+(ニ コ チ ン ア ミ ド ア デ ニ ン ジ ヌ ク レ オ チ ド )及 び 200 mgの グ ル コ ー ス を 追 加 し た
。 反 応 を pH6.0に お い て 、 150RPMの 攪 拌 及 び 30℃ で 行 っ た 。 試 料 を 定 期 的 に 反 応 媒 体 か ら
抜 き 出 し て 分 析 し た 。 生 成 物 を 95％ 収 率 で か つ >98％ ジ ア ス テ レ オ マ ー 純 度 で 得 た 。 こ の
実 施 例 に お い て 、 グ ル コ ー ス デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 、 NAD+及 び グ ル コ ー ス を 用 い て 、 下 記 に 示
す よ う に NADH補 助 因 子 を 再 生 し た 。
【００４７】
【化１５】
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フロントページの続き
微生物の受託番号 ATCC 21227
微生物の受託番号 ATCC 27854
微生物の受託番号 ATCC 19653
微生物の受託番号 DSM 6971
(74)代理人 100074228
弁理士 今城 俊夫
(74)代理人 100084009
弁理士 小川 信夫
(74)代理人 100082821
弁理士 村社 厚夫
(74)代理人 100086771
弁理士 西島 孝喜
(74)代理人 100084663
弁理士 箱田 篤
(72)発明者 ペイテル ラメッシュ エヌ
アメリカ合衆国 ニュージャージー州 ０８８０７ ブリッジウォーター カボット ヒル ロー
ド ５７２
(72)発明者 チュ リンダ
アメリカ合衆国 ニュージャージー州 ０８８１６ イースト ブランズウィック オーヴァーヒ
ル ロード ９
審査官 左海 匡子
(56)参考文献 特開平０９−０００２８５（ＪＰ，Ａ）
特開平０２−２９５９７０（ＪＰ，Ａ）
特開平０２−２９５９６９（ＪＰ，Ａ）
特開平０６−２３３６９５（ＪＰ，Ａ）
特開平１１−１０３８７８（ＪＰ，Ａ）
特開昭６１−１０８３９４（ＪＰ，Ａ）
特開平０９−２８９８９７（ＪＰ，Ａ）
Journal of American Oil Chemist's Scoiety，米国，１９９９年，Vol.76, No.11, p.1275-128
1
(58)調査した分野(Int.Cl.，ＤＢ名)
C12P 13/02
C07D301/26
C07D303/36
BIOSIS/WPI(DIALOG)
JSTPlus(JDream2)
CA(STN)
MEDLINE(STN)
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