SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0

SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
SeqCap Epi Enrichment System
日本語マニュアル v1.0
英語版 Version 1.0 対応
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
もくじ
1.
必要機器・試薬 ............................................................................................................................................... 3
1.1.
SeqCap Epi Enrichment Kit ................................................................................................................. 3
1.2.
Roche から販売されている試薬・消耗品 .............................................................................................. 4
1.3.
一般研究用試薬・消耗品 ........................................................................................................................ 5
1.4.
一般実験機器 .......................................................................................................................................... 6
2.
はじめに .......................................................................................................................................................... 7
2.1.
ワークフロー .......................................................................................................................................... 7
2.2.
本マニュアルで使用されている用語 ...................................................................................................... 8
3.
実験の前に ...................................................................................................................................................... 9
4.
ライブラリ調製 ............................................................................................................................................. 10
4.1.
ゲノム DNA の調製 ............................................................................................................................... 10
4.2.
Bisulfite-conversion Control の調製 .................................................................................................. 10
4.3.
ゲノム DNA の断片化 ........................................................................................................................... 11
4.4.
Index アダプターの溶解 ....................................................................................................................... 12
4.5.
ライブラリ調製用の各反応マスターミックスの準備 ........................................................................... 13
4.6.
エンドリペア反応と精製 ...................................................................................................................... 14
4.7.
A-テーリング反応と精製 ...................................................................................................................... 16
4.8.
アダプターライゲーション反応と精製 ................................................................................................. 19
4.9.
Dual SPRI (短鎖および長鎖ライブラリの除去).................................................................................... 22
5.
サンプルライブラリのバイサルファイト変換および精製 ............................................................................ 26
6.
Pre-Capture LM-PCR 反応と反応産物の精製 .............................................................................................. 28
6.1.
Pre-Capture LM-PCR 用プライマーの準備 ......................................................................................... 28
6.2.
Pre-Capture LM-PCR の準備 ............................................................................................................... 29
6.3.
Pre-Capture LM-PCR 増幅 .................................................................................................................. 30
6.4.
Pre-Capture LM-PCR 産物の精製........................................................................................................ 30
6.5.
Pre-Capture LM-PCR 産物の品質確認 ................................................................................................ 33
7.
ハイブリダイゼーション............................................................................................................................... 34
7.1.
SeqCap Epi プローブプールの分取および保存 .................................................................................. 34
7.2.
SeqCap HE オリゴの準備 .................................................................................................................... 35
7.3.
ハイブリダイゼーションの準備と開始 ................................................................................................. 36
8.
洗浄と回収 .................................................................................................................................................... 40
8.1.
洗浄用バッファーの準備 ...................................................................................................................... 40
8.2.
Capture Beads の準備 ......................................................................................................................... 41
8.3.
Capture Beads とハイブリダイゼーション DNA の結合 .................................................................... 43
8.4.
DNA が結合した Capture Beads の洗浄 ............................................................................................. 44
9.
Post-Capture LM-PCR 反応と反応産物の精製 ............................................................................................ 47
9.1.
Post-LM PCR オリゴの準備................................................................................................................. 47
9.2.
Post-LM PCR の準備 ........................................................................................................................... 48
9.3.
Post-Capture LM-PCR 増幅 ................................................................................................................ 49
9.4.
Post-Capture LM-PCR 産物の精製 ...................................................................................................... 50
9.5.
Post-Capture LM-PCR 産物の品質確認 .............................................................................................. 53
9.6.
シークエンシングに際しての注意 ........................................................................................................ 54
10. 付録 ............................................................................................................................................................... 55
10.1. Bisulfite-conversion Control による変換効率の算出 ......................................................................... 55
10.2. トラブルシューティング ...................................................................................................................... 56
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もくじ
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
1.
1.1.
必要機器・試薬
SeqCap Epi Enrichment Kit
構成品
SeqCap Epi
プローブプール
CD/DVD
・
・
・
備考
CpGiant, Choice S / M / L, Developer S / M / L / XL などのプローブ
プール溶液
デザイン情報・アノテーション情報が記載されたファイル (.gff
/.bed ) やユーザーズガイド (.pdf) が保存されています。
拡張子 bed のファイルは、UCSC ゲノムブラウザにより内容を確認できます。
(http://genome.ucsc.edu/)
Roche NimbleGen SignalMap ソフトウェア v2.0 以降では、拡張子 bed のファイルと拡張子 gff
(general feature format) のファイルの内容を確認できます。
(www.nimblegen.com/products/software/signalmap/)
Roche NimbleGen SignalMap ソフトウェア v1.9 では、拡張子 gff のファイルのみ内容を確認でき
ます。
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1 必要機器・試薬
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
1.2.
Roche から販売されている試薬・消耗品
試薬・消耗品
品番
仕様
備考
PCR grade water
03315843001
4 x 25 ml
07137923001
10 反応
07137974001
50 反応
KAPA High Throughput Library
Preparation Kit
07138008001
96 反応
SeqCap Adapter Kit A
07141530001
各 96 反応
SeqCap Adapter Kit B
07141548001
(12 インデックス×8 反応)
SeqCap Epi Reagent Kit Plus
07185723001
24 反応 (①+②+③+④) 注２）
SeqCap Epi Reagent Kit
07185715001
24 反応 (①+②+③) 注３）
いずれか
KAPA Library Preparation Kit
個別試薬キット注
4）
注１）
いずれか、または
下表の個別試薬キ
ットにて準備
品番
仕様・備考
SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit ①
05634261001
24 反応
SeqCap Epi Accessory Kit ②
07145519001
24 反応
SeqCap Epi Accessory Kit
07185707001
96 反応
SeqCap HE-Oligo Kit A ③
06777287001
各 96 反応
SeqCap HE-Oligo Kit B
06777317001
(12 インデックス×8 反応) 注１）
SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit ④
06977952001
24 反応
注１）サンプルライブラリ作製時に SeqCap Adapter Kit からどのアダプターを選択・ライゲーションす
るかによって、アダプター配列同士のハイブリダイゼーションをブロックするために必要な HE オ
リゴは異なりますのでご注意ください。SeqCap Adapter Kit と SeqCap HE-Oligo Kit の Kit A、Kit B
はそれぞれ相互に対応しています。
注２）本キットは、① SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit (05634261001) と、② SeqCap Epi
Accessory Kit (07145519001) 、③ SeqCap HE-Oligo Kit A (06777287001) 、④ SeqCap EZ Pure
Capture Bead Kit (06977952001) の４種類のキットがセットになったキットになります。
注３）本キットは、① SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit (05634261001) と、② SeqCap Epi
Accessory Kit (07145519001)、③ SeqCap HE-Oligo Kit A (06777287001) の３種類のキットがセッ
トになったキットになります。
注４）SeqCap Epi Reagent Kit Plus または SeqCap Epi Reagent Kit を利用されない場合には、各構成キ
ットは個別にご準備いただくことも可能です。
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1 必要機器・試薬
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
1.3.
一般研究用試薬・消耗品
機器
販売元
品番
備考
TE Buffer, 1 X Solution pH 8.0,
Low EDTA
Affymetrix USB
75793
100 ml
EZ DNA Methylation-Lightning
Kit
Zymo Research
50 reactions
D5030
200 reactions
D5031
Agilent High Sensitivity DNA
1000 Kit
Agilent
5067-4626
1 kit (10 chips)
Agilent DNA 1000 Kit
Agilent
5067-1504
1 kit (25 chips)
Ethanol, 200 proof (absolute), for
molecular biology
Sigma-Aldrich
E7023-500ML
500 ml
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit
Snap-Cap 6x16mm (25)
Covaris
520045
25 本、注）
10mM Tris-Hcl pH8.0
指定なし
Agencourt AMPure XP reagent
Beckman Coulter
A63880, A63881,
A63882
5 ml, 60 ml, 450 ml
チューブ類
指定なし
フィルターチップ
指定なし
0.2 ml / 1.5 ml
注）Covaris Ultra Sonicator による DNA 断片化の際に使用する消耗品です。
5 / 59
1 必要機器・試薬
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
1.4.
一般実験機器
機器
DNA 遠心濃縮機
(1.5 ml チューブが使用可であること)
販売元
Covaris など
DynaMag-2 Magnet (16 x 1.5 ml tube
holder)
Life
Technologies
0.2 ml tube 用マグネットスタンド
指定なし
ヒートブロック
指定なし
ウォーターバスまたはオーブン (インキ
ュベーター)
指定なし
(16,000 x g で遠心できること)
備考
指定なし
DNA 断片化装置
1.5 ml チューブ遠心機
品番
例：
Covaris Ultra Sonicator
#S220 や #E210 等
12321D
例：
DynaMag-96 Side
Magnet (Life
Technologies, 12331D)
指定なし
PCR プレート遠心機
(PCR、qPCR でプレートを使用する場
合)
指定なし
Spectrophotometer
NanoDrop
Bioanalyzer 2100
Agilent
サーマルサイクラー
指定なし
ボルテックスミキサー
指定なし
ピペッター一式 (2-1000 μl)
指定なし
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1 必要機器・試薬
ND-1000 以降
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
2.
はじめに
本マニュアルでは、SeqCap Epi Enrichment Kit を用いた、シングルプレックスのサンプルライブラリのキャプ
チャー手順を示しています (下図ワークフロー)。本マニュアルに従っていただくことで、Illumina 社製シークエ
ンサーにて直接シークエンシング可能なキャプチャーされた gDNA 断片が調製されます。
Note：本プロトコールは SeqCap Epi Enrichment Kit の全ての製品群に適用可能です。
お使いのマニュアルが最新のものかどうかにつきましては、www.nimblegen.com/lit/でご確認ください。
2.1.
ワークフロー
SeqCap Epi Enrichment Kit を用いた実験の大まかな流れは以下の様になります：
①
ゲノム DNA から KAPA Library Preparation Kit を用いてサンプルライブラリを準備
②
EZ DNA Methylation-Lightning Kit を用いたサンプルライブラリのバイサルファイト変換
③
バイサルファイト変換済みのサンプルライブラリの KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix による増幅
④
増幅済みサンプルと SeqCap Epi プローブプールとのハイブリダイゼーション
⑤
キャプチャー済みサンプルの増幅
⑥
Illumina Genome Analyzer II や HiSeq、MiSeq などを用いてキャプチャー・増幅されたゲノム DNA 断片を
シークエンシング
下図は上記一連の実験のワークフローになります。
各ステップ横に記載されている所要時間は、１キャプチャー反応を実施する場合を想定しています。各ステップ
の所要時間の間に記載されている時間はインキュベーション時間を示しています。
操作
所用時間
サンプルライブラリの調製
6 時間
サンプルライブラリのバイサルファイト変換
2 時間
LM-PCRによるバイサルファイト変換済みの
サンプルライブラリの増幅
2 時間
ハイブリダイゼーションの準備
1 時間
3 日間インキュベーション
洗浄とキャプチャーされたDNAの回収
2 時間
LM-PCRによるキャプチャーされたDNAの増幅
3 時間
シークエンシングへ
図：Illumina 社の各種のシークエンサーを用いた SeqCap Epi Enrichment Kit 実験のワークフロー
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2.1 ワークフロー
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
2.2.
本マニュアルで使用されている用語
Bisulfite-conversion Control (BCC)：
ゲノム DNA サンプルに添加するコントロールゲノム DNA。サンプルゲノム DNA と同じ反応溶液中でライブラ
リ調製、バイサルファイト変換、キャプチャー、シークエンシングされます。
LM-PCR：
Ligation Mediated PCR の略。本マニュアルでは、シークエンシングアダプターに相補的なプライマーを使用し
た PCR を指します。
シークエンスキャプチャー (キャプチャー)：
ゲノム DNA からターゲットとした領域を濃縮する実験。本マニュアルでは、増幅したサンプルライブラリと
SeqCap Epi プローブプールとのハイブリダイゼーションと、それに続く洗浄の工程を指します。
SeqCap Epi プローブプール (SeqCap Epi エンリッチメントシステム)：
シークエンスキャプチャーを実施する為の Roche NimbleGen から供与されるビオチンが付与された長鎖のオリ
ゴヌクレオチドのセット。製品名：SeqCap Epi CpGiant Enrichment Kit や SeqCap Epi Choice S / M / L
Enrichment Kit、SeqCap Epi Developer S / M / L / XL Enrichment Kit。
サンプルライブラリ：
ゲノム DNA を断片化し、シークエンシングのプラットフォームに即した特異的リンカーがライゲーションされ
たショットガンライブラリ。本マニュアルでは、シークエンスキャプチャー前に LM-PCR で増幅される前の状
態を指します。
Pre-Capture LM-PCR 産物 (バイサルファイト変換後に増幅したサンプルライブラリ)：
バイサルファイト変換したサンプルライブラリを LM-PCR により増幅したサンプル。本マニュアルではシークエ
ンスキャプチャー前の状態を指します。
Post-Capture LM-PCR 産物：
キャプチャー済み DNA サンプルを LM-PCR により増幅したサンプル。シークエンシング反応に進めるサンプル
を指します。
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2.2 本マニュアルで使用されている用語
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
3.
実験の前に
・
キット名称について
SeqCap HE-Oligo Kit A / B は、これまで SeqCap EZ HE-Oligo Kit A / B という名称で取り扱っておりました。
構成や組成に変更はありませんが、構成物の名称が TS-HE Universal Oligo と TS-INV-HE Index Oligo から、
それぞれ SeqCap HE Universal Oligo と SeqCap HE Index Oligo と変更になりました。お手元の試薬と本マ
ニュアルに記載の名称が一致しない場合がありますのでご注意ください。
・
サーマルサイクラーにプログラムを入力しておきます。プログラムは下記の箇所に記載されています。
4章6項④
(14 ページ)
4章7項④
(17 ページ)
4章8項④
(19 ページ)
5章⑤
(26 ページ)
6章3項
(30 ページ)
7章3項⑬
(39 ページ)
9章3項
(49 ページ)
・
SeqCap Epi プローブプールの保存方法に関しては、7 章 1 項 (34 ページ) を参照ください。
・
下記試薬は使用するまで -15 ∼ -25 ℃で保存します。
KAPA Library Preparation Kit
(Roche, 07137923001 or 07137974001 or 07138008001)
SeqCap Adapter Kit A / B
(Roche, 07141530001 and/or 07141548001)
SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit
(Roche, 05634261001)
SeqCap Epi Accessory Kit
(Roche, 07145519001 or 07185707001)
SeqCap HE-Oligo Kit A / B
(Roche, 06777287001 and/or 06777317001)
注）弊社販売以外の試薬につきましては、各メーカーの指示に従い保管ください。
・
下記試薬は使用するまで+2 ℃∼+8 ℃で保存します。
SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit
(Roche, 06977952001)
SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit は凍結させないでください。
注）弊社販売以外の試薬につきましては、各メーカーの指示に従い保管ください。
・
コンタミネーションの防止のために実験用手袋 (パウダーフリー) を着用してください。
・
全ての遠心操作は特に記載の無い限り +15 ∼ +25 ℃ の設定で行ってください。
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3 実験の前に
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
4.
ライブラリ調製
本章では、KAPA Library Preparation Kit と SeqCap Adapter Kit、SeqCap Epi Accessory Kit を用いて 1μg のゲ
ノム DNA の初発サンプルからサンプルライブラリを調製する方法について記載します。
本章は、KAPA Library Preparation Kit に付属されるプロトコール (KAPA Library Prep Kit Technical Data Sheet,
KR0935 ‒ v1.13) に準拠しています。操作方法の詳細につきましては、KAPA Library Prep Kit Technical Data
Sheet, KR0935 ‒ v1.13 をご参照ください。
断片化装置 (Covaris Ultra Sonicator 等) の操作は、機器付属のマニュアルに従ってください。
4.1.
ゲノム DNA の調製
インプットゲノム DNA を断片化の条件に沿う濃度・液量に調製します。
Qubit や PicoGreen などにより正確に定量してください。

(推奨量) 1μg (Covaris Ultra Sonicator を使用する場合、容量を 46.7μl 以下にする)

OD260/280 ： 1.8∼2.0

分解、RNA のコンタミネーション、不純物の混入などが無いこと
TE Buffer, 1 X Solution pH 8.0, Low EDTA (Affymetrix USB、75793) を溶媒としてください。水を
溶媒とした断片化は推奨しておりません。
4.2.
Bisulfite-conversion Control の調製
①
SeqCap Epi Accessory Kit の PCR Grade Water (ボトル “H2O”) を融解します。
②
SeqCap Epi Accessory Kit の SeqCap Epi Capture & Bisulfite-conversion Control (バイアル “CC”) を融解し、
スピンダウンします。
③
PCR Grade Water (ボトル ”H2O”) 1 ml を、SeqCap Epi Capture & Bisulfite-conversion Control (バイア
ル ”CC”) に添加します。
1 ml
ボトル “H2O”
バイアル “CC”
④
Vortex などにより十分に溶解させた後、スピンダウンします。
⑤
PCR Grade Water (ボトル ”H2O”) 990μl を新しいチューブに分注します。
990μl
ボトル “H2O”
新しいチューブ
10 / 59
4.1 ゲノム DNA の調製・4.2 Bisulfite-conversion Control の調製
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
⑥
本項 ④ の溶液 10μl を、本項 ⑤ のチューブ (990μl の PCR Grade Water) に添加します。
10μl
チューブ④ “CC” (1 ml)
PCR Grade Water (990μl)
⑦
Vortex などにより十分に混合させた後、スピンダウンします。
⑧
次の工程に使用できる希釈済み Bisulfite-conversion control 溶液が調製されました。
希釈済み Bisulfite-conversion control 溶液 (1 ml)
凍結融解を繰り返さないために適当量ずつ分注し、-15 ∼ -25 ℃で保存してください。
4.3.
ゲノム DNA の断片化
①
希釈済み Bisulfite-conversion control 溶液 5.8μl (4 章 2 項 ⑧) を 1μg のゲノム DNA 溶液に添加し、3 秒間
の Vortex などにより十分に混合させた後、スピンダウンします。
②
Covaris Ultra Sonicator を使用する場合には、本項 ① の溶液を TE Buffer, 1 X Solution pH 8.0, Low EDTA
(Affymetrix USB、75793) で 52.5μl にメスアップします。
断片化用ゲノム DNA 溶液
1 サンプルあたりの容量
ゲノム DNA 溶液：1μg 相当
*μl
希釈済み Bisulfite-conversion control 溶液
5.8μl
TE Buffer, 1 X Solution pH 8.0, Low EDTA
*μl
total
52.5μl
③
Covaris Ultra Sonicator 等により、断片化後の DNA 平均長が 180∼220 bp となるように断片化します。
④
200μl PCR チューブまたは 96 well プレートに、断片化ゲノム DNA 溶液 50μl を移し替えます。
液量が 50μl を超えるような場合には、AMPure Beads XP を用いた SPRI ビーズ精製を実施して
液量を 50μl としてください。
11 / 59
4.3 ゲノム DNA の断片化
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
4.4.
Index アダプターの溶解
①
SeqCap Adapter Kit A または B の PCR Grade Water (バイアル “H2O”) を融解します。
②
SeqCap Index Adapter (バイアル “H2O”と”LP1” 以外のバイアル) をスピンダウンします。
 SeqCap Adapter Kit B (Roche, 07141548001)
 SeqCap Adapter Kit A (Roche, 07141530001)
バイアル No.
品名
バイアル No.
品名
A2
SeqCap Index Adapter 2
A1
SeqCap Index Adapter 1
A4
SeqCap Index Adapter 4
A3
SeqCap Index Adapter 3
A5
SeqCap Index Adapter 5
A8
SeqCap Index Adapter 8
A6
SeqCap Index Adapter 6
A9
SeqCap Index Adapter 9
A7
SeqCap Index Adapter 7
A10
SeqCap Index Adapter 10
A12
SeqCap Index Adapter 12
A11
SeqCap Index Adapter 11
A13
SeqCap Index Adapter 13
A20
SeqCap Index Adapter 20
A14
SeqCap Index Adapter 14
A21
SeqCap Index Adapter 21
A15
SeqCap Index Adapter 15
A22
SeqCap Index Adapter 22
A16
SeqCap Index Adapter 16
A23
SeqCap Index Adapter 23
A18
SeqCap Index Adapter 18
A25
SeqCap Index Adapter 25
A19
SeqCap Index Adapter 19
A27
SeqCap Index Adapter 27
これらは以降 SeqCap Index Adapter と総称しますが、各 SeqCap Index Adapter # の
デックス配列の種類を示す数値が入ります。
③
# はイン
各 SeqCap Index Adapter のバイアルに、PCR Grade Water (バイアル ”H2O”) を 50μl ずつ添加します。
開封時に乾燥オリゴ DNA 粉末の飛散にご注意ください。
50μl
PCR Grade Water
(バイアル ”H2O”)
④
各 SeqCap Index Adapter
Vortex などにより十分に溶解させた後、スピンダウンします。10μM の各 SeqCap Index Adapter 溶液が調
製されました。
-15 ∼ -25 ℃で保存できます。
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4.4 Index アダプターの溶解
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ライブラリ調製用の各反応マスターミックスの準備
4.5.
①
必要試薬を氷上で融解します。







KAPA Library Preparation Kit の KAPA End Repair Buffer (10X)
KAPA Library Preparation Kit の KAPA End Repair Enzyme Mix
KAPA Library Preparation Kit の KAPA A-Tailing Buffer (10X)
KAPA Library Preparation Kit の KAPA A-Tailing Enzyme
KAPA Library Preparation Kit の KAPA Ligation Buffer (5X)
KAPA Library Preparation Kit の KAPA DNA Ligase
PCR grade water (Roche, 03315843001)
必ず氷上で融解、調製を行ってください。
ビーズの乾燥を防ぐ為に、予め本項 ② ∼ ④ のマスターミックスを調製しておいてください。
本項 ② ∼ ④ のマスターミックスの混合に Vortex は使用しないでください。
ピペッティング誤差を見込んでマスターミックスの容量を計算してください。
本項 ② ∼ ④ のマスターミックスは 4℃で 1 週間、-20℃で 2 週間まで保存できます。-20℃で保存
する場合には、凍結融解は 3 回以内に抑えてください。
いずれかの反応工程後に一時作業を中断する場合には、専用のマスターミックスを反応後のチュー
ブに添加する必要があります。その組成と中断・再開の方法については KAPA Library Prep Kit
Technical Data Sheet, KR0935 ‒ v1.13 の指示に従ってください。
②
エンドリペア反応のマスターミックスを調製します。
1 反応あたりの
容量
8 反応時
(+5%)
48 反応時
(+5%)
96 反応時
(+20%)
PCR grade Water
8μl
67μl
403μl
922μl
10X KAPA End Repair Buffer
7μl
59μl
353μl
806μl
KAPA End Repair Enzyme Mix
5μl
42μl
252μl
576μl
20μl
168μl
1008μl
2304μl
1 反応あたりの
容量
8 反応時
(+5%)
48 反応時
(+5%)
96 反応時
(+20%)
PCR grade Water
42μl
353μl
2117μl
4838μl
10X KAPA A-Tailing Buffer
5μl
42μl
252μl
576μl
KAPA A-Tailing Enzyme
3μl
25μl
151μl
346μl
50μl
420μl
2520μl
5760μl
エンドリペア反応マスターミックス
total
③
A-テーリング反応のマスターミックスを調製します。
A テーリング反応マスターミックス
total
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4.5 ライブラリ調製用の各反応マスターミックスの準備
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
④
ライゲーション反応のマスターミックスを調製します。
1 反応あたりの
容量
8 反応時
(+5%)
48 反応時
(+5%)
96 反応時
(+20%)
PCR grade Water
30μl
252μl
1512μl
3456μl
5X KAPA Ligation Buffer
10μl
84μl
504μl
1152μl
KAPA T4 DNA Ligase
5μl
42μl
252μl
576μl
45μl
378μl
2268μl
5184μl
ライゲーション反応マスターミックス
total
エンドリペア反応と精製
4.6.
①
4 章 6 項∼4 章 9 項で使用する必要試薬の準備をします。


Agencourt AMPure XP reagent を室温に置きます (使用する 30 分前)。
80％エタノールを準備します (200μl x サンプル数 x 8 + α)。
Agencourt AMPure XP reagent は凍結させないでください。使用前にメーカー提供のプロトコール
をご確認ください。
②
③
50μl の断片化 DNA 溶液のチューブ (4 章 3 項 ④) に、エンドリペア反応マスターミックス (4 章 5 項 ②) を
20μl 添加します。
エンドリペア反応
1 反応あたりの容量
断片化 DNA 溶液
50μl
エンドリペア反応マスターミックス
20μl
total
70μl
5 回、ピペッティングすることでよく混合します。
Vortex を使用せずに充分混合してください。
④
20 ℃ で 30 分間、サーマルサイクラーでインキュベーションします。
70μl
ヒートリッドはオフにしてください。
14 / 59
4.6 エンドリペア反応と精製
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
⑤
Agencourt AMPure XP reagent を Vortex でよく混合し、120μl をエンドリペア反応後の溶液 (70μl) に添
加します。
120μl
Agencourt AMPure XP reagent
10 秒間
精製
1 反応あたりの容量
エンドリペア反応後溶液
(70μl)
Agencourt AMPure XP reagent
120μl
total
⑥
190μl
ピペッティングでよく混合した後、室温で 5∼15 分間インキュベーションします。
ピペッティング
⑦
70μl：エンドリペア反応後溶液
室温、5∼15 分間
チューブをマグネティックラックに差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸い
取り、除去します。
マグネティックラックの種類により、
凝集箇所が異なる場合もあります
ビーズが完全にマグネット側に凝集するまでに必要な時間は、チューブの種類やマグネティックラ
ックの種類に依存します。
⑧
マグネティックラックにチューブを差し込んだまま、80 % エタノール 200μl を添加し、そのまま室温で
30 秒間インキュベートします。
200μl
室温、30 秒間
80％エタノール
(用時調製)
15 / 59
4.6 エンドリペア反応と精製
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
⑨
上澄みをピペットで吸い取り、除去します。
⑩
本項 ⑧ ∼ ⑨ を繰り返します。
80 % エタノールにより合計 2 回洗浄します。
⑪
チューブの蓋を開けた状態で、ビーズが乾燥するまで室温でインキュベーションします。
上澄み除去後にピペットチップを交換してもう一度余分なエタノールを除去すると、乾燥時間を短
縮することができ、また、常に同じ乾燥時間で操作をすることができます。この場合、乾燥時間は
室温で 2∼3 分間となります。
乾燥させ過ぎは収量の低下につながります。すぐに次の工程に進めてください (37℃での乾燥は推
奨しておりません)。
4.7.
①
A-テーリング反応と精製
チューブをマグネティックラックから外し氷上に置きます。必要試薬の準備をします。


②
KAPA Library Preparation Kit の KAPA PEG/NaCl SPRI Solution を氷上に置いておきます。
SeqCap Adapter Kit A / B の必要インデックス番号の SeqCap Index Adapter 溶液 (4 章 4 項 ④) を氷上
で融解しておきます (次項で使用します)。
エンドリペア反応後産物 (4 章 6 項 ⑪) に、A-テーリング反応マスターミックス (4 章 5 項 ③) を 50μl 添加
します。
A テーリング反応
1 反応あたりの容量
(ビーズ)
エンドリペア反応後産物
A-テーリング反応マスターミックス
total
③
50μl
50μl
5 回、ピペッティングすることでよく混合します。
Vortex を使用せずに充分混合してください。
16 / 59
4.7 A-テーリング反応と精製
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
④
30 ℃ で 30 分間、サーマルサイクラーでインキュベーションします。
50μl
ヒートリッドはオフにしてください。
⑤
本項 ④ A テーリング反応後の溶液 (50μl) に、PEG/NaCl SPRI Solution を 90μl 添加します。
90μl
A-テーリング反応後の
溶液 (50μl)
PEG/NaCl
SPRI Solution
精製
1 反応あたりの容量
ビーズ入り A-テーリング反応後の溶液
(50μl)
PEG/NaCl SPRI Solution
90μl
total
⑥
ピペッティングでよく混合した後、室温で 5∼15 分間インキュベーションします。
ピペッティング
⑦
140μl
室温、5∼15 分間
チューブをマグネティックラックに差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸い
取り、除去します。
マグネティックラックの種類により、
凝集箇所が異なる場合もあります
⑧
マグネティックラックにチューブを差し込んだまま、80 % エタノール 200μl を添加し、そのまま室温で
30 秒間インキュベートします。
200μl
室温、30 秒間
80％エタノール
(用時調製)
17 / 59
4.7 A-テーリング反応と精製
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
⑨
上澄みをピペットで吸い取り、除去します。
⑩
本項 ⑧ ∼ ⑨ を繰り返します。
80 % エタノールにより合計 2 回洗浄します。
⑪
チューブの蓋を開けた状態で、ビーズが乾燥するまで室温でインキュベーションします。
上澄み除去後にピペットチップを交換してもう一度余分なエタノールを除去すると、乾燥時間を短
縮することができ、また、常に同じ乾燥時間で操作をすることができます。この場合、乾燥時間は
室温で 2∼3 分間となります。
乾燥させ過ぎは収量の低下につながります。すぐに次の工程に進めてください (37℃での乾燥は推
奨しておりません)。
18 / 59
4.7 A-テーリング反応と精製
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
アダプターライゲーション反応と精製
4.8.
①
チューブをマグネティックラックから外し氷上に置きます。使用する必要試薬を用意しておきます。

②
Elution buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0)を用意しておきます。
A-テーリング反応後産物 (4 章 7 項 ⑪) に、ライゲーション反応マスターミックス (4 章 5 項 ④) を 45μl と
SeqCap Adapter Kit A / B の必要インデックス番号の SeqCap Index Adapter 溶液 (4 章 4 項 ④) を 5μl 添加
します。
アダプターライゲーション反応
1 反応あたりの容量
A-テーリング反応後産物
(ビーズ)
ライゲーション反応マスターミックス
45μl
SeqCap Index Adapter #, 10μM (溶解済みバイアル “A#”)
5μl
total
50μl
ハイブリダイゼーションおよびシークエンシング時のサンプルの混合計画に従い、サンプル毎にア
ダプター溶液を適切な組み合わせで添加してください。
例） SeqCap Index SeqCap Index SeqCap Index SeqCap Index SeqCap Index SeqCap Index
Adapter 2
Adapter 4
Adapter 5
Adapter 6
Adapter 7
Adapter 16
(バイアル ”A2”)
(バイアル ”A4”)
5μl
5μl
Sample 1
③
(バイアル ”A5”)
Sample 2
5μl
Sample 3
(バイアル ”A6”)
5μl
Sample 4
5 回、ピペッティングすることでよく混合します。
Vortex を使用せずに充分混合してください。
④
20 ℃ で 15 分間、サーマルサイクラーでインキュベーションします。
50μl
ヒートリッドはオフにしてください。
19 / 59
4.8 アダプターライゲーション反応と精製
(バイアル ”A7”)
5μl
Sample 5
(バイアル ”A16”)
5μl
Sample 6
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
⑤
本項 ④ アダプターライゲーション反応後の溶液 (50μl) に、PEG/NaCl SPRI Solution を 50μl 添加します。
50μl
アダプターライゲーション
反応後の溶液 (50μl)
PEG/NaCl
SPRI Solution
精製
1 反応あたりの容量
(50μl)
ビーズ入りアダプターライゲーション反応後の溶液
PEG/NaCl SPRI Solution
50μl
total
⑥
ピペッティングでよく混合した後、室温で 5∼15 分間インキュベーションします。
ピペッティング
⑦
100μl
室温、5∼15 分間
チューブをマグネティックラックに差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸い
取り、除去します。
マグネティックラックの種類により、
凝集箇所が異なる場合もあります
⑧
マグネティックラックにチューブを差し込んだまま、80 % エタノール 200μl を添加し、そのまま室温で
30 秒間インキュベートします。
200μl
室温、30 秒間
80％エタノール
(用時調製)
⑨
上澄みをピペットで吸い取り、除去します。
20 / 59
4.8 アダプターライゲーション反応と精製
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
⑩
本項 ⑧ ∼ ⑨ を繰り返します。
80 % エタノールにより合計 2 回洗浄します。
⑪
チューブの蓋を開けた状態で、ビーズが乾燥するまで室温でインキュベーションします。
上澄み除去後にピペットチップを交換してもう一度余分なエタノールを除去すると、乾燥時間を短
縮することができ、また、常に同じ乾燥時間で操作をすることができます。この場合、乾燥時間は
室温で 2∼3 分間となります。
乾燥させ過ぎは収量の低下につながります。すぐに次の工程に進めてください (37℃での乾燥は推
奨しておりません)。
⑫
チューブをマグネティックラックから外し、Elution buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) を添加し、ピペッティ
ングでよく懸濁します。
100μl
Elution buffer
(10 mM Tris-HCl, pH 8.0)
懸濁済みのビーズは 4℃で 24 時間まで保存できます。
⑬
室温で 2 分間、インキュベートします。
室温、2 分
21 / 59
4.8 アダプターライゲーション反応と精製
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
4.9.
①
Dual SPRI (短鎖および長鎖ライブラリの除去)
4 章 8 項 ⑬ のチューブ (Elution Buffer 100μl に懸濁されたビーズ溶液) に、PEG/NaCl SPRI Solution を 60
μl 添加します。
60μl
Elution Buffer に懸濁された
ビーズ溶液 (100μl)
PEG/NaCl
SPRI Solution
精製
1 反応あたりの容量
Elution Buffer に懸濁されたビーズ溶液
(100μl)
PEG/NaCl SPRI Solution
60μl
total
②
ピペッティングでよく混合した後、室温で 5∼15 分間インキュベーションします。
ピペッティング
③
160μl
室温、5∼15 分間
チューブをマグネティックラックに差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みから 155μl をピ
ペットで吸い取り、新しいチューブに移します。
155μl
160μl
新しいチューブ
上澄みを回収します。
回収液にはビーズが全く含まれないように慎重に操作してください。
回収液には、約 450bp 以下のサイズのライブラリが含まれています。
22 / 59
4.9 Dual SPRI (短鎖および長鎖ライブラリの除去)
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
④
Agencourt AMPure XP reagent を Vortex でよく混合し、20μl を本項 ③ 回収液 (155μl) に添加します。
20μl
Agencourt AMPure XP reagent
10 秒間
精製
1 反応あたりの容量
Agencourt AMPure XP reagent
20μl
約 450 bp 以下のフラグメントを含む回収液
total
⑤
(155μl)
175μl
ピペッティングでよく混合した後、室温で 5∼15 分間インキュベーションします。
ピペッティング
⑥
155μl：回収液
室温、5∼15 分間
チューブをマグネティックラックに差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸い
取り、除去します。
マグネティックラックの種類により、
凝集箇所が異なる場合もあります
廃棄する上澄み溶液には、約 250bp 以下のサイズのライブラリが含まれています。
⑦
マグネティックラックにチューブを差し込んだまま、80 % エタノール 200μl を添加し、そのまま室温で
30 秒間インキュベートします。
200μl
室温、30 秒間
80％エタノール
(用時調製)
23 / 59
4.9 Dual SPRI (短鎖および長鎖ライブラリの除去)
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
⑧
上澄みをピペットで吸い取り、除去します。
⑨
本項 ⑦ ∼ ⑧ を繰り返します。
80 % エタノールにより合計 2 回洗浄します。
⑩
チューブの蓋を開けた状態で、ビーズが乾燥するまで室温でインキュベーションします。
上澄み除去後にピペットチップを交換してもう一度余分なエタノールを除去すると、乾燥時間を短
縮することができ、また、常に同じ乾燥時間で操作をすることができます。この場合、乾燥時間は
室温で 2∼3 分間となります。
乾燥させ過ぎは収量の低下につながります。すぐに次の工程に進めてください (37℃での乾燥は推
奨しておりません)。
⑪
チューブをマグネティックラックから外し、Elution buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) を 25μl 添加し、ピペ
ッティングでよく懸濁します。
25μl
Elution buffer
(10 mM Tris-HCl, pH 8.0)
⑫
室温で 2 分間、インキュベートします。
室温、2 分
24 / 59
4.9 Dual SPRI (短鎖および長鎖ライブラリの除去)
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
⑬
チューブをマグネティックラックに差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みから 20μl をピペ
ットで吸い取り、新しい PCR チューブ (0.2 ml) に移します。
20μl
25μl
⑭
新しい PCR チューブ (0.2 ml)
約 20μl のライブラリ溶液が調製されました。
4 ℃で 1 週間、または -20 ℃で少なくとも 1 か月間保存できます。
25 / 59
4.9 Dual SPRI (短鎖および長鎖ライブラリの除去)
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
5. サンプルライブラリのバイサルファイト変換および精製
本章では、Zymo Research 社製の EZ DNA Methylation-Lightning Kit を用いて 4 章で作成したサンプルライブラ
リのバイサルファイト変換を行う方法について概説します。
本章は、EZ DNA Methylation-Lightning Kit 付属の Instruction Manual (ver1.0.3) に準拠しています。操作方法の詳
細につきましては、Instruction Manual (ver1.0.3)をご参照ください。
①
SeqCap Epi Accessory Kit の PCR Grade Water (ボトル “H2O”) を融解します。
②
EZ DNA Methylation-Lightning Kit (D5030) の 6 ml の M-Wash Buffer concentrate に 24 ml の 100%エタノー
ルを加えます。D5031 キットの場合には 24 ml の M-Wash Buffer concentrate に 96 ml の 100%エタノール
を加えます。
③
20 μl のサンプルライブラリ溶液 (4 章 9 項 ⑭) が分注された PCR チューブに、130 μl の Lightning
Conversion Reagent を添加します。十分に混合させた後、スピンダウンします。
④
本項 ③ の溶液を 75μl ずつ 2 本に分注します。
100μl 以上の容量に対応したサーマルサイクラーを利用する場合には 2 本に分割する必要はありま
せん。
⑤
サーマルサイクラーで下記のプログラムを実行します。
温度
時間
98℃
8 min
54℃
60 min
4℃
Hold (20 時間まで)
75μl ずつ 2 本
⑥
Zymo-Spin™ IC Column を Collection Tube にセットし、600 μl の M-Binding Buffer を添加します。
⑦
本項 ⑤ の反応後の溶液全量 (1 サンプルあたり合計 150μl) を、本項 ⑥ のカラム (M-Binding Buffer 入りの
Zymo-Spin™ IC Column) に加えます。キャップを閉じ、何度か上下転倒することで混和します。
⑧
最高回転速度 (> 10,000 x g) で 30 秒間遠心し、フロースルーを捨てます。
⑨
100 μl の M-Wash Buffer を添加します。最高回転速度 (> 10,000 x g) で 30 秒間遠心し、フロースルーを捨
てます。
26/ 59
5 サンプルライブラリのバイサルファイト変換および精製
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
⑩
200 μl の L-Desulphonation Buffer を本項 ⑨ のカラムに添加し、室温 (20∼30℃) で 15∼20 分間、静置し
ます。
温度
時間
室温 (20∼30℃)
15∼20 分間
⑪
最高回転速度 (> 10,000 x g) で 30 秒間遠心します。
⑫
200 μl の M-Wash Buffer を添加します。最高回転速度 (> 10,000 x g) で 30 秒間遠心し、フロースルーを捨
てます。
⑬
本項 ⑫ の洗浄ステップをもう一度繰り返します。
⑭
Zymo-Spin™ IC Column を新しい 1.5 ml チューブに移します。20 μl の PCR Grade Water (ボトル “H2O”)
をカラムマトリックスの中央に滴下します。
製品添付のプロトコールでは M-Elution Buffer を用いていますが、PCR Grade Water をお使いくだ
さい。
⑮
最高回転速度 (> 10,000 x g) で 30 秒間遠心します。
⑯
20μl のバイサルファイト変換済みのサンプルライブラリ溶液が調製されました。
-20 ℃で保存できます。長期間保存する場合には-70℃で保存してください。
27 / 59
5 サンプルライブラリのバイサルファイト変換および精製
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
6.
Pre-Capture LM-PCR 反応と反応産物の精製
本章では、SeqCap Epi Accessory Kit の構成品である KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix (2X) および SeqCap
Adapter Kit A または B の構成品である Pre-LM PCR オリゴを用いたバイサルファイト変換後サンプルライブラ
リの増幅方法について記載します。増幅後の溶液は SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit (または QIAquick PCR
Purification Kit (Qiagen, 28106) ) を用いて精製を行います。
6.1.
Pre-Capture LM-PCR 用プライマーの準備
①
SeqCap Adapter Kit A または B の PCR Grade Water (バイアル “H2O”)を融解します。
②
SeqCap Adapter Kit A または B の Pre-LM-PCR Oligos 1 & 2 (バイアル ”LP1”) をスピンダウンします。
開封時に乾燥オリゴ DNA 粉末の飛散にご注意ください。
1 本のバイアルチューブにフォワードとリバースのプライマーの両方が含まれています。
③
Pre-LM-PCR Oligos 1 & 2 (バイアル ”LP1”) に、PCR Grade Water (バイアル “H2O”) を 550μl 添加します。
550μl
バイアル “H2O”
④
バイアル “LP1”
Vortex などにより十分に溶解させた後、スピンダウンします。5μM の Pre-LM-PCR Oligos 1 & 2 溶液が調
製されました。
-15 ∼ -25 ℃で保存できます。
28 / 59
6.1 Pre-Capture LM-PCR 用プライマーの準備
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
Pre-Capture LM-PCR の準備
6.2.
①
必要試薬とサンプル溶液を氷上で融解します。




バイサルファイト変換済みサンプルライブラリ溶液 (20μl) (5 章 ⑯)
SeqCap Epi Accessory Kit の KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix (2X) (バイアル ”KU”)
SeqCap Epi Accessory Kit の PCR Grade Water (ボトル ”H2O”)
SeqCap Adapter Kit の溶解済み Pre-LM PCR オリゴ (6 章 1 項 ④, バイアル ”LP1”)
ネガティブ、ポジティブコントロールを同時に調製していただくことをお奨めします。ネガティ
ブコントロールとしては PCR grade water を、ポジティブコントロールとしては以前に増幅が確認
されているライブラリ溶液をご利用ください。
Pre-Capture LM-PCR マスターミックス
1 反応あたりの容量
KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix (2X) (バイアル ”KU”)
25μl
PCR Grade Water (ボトル ”H2O”)
2μl
Pre-LM PCR オリゴ, 5μM (溶解済みバイアル ”LP1”)
3μl
total
30μl
KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix (2X) および本試薬を含む溶液は温度に対して敏感です。必
ず氷上で融解、調製を行ってください。
マスターミックスの容量の算出には、ピペッティング誤差を見込んで上記容量に 10% 程度を増量
して計算してください。
②
マスターミックスをよく混合し、スピンダウンします。
Vortex を使用せずに充分混合してください。
③
バイサルファイト変換済みサンプルライブラリ溶液 (20μl) に、 Pre-Capture LM-PCR マスターミックスを
30μl 添加します。
30μl
Pre-Capture LM-PCR
マスターミックス
④
20μl：バイサルファイト変換済みサンプルライブラリ溶液
(または) PCR grade water
5 回、ピペッティングすることでよく混合します。
Vortex を使用せずに充分混合してください。
29 / 59
6.2 Pre-Capture LM-PCR の準備
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
Pre-Capture LM-PCR 増幅
6.3.
サーマルサイクラーで下記のプログラムを実行します。
温度
時間
95℃
2 min
98℃
30 sec
60℃
30 sec
72℃
4 min
72℃
10 min
4℃
Hold (72 時間まで)
サイクル
50μl
12 サイクル
SeqCap Epi プローブプールとのハイブリダイゼーションには本反応産物を 1μg 使用します。この
ため、初発サンプルであるゲノム DNA の品質と量によってはサイクル数を増やす必要がある可能
性があります。一方で PCR サイクル数を増やすとシークエンスリードの重複率が増加する危険性
があります。逆に、一貫して 1μg 以上の増幅産物が得られる場合にはサイクル数を減らすことも
可能です。
Pre-Capture LM-PCR 産物の精製
6.4.
①
必要な試薬の準備をします。



SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit の SeqCap EZ Purification Beads (ボトル ②) を室温に置きます
(使用する 30 分前)。
SeqCap Epi Accessory Kit の PCR Grade Water (ボトル “H2O”)を融解します。
80％エタノールを準備します (200μl x サンプル数 x 2 + α)。
SeqCap EZ Purification Beads ではなく QIAquick PCR Purification Kit を用いてサンプルを精製す
ることも可能です。この場合、QIAquick 付属のマニュアルと異なり、最後の溶出のステップでは
Buffer EB ではなく PCR grade water を使用してください。
②
新しい 1.5 ml チューブに、各増幅後の溶液を移します。
全量 (50μl)
新しい 1.5ml チューブ
ネガティブ、ポジティブコントロールサンプルについても同様に操作してください。
30 / 59
6.3 Pre-Capture LM-PCR 増幅・6.4 Pre-Capture LM-PCR 産物の精製
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
③
SeqCap EZ Purification Beads を Vortex でよく混合し、90μl を本項 ② の 1.5ml チューブに添加します。
90μl (1.8 倍量)
SeqCap EZ Purification Beads
10 秒間
④
50μl：増幅後溶液
Vortex で混合し、室温で 15 分間インキュベーションします。
室温、15 分間
⑤
チューブを DynaMag-2 (または他のマグネティックラック) に差し込み、チューブ内の溶液が透明になった
ら上澄みをピペットで吸い取り、除去します。
⑥
マグネティックラックにチューブを差し込んだまま、80 % エタノール 200μl を添加し、そのまま室温で
30 秒間インキュベートします。
200μl
室温、30 秒間
80％エタノール
(用時調製)
⑦
上澄みをピペットで吸い取り、除去します。
⑧
本項 ⑥ ∼ ⑦ を繰り返します。
31 / 59
6.4 Pre-Capture LM-PCR 産物の精製
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
⑨
チューブの蓋を開けた状態でビーズが乾燥するまで (15 分間)、室温でインキュベーションします。
ピペットによる上澄み除去後、軽くスピンダウンしてから再びマグネットラックに戻すと余分なエ
タノールを除去でき、乾燥時間を短縮することができます。
乾燥させ過ぎは収量の低下につながります。
⑩
チューブをマグネティックラックから外し、PCR Grade Water を 52μl 添加し、ピペッティングでよく懸
52μl
濁します。
PCR Grade Water
Buffer EB や 1x TE ではなく、必ず PCR Grade Water を使用してください。
タッピングからのスピンダウンも可。
⑪
室温で 2 分間、インキュベートします。
室温、2 分間
⑫
チューブを DynaMag-2 (または他のマグネティックラック) に差し込みます。
⑬
チューブ内の溶液が透明になったら 50μl の上澄みをピペットで吸い取り、新しいチューブに移します。
50μl
新しい 1.5ml チューブ
⑭
約 50μl の Pre-Capture LM-PCR 産物 (バイサルファイト変換後に増幅したサンプルライブラリ) が調製さ
れました。
32 / 59
6.4 Pre-Capture LM-PCR 産物の精製
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
6.5.
①
Pre-Capture LM-PCR 産物の品質確認
濃度を測定し、吸光度測定上での品質基準を満たしていることを確認します。
Pre-Capture LM-PCR 産物の品質
基準
1.7 - 2.0
A260/280 比
1.0μg 以上
収量
ネガティブコントロールでの収量
ごく微量
Pre-Capture LM-PCR 産物の容量は約 50μl ですので、約 20 ng/μl 以上の濃度で測定されると見
込まれます。
②
1μl の Pre-Capture LM-PCR 産物あるいはネガティブコントロール産物を Agilent High Sensitivity DNA Kit
で泳動し、平均サイズが 150∼500bp の範囲にあることを確認します。
Pre-Capture LM-PCR 産物の濃度が 20 ng/μl を超えている場合は、産物の一部を 10 倍希釈し、そ
の内の 1μl を泳動してください。
Pre-Capture
LM-PCR 産物
DNA マーカー
リファレンスピーク
ネガティブコントロール産物で 150∼500bp の範囲にピーク見られないことをご確認ください。一
方で 150bp 以下にピークが見られる場合があります。
150 bp 以下のサイズに 1 本以上のシャープなピークが見られる場合がありますが、LM-PCR 前の
ステップからのオリゴヌクレオチドなどのキャリーオーバー等と考えられます。こうしたピークが
見られる場合でも、キャプチャー反応に影響はありません。
③
1μg に相当する Pre-Capture LM-PCR 産物の容量を算出しておきます。
33 / 59
6.5 Pre-Capture LM-PCR 産物の品質確認
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
7.
ハイブリダイゼーション
本章では、SeqCap Epi Enrichment Kit、SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit、SeqCap Epi Accessory Kit 、
SeqCap HE-Oligo Kit を用いたハイブリダイゼーション溶液の調製方法とハイブリダイゼーションの手順につい
て記載します。
ハイブリダイゼーションには、47℃を 64∼72 時間キープできるサーマルサイクラーが必要です。
温度制御可能なヒートリッドが付属している機種を推奨しています。
7.1.
SeqCap Epi プローブプールの分取および保存
①
SeqCap Epi Enrichment Kit の SeqCap Epi プローブプールを氷上で融解します。
②
3 秒間 Vortex します。
3 秒間
③
10,000 x g で 30 秒間遠心し、SeqCap Epi プローブプールをチューブの底に集めます。
④
PCR チューブに 4.5μl ずつ分注します。
4.5 μl ずつ
SeqCap Epi
プローブプール
ハイブリダイゼーションに使用するサーマルサイクラーに対応したサイズの PCR チューブに分注
してください。
4.5μl は 1 回分の使用量になります。
凍結中の揮散を防ぐためにチューブの蓋を確実に閉めてください。
SeqCap Epi プローブプールは製品反応数の容量より若干多く梱包されています。このため、分注
操作後、元の製品チューブに多少溶液が残ることがあります。
⑤
-15 ∼ -25 ℃で保存します。
SeqCap Epi プローブプールは凍結融解を繰り返さないでください。
34 / 59
7.1 SeqCap Epi プローブプールの分取および保存
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
7.2.
SeqCap HE オリゴの準備
①
SeqCap HE-Oligo Kit の PCR Grade Water (バイアル “H2O”) を融解します。
②
乾燥オリゴの封入された各 SeqCap HE オリゴのバイアル (13 / 26 本、バイアル “H2O”以外 ) をスピンダウ
ンします。
③
SeqCap HE Universal Oligo (バイアル “BU”) には、PCR Grade Water (バイアル “H2O”) 120μl を添加し、
その他の SeqCap HE Index # Oligo (12 / 24 本、バイアル”H2O”,”BU”以外 ) には PCR Grade Water (バイア
ル “H2O”) 10μl ずつを添加します。
開封時に乾燥オリゴ DNA 粉末の飛散にご注意ください。
SeqCap HE Index # Oligo の “#” にはインデックス配列の種類を示す数値が入ります。
120μl
PCR Grade Water
(バイアル “H2O”)
10μl
SeqCap HE
Universal Oligo
(バイアル “BU”)
PCR Grade Water
(バイアル “H2O”)
SeqCap HE
Index # Oligo
ピペッティング誤差を防ぐために、更に 1/10 希釈した溶液を調製しても構いません。希釈した場
合には次の工程で 10 倍量を使用するようご注意ください。
④
Vortex などにより十分に溶解させた後、スピンダウンします。1,000μM の各 SeqCap HE オリゴ溶液が調
製されました。
-15 ∼ -25 ℃で保存できます。
凍結融解を繰り返さないために、少量ずつ分注していただくことをお勧めいたします。
凍結中の揮散を防ぐためにチューブの蓋を確実に閉めてください。
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7.2 SeqCap HE オリゴの準備
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
ハイブリダイゼーションの準備と開始
7.3.
①
ヒートブロックを 95℃ に加温しておきます。
95 ℃
②
サンプル溶液と必要試薬を氷上で融解します。






③
Pre-Capture LM-PCR 産物 (6 章 5 項)
SeqCap HE Oligo Kit の溶解済の SeqCap HE オリゴのバイアル (7 章 2 項 ④)
SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit のバイアル ⑤
SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit のバイアル ⑥
SeqCap Epi Accessory Kit のバイアル “BCE”
SeqCap Epi Enrichment Kit の分注した SeqCap Epi プローブプール (7 章 1 項 ⑤)
新しい 1.5 ml チューブに、Bisulphite Capture Enhancer (バイアル “BCE”) 10μl、増幅済みバイサルファイ
ト変換サンプルライブラリ 1μg 相当量、1000μM SeqCap HE Universal Oligo (バイアル “BU”) 1μl 、
1000μM SeqCap HE Index # Oligo (バイアル “B#”) 1μl ずつを分注します。
ハイブリダイゼーションコンポーネント
混合容量
Bisulphite Capture Enhancer (バイアル “BCE”)
10μl
Pre-Capture LM-PCR 産物：1μg 相当
＊μl
SeqCap HE Universal Oligo, 1000μM (溶解済みバイアル “BU”)
1μl
SeqCap HE Index # Oligo, 1000μM (溶解済みバイアル “B#”)
1μl
SeqCap HE Index # Oligo の # にはインデックス配列の種類を示す数値が入ります。SeqCap
HE Index # Oligo は以降の記述で HE Index オリゴと総称します。
(次ページに続く)
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7.3 ハイブリダイゼーションの準備と開始
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
(前ページより引き続き)
HE Index オリゴは、調整したライブラリの Index に対応したものを必ずご使用ください。
SeqCap Index Adapter の番号と HE Index オリゴの対応は下記の通りです；
 SeqCap HE-Oligo Kit A (Roche, 06777287001)
アダプターバイアル
No.
番号
 SeqCap HE-Oligo Kit B (Roche, 06777317001)
品名
アダプター
番号
バイアル
No.
品名
Index
Adapter 2
B2
SeqCap HE Index 2 Oligo
Index
Adapter 1
B1
SeqCap HE Index 1 Oligo
Index
Adapter 4
B4
SeqCap HE Index 4 Oligo
Index
Adapter 3
B3
SeqCap HE Index 3 Oligo
Index
Adapter 5
B5
SeqCap HE Index 5 Oligo
Index
Adapter 8
B8
SeqCap HE Index 8 Oligo
Index
Adapter 6
B6
SeqCap HE Index 6 Oligo
Index
Adapter 9
B9
SeqCap HE Index 9 Oligo
Index
Adapter 7
B7
SeqCap HE Index 7 Oligo
Index
Adapter 10
B10
SeqCap HE Index 10 Oligo
Index
Adapter 12
B12
SeqCap HE Index 12 Oligo
Index
Adapter 11
B11
SeqCap HE Index 11 Oligo
Index
Adapter 13
B13
SeqCap HE Index 13 Oligo
Index
Adapter 20
B20
SeqCap HE Index 20 Oligo
Index
Adapter 14
B14
SeqCap HE Index 14 Oligo
Index
Adapter 21
B21
SeqCap HE Index 21 Oligo
Index
Adapter 15
B15
SeqCap HE Index 15 Oligo
Index
Adapter 22
B22
SeqCap HE Index 22 Oligo
Index
Adapter 16
B16
SeqCap HE Index 16 Oligo
Index
Adapter 23
B23
SeqCap HE Index 23 Oligo
Index
Adapter 18
B18
SeqCap HE Index 18 Oligo
Index
Adapter 25
B25
SeqCap HE Index 25 Oligo
Index
Adapter 19
B19
SeqCap HE Index 19 Oligo
Index
Adapter 27
B27
SeqCap HE Index 27 Oligo
37 / 59
7.3 ハイブリダイゼーションの準備と開始
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
④
18 -20 ゲージ以下のサイズの注射針で本項 ③ のチューブの蓋中央に穴を開けます。
乾燥工程中でのコンタミネーションを防止するために、このような方法を推奨しています。
複数のサンプルを乾燥させる場合にはチューブ毎に新しい注射針を使用してください。
注射針は感染性廃棄物となります。施設の廃棄方法に従って適切に廃棄してください。
⑤
真空乾燥機にセットし、溶液を完全に乾燥させます。容量により乾燥時間を調節します。
後の工程で熱変性を行うことから、このステップで加温 (60℃以上) しても問題ありません。
⑥
本項 ⑤ のチューブに、2x Hybridization Buffer (バイアル ⑤) を 7.5μl と、 Hybridization Component A (バ
イアル ⑥) を 3μl 添加します。
7.5μl
3μl
2x Hybridization Buffer
(バイアル ⑤)
Hybridization Component A
(バイアル ⑥)
正確な容量を添加してください。
⑦
チューブの蓋の穴をステッカーかラボ用テープ片で塞ぎます。
10.5μl
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7.3 ハイブリダイゼーションの準備と開始
⑤のチューブ
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
⑧
Vortex でよく混合し (10 秒) 、最高速度設定で 10 秒間遠心します。
遠心、10 秒間
10 秒間
⑨
95 ℃ のヒートブロック上で 10 分間の熱変性を行います。
10 分間
95 ℃
⑩
最高速度設定で 10 秒間遠心します (室温) 。
⑪
4.5μl ずつ分注した SeqCap Epi プローブプール溶液に、全量 (10.5μl) を移します。
全量 (10.5μl)
SeqCap Epi プローブプール
4.5μl
⑫
Vortex で 3 秒間混合し、最高速度設定で 10 秒間遠心します。
遠心、10 秒間
3 秒間
⑬
47 ℃ で 64 ∼ 72 時間、サーマルサイクラーでインキュベーションします。
64∼72 時間
47 ℃
サーマルサイクラーのヒートリッド機能を利用し、PCR チューブの上蓋が 57 ℃ 以上となるよう
設定してください。
39 / 59
7.3 ハイブリダイゼーションの準備と開始
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
洗浄と回収
8.
本章では、SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit、SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit を用いた非特異的ハイ
ブリダイゼーションの洗浄およびキャプチャー産物の回収の方法について記載しています。
洗浄用バッファーの準備
8.1.
①
洗浄用バッファーの予加温や Stringent Wash バッファーでの洗浄時の保温に使用するための、47 ℃ のイン
キュベーターを準備します。
実測値として 47 ℃ が保持されるウォーターバス、サーマルサイクラー、ヒートブロック、オーブ
ン (インキュベーター) 等をご用意ください。温度は温度計を使用してご確認ください。
②
必要試薬を融解します。



Seq SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit のバイアル ①∼④
Seq SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit のボトル ⑦
PCR grade water (Roche, 03315843001)
10X Wash Buffer I (バイアル ①) は、18 ℃以下で析出します。25 ℃ で 5 ∼ 10 分間加温して完全
に溶解してからご使用ください。同様に、10X Stringent Wash Buffer、2.5X Bead Wash Buffer に
ついても低温で析出することがありますので、完全に溶解してご利用ください。
③
本項 ② の各溶液を希釈します。
SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit
PCR grade water
1x 溶液の
必要量
使用温度
10x Wash Buffer I (バイアル ①)
10μl
90μl
100μl
47℃
10x Wash Buffer I (バイアル ①)
20μl
180μl
200μl
室温
10x Wash Buffer II (バイアル ②)
20μl
180μl
200μl
室温
10x Wash Buffer III (バイアル ③)
20μl
180μl
200μl
室温
10x Stringent Wash Buffer (バイアル ④)
40μl
360μl
400μl
47℃
2.5x Bead Wash Buffer (ボトル ⑦)
200μl
300μl
500μl
室温
上記の容量は、ハイブリダイゼーションサンプル 1 本あたりに必要となる容量です。複数本のハイ
ブリダイゼーションを行っている場合には適宜増量させてください。
希釈後の溶液は室温 ( +15 ∼ +25 ℃) で 2 週間保存可能です。
④
本項 ③ で調製した 1x 溶液のうち、 100μl 1x Wash Buffer I と、400μl 1x Stringent Wash Buffer を 47 ℃
に加温します。
実測値として 47 ℃に設定されたインキュベーターを使用してください。
少なくとも 2 時間は加温し、溶液の温度を安定化させてください。
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8.1 洗浄用バッファーの準備
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
8.2.
Capture Beads の準備
①
SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit の SeqCap EZ Capture Beads (ボトル ①) を室温に置きます (使用する
30 分前) 。
②
SeqCap EZ Capture Beads を Vortex でよく混合し、100μl を新しいチューブに分注します。
100μl
SeqCap EZ Capture Beads
15 秒間
新しいチューブ
例えば 4 反応量の場合、400μl を分取して複数サンプル分をまとめて準備することも可能です。
ただし、分取量は 1 チューブに 6 反応量までとしてください。
③
本項 ② のチューブを DynaMag-2 (または他のマグネティックラック) に差し込み、チューブ内の溶液が透
明になったら上澄みをピペットで吸い取り、除去します。
DynaMag-2 を使用する場合には、通常、5 分以内に溶液は透明になります。MagnaBot II Magnetic
Separation Device (96 ウェルプレート用マグネティックラック) を使用する場合には 1 分間置いて
ください。
以下では 1.5 ml チューブを用いて洗浄する方法について説明します。 96 ウェルプレートを使用す
る場合は、SeqCap Epi Enrichment System User’s Guide (Version1.0、英語版) の Appendix C をご
参照ください。
上澄みを捨てる際にビーズに触れないようご注意ください。多少の上澄み溶液の残存は次のステッ
プで取り除かれます。
上澄み溶液を捨てた後はビーズが乾燥しないよう手早く次のバッファー等を添加してください。
懸濁中に溶液がチューブの蓋裏に付着してしまった場合には軽くスピンダウンを行ってから次のス
テップに進んでください。
41 / 59
8.2 Capture Beads の準備
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
④
200μl の 1x Bead Wash Buffer を添加し、十分に懸濁します。
200μl
10 秒間
1x Bead Wash Buffer
(室温)
③のチューブ
まとめて準備している場合、例えば 4 反応量の Capture Beads を準備している場合、800μl の 1x
Bead Wash Buffer を添加します。
⑤
マグネティックラックにチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸
い取り、除去します。
⑥
本項 ④ ∼ ⑤ をもう一度繰り返します。
ここまでのステップで、1x Bead Wash Buffer で合計 2 回洗浄します。
⑦
100μl の 1x Bead Wash Buffer を添加し、Vortex またはピペッティングでよく懸濁します。
100μl
10 秒間
1x Bead Wash Buffer
(室温)
＜サーマルサイクラーに対応していないサイズのチューブを使用している場合＞
47 ℃ サーマルサイクラーに対応したサイズのチューブに 100μl ずつ分注します。
100μl ずつ
47 ℃ サーマルサイクラーに対応したサイズの新しいチューブ
例えば 4 反応量の Capture Beads を準備している場合、400μl の 1x Bead Wash Buffer を添加し、
Vortex でよく懸濁した後、100μl ずつ 4 本に分注します。
96 ウェルプレートを使用している場合には、ピペッティングにより充分に懸濁してください。こ
の場合には移し変えなどの操作は必要ありません。
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8.2 Capture Beads の準備
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
⑧
マグネティックラックにチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸
い取り、除去します。
ここまでのステップで、1x Bead Wash Buffer で合計 3 回洗浄します。
多少の洗浄溶液の残存は後のストレプトアビジンとビオチンの結合反応に影響を与えません。
上澄みを除去した後は、直ちに次のステップへ進んでください。Capture Beads を乾燥させないよ
うにしてください。
8.3.
①
Capture Beads とハイブリダイゼーション DNA の結合
洗浄済みの Capture Beads にハイブリダイゼーション溶液の全量を添加し、10 回のピペッティングにより
充分に懸濁させます。
全量 (15μl)
47 ℃
ハイブリダイゼーション溶液
洗浄済み Capture Beads
(ビーズペレット)
手早く充分に懸濁してください (軽度の Vortex、スピンダウンは可)。
②
47 ℃ のサーマルサイクラーに入れます。
①のチューブ
約 15μl
47 ℃
ヒートリッド機能を利用し、PCR チューブの上蓋が 57 ℃ 以上となるよう設定してください。
③
15 分毎に 3 秒間の Vortex をしながら、45 分間 47 ℃ でインキュベーションを行います。
15 分間
3 秒間
47 ℃
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8.3 Capture Beads とハイブリダイゼーション DNA の結合
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
8.4.
①
DNA が結合した Capture Beads の洗浄
47 ℃ に加温した 1x Wash Buffer I を 100μl 添加し、Vortex でよく懸濁します。
100μl
10 秒間
1x Wash Buffer I
47℃
＜0.2ml チューブで操作している場合＞
全量を新しい 1.5ml チューブに移します。
全量 (約 115μl)
新しい 1.5ml チューブ
1.5 ml チューブに移し替えることにより、以降の洗浄ステップでマグネティックデバイスのサイズ
とチューブサイズが一致し分離操作が容易になり、また、洗浄バッファーの容量に対して充分なチ
ューブ容積を持たせることができるようになります。
サンプル数が多く、移し替えに時間が掛かる場合には、数本ずつ操作を行うことで温度の低下を防
いでください。
②
マグネティックラックにチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸
い取り、除去します。
このステップでは、溶液は直ぐに透明になります。迅速に上澄みを除去してください。
③
47 ℃ に加温した 1x Stringent Wash Buffer を 200μl 添加し、10 回のピペッティングでよく懸濁します。
200μl
1x Strigent Wash Buffer
47℃
手早く充分に懸濁してください (軽度の Vortex、スピンダウンは可)。
④
47 ℃ で 5 分間加温します。
44 / 59
8.4 DNA が結合した Capture Beads の洗浄
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
⑤
マグネティックラックにチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸
い取り、除去します。
このステップでは、溶液は直ぐに透明になります。迅速に上澄みを除去してください。
⑥
本項 ③ ∼ ⑤ を繰り返します。
1x Stringent Wash Buffer での洗浄は合計 2 回です。
⑦
1x Wash Buffer I を 200μl 添加し、2 分間の Vortex でよく懸濁します。
200μl
2 分間
1x Wash Buffer I
室温
⑧
マグネティックラックにチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸
い取り、除去します。
⑨
1x Wash Buffer II を 200μl 添加し、1 分間の Vortex でよく懸濁します。
200μl
1 分間
1x Wash Buffer II
室温
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8.4 DNA が結合した Capture Beads の洗浄
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
⑩
マグネティックラックにチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸
い取り、除去します。
サンプルが複数本の場合には、本項 ⑩ ∼ ⑬ までの操作を 1 本ずつ進めてください。
⑪
1x Wash Buffer III を 200μl 添加し、30 秒間の Vortex でよく懸濁します。
200μl
30 秒間
(厳守)
1x Wash Buffer III
室温
⑫
マグネティックラックにチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸
い取り、除去します。
手早く操作してください。Wash Buffer III に長時間置くと回収率や Complexity が低下する恐れが
あります。
⑬
PCR grade water を 50μl 添加し、よく懸濁します。
50μl
PCR grade water
サンプルが複数本あり、1 本ずづ操作している場合には、本項 ⑩ に戻り残りのサンプルの操作を 1
本ずつ進めてください。
次の章に進めるサンプルは、この Capture Beads 懸濁溶液 (茶色の溶液) です。ここで上澄みを捨
てる操作は絶対にしないでください！
⑭
-15 ∼ -25 ℃で保存するか、9 章へ進めてください。
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8.4 DNA が結合した Capture Beads の洗浄
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
9.
Post-Capture LM-PCR 反応と反応産物の精製
本章では、SeqCap Epi Accessory Kit を用いたキャプチャー後のサンプルライブラリを増幅する方法について記
載しています。増幅後の溶液は SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit (または QIAquick PCR Purification Kit
(Qiagen, 28106) ) を用いて精製を行います。
9.1.
Post-LM PCR オリゴの準備
①
SeqCap Epi Accessory Kit の PCR Grade Water (ボトル “H2O”) を融解します。
②
SeqCap Epi Accessory Kit の Post-LM-PCR-Oligonucleotides 1&2 (バイアル ”LP2”) をスピンダウンします。
開封時に乾燥オリゴ DNA 粉末の飛散にご注意ください。
1 本のバイアルチューブにフォワードとリバースのプライマーの両方が含まれています。
③
Post-LM-PCR-Oligonucleotides 1&2 (バイアル ”LP2”) に、PCR Grade Water (バイアル “H2O”) を 480μl 添
加します。
480μl
バイアル “H2O”
④
バイアル “LP2”
Vortex などにより十分に溶解させた後、スピンダウンします。5μM の Post-LM-PCR-Oligonucleotides 1&2
溶液が調製されました。
-15 ∼ -25 ℃で保存できます。
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9.1 Post-LM PCR オリゴの準備
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
Post-LM PCR の準備
9.2.
①
必要試薬とサンプル溶液を氷上で融解します。



②
Capture Beads 懸濁溶液 (茶色の溶液) (8 章 4 項 ⑭)
SeqCap Epi Accessory Kit の KAPA HiFi HotStart ReadyMix (バイアル “KH”)
SeqCap Epi Accessory Kit の溶解済み Post-LM PCR オリゴ (9 章 1 項 ④)
Post-Capture LM-PCR マスターミックスを調製します。(1 本のキャプチャーサンプルにつき、2 反応を行
います)。
ネガティブ、ポジティブコントロールを同時に調製していただくことをお奨めします。ネガティ
ブコントロールとしては PCR grade water を、ポジティブコントロールとしては以前に増幅が確認
されているライブラリ溶液をご利用ください。
2 反応 (1 キャプチャーサンプル)
あたりの容量
Post-Capture LM-PCR マスターミックス
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (バイアル “KH”)
50μl
Post-LM PCR オリゴ, 5μM (溶解済みバイアル “LP2”)
10μl
total
60μl
KAPA HiFi HotStart ReadyMix および本試薬を含む溶液は温度に対して敏感です。必ず氷上で融解、
調製を行ってください。
マスターミックスの容量の算出には、ピペッティング誤差を見込んで上記容量に 10% 程度を増量
して計算してください。
③
マスターミックスをよく混合し、スピンダウンします。
Vortex を使用せずに充分混合してください。
④
新しい PCR チューブに、Post-Capture LM-PCR マスターミックスを 30μl ずつ分注します。
30μl ずつ
Post-Capture LM-PCR
マスターミックス
⑤
Capture Beads 懸濁溶液 (茶色の溶液) を Vortex でよく混合します。
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9.2
Post-LM PCR の準備
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
⑥
本項 ④ の Post-Capture LM-PCR マスターミックス分注チューブに、20μl ずつの Capture Beads 懸濁溶
液 (茶色の溶液) を添加します。
Capture Beads 懸濁溶液 (茶色の溶液)
(または)
PCR grade water (negative control)
ライブラリ溶液 (positive control)
20μl ずつ
⑦
ピペッティングでよく混合します。
Vortex を使用せずに充分混合してください。
残りの Capture Beads 懸濁溶液 (茶色の溶液) (約 10μl) は、-15 ∼ -25℃で保存します。
9.3.
Post-Capture LM-PCR 増幅
サーマルサイクラーで下記のプログラムを実行します。
温度
時間
98℃
45 sec
98℃
15 sec
60℃
30 sec
72℃
30 sec
72℃
1 min
4℃
Hold (72 時間まで)
サイクル
50μl
16 サイクル
Pre-Capture LM-PCR でのプログラムとは異なりますので、実行プログラムを間違えないようご注
意ください。
反応終了後は 4 ℃で保存し、72 時間以内に精製の工程へ進んでください。
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9.3 Post-Capture LM-PCR 増幅
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
Post-Capture LM-PCR 産物の精製
9.4.
①
必要な試薬の準備をします。



SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit の SeqCap EZ Purification Beads (ボトル ②) を室温に置きます (使
用する 30 分前)。
SeqCap Epi Accessory Kit の PCR Grade Water (ボトル “H2O”) を融解します。
80％エタノールを準備します (200μl x サンプル数 x 2 + α)。
SeqCap EZ Purification Beads ではなく QIAquick PCR Purification Kit を用いてサンプルを精製す
ることも可能です。この場合、製品付属のマニュアルと異なり、最後の溶出のステップでは Buffer
EB ではなく PCR grade water を使用してください。
②
新しい 1.5 ml チューブに、各増幅後溶液を移します。
全量 (100μl)
新しい 1.5ml チューブ
増幅後溶液
ネガティブ、ポジティブコントロールサンプルについても同様に操作してください。
③
SeqCap EZ Purification Beads を Vortex でよく混合し、180μl を本項 ② のチューブに添加します。
180μl (1.8 倍量)
SeqCap EZ Purification Beads
10 秒間
④
②のチューブ
Vortex で混合し、室温で 15 分間インキュベーションします。
室温、15 分間
⑤
チューブを DynaMag-2 (または他のマグネティックラック) に差し込み、チューブ内の溶液が透明になった
ら上澄みをピペットで吸い取り、除去します。
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9.4 Post-Capture LM-PCR 産物の精製
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
⑥
マグネティックラックにチューブを差し込んだまま、80 % エタノール 200μl を添加し、そのまま室温で
30 秒間インキュベートします。
200μl
室温、30 秒間
80％エタノール
(用時調製)
⑦
上澄みをピペットで吸い取り、除去します。
⑧
本項 ⑥ ∼ ⑦ を繰り返します。
80 % エタノールにより合計 2 回洗浄します。
⑨
マグネティックラックからチューブを外し、チューブの蓋を開けた状態でビーズが乾燥するまで (5 ∼ 10
分間)、37℃でインキュベーションします。
乾燥のさせ過ぎは収量の低下につながりますのでご注意ください。
⑩
PCR Grade Water を 52μl 添加し、ピペッティングでよく懸濁します。
52μl
PCR Grade Water
Buffer EB や 1x TE ではなく、必ず PCR Grade Water を使用してください。
タッピングからのスピンダウンも可。
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9.4 Post-Capture LM-PCR 産物の精製
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
⑪
室温で 2 分間、インキュベートします。
室温、2 分間
⑫
チューブを DynaMag-2 (または他のマグネティックラック) に差し込みます。
⑬
チューブ内の溶液が透明になったら 50μl の上澄みをピペットで吸い取り、新しいチューブに移します。
50μl
新しい 1.5ml チューブ
⑭
約 50μl の Post-Capture LM-PCR 産物が調製されました。
このサンプルがシークエンシング反応に進める溶液となります。
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9.4 Post-Capture LM-PCR 産物の精製
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
9.5.
①
Post-Capture LM-PCR 産物の品質確認
濃度を測定し、吸光度測定上での品質基準を満たしていることを確認します。
Pre-Capture LM-PCR 産物の品質
基準
1.7 - 2.0
A260/280 比
500 ng 以上
収量
ネガティブコントロールでの収量
ごく微量
Post-Capture LM-PCR 産物の容量は約 50μl ですので、約 10 ng/μl 以上の濃度で測定されると見
込まれます。
②
1μl の Pre-Capture LM-PCR 産物あるいはネガティブコントロール産物を Agilent DNA 1000 Kit で泳動し、
平均サイズが 150∼500bp の範囲にあることを確認します。
DNA マーカー
リファレンスピーク
Post-Capture
LM-PCR 産物
ネガティブコントロール産物でピーク見られないことをご確認ください。
吸光度測定上の品質基準を満たしていない場合には、もう一度精製を行って下さい。電気泳動上で
の品質基準を満たしていない場合にはトラブルシューティングをご参照ください。
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9.5 Post-Capture LM-PCR 産物の品質確認
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
シークエンシングに際しての注意
9.6.
バイサルファイト変換済みのサンプルライブラリを Illumina 社のシークエンサーを用いてシークエンシングする
際には、注意しなければいけない点が数点あります。これはバイサルファイト処理した DNA の複雑性が低下し
ているためであり、下記の何れかのオプションを実施する必要があるかもしれません；
•
HiSeq2000 を使用する場合には、フローセルに「コントロール」レーンを割り当ててください。この
「コントロール」レーンには 4 種類のジヌクレオチド由来のシグナルが均等に出現するようなサンプル
を用いてください。
•
シークエンシングしたいバイサルファイト変換済みの DNA サンプルの中に、異なるバーコードインデ
ックスを持つ 4 種類のジヌクレオチド由来のシグナルがより多様に出現するようなサンプルを混合しま
す。混合する多様性の高いサンプル DNA は、全体の 10%以上の量になるようにします。
•
追加的処置として: フローセルへのインプットサンプル量をやや少なくすることで、クラスターの数が
少なくなるように微調整します。この処置により、シークエンシングの品質が向上し、有効なシークエ
ンスデータが増加します。
最良の結果を得るには、シークエンシングを実施する前に Illumina Technical Support にご連絡く
ださい (www.illumina.com)。
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9.6 シークエンシングに際しての注意
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
10. 付録
10.1. Bisulfite-conversion Control による変換効率の算出
ゲノム DNA に添加した Bisulfite-conversion Control (BCC) はラムダファージのゲノム DNA であり、その CpG
はホストである大腸菌内で通常はメチル化されていません。このため、バイサルファイト処理と PCR 増幅によ
り、BCC の全てのシトシン (C) がチミン (T) に変換されます。実験サンプル DNA がどのくらいの効率でバイサ
ルファイト変換されているかを調べるために、BCC の C から T への変換効率を代わりに利用します。つまり、
BCC で C が T へほぼ完全に変換されているのであれば、実験サンプルの CpG サイトが「C」と読まれたとき、
この塩基はバイサルファイト変換の効率の悪さによる false positives としての「C」ではなく、メチル化による
バイサルファイトで変換されない true positives の「C」であると判断することができます。
例えばミトコンドリア DNA のように、非 CpG のシトシンしか持たないサンプル DNA 中の領域をバイサルファ
イト変換効率の評価に利用することも出来ますが、本プロトコールのようにスパイクイン法を採用することで、
サンプルの品質やシークエンスの多様性に関連した変動を避けることができます。また、BCC のように小さな領
域に絞った解析をすることで、バイサルファイト変換効率の算出プロセスが容易になります。
BCC をキャプチャーするためのプローブは全ての SeqCap Epi デザインに初期設定として含まれています
(NC_001416.1 の 2kb (4500∼6500bp) の領域をターゲットとしています)。
①
ラムダファージのゲノム配列 (NC_001416.1) を含むリファレンスゲノムに対してシークエンスリードをマ
ッピングします。
②
マップ済みのリードをメチレーション解析パッケージで処理します。例えば、BSMAP
(https://code.google.com/p/bsmap/) にはメチレーションを検出する methratio.py スクリプトが含まれていま
す。下記のようなコマンドを使用した場合、ラムダファージのゲノム配列中の全ての「C」のポジションに
ついてメチレーションの有無を纏めたファイルが作成されます。
python2.6 methratio.py -d hg19_plus_NC001416.fa -s /usr/local/samtools -m 1 -z -i skip -o
Sample.methylation_results.txt Sample.bam
③
本項 ② のファイルから、NC_001416 の 4500∼6500 位置 (BCC のターゲット領域) の情報だけを抽出し、
「C_count」と「CT_count」の値を用いて変換効率を算出します。下記の例の場合、変換効率は 99.72%で
す (1 - (13 / 4720) = 0.9972)。
例）
chr
NC_001416
NC_001416
NC_001416
NC_001416
NC_001416
NC_001416
NC_001416
NC_001416
NC_001416
NC_001416
pos
4500
4501
4502
4512
4514
4515
4517
4521
4523
4524
strand
+
+
+
-
context
GCGGG
CGGGT
GGGTT
TTGTG
GTGCG
TGCGC
CGCTT
TGCAG
CAGGC
AGGCC
ratio
0.005
0
0
0.007
0.002
0.007
0
0.003
0.002
0
eff_CT_count
388
392
399
437
449
538
555
575
490
497
C_count
2
0
0
3
1
4
0
2
1
0
CT_count
388
392
399
437
449
538
555
575
490
497
変換効率 = 1 - (sum (C_count) / sum (CT_count) )
④
一般的には、バイサルファイト変換効率が 99.5%以上であれば実験は成功していると考えることができま
す。
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10.1 Bisulfite-conversion Control による変換効率の算出
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
10.2. トラブルシューティング
＜Pre-Capture LM-PCR 産物 (バイサルファイト変換後に増幅したサンプルライブラリ) ＞
症状
原因 / 対処法
収量が 1μg 未満である。
ライブラリ調製の操作に間違いがあった、使用した試薬が劣化し
た、PCR プログラムが間違っていた、プライマーの希釈に TE を
使用したなどの可能性があります。LM-PCR 用の試薬・プライマ
ーについては、評価済みのサンプルをポジティブコントロールと
して使用してください。PCR プログラムを確認してください。必
要であればライブラリ調製をやり直してください。
SeqCap Epi Accessory Kit のポリメラーゼ試薬を
適切に保存していませんでしたので、別のポリメ
ラーゼで代用することは出来ますか？
本プロトコールで指定した酵素は、ウラシルを含む鋳型 DNA を
増幅させるために特別に開発された試薬です。このような特性を
持たないポリメラーゼを代用した場合には収量が少なくなる可能
性があります。
Agilent High Sensitivity DNA chip の結果におい
て、増幅産物の平均長が 150∼500 bp でない。
適切にゲノムが断片化されていなかった可能性があります。ライ
ブラリ調製をやり直してください。ゲノムの断片化の条件と、
AMPure Beads や SeqCap EZ Purification Beads での精製・サイ
ズ調製のステップでの操作にご注意ください。ゲルからのフラク
ションの切り出しが有効な場合もあります。
一方で、過剰なバイサルファイト処理により、サンプルライブラ
リが過剰に断片化されて平均 DNA 断片長が 150 bp 以下となる場
合があります。シークエンシングやマッピング方法を変更する
か、ライブラリ調製をやり直してください。
サンプルの精製が充分ではありません。もう一度精製を繰り返し
てください。
A260/280 比が 1.7 未満である。
LM-PCR のステップからのオリゴヌクレオチドのキャリーオーバ
ーによるものと考えられます。こうしたキャリーオーバーは 150
bp 以下のサイズに 1 本か複数のシャープなピークとして観察さ
れます。こうした短い核酸はコンタミネーションとはみなされ
LM-PCR のネガティブコントロールで、バックグず、キャプチャーの工程にも影響を与えません。しかし、ネガテ
ランドレベル以上に吸光度測定値が観察された。ィブコントロールからの LM-PCR 産物の吸光度測定値がかなり高
い値を示す場合にはサンプルライブラリのコンタミネーションが
起こっている可能性があります。必ず電気泳動で核酸サイズ分布
を確認し、必要であれば LM-PCR /ライブラリ調製をやり直して
ください。
150 bp 以下に 1 本か複数のシャープなピークが
観察される。
LM-PCR のステップからのオリゴヌクレオチドのキャリーオーバ
ーによるものと考えられます。こうした短い核酸はコンタミネー
ションとはみなされず、キャプチャーの工程にも影響を与えませ
んが、吸光度による濃度測定が過大評価されてしまいます (実際
のライブラリ濃度は吸光度測定値よりも低濃度となります) 。低
分子断片の除去をゲルからの切り出しで実施する場合にはこのよ
うなピークは観察されません。
LM-PCR のネガティブコントロールで、150∼
500 bp のサイズで増幅産物が観察される。
増幅サンプル間でのクロスコンタミネーションが原因である可能
性があります。ライブラリ調製試薬のコンタミネーションが無い
かどうかを確認し、必要であれば新しいキット・新たに調製した
ゲノム DNA でライブラリ調製をやり直してください。
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10.2 必要機器・試薬
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
＜Post-Capture LM-PCR 産物＞
症状
原因 / 対処法
ハイブリダイゼーションか洗浄のステップでの温度が適正ではな
かった可能性があります。それぞれの機器の温度を実測で測定
し、正しい温度でもう一度実験を繰り返してください。
収量が 500 ng 未満である。
PCR 用の試薬が劣化していた可能性があります。ポジティブコン
トロールを用いた場合に充分に増幅されるかどうかをご確認くだ
さい。ポジティブコントロールでの増幅が確認できなかった場合
には、ハイブリダイゼーションをやり直し、新しい PCR 試薬で
操作を行ってください。
NOTE:
ターゲット領域の設定が小さい場合 (特に小さな Loci を累積的に
デザインするカスタム SeqCap Epi の場合) は、実験に成功して
いる場合でも収量が充分に得られない場合があります。
適切にゲノムが断片化されていなかった可能性があります。ライ
ブラリ調製をやり直してください。ゲノムの断片化の条件と、
Agilent DNA 1000 chip の結果において、増幅産物
SeqCap EZ Purification Beads でのサイズ調製のステップでの操
の平均長が 150∼500 bp でない。
作にご注意ください。ゲルからのフラクションの切り出しが有効
な場合もあります。
A260/280 比が 1.7 未満である。
サンプルの精製が充分ではありません。もう一度精製を繰り返し
てください。
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10.2 トラブルシューティング
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
＜シークエンス結果の解析＞
症状
原因 / 対処法
Bisulfite-conversion Control の変換が確認できな
い。
データを適切に解釈していないことにより、メチレーション状態
を適切に評価していない可能性があります。10 章 1 項「Bisulfiteconversion Control による変換効率の算出」の手順を見直してく
ださい。
Bisulfite-conversion Control の変換効率が低い。
コントロールが十分にバイサルファイト変換されていないことに
より、メチレーション状態を適切に評価していない可能性があり
ます。バイサルファイト処理のプロトコールを再検証し、10 章 1
項「Bisulfite-conversion Control による変換効率の算出」の手順を
見直してください。
サンプルの複雑性の低下により PCR 重複率の増加が引き起こさ
れます。ネイティブな (バイサルファイト変換されていない) ゲノ
ム DNA ライブラリのキャプチャー実験においては、一般的に
は、ライブラリ調製に使用する DNA 量を減らした場合、ライブ
ラリ調製時のアダプターライゲーションの反応効率が低い場合、
Pre- and/or Post-Capture LM-PCR で過剰に増幅された場合、ハ
イブリダイゼーションまたは洗浄を過度に厳密な条件で実施した
場合、増幅後のビーズ精製工程でサンプルをロスした場合などが
PCR 重複リードを高くする要因と考えられます。
PCR 重複リード率が予想よりも高い。または、
同じキャプチャープローブデザインの試薬を用い
た場合での実験間のバラつきが大きい。
サンプルライブラリをバイサルファイト変換する SeqCap Epi エ
ンリッチメントシステムでは、PCR 重複リード率が高くなったり
サンプル間での差が大きくなったりする追加の要因が考えられま
す。これは、バイサルファイト変換プロセスが過酷な反応である
(85%以上の DNA 分子にダメージを受ける) ために、PCR の鋳型
として機能できなくなることに由来します。バイサルファイト変
換によるダメージが小さければ、ダメージを受けていない DNA
の量は増加しますが、これがサンプル間での差が大きくなる要因
となります (例えば、90%の分子がダメージを受ける条件と 92%
の分子がダメージを受ける条件とを想定した場合、ダメージを受
けていない分子はそれぞれ 10%と 8%になりますが、ダメージを
受けていない分子間での差は 20％となります) 。ライブラリ調製
に使用するゲノム DNA の量を増やしたり、LM-PCR サイクル数
を減らしたりすることで、PCR 重複リード率を下げることができ
るかもしれません。
PCR によるバイサルファイト変換済み DNA の増幅が、アレル間
のバイアスのリスク増加に関連すると考えられます (一般的には
非メチル化アレルが増幅されやすい) 。LM-PCR は 1 セットのプ
ライマーを使用するためプライマーアニーリングのバリエーショ
ンを考慮する必要が無いという利点がある方法ですが、ライブラ
リインサートのメチル化状態が異なると、同じローカスの増幅に
おいてもメルティングプロファイルが変化し、この結果、バイサ
ルファイト変換後のアレル間で増幅率の違いが生じ、最終的にシ
ークエンスデータでのバイアスとなります。
データ解析の結果、非メチル化アレルのキャプチ
ャーの方が多くデータを得られる傾向がありますこうしたメルティングプロファイルの差による影響を最小限にす
が？
るには、LM-PCR 反応での効率的な変性ステップが重要となりま
す。サーマルサイクラーの適切なキャリブレーション、適切な
PCR チューブの使用 (thin-walled) 、変性時間の延長やより高温で
の設定、DMSO やベタインなどの PCR 添加剤の使用などがこの
現象に効果をもたらすかもしれません。また、LM-PCR のサイク
ル数を減らすこともアレル間のバイアスのリスクを下げることに
有効かもしれません。バイサルファイト変換 DNA を用いた実験
に内在するバイアスを測定・補正するようなバイオインフォマテ
ィクス技術もご検討ください。
58 / 59
10.2 トラブルシューティング
SeqCap Epi Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
R ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社
〒105-0014 東京都港区芝 2-6-1
TEL: 03-5443-5287
MAIL: [email protected]

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