2015 / July No.31 NEXT Interview 生物が刻む時を理解する 生 命 現 象 を 透 明 化し 、個 体 全 身 を 一 つ の シ ス テ ム とし て 解 析 上田泰己 氏（ 東 京 大 学 医 学 系 研 究 科 機 能 生 物 学 専 攻システムズ薬 理 学 教 授 、理 化 学研究所生命システム研究センター細胞デザインコア・コア長） P. 04 Ther mo Scientific Q Exactive 四重極 - オービトラップハイブリッド質量分析計 P. 06 GeneAr t CRISPR Nuclease mRNA システム P. 07 mMESSAGE mMACHINE Kit P. 08 iBind Flex Western System P. 10 QuantStudio 3 リアルタイムPCRシステム, QuantStudio 5 リアルタイムPCRシステム P. 12 Custom TaqMan SNP Genotyping Assays P. 14 Ion PGM Hi-Q Chemistry, Ion Proton Hi-Q Chemistry P. 16 ProLong Live Antifade 試薬 NEXT Interview 生物が刻む時を理解する page 02 インタビュアー： サ ーモフィッシャーサイエンティフィック 橋本裕子 page 03 す ぎ な い 問 題 から 始 め 、そ の 後 複 雑 な 探し出しました。するとたった 1 種類のキ も のにチャレンジしようと思 い 、 『 時間 』 ナ ー ゼ を 阻 害 するだ け で 、時 計 の 周 期 生 命 現 象 を 透 明 化し 、個 体 全 身 を 一 つ の シ ス テ ム とし て 解 析 と『 空 間 』を テ ー マ に 選 び ました 。生 物 が 24 時 間から 48 時 間に大きく変 化する はどうやって 時を刻 む の か 、細 胞 は 同じ ことを見 つけました。しかもそ の 反 応 は、 「 生 物 は 、たった 1 個 の 細 胞 に す べ て の 上田泰己 氏 情 報 を 使 い な がらどうやって 異 なった そ れまで の 化 学 の 常 識に反して 温 度 非 情 報を圧 縮し、次 世 代 へと伝えてきまし 細 胞 に 分 化し正しい 空 間 に 配 置 さ れる 依存性。生体分子の質を観察することの た 。しかし生 き て い る間 は 、同じ情 報 を の か 、そういう問 題を解きた いと思った ん で す 。そして『 時 間 』の 研 究 で は 、一 重要性に気づきました」。そこで 2011 年、 最 大 限に活 用し、環 境ともやり取りしな がら、学 習や進 化で困 難を乗り越えてい 新しく赴 任した 理 化 学 研 究 所 の 生 命 シ 方 向 に 進 む 時 間 よりも 、周 期 性 が あ る ステム研究センターでは、質量分析計を 時 間 の 方 が 検 証しや す い と思 い 、体 内 導 入し、キナーゼやそ の 基 質 のリン酸 化 （東京大学医学系研究科機能生物学専攻システムズ薬理学教授、理化学研究所生命システム研究センター細胞デザインコア・コア長） 「昨年、マウスの全身を丸ごと透明化する技術を開発しました。それは生物の個体の中で起きる現象を 1 細胞レベルの解像度で捉え、分子、細胞、個体という3 つの階層をつなげる技術です。 この技術を使えば個体レベルの生命現象を部分と全体の両面から解析できるはず」。 こう語るのは、上田泰己氏。体内時計の分子メカニズムをシステムバイオロジーから描き出し、 新しく 『 睡眠 』という個体レベルの生理現象の原理に迫ろうとしています。 「睡眠をモデル化することは、その対照である覚醒を照らしだすこと。 その先には、意識とは何か、自己とは何かという興味深い問いが続いています」。 新たな生命科学の地平に挑む上田氏に、時間研究の過去と未来を伺いました。 時 計 の 研 究を始 めました 。ちょうどそ の を始め、様々なタンパク質の修飾を解析 頃 、生 物 のゲノム解 読が次々と終 了して できる体制を整えます。 いった の で 、そ れらを 分 子カタログとし て利 用できるとも思 いました」と上 田 氏 。 2005 年 、哺 乳 類 のマウスで体 内 時 計 の 周 期 性 を 生 み 出 す 一 連 の 遺 伝 子 群（ 時 計 遺 伝 子 ）とそ の 相 互 作 用 ネットワーク を明らかにしました。生 命 現 象を動 的で 複 雑 な シ ス テ ムと 捉 え 、実 験 的 手 法 と 全身を透明化する新技術 2 0 1 4 年 1 1 月、上 田 氏らは 、マウス個 体 全身における遺伝子の働きや細胞ネット ワーク構造を三次元データとして取得し、 病理解析や解剖学に応用するための基盤 技 術を発 表しました。マウス個 体には約 300 億個の細胞があり、複雑な細胞ネット ワークが構築されています。この技術は、 個体全身の遺伝子発現や細胞ネットワー クの動きを定量的に取り扱うことで、生命 現象を個体レベルで捉え、その現象の仕 組みを解明する新たなイメージング法で す。 「半年前に発表した全脳イメージング 解析技術『 CUBIC（キュービック）』の透 明 化 試 薬を、他 の 研 究 室で試しに使って もらったところ、肝臓が脱色されることに 気付いた大学院生がいました。調べてみ 数 理 的 手 法 を 統 合 的 に 用 い て 包 括 的・ 定 量 的 な 解 析 を 行うシステム バイオロ ジーからのアプローチでした。 分子から細胞、そして 個体レベルの研究へ 「また そ の 頃 、個 体 を 対 象に研 究 するた め の 長 期 計 画 を 立 て ました 。一 つ は 少 量多品種の遺伝子改変動物を作製す ること、二 つ 目 は そ れらをしっかり調 べ るた め の 技 術 開 発 で す 。前 者 に つ い て 分子カタログだけでは不十分 ? 現 象 の 解 析 は 宇 宙 研 究と肩を並 べるス ケ ー ルに 達します 。1 6 世 紀 の 天 文 学 で は 、テイコ・ブラ ー エ の 詳 細 な 観 測 デ ー タから、ケプラーが運 動 の 法 則を発 見し、 そ こから ニュートン が 万 有 引 力 の 法 則 を導きました 。生 命 科 学 の 分 野 でも 、技 術を使 いこなし、新たな法 則を見つけ出 すケプラー 達が出てくることを期 待して い ます 」と、上 田 氏 は 若 い 研 究 者 にメッ セージを送ります。 「 あ まり意 識して い ま せ ん でした が 、分 子とそ のつながりが分かれば、そ れです べてを理解できると、その当時は考えて いました 。しかし個 体にとって の 時 間に つ い て 真 剣に考 えだすと、どうしても 不 十 分 だと思 い 始 めました 。例 えば 、分 子 レベ ル の 現 象 は 生 化 学 反 応 が 基 本 で あ り、温 度 に 依 存 するは ず 。ところが 生 物 は寒くても暑くても、基 本 的には同じ周 期 で時を刻 ん でいます。この ギャップは どこから来 るの か ? そ の 疑 問 に 答 える ため、体内時計が大きく乱れる変異体を で 個 体 全 体 をゲノム 改 変 できる技 術 を 開 発しまし た 。二 つ 目 は 、冒 頭 の 全 身 透 明 化 技 術 で す 。そ れ 以 外 に も 、1 細 胞 から遺 伝 子 発 現 を 網 羅 的に解 析 する 『 Q u a r t z - S e q 』技 術 等を開 発しました 。 今 後 、これら 技 術 を 柔 軟 に 組 み 合 わ せ 、 『 睡 眠 』の 研 究 を 進 めた い 。自 分 自 身 も ワクワクして いますよ」と上 田 氏 は 声を 弾ませます。 「睡眠」のモデル化へ 「 体 内 時 計は、24 時 間 周 期で自転する地 球 の 環 境を生 物 が 体 の 内 部に取り込 ん 組織を脱色することがわかりました。そこ 的に備えているシステムです。例えばヒ で還流操作を加えたプロトコールを開発 トでは、睡 眠・覚 醒 、血 圧・体 温 調 整 、ホル し、シート照明型蛍光顕微鏡と使うことで、 モン分 泌 などをフィードフォワード的に 臓器や全身を高速解析するイメージング 制 御します。これに対して周 期 的ではな 技術として発表しました」と上田氏は、発 い 睡 眠 が あります 。そ れは 、疲 れが 溜ま 見のきっかけを語ります。 ると眠くなるという、フィードバック的 な 現 象であり、記 憶や学 習が関 与している ました 。自 分 にとって 複 雑 す ぎ ず 、簡 単 は 1000 億 個 。300 億 個 の 細 胞を総 合 的 に解析できる透明化技術を使えば、生命 しの 遺 伝 学 』を 実 践 す べく、ゲノム 編 集 だものであり、地球上の生命がほぼ普遍 「 大 学 三 年 の 頃 、何を研 究 するかを考 え ます。一 方 、この 宇 宙で観 測 可 能 な 銀 河 は 、スピ ートアップ を 図 るた め『 交 配 な ると、この 試 薬は血 液 中 の ヘムを溶 出し、 なぜ、 「時間」を研究するのか ? 透明化された生命に宿る 新たな宇宙 可能性があります。疲れを感知する機構 マウス全身の透明化 や 睡 眠 の 核となる脳 の 部 位 を 探しだし、 開発した灌流（ CB-Perfusion ）プロトコールで、マウスの全身 睡眠をモデル化していきたい」と上田氏 を丸ごと透明化した様子。左は幼児マウス、右は成体マウス。 出典：理化学研究所 は語ります。 上田泰己（うえだ ひろき） 2 0 0 0 年 東 京 大 学 医 学 部 医 学 科 卒 業 、2 0 0 4 年 同 大 学 医 学 系 研 究 科 博 士 課 程 修 了 、博 士（ 医 学）。その間、ソニーコンピュータサイエンス研究 所、ERATO 北野プロジェクト、山之内製薬株式会 社 研 究 員など。2003 年 理 化 学 研 究 所 発 生・再 生 科 学 総 合 研 究センターシステムバイオロジー 研 究チーム・チームリーダー、2004 年同機能ゲノミ クスサブユニット・ユニットリーダー、2009 年同シ ステムバイオロジー研究プロジェクト・プロジェク トリーダーを経て、2011 年より理 化 学 研 究 所 生 命システム研究センター細胞デザインコア・コア 長、2013 年より東京大学大学院医学系研究科シ ステムズ 薬 理 学 教 室 教 授 。日本イノベ ーター 大 賞・優秀賞（ 2004 年）、文部科学大臣賞若手科学 者賞（ 2006 年）、日本 IBM 科学賞（ 2009 年）、日本 学術振興会賞（ 2011 年）、塚原仲晃記念賞（ 2012 年）等を受賞。 Thermo Invitrogen Scientific page 04 Thermo Invitrogen Scientific page 05 プロテオミクス／メタボロミクスから創薬研究まで対応 質量分析から何が分かる ? ∼バイオマーカーの探索・同定への応用∼ ■ Thermo Scientific Q Exactive 四重極 - オービトラップハイブリッド質量分析計 ▶ 信頼性の高い分析結果を迅速に取得 Thermo Scientific™ Q Exactive™ 四重極 - オービトラップハイブリッド質 ● 化 合 物 を 迅 速 か つ 確 実に定 性 、同 定 、 定量分析するシステムです。プリカー サーイオンを選択する四重極と、高分 質量分析部を組み合わせ、様々な用途 異なったもの、翻訳後修飾によって質量が変化したものなど生 体分子の違いを示す情報が含まれてます。 ● フルスキャンモードおよび全イオンフラグメンテーション（ AIF ）モードでサブ 内部で開裂させて得られる MS/MS スペクトルから分子の構 ppm の質量精度が得られ、確実に化合物を同定します。 AIF 、インソース CID 、および HCD など複 数 の 開 裂 手 法により、幅 広 いアプリ 造が分かります。図 3 は 2 つのセリンがリン酸化されたペプチ 図 5 は LC-MS のデータを、横軸を時間、縦軸をイオン強度で ドの MS/MS スペクトルですが、N 末 端から 6,9 残 基目のセリ 示したものです。2 つのサンプルで明らかに存在量が異なる物 ケーションで化合物同定を支援 ンがリン酸化されていることが解析結果から分かります。同様 質が含まれることが分かります。生体サンプルの場合、非常に ● ● 最大分解能 140,000FWHM で m/z 6,000まで拡大することで低分子 の 解 析は糖 鎖にも応 用でき、図 4 のように糖 鎖 構 造 情 報が得 近接した質量の分子が多数存在するため、オービトラップのよ から生体高分子までの検出能力を向上 られます。 うな質量分解能が高い装置が必須となります。 4 桁を超えるスペクトルダイナミックレ ンジとフェムトグラムレベ ルの感度に 近接した分子量を高精度に分離同定 図3 より、一度のスキャンで微量化合物と HCDを始め、複数の開裂手法で 図4 C441-R449, N448 glycosylation, Relative abundance = 0.52% 図5 高含量化合物を同時に検出 幅広いアプリケーションに対応 ● 数千スペクトル取得できます。この膨大なデータには発現量が ばリン酸化であれば、分子量が 80Da 増加するため、質量分析 ● で優れた性能と機能を提供します。 で分析すると、時々刻々と変化する溶出物の質量スペクトルを 量（ m/z ）、縦軸をイオン強度とする質量スペクトルです。例え によって容易に識別できます。さらに、着目したイオンを装置 ● 解能・高質量精度を誇るオービトラップ このような質量分析計を液体クロマトグラフと連結し、LC-MS 時に相対的な存在量が分かります。得られる情報は、横軸を質 ● オービトラップを搭載し、 高い分解能で極めて近接した分子量も質量分離します。 再分析の必要がありません。 量分析計は、より多くのタンパク質や ● HR/AM フルスキャンにより、常にすべてのサンプルデータが取得されるため、 質 量 分 析 計は原 子 、分 子 の 重さを知るための 装 置であり、同 m/z6,000まで拡大でき、 低分子から生体高分子までを検出 ● ベンチトップ型のLC-MS ／MSシステム ［オービトラップ質量分析計とは? ］ s Comments User ’ サーモフィッシャーサイエンティフィックのオービトラップ質量分析計は、2005 年の販売開始以来、薬物代謝、不純物分析、天然物、 メタボロミクスやプロテオミクスなど幅広いアプリケーション分野で活用されています。オービトラップ質量分析計は、高周波や強 大出晃士 氏（東京大学大学院医学系研究科 機能生物学専攻 システム薬理学教室 助教） 磁場を必要としない、新しい原理に基づくイオントラップ型質量分析計であり、Alexander Makarov によって開発されました。高 概日時計の研究や臨床プロテオーム研究に質量分析計を活用 い分解能（最大 140,000 ）と安定した質量精度が特長です。これにより、複雑なマトリックス中のターゲット化合物であっても、より 迅速に、より確実に検出・同定できます。従来の TOF 型を超える分解能で、プロテオミクスやメタボロミクスにおいて、定性だけで になるRNA 分解に気を使う必要は必ずしもありませんし、生化 なく定量も同時に行い、未知分子の同定に威力を発揮します（図 1,2 ）。 学的な解析のようにタンパク質の立体構造が保たれている必 要もないので、扱えるサンプルの幅は広いと思います。例えば 10 年以上前に保存されたパラフィン包埋組織切片からリン酸 外部電極 化サイトが同定できるものもありました。今後ますます、臨床 イオン導入口 研究での質量分析の重要性が高まると考えています。 中心電極 回転運動 分解能 概日時計の研究では、周期の長さがなぜ 24 時間になるのか、そ の制御に関わるタンパク質の翻訳後修飾、特にリン酸化に注目 30,000（高性能なTOF ） してアプローチしています。具体的には、マウス肝臓や培養細胞 分解能 120,000（現在のオービトラップ） をサンプルに、質量分析計で概日時計タンパク質のリン酸化部 振幅運動 位の同定と定量を行っています。抗体を使うアプローチに比べ Z 軸方向の周波数 （ k：定数、ｍ：質量、z：電荷数） 図 1 分解能の比較 オービトラップは、プロテオミクス解析などで使用されるTOF（ Time of Flight ）分析より 図 2 オービトラップ原理図 も高い分解能を有しています。例えばオービトラップなら、分子量 480.30と480.35 の分 加速されたイオンが中心電極の周囲を安定して回転振幅運動するような形状になってい 子を分離できますが（下段）、TOF の分解能では分離できません（上段）。 ます。振幅運動の周波数を記録し、周波数の違いを m/z の違いとして検出します。 て、同定・定量するリン酸化サイトの選択自由度が高いことが魅 力ですね。 質量分析計を使い始めて 4 年程度ですが、研究手法の選択肢 の一つとして多様な用途で常時使っています。安定した測定を 続けるには HPLC や質量分析計の状態を普段からモニターし、 不具合の " 気配 "を察知して適切なメンテナンスをすることが欠 かせません。このあたりが、質量分析計は運用が難しいと、専門 家でない研究者に敬遠されがちな理由かもしれません。私た ちの研究室は質量分析を主な専門とする研究室ではありませ んが、そうであるが故に、身近にいつでも質量分析計が稼働し もう一つは、臨床の先生方との共同研究で、バイオマーカーの ているからこそ生まれる発想が多々あります。抗体がないから、 発見や疾患の深刻度を定量できないかと研究を進めています。 あるいはそもそもどの分子に着目すればよいか解らないから、 サンプルは、脳脊髄液やパラフィン包埋組織などと様々で、そ といった理由で、自分たちの発想、見つけた面白い現象の追及 れぞれに応じたサンプル調製法を整える必要があります。それ を諦める必要はありません。質量分析計が研究者にとって、一 でも、プロテオーム解析に限定すれば、遺伝子発現解析で問題 層身近なツールになることを期待しています。 分析機器のお問い合わせはこちら▶ TEL.0120-753-670 Invitrogen page 06 Invitrogen page 07 User's Voice mRNAフォーマットの Cas9 が、ゲノム編集をさらに身近に! 真 下 知 士 氏（ 大 阪 大 学 医 学 系 研 究 科 ■ GeneArt CRISPR Nuclease mRNA システム 准教授） CRISPR ／ Cas システムが支えるヒト化動物の開発に向けて GeneArt CRISPR T7 Strings DNAとmMESSAGE mMACHINE kit で効率よくゲノム編集 Invitrogen™ GeneArt™ CRISPR Nuclease mRNA システムは、 野生型 Cas9をmRNA で導入するシステムです。 共導入するガイドRNA（ gRNA ）の導入方法を目的に応じて選択すれば、 ベクターの準備にかかる手間を大幅に省略したり、 ● 複数ターゲットのゲノム編集に最適 ● より幅広い細胞種や胚でのゲノム編集を実現 2009 年、世界に先駆けてゲノム編集に よるラット疾患モデルの作製に成功した ▶ 柔軟な実験ワークフロー 真下知士氏。前職の京都大学では約 7 年 間 遺 伝 子 改 変ラットの 作 製に関 わる研 mRNA の Cas9と一緒に導入するgRNA 発現エレメントは、目的に合わせて2つの方法から選べます。 究やゲノム編 集 技 術 の 開 発を行ってき ました。今年 4 月より赴任した大阪大学 ① 時間と手間を短縮するなら、Ready-to-transfect ② 抜群の切断効率を求めるなら、RNAを直接導入 GeneArt CRISPR U6 Strings™ DNAに標的配列を組み込み、GeneArt CRISPR Nuclease mRNAと一緒に導入します。ready-to-use のシンプルな実験系です。 GeneArt CRISPR T7 Strings™ DNAに標的配列を組み込み、MEGAshortscript™ T7 Transcription Kitを使用してin vitroでgRNAを調製後、細胞に導入します。直接 RNA を導入するので、 トランスフェクション効率が低い細胞や、U6プロモーターが働かない細胞 ® ® にも対応します。幹細胞や胚など、従来よりも幅広い細胞種でゲノム編集効率が向上します。 GeneArt CRISPR U6 Strings™ DNA GeneArt CRISPR Nuclease mRNA GeneArt CRISPR T 7 Strings DNA gRNA in vitro 転写産物 TRANSFECT with Lipofectamine MessengerMAX Reagent ANALYZE TRANSFECT with Lipofectamine MessengerMAX Reagent GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit を ゲノム編集を シーケンスで確認 用いて切断効率を評価 ANALYZE では、ゲノム編集技術の開発を発展させ、 さらに遺伝子改変動物作製の学内支援 を行う研究グループを率いる、まさにゲ ノム編集のエキスパートです。 mRNA のインジェクションで CRISPR ／ Cas システムを IVT gRNAs 用いて切断効率を評価 の 作 製 も 進 めて います 。様 々 なヒトの す。一度に複数の gRNA を導入し、標的 遺 伝 子 の 疾患モデルを作製することが 易になったと続けます。近 年 、真 下 氏ら ● ゲノム編集の準備にかかる時間と手間を削減 GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit を ながらにヒト遺 伝 子をもつ モデ ル 動 物 業効率が格段に上がりました」と語りま の 遺 伝 子をまとめて破 壊 することも容 幅広い細胞種へのゲノム編集が可能。 GeneArt CRISPR Nuclease mRNA するだけでインジェクション可 能で、作 一層効率化 真下氏は CRISPR ／ Cas システムを活 ゲノム編集を シーケンスで確認 用し、m R N A を受 精 卵 へ 直 接インジェ クションする方 法で様 々な 遺 伝 子 改 変 動物を作製してきました。 「 mRNA 合成 には、初めてラット疾患モデルを開発し た頃から mMESSAGE mMACHINE ▶ 効率良い導入方法は? トランスフェクション試薬を使う場合、どちらの方法でも Invitrogen™ Lipofectamine™ MessengerMax Reagent がお勧めです。高い 導入効率が期待できます。特に導入効率が低い細胞や胚へは、ワークフロー②で RNA をマイクロインジェクションなどで直接導入すること もできます。 kit を使用しています。また guide RNA （ g R N A ）は G e n e A r t C R I S P R T 7 Strings DNA で設計して発現させてい ます。クロー ニングせ ずに R N A を作 製 狙いです。 「 ゲノム編 集 技 術 の 発 展 で細 胞 移 植に は受精卵への導入に手間のかかるイン よってヒト化させる、あるいは遺伝子から ジェクションに代わり、エレクトロポレー ヒト化させる、 といったヒト化動物作製へ ションによって効率よくmRNA を導入す の研究手法が容易になってきました。今 る技術を開発しました。今後もゲノム編 後ヒト化動物は様々な医学研究の基盤 集技術を使った研究の進展が期待でき になっていくでしょう」と創薬研究のブレ そうです。 「ノックインのゲノム編集が一 イクスルーについて語ります。 般化すれば、mRNA だけでなくノックイ ンベクターを利 用した人 工 遺 伝 子 合 成 のニーズも一 層 高くなるでしょう」とさ らなる展開を予想します。 ゲノム編集で作製した ヒト化動物で創薬研究の ブレイクスルーをねらう ノックインのゲノム編集が 医学研究の新たなトレンドに 真下氏が現在注目する研究は二つ。 「一 つ目は光 感 受 性チャネル遺 伝 子をゲノ ム編集で動物体内にノックインし、外部 から光を当てるだけで特定の神経細胞 の活動を制御するオプトジェネティクス 現 在 、真 下 氏が進めている研 究 の 一 つ 研 究 。動 物 の 行 動を神 経 細 胞レベ ルで は CRISPR ／ Cas システムによる免疫 解析できると考えています。二つめは in 不全動物の作製。例えば、薬のスクリー vivo ゲノム編集。これまでは受精卵にイ ニ ング で 活 用 さ れ るヒト 肝 細 胞 は i n ンジェクションして " 次に生まれる世代の vitro 培養で増やすことが難しいけれど、 ゲノム編集 " を行ってきましたが、これか 動物体内に移植できれば安定して増や らは " 現 世 代 のゲノム編 集 " にも取り組 せます。また、患者の細胞を遺伝子レベ む 予 定です。この 研 究が進 めば遺 伝 子 ルで治 療する研 究は i P S 細 胞 などでも 治療が薬物治療のように利用されてい 進 められて い ますが 、作 製した 細 胞 の く日も近いかもしれません」。 安 全 性 を 確 認 するた めには 、ヒト細 胞 「ヒト化動物をはじめ遺伝子改変動物の の動態を動物体内で確認していく必要 開発支援も学内に留まらず学外にも広 が あり、免 疫 不 全 動 物 が 欠 か せませ ん 。 げていきたい」と語る真下氏。ゲノム編 さらに真 下 氏 は 、C R I S P R ／ C a s シス 集 技 術をさらに深 化させ 、医 学 研 究 の テムで遺伝子をノックインさせ、生まれ 可能性を大きく広げていきます。 ▶ 確実な切断効率の評価方法は? Invitrogen™ GeneArt™ Genomic Cleavage Detection Kitを使えば、切断効率を定量化できます。CRISPR/Cas9 で切断された標的 配列は、細胞の NHEJ 修復機構の過程で塩基の欠失や挿入（ indels ） が生じています。その領域を PCR 増幅して、このキットに含まれるミ スマッチ認識酵素で切断。短くなったフラグメントを電気泳動で検出します。クローニングやシーケンシングなどの手間はかかりません。 製品名 GeneArt CRISPR Nuclease mRNA サイズ 製品番号 価格 ■ mMESSAGE mMACHINE Kit Invitrogen™ mMESSAGE mMACHINE™ T7 Ultra Kit は、キャップ構造とポリ（ A ） テー ルを持 つ R N A を大 量に合 成 するキットです。より高 収 量 のタンパク質を産 生 する RNA 転写産物を合成し、ゲノム編集実験において TALENs や CRISPR ／ Cas9 を mRNA 15 µg A25640 ※1 200 ng 受託合成品 GeneArt CRISPR Strings T7 DNA ※1 200 ng 受託合成品 ※2 Lipofectamine MessengerMAX Transfection Reagent 1.5 mL LMRNA015 MEGAshortscript T7 Transcription Kit 25 反応 AM1354 MEGAclear Transcription Clean-Up Kit 20 反応 AM1908 ¥ 21,200 製品名 サイズ 製品番号 GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit 20 反応 A24372 ¥ 47,200 mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA Kit 10 反応 AM1345 GeneArt CRISPR Strings U6 DNA ※ 1 ご注文にはライフテクノロジーズオンラインオーダー IDが必要です。 www.lifetechnologies.com/crispr-mrna-jp から、注文書をダウンロードして必要事項をご記入の上、[email protected]までお送りください。 ※ 2 納期は9 営業日∼です。CRISPR 配列デザインをオプションで依頼した場合は、別途 2 営業日要します。 ¥73,100 RNAフォーマットのゲノム編集に最適 ! ※2 ¥12,900 ¥12,900 ¥ 101,100 ¥ 61,400 で導入する場合に最適です。 価格 ¥92,200 Invitrogen page 08 電源不要の抗体反応自動化システムが、よりフレキシブルに進化 ! ■ iBind Flex Western System Invitrogen page 09 User's Voice 増 田 万 里 氏（ 国 立 が ん 研 究 セン タ ー 研 究 所 治 療 開 発 グ ル ー プ・主 任 研 究 員 ） がんの個別化医療を見据えた新規プロテオーム解析技術の開発 NEW! プレキャストゲルや iBlot ドライブロッティングシステムで効率よく標的分子を検出 Invitrogen™ iBind™ Flex Western System は、 ウェスタンブロッティング解析の抗体反応を自動で行うシステムです。 次世代のがん治療で中心的な役割を期待される分子標的治療薬。治療効果に個人差が生じることから、投薬前に患者の微量検 人気の iBindシステムよりも、多くのサイズのメンブレンに対応し、実験を効率よく進められます。 体をバイオマーカーで診断し、有効性と安全性の確認を行う必要があります。このような「コンパニオン診断」は、個別化医療だ けでなく、少ない症例での薬の臨床開発が可能となり、創薬開発を加速すると注目されています。有効なコンパニオン診断技術 ● すべての抗体反応 ・ 洗浄ステップを自動化 の開発に向けて、研究を進める国立がん研究センター研究所の増田万里氏にお話を伺いました。 ● 煩雑な作業から解放され、他の実験 ・ 研究に使える時間を確保 ● 高感度で再現性の高いクリアなデータを取得 ● オーバーナイトの抗体反応を約 2.5 時間に短縮可能 ▶ 様々なメンブレンサイズに対応 メンブレンのタイプ iBind Flex Western Device（ SLF2000 ） Yes Yes Mini blot（ dual ） Yes No Midi blot Yes No Vertically cut strips ※ Yes No ※メンブレンを細長く切り分け、1 度に複数抗体を使用可能 ▶ 簡単な操作の流れ iBind デバイスに iBind 装置の 4 つのウェルに カードとメンブレンをセット 抗体液・洗浄液をセット メンブレン メンブレンを取り出し、 約 2.5 時間、静置する AP または HRP で検出 ウェルカバー iBind カード iBindカードとメンブレンをシステムにセットすると、システム本体からiBindカードに加えられた機械的な圧力によって、メンブレン上を 各溶液が適切なタイミングで流れます。抗体溶液や洗浄液は、iBindカードに埋め込まれたグラスファイバーによってメンブレン上を一 キ ング から 2 次 抗 体 反 応 後 の 洗 浄 ま 氏は説明します。 でを自 動 で 行うハンズフリー の i B i n d W e s t e r n S y s t e m s も 活 用 するとか 。 「これらは す べ て 難しい 操 作 や 技 術 は 必 要 なく、誰 で も 再 現 性 よくできる点 がメリットで すね 。プレキャストゲ ルや 存 するの で 、検 証 は 主 にウェスタンで 手作業に要する労力と時間を他の作業 自動 化 技 術を上 手に使 いこなすことで、 増田氏らは、細胞抽出液をスライドガラ シング ル バンド 、あ る い は 予 測 で きる に配 分 できるの で 、研 究 が 大 幅に効 率 スにマイクロアレイ化し、リン酸化特異 複 数 バ ンド が 検 出 さ れ る か を 確 認し 化 できます 」と効 率 的 な 実 験につ い て 的 抗 体 を 用 い て 、数 百 ~ 数 千 の 試 料に ます 。また R P PA 法 で 得られた 結 果 は 、 コメントします。 おける約 200 個のシグナル伝達のキー ウェスタンでも 確 認 できることは 重 要 がんに対する創薬標的キナーゼ探索と と な る タ ン パ ク 質 リン 酸 化 状 態 を 把 で す 」と増 田 氏 。信 頼 性 の 高 い 検 証 の コンパニオン診 断を軸とする個 別 化 医 握 できる逆 相 タンパクアレイ（ R P PA ) た めに 選 ん だ の は 、バンドの ゆ が み が 療 の 実 現に向 けて 、増 田 氏 は 効 率よく 基 盤 を 確 立しました 。この 基 盤 を 用 い 少 なく分 離 が 良 い 、N u PA G E S D S - 着実に研究成果を積み上げています。 て、マルチキナーゼ阻害剤ソラフェニブ には、スライドガラス上に希釈系列を含 PA G E g e l s y s t e m 。サ ンプ ル 数 が 多 い 時 は 、2 6 ウェ ル の ミ ディゲ ル で 、 XCell4 SureLock Midi-Cell タンク を 使 い 、同 時 に 4 枚 まで 一 気 に 泳 動し ます。転 写にはドライ式 の iBlot ドライ めた 3 , 0 7 2 個 の 抽 出 液 のスポットを打 ブロッティングシステムを使うことも多 ち 込 み 、約 2 3 0 種 のリン酸 化 特 異 抗 体 く、2 0 k D a 以 下や 大きい 分 子 量 でも 7 で免疫染色します。微量の検体から、コ 分 程 度 で 転 写 でき 、スピ ー ディに実 験 「具体的 S235/236 を同定しています。 New Technology 最 も 優 れたプロテオ ー ム 技 術 」と増 田 「 R P PA 法 の 正 確 性 は 抗 体 の 質 に 依 果 予 測 マ ーカーとしてリン酸 化 R P S 6 電源不要の iBind システムを支える Sequential Lateral Flow（ SLF ）技術 間 で 確 実 に結 果 を 出 す 場 合 は 、ブロッ 逆相タンパクアレイ法で 抗がん剤のバイオマーカーを探索 （ ネクサ バ ー ル ）の 肝 が ん に お け る 効 1. 1 次抗体 3. 2 次抗体 2. iBInd Solution 4. iBInd Solution が進められるとのこと。また限られた時 プレキャストゲルや 自動化システムで 時間節約と高い再現性を確保 iBind Western Device（ SLF1000 ） Mini blot（ single ） ストを 削 減しつ つ 、正 確 か つ 迅 速 にプ ロファイリングを行うことができる点で、 26ウェルのミディゲルでのウェスタン解析の結果。 リン酸化特異的抗体で免疫染色。 定速度で流れ、カードの先に取り付けられたろ紙スタックが、カードやメンブレンを通して溶液を引き寄せます。 製品名 iBind Flex Starter Kit サイズ 製品番号 SLF2000S NEW! 価格 ¥263,400 ：1 台／ iBind Flex Cards（ SLF2010 ） ：10 枚 iBind Flex Device（ SLF2000 ） ウェスタン解析を支える強力なトータルワークフロー ウェスタンブロッティングの 3 ステップの手間を極力省き、データ品質を改善する高性能ツールシリーズです。 ルーチンワークのウェスタン解析を効率的に行うことで、他の実験に集中できます。 ：midi10 反応分またはmini 20 反応分 iBind Solution Kit（ SLF2020 ） iBind Flex Western Device Easy! Fast! Clear! NEW! iBind Western Starter Kit SLF2000 ¥239,400 SLF1000S ¥187,500 Separate Transfer Detection ：1 台／ iBind Cards（ SLF1010 ） ：10 枚 iBind Device（ SLF1000 ） NEW! ：10 反応分 iBind Solution Kit（ SLF1020 ） iBind Western Device M ORE 1台 SLF1000 ¥176,400 INFO タンパク質関連製品のお問い合わせ、デモ依頼、製品情報はこちらから → www.lifetechnologies.com/protein-biology ［クリアなタンパク質分離］ ［わずか 7 分で転写完了］ ［抗体反応を自動化］ ■ Bolt プレキャストゲル & 泳動槽 ■ iBlot 2ドライブロッティングシステム ■ iBind Flex Western System Applied Biosystems page 10 世 界とつ な が るリア ル タイ ム P C R ■ ■ Applied Biosystems page 11 NEW! さらに便利なリアルタイム PCR システムへ QuantStudio 3 リアルタイム PCRシステム QuantStudio 5 リアルタイム PCRシステム Applied Biosystems™ QuantStudio™ シリーズに新しいモデルが登場しました。 QuantStudio 3 / 5 リアルタイムPCR システムは、 パーソナルユースのリアルタイムPCRシステムとして、 優れた性能と斬新な操作性に加え、これからのクラウド時代に対応するシステムです。 貴重な実験時間を短縮 信頼のデータを QuantStudio3 はブロックを 3 分割、QuantStudio5 は 6 分割で温度をコントロールするApplied Biosystems™ Veri Flex™ブロックを搭載し、温度条件の異なる複数のプ ロトコールを同時に走らせることができます。また、Fast モードランは、最短 30 分以内で終了します。 シングルプレックス反応で1.5 倍の量差を検出。ダイナミッ すぐに実験スタート 工場出荷時に光学系のキャリブレーションを行うので、装置 ● 独立分割して温度コントロール可能な VeriFlexブロックを搭載 ● クレンジは10 桁を実現しました。 QuantStudio 3 システムは4色蛍光、QuantStudio 5システムは6色蛍光に対応 を箱から出して設置したら、すぐに実験を開始できます。 いつでも、どこからでもアクセス ● パソコンもソフトもいらないクラウドベースの解析ソリューションを提供 Webブラウザ上のソフトを介し、いつでも、どこからでもリ モートコントロールでシステムへアクセスできます。PC の 性能に依存せず、わずかな時間で高精度な解析を実現し ます。データは安全に保存され、世界中の研究者とオンラ ▶ クラウド時代の新しい解析ソリューション "ThermoFisher Cloud" インでデータをシェアできます。 操作のトレーニング時間を削減 新しい利用者でも簡単に実験が開始できるように、最適化 されたプロトコール・テンプレートを提供しています。 これまでの実験機器に付属する解析ソフトウェアは、専用コンピュータのモデルや OS のバージョンに依存していました。今回、私たちが提案 する新しい実験環境は、クラウドを利用し、常に最新のソフトウェアをユーザーのデスクトップにお届します。クラウドには、ウェブブラウザか スタンダードプロトコールの設計を容易に らアクセスするので、どんな OS でも、もちろん Macintosh ® コンピューターでも解析できます。ソフトウェアのアップグレードは不要となり、 ラボスペースを有効に 常に最新のソフトウェアがデスクトップに届きます。 PCがなくても操作できるコンパクトなシステムなので、研 究室のスペースを有効に活用できます。 実験プロトコール・テンプレートの管理とクオリティコント ロールのフィードバック機能、さらにデータの品質を担保 する消耗品のトレーサビリティーを提供します。 Thermo Fisher Cloudが解決します 学会で発表する データを忘れたかも。 どうしよう… 新しい 共同研究先に Macを使いたい ! 感染症が流行 ? データを 送りたいんだけど、 ファイルが重いね… 96 ウェル スタンダードブロック（ 0.2 mL ） 反応容量 10–100 µL ブロック温度制御 VeriFlex 3 zones VeriFlex 6 zones 光源 解析できない ! PC が古くて、 QuantStudio 5 リアルタイムPCRシステム ブロック ソフトのバージョンが 古くて、 QuantStudio 3 リアルタイムPCRシステム 励起／蛍光波長数 データの処理が 白色 LED 励起 4 波長／蛍光 4 波長 励起 6 波長／蛍光 6 波長 大変… 大変 ! PC が壊れた !! Thermo Fisher Cloudへのアクセス Life ID があれば、どなたでもアクセスでき ます。1 アカウントにつき 10GB のストレージ サイズ（ W× D× H ）, 重量 27cm × 50cm × 40cm, 27kg 電源 100-240VAC 製品名 サイズ QuantStudio 3 リアルタイムPCRシステム期間限定パッケージ 1式 構成：QuantStudio 3 リアルタイムPCR システム本体、 ノート型コンピュータ、 ソフトウェア、TaqMan Fast Advanced Master Mix（ 1,000 反応）、 MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate（ 100 枚）、MicroAmp Optical Film（ 100 枚）、 インスタレーション試薬、設置・基本取扱説明、2 年保証付 を無償で提供しています。現在、定量 PCRと QuantStudio 5 リアルタイムPCRシステム期間限定パッケージ キャピラリシーケンサの解析モジュール（無 構成：QuantStudio 3 リアルタイムPCR システム本体、 ノート型コンピュータ、 ソフトウェア、TaqMan Fast Advanced Master Mix（ 1,000 反応）、 MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate（ 100 枚）、MicroAmp Optical Film（ 100 枚）、 インスタレーション試薬、設置・基本取扱説明、2 年保証付 償および有償）も提供中です。 製品番号 QS3-96S-LP 価格 ¥4,700,000 （ 2 年保証） 1式 QS5-96S-LP （ 2 年保証） ¥6,870,000 Applied Biosystems page 12 デジタル PCR 専用 TaqMan アッセイ登場 ! Invitrogen page 13 画期的な in vivo用トランスフェクション試薬 NEW! ■ Custom TaqMan SNP Genotyping Assays ■ Invivofectamine 3.0 Reagent NEW! きわめて稀な変異を検出するためには、高感度に検出でき、偽陽性・偽陰性率の低いアッセイが必要です。Applied Biosystems™ Invitrogen™ Invivofectamine™ 3.0 Reagent は、 siRNAまたはmiRNAを全身投与で肝臓へ導入するためのトランスフェクション試薬です。 Custom TaqMan™ SNP Genotyping Assays は、Applied Biosystems™ QuantStudio™ 3D デジタルPCRシステムでバ リデーション済みの TaqManアッセイ。実績のあるTaqManアッセイのデザインパイプラインでデザインしたデジタルPCR 専用のプ 従来試薬よりも大幅に性能が向上しました。 ローブなので、確かな品質を提供します。ラインナップも増え、さらに多様なワークフローをサポートします。 ● シンプル操作：数ステップの作業で、導入用 siRNA 複合体を調製 ● がん関連の研究でよく利用されるKRAS 、BRAF 、EGFR などの体細胞変異をターゲット ● 優れた感度 ― ● 高いノックダウン効果：最大 85% のノックダウンを観察 0.1% 程度のレアな変異の検出や定量が可能 ● TaqMan アッセイによるレアバリアントの定量のための解析アルゴリズムをサポート ● siRNA 使用量を削減：従来試薬より、siRNAを最大 90%まで削減可能 ● 持続性：1 回の投与で、長期間のノックダウン効果を観察 ● 低毒性：極めて低い in vivo 毒性 ▶ レアな遺伝子変異を検出 ! ▶ 使いやすいシンプルな操作 Custom TaqMan SNP Genotyping AssaysとQuantStudio 3D デジタル PCRシステムでKRAS G12V の変異を解析しました。 その結果、わずか0.1% の変異も高い信頼度で検出しました。 準備は、試薬とRNAi を混合して 30 分イン P P I BとF a c t o r Ⅶ に 対 するs i R N A を Invivofectamine 3.0 を使ってマウスに導 入用の siRNA 複合体をすぐに投与できます。 入した結 果 、ターゲットの mRNA に対して 最 大 8 5 % の 阻 害を示しました 。s i R N A と 試 薬 の 複 合 体 はマウスの 体 重 1 k g あたり 1mg で投与しています。 キュベーションするだけ。簡単な操作で、導 野生型ゲノムに0 ∼ 10% の変異 DNA を混合して測定した結果 0.1% D 0%（コントロール） FAM C FAM FAM 1% B FAM 10% A ▶ 高いノックダウン効果 VIC VIC VIC 結果：10.384% 、 結果：1.393% 、 結果：0.142% 、 信頼区間 8.235% -13.076% 信頼区間 0.772%-2.507% 信頼区間 0.064%-0.310% VIC ▶ siRNA 量を最大 90% 削減 Factor Ⅶに対する阻害効果を用量依存的に 検証しました。その結果、Invivofectamine 3.0 の ED 50は、0.1mg/kgとなり、従来試薬の 10 分 の 1 となりました。右 のグラフは、Factor Ⅶに対するsiRNA 複合体を 0.02 ∼ 2mg/kg デジタル PCR によるレアバリアント解析のソリューション の 範 囲 でマウスに投 与 後 、血 清を分 離して 、 Custom TaqMan SNP Genotyping Assays デジタルPCRシステムのための QuantStudio 3D デジタル PCR システム 20,000 個の微細ウェルを持ったチップで バリデーション済みの専用アッセイ 貴重なサンプルも無駄なく解析 Factor Ⅶタンパク質を定量しました。 QuantStudio 3D AnalysisSuite ソフトウェア 専用のクラウドソフトウェアで解析 Custom TaqMan SNP Genotyping Assays 製品名 サイズ 製品番号 Custom TaqMan SNP Genotyping Assays for Rare Mutation Analysis（ 20x, Small scale ） 12 反応 4383547 ¥11,500 価格 （ 40x, Medium scale ） Custom TaqMan SNP Genotyping Assays for Rare Mutation Analysis 450 反応 4332077 ¥65,900 製品名 サイズ 製品番号 QuantStudio 3D デジタル PCR システム ProFlex PCR システム付 1式 QS3D-PF（ 2 年保証） QuantStudio 3D デジタル PCR システム、消耗品、デジタル PCR 用マスターミックス 価格 ¥6,400,000 構成：QuantStudio デジタルPCR システム、デュアルフラットブロックProFlex PCR システム、QuantStudio 3D ChipLoader 、インスタレーションキット、設置・基本取扱説明付 QuantStudio 3D デジタル PCR Chips 12 チップ 4485507 ¥11,880 QuantStudio 3D デジタル PCR Master Mix, 1.5 mL 1.5 mL 4482710 ¥17,000 QuantStudio 3D デジタル PCR Master Mix, 5.0 mL 5.0 mL 4485718 ¥48,000 M ORE INFO Custom TaqMan SNP Genotyping Assays のご注文はこちらから → www.lifetechnologies.com/taqman-order ▶ 一回の投与でノックダウン効果が長期間持続 投 与 後 1 日で効 果を確 認でき、最 長 3 週 間まで効 果が持 続しました。持 続 効 果は、用 量 依 存的に観察されました。右のグラフは、1 、0.5 、0.25 、10mg/kg の用量で、Factor Ⅶに対 するsiRNA をマウスに投与した結果です。投与後 2 、5 、9 、16 、23 、30 日目に血清を採取し、 発色アッセイによりFactor Ⅶ タンパク質の量でノックダウン効率を解析しました。 製品名 サイズ 製品番号 Invivofectamine 3.0 Reagent 10 反応 IVF3001 ¥158,400 価格 50 反応 IVF3005 ¥588,000 page 14 Ion Torrent page 15 Technical Review Ion PGM & Ion Protonシステムの Ion Torrent Hi-Q sequencing Chemistryによる GC-rich 領域のシーケンシング向上 シーケンス精度向上へ NEW! ■ Ion PGM Hi-Q Chemistry ■ Ion Proton Hi-Q Chemistry ［要旨］ Ion Proton Hi-Q Sequencing Solutionを使い、ヒトエキソームライブラリのシーケンシングを行いました。その結果、現行法に比 べ GC-rich 領域におけるシーケンシングのカバレッジが大きく向上することを確認しました。 Ion PGM™とIon Proton™システムのシーケンシング精度を向上させるため、 新しくIon PGM™ Hi-Q™ ChemistryとIon Proton™ Hi-Q™ Chemistry Ion PI Template OT2 200 Kit v3 Ion PI Hi-Q Sequencing 200 kit 変異検出力が向上 ! ■ Ion Proton Hi-Q Sequencing Solution mapped reads on target mean depth uniformity 現行法 36,376,988 94.89% 104.7 89.54% Hi-Q 36,447,949 94.91% 106.4 91.64% 多くのユーザーの方が、エキソームシーケシングにおける バリアントコール性能が向上し、原因の変異を見つけやすくなったと認めています。 表 1 現行法とHi-Q Chemistry のシーケンスサマリー 図 1 Hi-Q Chemistryを用いたシーケンス結果 ● シーケンス精度の向上で、 より高精度なシーケンスが可能 GC-rich アンプリコンに対するカバレッジが大きく向上 次に、 この結果を基にGCコンテンツとリード数の関係を図 2に示します。現行法では、GCコンテンツが70% 以上になるとリード数が ● 他の方法で確認するためのコストを抑制 急激に減少しますが、Hi-Q Chemistryでは維持できています。現行法よりも、Hi-Q ChemistryはGC-rich 領域でのシーケンスリー サイズ 製品番号 価格 Ion PGM Hi-Q OT2 Kit 8 反応 A27739 ¥160,500 Ion PGM Hi-Q Sequencing Kit 8 ラン A25592 ¥128,400 Ion PGM Hi-Q Chef Kit 8 反応 A25948 ¥300,500 Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit 8 反応 A26434 ¥149,800 Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit 8 ラン（ 2ラン／イニシャライズ） A26433 ¥117,700 Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit 8 ラン（ 1ラン／イニシャライズ） A24672 ¥181,900 Ion PI Hi-Q Sequencing Chef Kit 8 反応 A27198 ¥342,400 ド数が格段に増加することがわかりました。図 3 は、両キットでの GC-rich 領域におけるシーケンス結果の具体例です。現行法では、 シーケンス困難な領域もHi-Q Chemistryでは解読できることが示されました。 ［現行法］ ［現行法］ ［ Hi-Q Chemistry ］ リード数 製品名 研究の旬をお届けします！ メールニュース［ eNEXT ］ → GC-rich アンプリコンに対するカバレッジが向上 200 bp 及び 400 bp シーケンスに対応 Ion Proton → ● 従来法よりもシーケンス精度が向上し、 リシーケンスにおける多様な変異検出が可能 Ion PGM Ion PI Chip kit v3 Hi-Q Chemistryで得たシーケンス結果を図 1に示します。Hi-Q Chemistryを使うことで、16.1Gb, 88M read のシーケンスが迅 速に得られました。また現行法との比較を表 1に示します。mapped reads 数は、両キットでほぼ同じですが、Hi-Q Chemistryでは Uniformityが向上しており、ターゲット領域に対してより均一なカバレッジが得られていることがわかります。 高品質のデータと高い精度が得られます。 ● Ion PI Chip kit v2 ［結果］ Ion OneTouch2™ システムおよび Ion Chef™ システムにそれぞれに対応するキットを提供します。 ● Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit Ion PI Sequencing 200 kit v3 一つのキットですべてのアプリケーションに対応 ! ● ［ Hi-Q Chemistry ］ → RDY キット）を用い、Ion Proton システムで現行法及び Hi-Q Chemistry 双方でシーケンスを実施しました。使用したキット はそれぞれき右表のセットです。 ■ Ion PGM Hi-Q Sequencing Solution 同一 AmpliSeq Exome ライブラリ → とテンプレート調製キットとともに、質の高いデータを迅速に提供します。 ［現行法］ 同一のヒトエキソームライブラリ （ Ion AmpliSeq™ Exome → Ion Torrent™ Hi-Q™ Sequencing Chemistry は、パワフルなソフトウェア ［実験条件］ → を開発しました。 図 2 GCコンテンツとリード数の関係 ［ Hi-Q Chemistry ］ GC 含量 横軸：GCコンテンツ （ % ）、縦軸：リード数（対数） Hi-Q Chemistryでは赤枠内の GC-rich 領域でのリード数が現行法より増加しています。 図 3 GC-rich 領域でのシーケンス結果 GCコンテンツが81% の領域のシーケンスデータ。 現行法と比較して、Hi-Q Chemistryでは有効リード数が大幅に増加しています。 弊社メールニュースにご登録いただくと、お得なキャンペーン情報やセミナー、 新製品情報など、研究関連の最新情報を定期的にお届けします。ぜひご登録ください。 ご登 録フォーム 2015 年 7 月∼ 8 月には新規登録キャンペーン、 8 月には楽しいキーワードキャンペーンを実施します ! 詳しくはこちらから ［まとめ］ 次世代シーケンシングは、ハイスループットで解析できる利点がありますが、シーケンス精度の高さとともにカバレッジの均一性が問 題となります。リードでカバーされない領域は変異の評価ができないためです。Ion Torrent Hi-Q sequencing Chemistryはその 問題を解決するソリューションとして有効に機能すると期待されます。 Invitrogen page 16 Invitrogen page 17 Technical Review 生細胞イメージングの蛍光褪色を抑えます ! Attune NxT フローサイトメーターとpHrodo BioParticles を活用した、 ■ ProLong Live Antifade 試薬 溶血不要・洗浄不要で行うヒト全血中の食細胞の機能評価 NEW! Invitrogen™ ProLong™ Live Antifade試薬は生細胞中の蛍光の褪色を ［要旨］ 防止する製品です。様々な蛍光物質の褪色を防止し、生細胞イメージングを成功に導きます。 スピーディーな Invitrogen™ Attune™ NxT Acoustic Focusing Cytometer とpH 感受性試薬である Invitrogen™ pHrodo™ BioParticles™を活用し、全血中の食細胞機能的を評価しました。溶血・洗浄不要プロトコル用いてアッセイすること ● 生細胞イメージングの褪色を防止 で作業時間を短縮し、赤血球細胞の溶解や洗浄ステップでの細胞ロス、さらにフェノタイプが変化するリスクを低減できます。最 ● 様々な蛍光物質に対する褪色防止効果 善の細胞状態で実験を行うことで、信頼性の高い結果が得られます。 ● 細胞生存率と細胞増殖への影響を確認（ HeLa 細胞におけるデータ） ［実験］ Image=0 Image=0 HeLa 細胞とU2OS 細胞を完全培地中で種々の蛍光物質により染色。 2 時間暗室にてインキュベート後、それぞれに適した Em/Ex で 15 秒 間細胞イメージアナライザー によりイメージを取得しました。光強 ※1 度は専用ソフトウェアで標準化し測定しました。 蛍光色素 Image=60 Image=60 Hoechst 33342 Image=120 Image=180 Image=240 Image=120 Image=180 Image=240 中で酸性のファゴソームに取り込まれると、蛍光シグナルを発 する試薬です。これにより、ファゴサイトーシスの有無を判断 できます。図 1 で示す通り、4 ℃ではファゴサイトーシスが阻害 されるのでサンプルではシグナルが観察されません（図 1 中 No BioParticles conjugate added A B 4° C C 37 ° C Vybrant DyeCycle Ruby Stain（ RL-1 ） 央）が、37 ℃では高い食細胞機能を有する好中球で、強いシグ 100イメージ取得後の 蛍光強度の変化率（ % ） シグナルが半減するまでに コントロール 培地にProLong コントロール 培地にProLong ( 培地）のみ Liveを添加 ( 培地）のみ Liveを添加 60% 100% 80 ※2 230 ※2 な白血球の散乱光プロットにおける食細胞サブポピュレーショ 取得したイメージ数 ナルを確認しました（図 1 右）。 次にpHrodo BioParticles の濃度を変化させて、3 つの主要 emGFP 60% 80% 120 190 ンの変化を観察しました（図 2 ）。pHrodo BioParticles 濃度が MitoTracker Green 35% 80% 80 180 Tag RFP 23% 70% 70 140 MitoTracker Red 35% 55% 70 120 5µg/mL 以下では、好中球および単球の食細胞機能のみ観察 されます。 しかしpHrodo BioParticles 濃度が上がるにつれ、 MitoTracker Deep Red 25% 60% 60 120 好中球および単球の ポジティブシグナルの比率が高まり、標 準的なリンパ球ゲート内の細胞集団でも ポジティブなシグナ ※ 1 Thermo Scientific™ ArrayScan™ HCA Readerを使用 ルが観察されました。これらは樹状細胞である可能性がありま ※ 2 Hoecht 33342に関しては、シグナルが 75%になるまでに取得したイメージ数を表示 す（図 2 右端）。実験はすべて5%CO 2条件下で行いました。 ▶ 元気なままで細胞観察 図 2 ヒト全血アッセイにおけるpHrodo 9 6 ウェル プレ ートに 、1 0 0 0 細 胞 / ウェル で H e L a 細 胞 を 撒 き 、 10%FBSのMEM 培地で培養。ProLong Live Antifade試薬添加後、 6 時間ごとに48 時間まで 8 段階で測定。細胞生存率は Invitrogen™ Live/Dead™ Cell Imaging Kit 、細胞増殖はInvitrogen™ ClickiT™ Plus EdUを使い、細胞イメージアナライザーで検出しました。 その結果、細胞生存率や細胞増殖への影響は観察されませんでした。 BioParticles の用量依存性の食細胞解析 全 血に 0 ∼ 1 5 µ g / m L の p H ro d o G re e n E . c o l i B i o P a r t i c l e s を加え、図 1 と同じ条 件で実 験しまし た。 （ A ）pHrodo BioParticles 濃度の増加ととも に、この色素にポジティブな細胞が増加しました。 （B） 15µg/mL の pHrode BioParticles では、食細胞機能 が活性化した顆粒球、単球、およびリンパ球のゲート内 におけるサブポピュレ―ションが観察されました。 エラーバー ＝ 標準偏差 A No BioParticles conjugate added D E F Forward scatter（×10 3 ） 図 1 ヒト全血中の食細胞活性の測定 全血に5µg/mL の pHrodo Green S. aureus BioParticlesを添加し、4 ℃か 37 ℃で 30 分間インキュベーション。希釈後、Vybrant DyeCycle Ruby Stain で 37 ℃で 15 分処理 しました。その結果、4 ℃ （ B 、E ）では pHrodo BioParticles のシグナルは見られず、37 ℃ （ C 、F ）では強いシグナルが観察されました。バックグラウンド蛍光も顕著に低減でき、 洗浄も溶血も不要の全血アッセイの特異性と有効性が示されました。 1 µg/mL 5 µg/mL 15 µg/mL Vybrant DyeCycle Ruby Stain（ RL-1 ） B Side scatter（×10 6 ） Hoechst およびGFPに対する褪色防止効果の検討 HeLa細胞に、24時間Invitrogen™ CellLight™ Mitochondria-GFP を形質導入し、Hoechst 33342で15分間標識しました。片方のサンプ ルにはProLong Liveを加え、2時間インキュベートしました。ProLong Liveで処理したサンプル（左の列）はコントロールサンプル（右の列）に 比べ、すべてのタイムコースでより強いシグナルを持続できました。 pHrodo Green S. aureus BioParticles Conjugate（ BL-1 ） コントロール Invitrogen™ Vybrant™ DyeCycle™ Ruby Stainで有核 細胞の核のみを標識しました。pHrodo BioParticlesは、細胞 Side scatter（×10 6 ） ProLong Live 全血に pHrodo BioParticles を加えインキュベーション後、 ▶ 様々な蛍光物質に効果を発揮 pHrodo Green E. coli BioParticles Conjugate（ BL-1 ） ▶ タイムラプス観察でより強いシグナル Forward scatter（×10 3 ） Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer ［まとめ］ 細胞分裂の検出 細胞生存率の測定 4本レーザーを搭載したAttune NxT Acoustic Focusing Cytometerを使用すると、このアッセイをさらに多項目化して、活性化状 LIVE / DEAD Red Click-It Plus EdU ［製品番号 R37601 componentB ］を使用 ［製品番号 C10639 ］を使用 態における各細胞の食作用活性を測定できます。さらに殺菌機能である酸化的バースト （活性酸素発生）を検出する機能性プロー 製品名 サイズ 製品番号 価格 ProLong Live Antifade 試薬 5 × 1 mL P36974 ¥28,300 1 mL P36975 ¥8,000 ブの組み合わせも可能です。このシステムにMolecular Probes 試薬を組み合わせることで、最小限のサンプル調製でさまざまな 生物学的サンプルの解析が行えます。 M ORE INFO 詳しい情報はこちらから → www.lifetechnologies.com/attune Invitrogen page 18 蛍光の 基 礎を学 ぼう! Thermo Fisher Scientific page 19 い つ 行く ? どうす る ? 海 外 留 学 Molecular Probes 蛍光教室 Title 意外に知らない蛍光イメージングの 基礎知識を項目ごとにわかりやすく解析しています。 ホームページで好評開講中です。 蛍光の基礎からサンプル調製、標識方法、ハウツー & ヘルプまで、蛍光イメージングに必要な知識や実験 Name 最先端の技術でモノづくりを極めるたい やりたいことがや れるなら 日本にこだわる必要はないはず Number 13 井 手 口 拓 郎 氏（ 東京大学大学院理学系研究科附属スペクトル化学研究センター助教） プロトコールを豊富に掲載しています（図 1 ）。さらにバックグラウンド蛍光や光退色などに関するトラブル シューティングについても対処法を解説しています。例えば「サンプルの蛍光標識」のページでは、細胞に 蛍光標識を加える方法として、一つの蛍光色素を様々な形で使う場合を紹介したり （図 2 ）、1 次抗体や 2 次 ドイツへ留学した 2 年間勤めた光学機器メーカーを退職し、 抗体の選択について説明しています（図 3 ）。 井手口氏。 ドイツでは「光周波数コム」という特殊なレーザー を用いた分光イメージングに取り組み、2013 年、その成果を Nature 誌に報告します。分光学分野だけでなく、細胞内の www.lifetechnologies.com/imagingbasics 様々な分子の局在をラベルフリーで観測する技術として、今 後の発展が期待されています。 「思いっきり研究に打ち込み、 仲間と議論し、生活も楽しんだ」と振り返る井手口氏。 ドイツ での留学生活についてお話を伺いました。 顕微鏡へ向かう前に、さらには観察したい細胞の培養を始める前から、実験の目的を理解し、選択した細胞、 「幼いころからモノづくりが好きだったので、修士卒業後、 メー 図 2 同じ蛍光色素に対する異なる使用法 カーに就職しました。社会人として役立つ様々なことを学びま 観察を行う際の細胞の状態、および培養容器が画像の品質に与える影響を理解しておくことが重要です。 したが、自分がやりたいことはここではできないと感じました」 ● 細胞の形態 ● 蛍光標識のための固定細胞の準備 と井手口氏。メーカーでは安定して機能する製品づくりが第 一となり、夢見ていた「最先端技術を応用したモノづくり」との 取得したい画像に最適な細胞を選択するための 固定細胞を観察することのメリット、デメリットを ガイドラインをご覧ください。 理解し、固定処理の基本をご覧ください。 ● ライブセル観察のための準備 ● 容器の選択 観察実験に生細胞を使用するために必要な 様々な実験および装置のパラメーターによって、 考察事項をご覧ください。 使用するべき容器が変わることをご確認ください。 図 1 例えば蛍光観察に用いる細胞について、実験に即して説明しています。 ギャップに気づきます。そこで次のステップを模索することに。 選んだのは、 ドイツ・マックスプランク研究所への留学です。学 生の頃から憧れていたノーベル物理学賞受賞者の Theodor Hänsch 教授にメールでコンタクトをとり、修士論文の研究と 図 3 1 次抗体の選択について 自分がやりたいことを伝え、受け入れてもらいました。 次世代イメージング技術を目指して 「光周波数コム」という特殊なレーザー光技 Hänsch 教授は、 術の第一人者。井手口氏は、光周波数コムを励起光として使う 分光イメージングに取り組みます。蛍光イメージングとは異な C A あなたが救える蛍光の未来がある! P IG N 必殺裏技をお寄せいただいた方から抽選でMolecularProbes 蛍光教室オリジナルTシャツや、 もっとも光る投稿をお寄せいただいた方にはMolecularProbes 試薬 20 万円分をプレゼントします! A 普段、蛍光観察の時に便利な「小ネタ、裏技、技法」を教えてください。蛍光教室番外編として、後日ウェブサイトで公開予定です。 ［応募方法］ り、迅速なラベルフリーの観察を可能にする技術です。そして M 蛍光観察の小ネタ、裏ワザ大募集キャンペーン 光周波数コムをサンプルに当て、出てきたラマン散乱光を広 いスペクトルで計測することで、複数の種類の分子局在を非 侵襲的にマイクロ秒スケールで観察できることを示しました。 従来法より1000 倍程度速く測定でき、細胞内の分子の動きを トレースする等、幅広い応用の可能性を秘めています。 そ 。留 学 中に、経 済 面での 不 安はなかったのでしょうか。 「ド イツでは博 士 号を取 得するために大 学にも在 籍しましたが、 学費は年間 100 ユーロ程度。マックスプランク研究所からは 給 料を受け取っていたので、経 済 的 な 心 配はありませ んで した」と井手口氏。また、 「特に英語が得意というほどではな かったけれど、言語に対するストレスもほとんどなかった」と 日本との違いは ? 「 留 学して驚 いたことは、 ドイツ人が良くしゃべること。彼ら は寡黙というイメージがありましたが、本当に良くディスカッ ションしました」。また著 名な教 授が、セミナー の 時に、初 歩 的な質問を堂々とする姿にも驚いたとか。そんな環境の中で、 のびのびと研究できたと振り返る井手口氏。さらに日本人と の違いとして、短時間集中型の時間管理をあげます。 「自分 の時間を大切にするドイツ人は、10 時頃から集中して研究し、 遅くとも 19 時には帰 宅します。日本では難しい 習 慣ですが、 できればこのスタイルを維持したいとですね」と笑います。 舞台は世界中どこにでも 現在、井手口氏は東京大学理学部化学科にて分光イメージ ングのさらなる応用を目指して研究を進めています。 「自分 の研究を、生物学や化学分野でも役立つモノづくりに活かし たいと考えていた時、先端レーザー技術を用いた高速分光・ イメージング技術とバイオメディカル技術の融合を目指す研 究を行うというポストの公募を知り、応募しました」。日本に戻 るという意識よりは、やりたい研究の場がたまたま日本だっ たそうです。 「ドイツへ行くときも、特に『 留学 』という意識は ありませ んでした。研 究 室は世 界 中 のどこでも良く、特にこ だわりはありません」。井手口氏は、やりたい研究の軸をぶら 下記 URL のページで入力フォームに必要事項をご記入のうえ、送信してください。 または弊社 Twitterアカウント （ @LifeTechJPN ）をフォローして、 すことなく、これからも研究にまい進するようです。新たなイ ハッシュタグ"# 蛍光裏ワザ "をつけて、あなたの攻略方法をツイートしてください。 メージング技術の開発が楽しみです。 www.thermofisher.com/jp-fluore-tips ［応募受付期間］ 2015 年 7 月13日（月）∼ 2015 年 9 月4日（金） ［プレゼント］ 研 究 成 果を出 せるのも、研 究に打 ち 込める環 境があってこ 話します。 ドイツの研究室へ 細胞の形態、生細胞と固定細胞の違い、および容器の選択 生活面の不安は ? Molecular Probes 蛍光教室オリジナルTシャツ（ 30 名様） 定価 20 万円分までの Molecular Probes 試薬（ 1 名様） 皆 様 のご応募をお待 ちしています ! www.thermofisher.com/jp-fluore-tips プロフィール： 2008 年東京大学大学院工学系研究科物理工学専攻修士課程修了。企業 で 2 年間勤務後、渡独。2010 年から 2014 年までマックスプランク量子光学研究所にて 博士号の口述試験直後。伝統的な手作り 研究室の同僚。国籍は7カ国（ドイツ、 フラン の Doctoral hat 。ビールの樽の上には、分 ス、スペイン、ベルギー、インド、中国、日本）。 子模型を持ったゴジラが乗っている。 真ん中の白いシャツの方がHänsch 先生。 博士課程の学生として研究。ルートヴィヒ・マクシミリアン大学ミュンヘン博士課程修了 （物理学）。2014 年より現職。 井手口氏個人ホームページ http://takuroideguchi.jimdo.com/ INFORMATION 2015 / July / No.31 www.thermofisher.com/allforyou Applied Biosystems™ 、Invitrogen™ 、Gibco™ 、Ion Torrent™ブランドは、 ライフテクノロジーズからサーモフィッシャーサイエンティフィックのブランドに生まれ変わりました。 これにより、サーモフィッシャーサイエンティフィックは、これまで以上の豊富な製品ラインナップをご提供できるようになりました。 絶え間ないイノベーション、充実したサポート、全世界 50,000 人の従業員が、お客様のご成功を強力に支援します。 All from one company. All for you. 10 名様に 話題の書籍か NEXT 7 月号はいかがでしたか ? Quoカード プレゼント! 巻頭特集は、東京大学の上田泰己氏。常にライフサイエンス研究のエッジで、 目が覚めるような発見を報告しています。今号では、ライフサイエンス研究 でも注目の 質 量 分 析 機をご紹 介しています。人 気 の 留 学 記は自然 体でドイ ツに留学した井手口氏。ご研究にぜひお役立てください。 読者アンケートはこちらから 『 理 不 尽 な 進 化 ―― 遺 伝 子と運 の あ い だ 』 抽選でプレゼントが当たります。 photographs: mitsuhiro koyama（p.02-03,05） art direction & design: masami furuta , yuka uchida（opportune design） edition: yuko hashimoto 公式 Facebook ページ&Twitterもチェック ! facebook.com/LifeTechnologiesJapan @LifetechJPN ●記載価格は2015年7月現在の価格です。 ●消費税は含まれていません。 ●価格は予告なしに変更する場合がありますので あらかじめご了承ください。●最新の価格および在庫数は、弊社ホームページ右上の"製品価格と在庫の検索"でご確認いた だけます。●研究用にのみ使用できます。●診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。●記載の社名および製品 名は、弊社または各社の商標または登録商標です。●販売条件はこちらをご覧ください。www.lifetechnologies.com/TC For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. © 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified.TaqMan is registered trademark of Roche Molecular System, Inc. Printed in Japan. LFT084-A1506HS サーモフィッシャーサイエンティフィック ライフテクノロジーズジャパン株式会社 本社：〒108-0023 東京都港区芝浦 4-2-8 TEL.03（ 6832 ）9300 FAX.03（ 6832 ）9580 大阪：〒564-0052 大阪府吹田市広芝町 10-28 TEL.06（ 6389 ）1201 FAX.06（ 6389 ）1206 ウェブサイト： www.lifetechnologies.com 吉川浩満（朝日出版社） 販売店
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