DNA鑑定のしくみ ⿅児島⼤学理学部⽣命化学科 九町 健⼀（くちょう けんいち） 1 今⽇の話で理解してほしいこと 9 DNA鑑定は、従来法と⽐べて、どこが優れてい るのか 9 DNA鑑定の原理 9 DNA鑑定に⽤いられている技術や知識の多く は、DNA鑑定のために特別に⽤意されたわけで はない（もともとあったものを応⽤した） ※僕⾃⾝はDNA鑑定を研究しているわけではない。使われている技術や知識が⾮ 常に⼀般的なものなので、説明はできる 2 DNA鑑定の歴史 9 1985年：イギリスのアレックス・ジェフリ ーズ博⼠がDNA鑑定法を開発 9 1986年：初めて殺⼈事件の捜査に ⽤いられた 9 現在：400万件以上のDNAデータベ ース登録(⽶・英)。⽇本は数万件。 DNAとは DNA O デオキシリボヌクレオチド（４種類） アデニン・・・A シトシン・・・C グアニン・・・G チミン・・・T -O－P＝O 5’ O H2C G O 1’ 4’ 2’ O -O－P＝O O H2C A O 1’ 4’ 2’ 3’ O -O－P＝O O O 5’ H2C A 1’ 4’ 2’ 3’ 9 デオキシリボヌクレオチドが重合して鎖状になった分⼦を DNAと呼ぶ 9 デオキシリボヌクレオチドは４種類あり、それぞれ異なる 塩基を含む（A・C・G・T） 9 同じ⽣物種では、 A・C・G・Tの並びの順番と数（塩 基配列）はほぼ同じ。異なる⽣物種では異なる 9 DNAの２つの末端は区別できる（5'末端、3'末端） O -O－P＝O O O 5’ H2C T 1’ 4’ 2’ 3’ O -O－P＝O O O 5’ H2C T 1’ 4’ 3’ 2’ O -O－P＝O O O 5’ H2C C 1’ 4’ 3’ O 2’ 4 O 2’ C G O O 4’ 1’ CH2 5’ O A T -O－P＝O O 1’ 3’ 2’ 2’ 4’ 1’ CH2 5’ O -O－P＝O O 1’ 4’ 1’ CH2 O A O -O－P＝O 1’ 4’ 2’ 2’ 4’ 1’ O -O－P＝O O O 5’ H2C O C 1’ 4’ G CH2 5’ -O－P＝O O T O O -O－P＝O O O 5’ H2C 3’ O 3’ 2’ 2’ 3’ O A T O O -O－P＝O O O 5’ H2C O + O - + G 3’ 2’ 2’ O -O－P＝O O O 5’ H2C - CH2 5’ -O－P＝O 1’ 4’ 3’ - T A 4’ + 4’ 1’ O -O－P＝O O O H2C 3’ 3’ 2’ 2’ 3’ C -O－P＝O 1’ 4’ 4’ 例）CとGとの結合 CH2 5’ O 9 細胞内では、DNAは２本の鎖が結合した状 態で存在する 4’ 1’ O -O－P＝O O H 5’ 2C O O 9 GとC、AとTは結合できる。それ以外の組合せ の結合は起こらない 3’ O DNAとは ２本鎖のDNA 2’ 5 3000塩基のDNAの配列(⽚鎖のみを表⽰) 9 ヒトは30億塩基のDNAを持つ ＝ この100万倍 ctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcg agatcccggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaa cgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaag tggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtc tggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcg tcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtgg aagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgg gcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcata aatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagg gcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggacatct cggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtgg accgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgc aaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgta agttagctcactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtc gccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcg acgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcag gccattatcgccggcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcag aatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcg taaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgta ttaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggca tgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtg accaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacag gcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcag ctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagcc atgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaat accgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccg taaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacagg actataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttc gggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttca gcccgaccgctgcgccttatccggtaacta 重要な前提 9 １⼈の⼈物が持つ、全ての細胞のDNAの塩基 配列は同⼀ 9 異なる⼈物が持つDNAの塩基配列は、わずか に異なる（1000塩基に1つ程度） 9 よって、DNAの塩基配列が同じならば、同じ⼈ 物だ（1卵性双⽣児は除く） 9 塩基配列が異なれば、異なる⼈物だ 7 DNA鑑定でできること ２つのDNAが同⼀かどうかを 判断できる • • • • 犯罪捜査 災害時の遺体同定 品種同定 etc... 8 犯罪捜査への応⽤例 同じ？ 現場に落ちていた 髪の⽑のDNA 同じ？ 容疑者A のDNA 容疑者B のDNA DNA鑑定で判断できる 9 犯罪捜査への応⽤例 犯⼈の DNA 容疑者A のDNA 現場に落ちていた 髪の⽑のDNA DNA 鑑定 よって、 犯⼈の DNA 容疑者A のDNA 10 犯罪捜査への応⽤例 犯⼈の DNA 容疑者A のDNA 現場に落ちていた 髪の⽑のDNA 9現場に落ちていた髪の⽑は、 必ずしも犯⼈が落としたもの とは限らない 9この点はDNA鑑定では判 断できない DNA 鑑定 11 犯罪捜査におけるDNA鑑定のメリット 鑑定可能な 対象の種類 検出感度 個⼈識別 の精度 ⾎液型 少ない（⾎液のみ） 低い 低い 指紋 少ない（指紋のみ） 低い ⾼い DNA鑑定 多い（⾎液、髪の⽑、 唾液、精液、etc.） ⾮常に⾼い ⾼い 12 DNA鑑定で使⽤可能な⽣体試料 • ⾎液および⾎痕 • 精液および精液痕 •⾻ •⻭ • ⽑根付きの⽑ • 唾液 • 排泄物 • ⽖の破⽚ • 筋⾁組織 • タバコの吸殻 • 郵便切⼿ • 封印した封筒の折ぶた • フケ • 指紋 • 剃⼑の刃 • チューインガム • 腕時計 • ⽿垢 • ⻭ブラシ 9 要するに、細胞を含むものなら使⽤可能 9 すべての細胞はDNAを含むので 13 DNA鑑定でできること ＝ ２つのDNAが同⼀かどうかを 判断できる ２つのDNAが異なるかどうか を判断できる 14 DNAが異なる＝ DNAの塩基の並び順が異なる＝ DNAの塩基配列が異なる 9 置換 Aさん: acgtggta Bくん: acggggta 9 挿⼊ Aさん: acgt ggta Bくん: acgtaggta 9 ⽋失 Aさん: acgtggta Bくん: acgt gta ※置換・挿⼊・⽋失は1塩基とは限らない 15 理論的には… 9 ２つのヒトDNAが同⼀かを知るには… – それぞれのDNAの全塩基配列を決定し、 – 塩基配列を⽐較して違いを調べる – ２つのDNA間で違いが全くなければ同⼀ – 違いが⼀つでもあれば同⼀でない 現実的にはこれは実現不可能 9 ヒトの全DNAの塩基配列を決めるには… 問題点1：莫⼤な時間とお⾦と労⼒がかかる → 数多く起 こる犯罪をこなし切れない 問題点2：⼤量のDNAが必要 → 犯罪現場からは微量の DNAしか採取できない 16 解決法 9 問題点1の解決法 – 全DNAを相⼿にするのをやめる→特定の限られた部 位の違いのみに着⽬ – 塩基配列を決定せずに違いを調べる→⽋失・挿⼊ の違いに着⽬（違いをDNAの⻑さで判断） 9 問題点2の解決法 – 微量のDNAを増幅する→PCR法の利⽤ ショートタンデムリピートタイピング （STRタイピング） 17 ショートタンデムリピート（STR）とは？ ショート 短い 例えば、 ・・・ agat ・・・ gat ・・・ tatc タンデム 直列の agat gat agat リピート 繰返し配列 agat ・・・ gat ・・・ tatc tatc tatc tatc ・・・ のようなもの 18 STRの特徴 9 ヒトDNA中に100万箇所以上存在する（う ち⼀般的に鑑定に使われるのは13種） 9 個⼈により繰返し回数が異なる 9 STRに隣接する配列はすべてのヒトで同⼀ 19 STRのイメージ図 Aさん 1本⽬の染⾊体 2本⽬の染⾊体 Bくん 1本⽬の染⾊体 2本⽬の染⾊体 ※ヒトは同じ染⾊体を2本持つ（⽗および⺟から受け取ったもの） 20 実際のDNA鑑定に⽤いられるSTRの例 STR名 繰返しの単位配列 繰返し回数 の範囲* 繰返しパターン の総数 繰返しを含む部分 の⻑さ D13S317 [TATC] 5〜17 17 193〜237 塩基 *繰返しの回数は、整数でない場合もある 21 D13S317の内訳 No. 繰返し回数 出現頻度(⽩⼈) 1 5 検出されず 2 6 検出されず 3 7 検出されず 4 7.1 検出されず 5 8 0.112 6 8.1 検出されず 7 9 0.074 8 10 0.051 9 11 0.339 10 12 0.248 11 13 0.124 12 13.3 検出されず 13 14 0.048 14 14.3 検出されず 15 15 0.001 16 16 検出されず 17 17 検出されず 出現頻度について 9⽩⼈を302⼈(604本の染⾊体) を調べたときの結果 9例えば８回繰返しを持つ染⾊体 は64本⾒つかったので、 64÷604＝0.112 となる 注） • 繰返し回数にドット「.」を含むものは規則正しい繰り 返しではない • 例えば、13.3は4塩基［TATC］の繰り返しを13回 と、3塩基の不完全な繰り返しを1つ含む 22 DNAが同⼀かどうかを判断する⽅法 9 例えば、 – 犯罪現場に落ちていた髪の⽑からとったDNA – Aさんの髪の⽑からとったDNA が同⼀かどうかを判断するとする 9 D13S317の繰返し数を調べる（⽅法はあとで話す） 9 2本の染⾊体を持つので、2種類の繰返し回数が検出される 9 現場の髪の⽑もAさんの髪の⽑もどちらとも、11回繰返しと14 回繰返しだったとする 9 現場の髪の⽑のDNAと、Aさんの髪の⽑のDNAは同⼀だと⾔え るか？ そのような組合せを持つ⼈の頻度を計算する 23 D13S317の内訳 繰返し回数 出現頻度(⽩⼈) 5 検出されず 6 検出されず 7 検出されず 7.1 検出されず 8 0.112 8.1 検出されず 9 0.074 10 0.051 11 0.339 12 0.248 13 0.124 13.3 検出されず 14 0.048 14.3 検出されず 15 0.001 16 検出されず 17 検出されず 24 D13S317で11回と14回を同時に持つ確率 2本⽬の染⾊体 11回の頻度 （p=0.339） 本⽬の染⾊体 1 11と14を持つ確率= pq =0.339×0.048 = 0.016 11回の頻度 （p=0.339） 14回の頻度 （q=0.048） 14回の頻度 （q=0.048） 14と11を持つ確率= qp =0.048×0.339 = 0.016 11回と14回を同時に持つ確率 = 0.016 + 0.016 = 0.032 つまり、1000⼈に32⼈ = 31⼈に1⼈は11回と14回を同時に持つ。 この程度の確率で犯⼈と決め付けるのは無理。 → さらに多くのSTRを調べる必要あり！ 25 ２つ⽬のSTR（TH01） 9「犯罪現場に落ちていた髪の⽑」と 「Aさんの髪の⽑」で、TH01の繰返 し数を調べた 繰返し回数 頻度（⽩⼈） 3 検出されず 4 検出されず 5 0.001 9それぞれ2本の染⾊体を持つので、2 種類の繰返し回数が検出される 5.3 検出されず 6 0.231 6.1 検出されず 6.3 検出されず 7 0.190 7.1 検出されず 7.3 検出されず 8 0.084 8.3 検出されず 9 0.114 9.3 0.367 10 0.008 10.3 検出されず 11 0.001 12 検出されず 13.3 検出されず 14 検出されず 9どちらの髪の⽑もAさんの髪の⽑も、 6回繰返しのみ（どちらの染⾊体も 6回繰返し）を持っていた 26 TH01で2本の染⾊体とも6回繰返しである確率 2本⽬の染⾊体 6回の頻度 （p=0.231） 本⽬の染⾊体 1 6回の頻度 （p=0.231） 6と6を持つ頻度= p2 = 0.231×0.231 = 0.053 TH01で6回のみを持つ確率 = 0.053 D13S317で11回と14回を同時に持ち、なおかつ、TH01で6回のみを持つ確率 = 0.032× 0.053 = 0.0016 つまり、10000⼈に16⼈＝625⼈に1⼈ これでもまだ偶然の⼀致の危険性を避けられない → さらに多くのSTRを調べる 27 実際のDNA鑑定に⽤いられる13種のSTR • CODIS（Convined DNA Index System） STR名 染⾊体 繰返しの単位配列 繰返し回数 の範囲*1 繰返しパターン の総数 繰返しの⻑さの範囲*2 CSF1PO 5番 [TAGA] 5〜16 20 304〜341 塩基 FGA 4番 [CTTT] 12.2〜51.2 80 214〜355 塩基 TH01 11番 [TCAT] 3〜14 20 163〜201 塩基 TPOX 2番 [GAAT] 4〜16 15 222〜249 塩基 VWA 12番 [TCTG], [TCTA] 10〜25 28 154〜206 塩基 D3S1358 3番 [TCTG], [TCTA] 8〜21 24 111〜140 塩基 D5S818 5番 [AGAT] 7〜18 15 134〜172 塩基 D7S820 7番 [GATA] 5〜16 30 255〜291 塩基 D8S1179 8番 [TCTA], [TCTG] 7〜20 17 123〜169 塩基 D13S317 13番 [TATC] 5〜16 17 216〜244 塩基 D16S539 16番 [GATA] 5〜16 19 252〜292 塩基 D18S51 18番 [AGGA] 7〜39.2 51 262〜345 塩基 D21S11 21番 [TCTA], [TCTG] 12〜41.2 82 184〜239 塩基 *1 繰り返しの回数は整数とは限らない *2 ABI社のAmpFISTER Identifierキットを⽤いてPCR増幅した場合の⻑さ 28 13種のCODIS STRを全て⽤いた結果の例 # STR 繰返し1 繰返し2 繰返し1 の頻度（p） 繰返し2 の頻度（q） 繰返し1と2を同時 に持つ確率 （p2 or 2pq） 累積確率 何⼈に1⼈? 1 D13S317 11 14 0.339 0.048 0.032 0.032 31 2 TH01 6 6 0.231 - 0.053 0.0016 625 3 D18S51 14 16 0.137 0.139 0.038 6.1×10-5 16,447 4 D21S11 28 30 0.158 0.278 0.087 5.3×10-6 189,050 5 D3S1358 16 17 0.253 0.215 0.108 5.7×10-7 1,750,465 6 D5S818 12 13 0.384 0.140 0.107 6.1×10-8 1.64×107 7 D7S820 9 9 0.177 - 0.031 1.9×10-9 5.28×108 8 D8S1179 12 14 0.185 0.165 0.061 1.2×10-10 8.65×109 9 CSF1PO 10 10 0.216 - 0.046 5.3×10-12 1.88×101 10 FGA 21 22 0.185 0.218 0.080 4.3×10-13 2.35×1012 11 D16S539 9 11 0.112 0.321 0.071 3.0×10-14 3.31×1013 12 TPOX 8 8 0.534 - 0.285 8.6×10-15 1.16×1014 13 VWA 17 18 0.281 0.200 0.112 9.6×10-16 1.04×1015 • 13種のSTRを使うと、偶然⼀致する確率が、1.04x 1015⼈（1040兆⼈）に1⼈にま で減る • 地球の⼈⼝は6.5x 109⼈（65億⼈）なので、ほぼ間違いなくAさんの髪の⽑であると ⾔える 29 繰返し回数はDNAの⻑さでわかる 繰返し回数 5 157 塩基 6 161 塩基 7 165 塩基 8 169 塩基 9 10 D13S317 [TATC]n の例 ⻑さ 173 塩基 177 塩基 … … 17 205 塩基 157 161 165 169 173 177 205 30 DNAの⻑さは電気泳動法により測れる 9 9 9 9 DNAは負に荷電している（リン酸基による） 電圧をかけるとDNAはマイナス側からプラス側へ泳動される（移動する） 電気泳動は微⼩な網⽬構造をもつゲルで⾏う（分⼦ふるい） 短いDNAほど速くゲル中を移動する。網⽬に引っかかりにくいため 分⼦ふるいの例（アクリルアミド） 特定の部分のDNAの⻑さを測るには？ ctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgct tcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatcccggacaccatcgaatggcgcaaaac ctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccag taacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaac caggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaatta cattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacct ccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactg ggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgca caatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgcca ttgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacaccc atcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcatt gggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctgg ctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactgg agtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgat gctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcg ttggtgcggacatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccg ttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaact ctctcagggccaggcggtgaagggcaatatctatctatctatctatctcagctgttgcccgtctc actggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccg attcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaat taatgtaagttagctcactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacc cagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttcttt atcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcg ctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaag ccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcg gccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgcct tactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgt ctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcgg aagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtgg aacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgcc gcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagta acccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatccccc ttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaa gccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgt gaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacgg tgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccggga gcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccag tcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgaga gtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgc tcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagc tcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgag caaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctc cgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggact ataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgc ctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgct tcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatcccggacaccatcgaatggcgcaaaac ctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccag taacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaac caggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaatta cattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacct ccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactg ggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgca caatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgcca ttgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacaccc atcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcatt gggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctgg ctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactgg agtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgat gctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcg ttggtgcggacatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccg ttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaact ctctcagggccaggcggtgaagggcaatatctatctatctatctatctatctatctcagctgttg cccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgc gttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgc aacgcaattaatgtaagttagctcactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagc cttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactg tcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggac cgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccct cgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccg gcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcgg ggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctg caaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctgg aaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggcta ccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctg gtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcat catcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacaga aatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctt tatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcag acatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggt gatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcgga tgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagcca tgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattg tactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgca tcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcg gtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttcc ataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccg 32 acaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgac 特定の部分のDNAの⻑さを測るには？ ctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgct tcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatcccggacaccatcgaatggcgcaaaac ctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccag taacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaac caggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaatta cattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacct ccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactg ggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgca caatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgcca ttgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacaccc atcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcatt gggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctgg ctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactgg agtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgat gctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcg ttggtgcggacatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccg ttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaact ctctcagggccaggcggtgaagggcaatatctatctatctatctatctcagctgttgcccgtctc actggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccg attcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaat taatgtaagttagctcactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacc cagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttcttt atcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcg ctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaag ccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcg gccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgcct tactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgt ctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcgg aagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtgg aacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgcc gcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagta acccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatccccc ttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaa gccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgt gaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacgg tgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccggga gcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccag tcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgaga gtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgc tcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagc tcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgag caaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctc cgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggact ataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgc ctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgct tcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatcccggacaccatcgaatggcgcaaaac ctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccag taacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaac caggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaatta cattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacct ccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactg ggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgca caatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgcca ttgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacaccc atcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcatt gggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctgg ctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactgg agtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgat gctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcg ttggtgcggacatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccg ttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaact ctctcagggccaggcggtgaagggcaatatctatctatctatctatctatctatctcagctgttg cccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgc gttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgc aacgcaattaatgtaagttagctcactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagc cttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactg tcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggac cgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccct cgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccg gcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcgg ggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctg caaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctgg aaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggcta ccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctg gtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcat catcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacaga aatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctt tatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcag acatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggt gatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcgga tgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagcca tgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattg tactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgca tcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcg gtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttcc ataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccg 33 acaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgac PCR法 9 Polymerase chain reactionの略 9 特定の部分のDNAを短時間で増幅（合成） する⽅法 – 数時間で数10億倍程度 9 DNA鑑定のために開発された技術ではない。 DNAや遺伝⼦を扱う研究者はみんな使ってい る 34 PCRによる特定のSTRの増幅 染⾊体 35 PCRによる特定のSTRの増幅 染⾊体 PCR ... 数10億倍 36 PCRによる特定のSTRの増幅 染⾊体 PCR ... 数10億倍 電気泳動による⻑さの測定 37 PCRの実験⼿順 ヒトのDNA • ⾎痕、髪の⽑、精液、 唾液などから採取 • ごく微量でOK DNA合成酵素 • 温泉に住む細菌から取ら れた熱に強いもの • Taq DNA polymerase が代表的 プライマー • ⼈⼯的に化学合成した DNA • 増幅したい領域の両端 の塩基配列を持つ デオキシリボヌクレオチド • いわゆるA、T、G、C • 新規DNA合成の原料 マイクロチューブ • 内容量は20 μL程度（1 μL＝1 mm3） DNA増幅反応 • 95℃ 30秒→ 55℃ 30秒→ 72℃ 30秒を30回繰り返し 38 PCRの実現に不可⽋なDNA合成酵素の特徴 9 2本鎖のDNAしか合成できない 可能 5’ tgcact 3’ 3’ acgtgattcacggt 5’ 不可能 5’ tgcact 3’ 9 既にある２本鎖部分に継ぎ⾜していくことしかできない 可能 5’ tgcact 3’ 3’ acgtgattcacggt 5’ 不可能 5’ 3’ 3’ acgtgattcacggt 5’ 9 決まった向き（5ʼから3ʼ⽅向）にしかDNAを合成できない 可能 5’ tgcact 3’ 3’ acgtgattcacggt 5’ 不可能 5’ gtgcca 3’ 3’ acgtgattcacggt 5’ 39 PCRの原理 5’ ...taaattgtaagcgttaatattttgtta....tcgcgttaaatttttgttaaatcagct... 3’ 3’ ...atttaacattcgcaattataaaacaat....agcgcaatttaaaaacaatttagtcga... 5’ 増幅したいSTR 5’ 3’ 3’ 5’ + STRの5ʼ末端の配列を持つプライマーを過 剰量反応系に加えておく 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 温度を55℃程度にすると、 プライマーがDNA鎖に結合 する 1サイクル⽬ 温度を95℃に上げ、DNA 2本鎖を1本鎖に解離させる 3’ 5’ 温度を72℃にすると、プライ マーを起点としてDNA合成 が⾏われる 40 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 温度を55℃程度にし、プラ イマーを結合させる 5’ 3’ 5’ 再び温度を95℃に上げ、 DNA 2本鎖を1本鎖にする 2サイクル⽬ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 温度を72℃にし、DNA合 成を⾏う 41 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 再び温度を95℃に上げ、 DNA 2本鎖を1本鎖にする 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 温度を55℃程度にし、プラ イマーを結合させる 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3サイクル⽬ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 42 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ ⽬的のDNA断⽚ 3’ ⽬的のDNA断⽚ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 温度を72℃にし、DNA合 成を⾏う 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 再び温度を95℃に上げ、 DNA 2本鎖を1本鎖にする 4サイクル⽬ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3サイクル⽬ 5’ 3’ 温度を55℃程度にし、プラ イマーを結合させる 43 3’ ⽬的のDNA断⽚ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ ⽬的のDNA断⽚ 5’ 3’ 3’ ⽬的のDNA断⽚ 5’ 5’ 3’ 3’ ⽬的のDNA断⽚ 5’ 温度を72℃にし、DNA合 成を⾏う 4サイクル⽬ 5’ 3’ 以降、⽬的のDNAは1サイクルごとに2倍増幅する 91サイクルでDNAは2倍に増幅する 930サイクルでは、230＝約10億倍 44 DNA鑑定の⼿順のまとめ 1. ⽐べたいDNAサンプルを準備する 2. 13種のSTR部分のDNAをPCRで増幅する 3. 電気泳動でそれぞれの⻑さを測り、２つのサンプル間で⽐較する 9 1つでも⻑さの違うSTRがあった場合 → 2つのDNAは異なる 9 全てのSTRの⻑さが同じだった場合 → 2つのDNAはほぼ間違いなく同じ → 各STRの出現頻度をもとに偶然同じと判断される確率を 計算し、それが限りなくゼロに近いことを⽰す 45 資料 9 DNA鑑定とタイピング : 遺伝学・データベース・計測技術・デー タ検証・品質管理 / John M. Butler著 / 藤宮仁ほか訳 / 共⽴出版 9 ワトソン 組換えDNAの分⼦⽣物学 第3版 第16章/ 丸善 9 STRのデータベース・・・ STRbase (http://www.cstl.nist.gov/strbase/)、英語 9 このプレゼンテーションのファイルは⿅児島⼤学理学部の九町の ホームページからダウンロード可能です（googleで、”九町 HP 教育”と検索してください） 46
© Copyright 2024 Paperzz
