BioResource Now

BioResource Now ! Vol.8 No.6
BioResource Now !
Issue Number 8
June 2012
国内外のバイオリソースを巡る様々な問題や取り組みについて、毎月ホットな話題をこのニュースレターで紹介していきます。
金子武人 ( 京都大学大学院医学研究科附属動物実験施設 )
ホット情報
No.40
じょうほう通信
No.70
お薦め Book！
No.6
10 年ひと仕事
−フリーズドライ精子保存法開発への道−
BLAST+ のインストール
P1 - 2
P2
「粘菌 −その驚くべき知性」
P2
NewsLetter に掲載されているあらゆる内容の無断転
載・複製を禁じます。すべての内容は日本の著作権法、
及び国際条約により保護されています。
ニュースレターのダウンロード先
URL: www.shigen.nig.ac.jp/shigen/news/
ホット情報〈NO.40〉
10 年ひと仕事
−フリーズドライ精子保存法開発への道−
2001 年 8 月、私はハワイ・ホノルル
空港に降り立った。これが、フリーズ
ドライ精子保存法開発の始まりであ
る。柳町隆造博士率いるハワイ大学の
研究グループは、1998 年にフリーズ
ドライ精子からマウスを誕生させるこ
とに成功した。柳町グループの NIH プ
ロジェクトに参画し、マウスフリーズ
ドライ精子保存法をより効率の良いも
のにすることが私に与えられた課題で
あった。2 年間という短い期間の中で、
絶対的な観光地である「ハワイ」の誘
惑と闘いながら、フリーズドライに対
する精子の耐性や作出効率向上に関す
る研究を行った。その甲斐もあって、
保存液への金属キレート剤の添加、
pH、保存温度、そして精子の成熟度が
フリーズドライ後の精子
の受精能に大きく影響す
ることを明らかにするこ
とができた。
液体窒素による凍結保存法が主流の
中、なぜ「フリーズドライ」にこだ
わるのか？それは、この技術が携
わっていたバイオリソース事業に大
きなメリットがあると感じたからで
ある。フリーズドライ精子保存法は、
○ 特殊な凍結保護剤・保存液が不要
（トリス -EDTA 保存液で保存可能）
○ 液体窒素タンクや定期的な液体窒
素の購入・補充が不要（冷蔵庫で
保存可能）
○ 設備・維持費の大幅なコストダウ
ンが可能
○ 保有サンプルの管理、バックアッ
プが容易
○ ドライシッパー・ドライアイス不
要の常温国際輸送が可能（常温で
3 ヶ月保存可能）
である。このため私は、帰国後もバ
イオリソース事業を行いながら、フ
リーズドライ精子保存法の効率向上
を目的とした研究を継続した。バイ
オリソース事業において、貴重な遺
伝資源を安全に次世代に受け継ぐこ
とは最重要課題である。そこで、マ
ウスやラットでは、生体維持による
感染症や遺伝的汚染のリスクを軽減
するために、凍結精子・受精卵によ
る系統保存が行われてきた。しかし
ながら、保存系統数の増加に伴う設
備の増設、液体窒素使用量の増加、
定期的な設備メンテナンス等による
ランニングコストは決して安価とは
言えない。
ナショナルバイオリソースプロジェクト「ラット」
京都大学大学院医学研究科
附属動物実験施設特定講師
金子武人
今後も起こりうるであろう大災害に
おいても、安全に遺伝資源を守るこ
とのできる液体窒素不要の新しい遺
伝資源長期保存法の実用化が、急務
の課題であるとあらためて強く認識
した瞬間であった。
そのような状況の中、フリーズドラ
イ精子の長期保存が成功した。ラッ
トで 5 年間、マウスで 3 年間、冷蔵
庫（4℃）で保存したフリーズドラ
イ精子から正常な繁殖能力を持つ子
供が産まれたのである ( 写真 1)。ど
ちらの精子もフリーズドライ直後の
精子を用いた時と変わらない産子作
出率が得られたことから、保存中の
劣化や受精能の低下は認められな
かった。この結果により、フリーズ
ドライ精子保存法は実用化に大きく
前進した。フリーズドライ精子長期
保存法の実用化によって、これまで
の液体窒素による凍結保存法よりも
「安全・簡易・低コスト」の遺伝資
源保存・輸送が可能となるのである。
また、精子のみで遺伝子を次世代に
伝えることができるトランスジェ
ニック・コンジェニック系統の保存
や、保存系統の簡易・安価なバック
アップとしてフリーズドライ精子保
存法は有効なツールになる。
また近年、安全面でも今後のバイオ
リソース事業において大きく考えさ
せられる事件が起きた。2011 年 3 月、
東日本を襲った大震災である。この
事件により、これまでフリーズドラ
イ精子保存法の開発は、研究レベル
であり実用化については将来的なも
のとしか考えていなかった私の思い
は大きく変わった。震災では、長期
停電により冷蔵庫・冷凍庫で保存さ
れていた多くの研究用サンプルが失
われた。液体窒素タンクは、供給シ
ステムが停止してもタンクが破損し
ない限り液体窒素の液面は維持
されるため、震災直後の遺伝資
源は守られた。しかしながら、1
日 5 ∼ 10 リットル気化する液体
窒素は、生産工場被災による製造
停止、道路の寸断による交通機能
1：フリーズドライ精子のアンプルと冷蔵庫（4℃）
のマヒにより供給が途絶えたこと写真
で 5 年間保存した精子から得られたラット（左）および
3 年間保存した精子から得られたマウス（右）
で危機的な状況に陥った。
次ページへ続く
BioResource Now ! Vol.8 No.6
今回の成果が得られるまでの道のり
は 10 年を要した。まさに「10 年ひ
と仕事」である。フリーズドライ精
子保存法は、野生動物の保護や優良
家畜の保存においても応用できる可
能性が高いことから、他の動物種で
の長期保存の成功を期待し、今後は
精子の常温長期保存、受精卵のフ
リーズドライ保存法の開発という新
たな道を歩んでいきたい。■
現在までに受精卵のフリーズドライ
に成功した報告はない。近交系は受
精卵で保存しなければならないので、
全てのラット・マウス系統をフリー
ズドライで保存することはできない
が、「精子＝フリーズドライ、受精卵
＝液体窒素保存」とするだけでもコ
スト・安全面での貢献度は大きい。
BLAST+ のインストール
実行時間 (sec.)
2009 年、NCBI は従来の BLAST(Legacy BLAST)
の改良版である BLAST+ をリリースしました。
長大なクエリ配列の分割や、Trace-back での
部分検索の導入などが主な改善点とされ、こ
れまで処理に時間のかかっていた大規模な検
索も、短時間で実行できるようになりました。
先生のご発表論文
・PLoS One 7(4): e35043, 2012
・Cryobiology 64: 211-214 (2012)
関連記事のサイト
・http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/repro
duction/sperm_freeze-drying_jp.aspx
・http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/repro
duction/home_jp.aspx
・http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/news_data/h/
h1/news6/2012/120410_1.htm
じょうほう通信
BLAST+
Legacy BLAST
クエリ配列長 kbases
図 1 は BLAST+ と Legacy BLAST とで、検索実
行時間にどれほどの違いが生まれるのかを示し図 1：BLAST+ と Legacy BLAST
た図です。大腸菌の全ゲノム配列 (4.6Mbases) における tblastx 実行時間
をデータベースとし、その任意の箇所から取得した 5kbases、
50kbases、500kbases の配列をクエリとして tblastx( フィルタオフ )
を実行し、その処理時間を計測しました。※実行環境は、表 1 の通りです。
その結果、クエリ配列が長くなるほど BLAST+ と Legacy BLAST の実
行時間の差が大きくなることがわかります。BLAST+ は Legacy BLAST
同様、ローカル環境にインストールして利用することが可能です。今
回は、Linux での BLAST+ のインストールから、処理の実行までを紹
介します。
表 1：マシンのスペック
CentOS 6.2 (32bit)
OS
AMD Athlon(tm) 64 X2 Dual Core Processor 3800+(2.0GHz)
CPU
メモリ 2.0Gbyte
1Tbyte, SATA 3.0, 7200rpm
HDD
blastn: 2.2.26+
Package: blast 2.2.26, build Feb 9 2012 16:01:19
① NCBI の BLAST ダウンロードページから、データベースのダウンロー
ドページを開きます。(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/)
② FASTA ディレクトリへアクセスし、目的のファイルを任意のディレ
クトリへダウンロードします。
③ 端末からコマンドを入力し ( 表 2-b 又は 2-c) 実行してください。
注）出力するデータベース名とハッシュインデックスの作成は必須ではありません。
④ 実行後、作成したデータベースの情報が端末に表示されれば、デー
タベースのフォーマットは成功です。
BLAST の実行
① FASTA 形式のクエリを用意します。
② 端末からコマンドを入力し ( 表 2- d 又は 2-e) 処理を実行します。
③ 現在のディレクトリに結果のファイルが出力されていれば処理は
成功です。
表 2 ：コマンド一覧
項番
目的
BLAST+ のインストール手順
b
塩基配列 DB のフォーマット
① NCBI の BLAST のダウンロードページから、BLAST+ 最新版のダウン
ロードページ (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/)
を開きます。
② 2012 年 6 月現在の最新版である ncbi-blast-2.2.26+-x64-linux.tar.gz
を任意のディレクトリへダウンロードします。
注）マシンの性能により時間のかかる場合があります。
③ gz ファイルをダブルクリックで解凍します。
④ 端末からコマンドを入力し（表 2-a）、BLAST の実行ファイルの格納
されている bin までの PATH を通します。
⑤ 最後に、 blastn -version と入力して実行してください。BLAST+ のバージョンが表示されれば、イントールは成功です。（図 2）
c
d
アミノ酸配列 DB の
フォーマット
blastn
e
blastp
中垣俊之著（PHP サイエンス・ワールド新書、2010 年）
著者はイグ・ノーベル賞を２度も受賞したことで有名な人。ちなみに、
イグ・ノーベル賞は「人々を笑わせ、そして考えさせてくれる」研究
に対して与えられるという。
本書では単細胞の真正粘菌が示す「優れた能力」が紹介されている
が、その１つが 2008 年のイグノーベル賞を受賞した「粘菌の迷路
解き」である。迷路の中に粘菌を入れ、迷路の入り口と出口に餌を
置くと、粘菌は２つの餌を同時に食べようとして、入り口と出口を
つなぐ最短の経路に沿って身体を伸ばす。つまり粘菌としては、餌
は食べたいし身体は２つに分断したくないので、最短の管（原形質）
でつないで身を１つに保つということらしい。
もう１つは、2010 年のイグノーベル賞に輝いた「関東圏の鉄道網
を再現した粘菌」の話だ。寒天プレート上に描いた関東地方の地図
の主要な都市に餌を置き、粘菌を東京の位置から出発させると、原
形質流動によって広がり、餌に集まる。多数の餌を同時に食べよう
とするので、結果的に粘菌はネットワーク状の管を形成し、その形
が現実の JR 路線図とよく一致したという。このとき、粘菌は管の
総延長を短くすると同時に、管の一部が断線しても身体は２分され
ないように（連結保証性）、二重の最適化を行ったのだという。こ
こまでくると、たしかに粘菌は「驚くべき知性」をもっていると言
えそうだ。(K.N.)
図 2：バージョン情報例
データベースのフォーマット
PATH を通す
「粘菌 −その驚くべき知性」
10 分
$ blastn -version
a
お薦め Book！〈NO.6〉
[ 第 70 回 ]
コマンド
export PATH=$PATH: 指定ディレクトリ
までの絶対パス
makeblastdb -in FASTAファイル -dbtype
nucl -out データベース -hash_index
makeblastdb -in FASTAファイル -dbtype
prot -out データベース -hash_index
blastn -db データベース -query クエリファイル
-out 出力ファイル
blastp -db データベース -query クエリファイル
-out 出力ファイル
大規模な検索であるほど性能を発揮する BLAST+ を、
ぜひ使ってみてはいかがでしょうか。
（生物遺伝資源センターデータベース事業部松野恭兵）
Contact Address
連絡先〒411-8540 静岡県三島市谷田 1111
国立遺伝学研究所生物遺伝資源センター
TEL 055-981-6885 ( 山崎 ) E-mail：[email protected]
Editor's Note
リソース保存技術の革新は、リソースセンターの運営に大きく貢献するこ
とはもちろんのこと、今後世界中の研究室に浸透することを考えるとその
影響力は計り知れないですね。それにしても、新技術の発見から実用化ま
で 10 年間の金子先生の弛まないご努力に頭が下がります（Y.Y.)。
バイオリソース情報
(NBRP) www.nbrp.jp/
(SHIGEN) www.shigen.nig.ac.jp/indexja.htm
(WGR) www.shigen.nig.ac.jp/wgr/
(JGR) www.shigen.nig.ac.jp/wgr/jgr/jgrUrlList.jsp
BioResource Now !
Issue Number 8 June 2012

Download Report