発表資料

低コスト生産が可能な
安定型VHH抗体の迅速開発法
琉球大学大学院医学研究科
助教 村上 明一
1
抗体とは?
生体に侵入した異物に特異的に結合し、それを除去するタンパク質
2本のH鎖と2本のL鎖で構成される
VH VL
相補性決定領域(CDR)
超可変領域
CDR1-H
CDR1-L
CDR2-L
一本鎖抗体(scFv)
~25KDa
CDR2-H
CDR3-H
可変部
CDR3-L
Hinge
CH2 CH2
定常部
ドメイン構造
Fc
CH3 CH3
ドメイン:
自立的に折り畳まれるタンパク質
構造の中の安定なユニット部分。
IgG ~150KDa
2
抗体の利用法
治療用抗体 ・ 検査用抗体 ・ バイオセンサー
イムノクロマトグラフィー :どこでも、誰でも、機器が不要、短時間(3~30分)
既存製品例
目視による判定
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
結核菌群同定
インフルエンザウイルス検出
アデノウイルス検出
大腸菌ベロトキシン検出
レジオネラ属菌検出
妊娠検査
心筋梗塞検査
腎機能
指定薬物検出
食物アレルゲン検出 など多数
医療分野(治療用抗体・検査用抗体など)
環境保全分野(環境ホルモン・アレルゲン物質など)
危機管理分野(生物化学兵器・爆発物・麻薬など)
食品管理分野(残留農薬・微生物・食物アレルゲンなど)
3
抗体製品の問題点とニーズ
開発期間が長く高コスト ・ 生産コストが高い ・ 安定性が悪い
安価かつ短期間で開発 ・ 低コストで大量に生産 ・ 高い変性耐性
当該技術
• ラクダ科H鎖抗体可変部(VHH)を利用
• ライブラリー法による迅速、低コスト開発
• 大腸菌などを使用した、低コスト・大量生産
4
H鎖のみで構成される抗体
IgNAR
一般的なIgG
hcIgG
C1NAR
CH2 CH2
C2NAR
CH3 CH3
C3NAR
ラクダ科動物由来
hcIgG: heavy chain IgG
C4NAR
サメ類由来
NAR: New Antigen Receptor
C5NAR
ラクダ科H鎖抗体
一般的な抗体
ラクダ科H鎖抗体
発見者:Hamers-Casterman et al., 1993
Camel: 50-80%
South american camelid: 10-25%
VHH
<15KDa
scFv
H鎖抗体可変領域
(抗原結合領域)
安定性が高い(熱・変性剤・pH)
CDR1
L鎖可変部 H鎖可変部
CDR3
大腸菌等での大量生産が可
CDR2
親和性は通常抗体と同等
隠れたエピトープも認識可
加工が容易
黄色が相互作用に関与する
疎水性アミノ酸残基
基本特許が終了
6
一般的なモノクローナル抗体作製法
1975年にミルスタイン先生らにより発明されたハイブリドーマ法
(1984年ノーベル生理学・医学賞)
動物免疫作業
初回免疫
追加免疫
追加免疫
追加免疫
最終免疫
~2ヶ月
細胞融合 & HAT選択
B細胞
短
有
○
親株
寿命
抗体産生
サルベージ回路
クローニング
(ハイブリドーマの単クローン化)
抗体発現・精製
長
無
×
HAT培地でのセレクション
ハイブリドーマ
~1ヶ月
~1ヶ月
7
抗体作製法の比較
ポリクローナル抗体
モノクローナル抗体
ハイブリドーマ法
ライブラリー法
•
期間 1~3ヶ月
•
期間 4~6ヶ月
•
期間 1~4週間
•
必要抗原量 数mg
•
必要抗原量 数mg
•
必要抗原量 ≦100mg
•
動物免疫
•
動物免疫
•
動物免疫不要
•
親和性成熟
•
親和性成熟
•
in vitro 親和性成熟法
•
自己反応性抗体除去
•
自己反応性抗体除去
•
交差反応性抗体の除去
•
抗血清からの抗体精製
•
ハイブリドーマ作製技術
•
分子生物学的手法技術
•
複数のエピトープを認識
•
単一のエピトープを認識
•
単一のエピトープを認識
•
有限 / 個体差・ロット差がある
•
無限 / ロット差が無
•
無限 / ロット差が無
•
自己、低免疫原性、抗毒物抗体
•
完全ヒト抗体作製可
動物飼育施設・経費
動物愛護
8
抗体ライブラリーとは
Filamentous phage
抗体分子とその遺伝子をリンク
多様な抗体を表面に発現し、それぞれの抗体遺伝子情報とリンクさせた集団
集団の大きさ≒多様性
9
ライブラリー多様性の概念図
どんな餌(抗原)でも
良い魚(抗体)が釣れる!?
10
生体での抗体の多様性形成メカニズム
4つの多様性形成のメカニズム
遺伝子断片の再構成
接合部の不均一性
H鎖・L鎖の組合せ
Vh
Vh
Vh
V(D)J遺伝子再構成
Vh
D D D D
J
J
J
(マウス V遺伝子: >100、D遺伝子: 約15、J遺伝子: 5)
Vh
VH:
体細胞超突然変異
CDR1
D
CDR2
J
CDR3
接合部分での塩基の追加あるいは欠失が起こる
(TdTやエクソヌクレアーゼが関与)
11
VHHライブラリーの多様性創製戦略
CDR1
CDR3
B細胞
CDR2
mRNA
cDNA
1st PCR
Leader
FR1
CDR1
FR2
CDR2
2nd PCR
FR1
CDR1
FR2
CDR2
3rd PCR
FR1
CDR1
FR2
CDR2
pPANA-01
PLac PelB
SfiI
FR3
CDR3
FR3
FR3
FR4
CDR3
CDR3
Hinge
CH2
FR4
FR4
DgIIIp
Stuffer
SfiI/NotI
12
構築したVHHライブラリー
計算上のVHH完全長遺伝子の多様性
{ ( 11頭アルパカ ) x 1x107 B細胞 } 2 ≒ 1x1016
Long hinge PCR #1
Day 1
Day 2
Day 3
Day 4
Short hinge PCR #1
Day 5
形質転換大腸菌数≒多様性:(4.0~4.2x109) x 5 ≧ 2x1010
13
VHHライブラリーの評価
CSAVRandomclone#01
CSAVRandomclone#02
CSAVRandomclone#04
CSAVRandomclone#05
CSAVRandomclone#06
CSAVRandomclone#07
CSAVRandomclone#09
CSAVRandomclone#10
CSAVRandomclone#11
CSAVRandomclone#12
CSAVRandomclone#13
CSAVRandomclone#14
CSAVRandomclone#15
CSAVRandomclone#16
CSAVRandomclone#17
CSAVRandomclone#18
CSAVRandomclone#19
CSAVRandomclone#20
CSAVRandomclone#21
CSAVRandomclone#22
CSAVRandomclone#23
CSAVRandomclone#24
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRSILSINAM-G-WYRQAPGKQRELVARISSGSS-THYADSVKGRFTISRHNANNTVYL-QMNNLKPEDTAVYYCATLRVVSLD-PWEY-----VYDY-T-GQGTQVTVSSAHHSEDPTASAAELQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEFSGSIFFYK-MG-WYRQAPG-KQRELVANISTTGRPY-YADAVKGRFTISKDSAKNTVH-LM-NSLKPEDTAVYYCNA--R-YLLT------Y-------W-GQGIQVTVSSEPKTPKPQSASAA
XXQLVESGGGFVQPGGSLRLSCTASGSIFGIVPM-G-WYRQAPGKQRDLVAMFTANGS-EWYAASVKGRFTISRDNAKNTVYL-QMNSLKPEDTGVYYCARCAGHVCFDVMDR-----DD-D-W-GQGTEVTVSSAHHSEDPTASAAQLQLVESGGGLVQTGDSLRLSCVYSGLT-FSEYGIAWFRQAPG-KEREGVSGISSSDGSTFYPNSVKGRFTISRDNAENTV-YLQMNSLKPEDTAVYYCAAR-GFAGLG-YSAH-E---YP-YW-GPGTQVTVSSAHHSEDPTASAAQVQLVESGGGVVQPGESLRLSCAATGFTFDYKGIA-WFRQVPG-KEREGVSCLTIYDGKTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTVY-LQMNSLEPEDTAVYYCHAE-GPWPGVN-----Y-------W-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA
ELQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGFIHDDTTIG-WFRQAPG-KEREGVSCIGRRDGSTDYADSVKGRFTISRDNAKKTIF-LEMSRLKPEDTAVYYCNEK-VTTGQG-MA---HRTGNY--W-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA
ELQLVESGGGLAQAGGSLKLSCATSGFTAFDH-AIGWFRQAPG-REREGVSCISIEDGRTIYGDSVKGRFTISIDSANNNTVYLQMNTLKPEDTAVYACN-W-G-------G--------H--W-GQGIQVTVPSAHHSEDPTASAAQLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGTLFSFNTMG-WYRQAPG-KERELVAVTTSGGSTN-YADSVKGRFTISMDNTKNTVY-LQMDSLKPEDTAVYHCHVD-RPYGND------Y-------W-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFRFDDDSIG-WFRQAPG-KEREGVSCISSSAGSTYCTDSVKGRFTISRDGAKNTVF-LQMISLKPEDTAVYYCKMN-RGAYYR-YD---F-------W-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA
ELQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSYCM-YWV-RQAPGKGLEWVSAINTRGDNIYYADSVKGRFTASRDDAKNTVFL-QMNSLKPEDTAVYYC--------GMIRWGT--SPDD---W-GQGTQVTVSYAHHSEDPTASAAELQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFGINTM-G-WYRQAPGKQRELVATIDQLSK-TNYANSVKGRFTISRDNAKNTLYL-QMNSLKSEDTAVYYCAKWVKKVVLTTAYY-----YGMDYW-GKGTLVTVSSAHHSEDPTASAAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSISGITSDYYAIG-WFRQAPE-KEREAVLCLSSSDESTYYDDSVKGRFTISRDNAKNTVY-LQMNSLKPEDTAVYYCAAK-YYSDYA-YD---Y-------W-GQGMQVTVSSEPKTPKPQSASAA
ELQLVESGGDLVQPGGSLRLSCAASGFTFRTYYM-AWV-RQAPGKGLEWVSSIDSRGITTTYADSVKGRFSISRDTAKNTVYL-QLNNLTPEDTAVYRCAA----TDGFVESPL--STYEYPYW-GQGTQVTVDSAHHSEDPTASAAEVQLVESGGGQVQPGGSLRLSCAGTGFTFDRNAIG-WFRQVPG-KEREGISCISSRGDSTGYVDSVKGRFTISRDNAKNTVY-LQMNSLKPEDTAVYYCVSL-GY------------------W-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA
QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMG-WFRQAPG-KEREFVAALSWSGLSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLY-LQMNRLKPEDTAVYYCAAK-LSWSGVWYDIA-TWSGYD-YW-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA
ELQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGTIFNINN--GFWYRQAPGNQREWVATIS-GYGGTDYADSVKGRFTISRDSAKNTVYL-QMDRLEPEDTAVYYCAIDYIGPYGSVVAWK--TRGYDS-W-GQGTQVTVSSAHHSEDPTASAAEVQLVESGGDLVQPGGSLRLSCSASGSIVNFTAM-G-WYRQAPGKQRESVAAIATD-----YAASVKG-FTISRDNAKNTLYL-QMNGLKPEDTAVYRCAAATRCTDGSRYPIT--S-GVDY-W-GKGTLVTVSPAHHSEDPTASAAEVQLVESGGGLVRAGGSLRLSCEASGSNLDAVDGFGWFRQ-APDKAREGLACISNRDGTTYYAASVKGRFTISRDNTKNTVYL-QMNSLIPDDTGNYTCVATW----GSQIHAA--AGIATHTYSGQGTQVTVSSAHHSEDPTASAAQVQLVESGGGSAQTGGSLRLSCAAPDGISSAISMG-WYRQAPGNQR-EKVASITATGVAL-YADSVKGRFTISRDNAKSTLYLQ-MDNLKPEDTAVYYCSLDYGYVCN---ERYRSLAGVADFYRK-GILVTVSSAHHSEDPTASAAEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGFTFDDYAIG-WFRQAPG-KEREAVSCISKIDGNTYYADSVKGRFTISRDNTEYTAY-LRMNSLKPEDTAVYYCNVK-GHVGIV-P----RKYDA---W-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCVGYGITLEDRAIG-WFRQAPG-KDREGVSCIQDDGST-YYTGSVKGRFTISRDNAKSTVN-LQMNNLKPEDTAVYYCART-TG-PAP---VE-G--GYK-DR-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASVSFFSTYAL-G-WYRQAPGKQRELVAGIASGGI-TNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYL-QMNSLKPEDTAVYYCNAKYGLGYGDPYEY-----D--Y-W-GQGTQVTVSSAHHSEDPTASAA-
CDR3 amino acid sequence
CDR1
CDR3
CDR2
CDR3 length
Ig sub-class (CDR3 region from)
Clone #01
ATLRVVSLDPWEYVYDYT
18
IgG3-Short hinge
Clone #02
Clone #04
Clone #05
Clone #06
Clone #07
Clone #09
Clone #10
Clone #11
Clone #12
Clone #13
Clone #14
Clone #15
Clone #16
Clone #17
Clone #18
Clone #19
Clone #20
Clone #21
Clone #22
Clone #23
NARYLLTY
ARCAGHVCFDVMDRDDD
AARGFAGLGYSAHEYPY
HAEGPWPGVNY
NEKVTTGQGMAHRTGNY
NWGGH
HVDRPYGNDY
KMNRGAYYRYDF
GMIRWGTSPDD
AKWVKKVVLTTAYYYGMDY
AAKYYSDYAYDY
AATDGFVESPLSTYEYPY
VSLGY
AAKLSWSGVWYDIATWSGYDY
AIDYIGPYGSVVAWKTRGYDS
AAATRCTDGSRYPITSGVDY
VATWGSQIHAAAGIATHTYS
SLDYGYVCNERYRSLAGVADFYRK
NVKGHVGIVPRKYDA
ARTTGPAPVEGGYKDR
8
17
17
11
17
5
10
12
11
19
12
18
5
21
21
20
20
24
15
16
IgG2-Long hinge
IgG3-Short hinge
IgG3-Short hinge
IgG2-Long hinge
IgG2-Long hinge
IgG3-Short hinge
IgG2-Long hinge
IgG2-Long hinge
IgG3-Short hinge
IgG3-Short hinge
IgG2-Long hinge
IgG3-Short hinge
IgG2-Long hinge
IgG2-Long hinge
IgG3-Short hinge
IgG3-Short hinge
IgG3-Short hinge
IgG3-Short hinge
IgG2-Long hinge
IgG2-Long hinge
Clone #24
NAKYGLGYGDPYEYDY
16
IgG3-Short hinge
135
125
135
136
131
137
125
129
132
130
137
132
137
125
141
139
133
139
139
135
134
134
14
ライブラリーからのスクリーニング法
(パニング:1ラウンド2日)
非結合ファージ除去
溶出
洗浄
抗原
結合ファージの溶出
ライブラリー
抗原との反応
次のラウンドへ
大腸菌へ感染
ファージ産生
抗体遺伝子の単離
抗エボラウィルス抗体
4.5
2nd パニング後に得た単クローンファージを用いたELISA
Absorbance(O.D.490)
4.0
所要期間:6日
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
A1
A3
A5
A7
A9
A11
B1
B3
B5
B7
B9
B11
C1
C3
C5
C7
C9
C11
D1
D3
D5
D7
D9
D11
E1
E3
E5
E7
E9
E11
F1
F3
F5
F7
F9
F11
G1
G3
G5
G7
G9
G11
H1
H3
H5
H7
H9
H11
0.0
Ebora
GP1 coat
EbolaEBoV
GP1 protein
coat
Ebola virus (Sudan) Glycoprotein / GP1 (mucin domain deleted) protein (aa Met1-Asp320, His Tag)
VHH遺伝子解析による独立したクローンの選択
PCR によるVHH遺伝子増幅
↓
HhaI で消化
↓
2% アガロースゲル電気泳動
HhaI 認識配列
GCGC
CGCG
16
抗インフルエンザ抗体
HA(H1N1)特異的VHHの作製
2nd パニング後に得た単クローンファージを用いたELISA
Absorbance (O.D.490)
2.0
1.5
1.0
0.5
A1
A3
A5
B1
B3
B5
C1
C3
C5
D1
D3
D5
E1
E3
E5
F1
F3
F5
G1
G3
G5
H1
H3
H5
A7
A9
B8
C7
C9
D8
E7
E9
F8
G7
G9
H8
A10
A12
B11
C10
C12
D11
E10
E12
F11
G10
G12
H11
0.0
H1 protein coat
Human serum albumin coat
Clone #I : KD = 4.947e-9 M
I
II
I
II
I
Clone #II:KD = 1.525e-9 M
II
100 nM VHH
25 kDa
20 kDa
大腸菌での発現精製
50 nM VHH
25 nM VHH
12.5nM VHH
固定化抗原:Recombinant HA (Sino Biological Inc.), 290.2 RU
17
抗インフルエンザ抗体
広範な亜型結合性抗体の作製
1st panning
2nd panning
3rd panning
A H1N1 (A/California/04/2009 ) Hemagglutinin Protein
A H5N1 (A/Indonesia/5/2005) Hemagglutinin Protein
A H7N7 (A/Netherlands/219/2003) Hemagglutinin Protein
ヘマグルチニン
• 少なくとも16種類 (H1~H16)
• 細胞表面のシアル酸に結合して感染
• エンドソームと融合してゲノムを細胞内に挿入
Absorbance (O.D.490)
6
5
4
3
2
1
0
H1-HA1-3
H1-E9
H1 coat
H1/5-G9
H5 coat
H1/5-2E4
H7 coat
H1/7-2B3
H1/7-2D1
NP coat
18
熱耐性の高いVHH単離法
特殊な耐熱性スクリーンング方法を検証
組織特異的なトロポニンアイソフォームの心筋トロポニンIと心筋トロポニンTは
心筋梗塞などにおける心筋損傷のバイオマーカーとして知られる
トロポニン
I CT
アクチン
トロポミオシン
2nd パニング後に得た単クローンファージを用いたELISA
耐熱性スクリーニング法由来
通常スクリーニング由来
2.5
2.0
1.5
1.0
cTnI coat
H9
H11
H7
G11
G9
G7
F9
F11
F7
E9
E11
E7
D9
D11
D7
C9
C11
C7
B9
cTnT coat
B11
B7
A9
A11
A7
H5
H3
H1
G5
G3
F5
G1
F3
F1
E5
E3
E1
D5
D3
D1
C5
C3
B5
C1
B3
B1
A5
0.0
A3
0.5
A1
Absorbance(O.D.490)
3.0
19
耐熱性 抗トロポニンT抗体
赤:耐熱性スクリーニングにより得られたVHHクローン
青:通常スクリーニングにより得られたVHHクローン
緑:一本鎖抗体(scFv)
VHH
VH VL
VHH
一本鎖抗体
(scFv)
120
% binding
100
50% inhibition temp. (℃)
80
VHH-H-A1
75
VHH-H-A5
>80
VHH-H-A6
>80
40
VHH-A10
62
20
VHH-A11
>80
VHH-B7
51
scFv-01
46
scFv-09
52
scFv-11
54
60
0
30
VHH-HA1
VHH-B7
40
50
60
70
Treated temperature (oC)
VHH-HA5
scFv-01
VHH-HA6
scFv-09
VHH-A10
scFv-11
80
VHH-A11
20
まとめ
既存抗体製品
開発期間が長く高コスト ・ 生産コストが高い ・ 安定性が悪い
発表技術
• ラクダ科H鎖抗体可変部(VHH)を利用
安定性が高い(熱・変性剤・pH)
• ライブラリー法による迅速、低コスト開発
1~2週間で従来法では得られない抗体を開発できる
• 大腸菌などを使用した、低コスト・大量生産
21
企業への期待
治療用や疾患検査用などは勿論ですが、
バイオセンサーとして医療分野以外への導入を加速したい
VHHライブラリー構築
鳥型インフルエンザ
SARS、MERS
デング熱など(感染症)
がん関連分子
リウマチ・アルツハイマー
アレルゲン
環境因子
・・・・・・・・・・・・・・, etc.
≧2x1010の多様性
抗原準備(標的選択)
様々な標的抗原に対して
スクリーニング
1~2週間で
安価に大量生産できる
発現精製
安定なVHHを取得可能
VHHの評価・標識
製品化
アイデア・要望・用途に応じて迅速に安定・安価なVHHが得られる
22
本技術に関する知的財産権
•
•
多様性に富むVHHライブラリーを所有
様々なスクリーニング系を所有
取得抗体を個別に特許化する方針です
共同研究開発を希望
23
産学連携の経歴
•
•
•
•
•
Panasonic株式会社
(株)抗体工学研究センター
イノベックスサイエンス株式会社
プロテックス株式会社
大手医療機器メーカー
研究費
• 第一回JSTマッチングプランナープログラム
• 沖縄科学技術イノベーションシステム構築事業
24
お問い合わせ先
琉球大学
研究推進機構 研究企画室
上席リサーチ・アドミニストレーター
殿 岡 裕 樹
〒903-0213 沖縄県中頭郡西原町千原1番地
TEL:098-895-8703
FAX:098-895-8837
E-mail: [email protected]
25