低コスト生産が可能な 安定型VHH抗体の迅速開発法 琉球大学大学院医学研究科 助教 村上 明一 1 抗体とは? 生体に侵入した異物に特異的に結合し、それを除去するタンパク質 2本のH鎖と2本のL鎖で構成される VH VL 相補性決定領域(CDR) 超可変領域 CDR1-H CDR1-L CDR2-L 一本鎖抗体(scFv) ~25KDa CDR2-H CDR3-H 可変部 CDR3-L Hinge CH2 CH2 定常部 ドメイン構造 Fc CH3 CH3 ドメイン: 自立的に折り畳まれるタンパク質 構造の中の安定なユニット部分。 IgG ~150KDa 2 抗体の利用法 治療用抗体 ・ 検査用抗体 ・ バイオセンサー イムノクロマトグラフィー :どこでも、誰でも、機器が不要、短時間(3~30分) 既存製品例 目視による判定 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 結核菌群同定 インフルエンザウイルス検出 アデノウイルス検出 大腸菌ベロトキシン検出 レジオネラ属菌検出 妊娠検査 心筋梗塞検査 腎機能 指定薬物検出 食物アレルゲン検出 など多数 医療分野(治療用抗体・検査用抗体など) 環境保全分野(環境ホルモン・アレルゲン物質など) 危機管理分野(生物化学兵器・爆発物・麻薬など) 食品管理分野(残留農薬・微生物・食物アレルゲンなど) 3 抗体製品の問題点とニーズ 開発期間が長く高コスト ・ 生産コストが高い ・ 安定性が悪い 安価かつ短期間で開発 ・ 低コストで大量に生産 ・ 高い変性耐性 当該技術 • ラクダ科H鎖抗体可変部(VHH)を利用 • ライブラリー法による迅速、低コスト開発 • 大腸菌などを使用した、低コスト・大量生産 4 H鎖のみで構成される抗体 IgNAR 一般的なIgG hcIgG C1NAR CH2 CH2 C2NAR CH3 CH3 C3NAR ラクダ科動物由来 hcIgG: heavy chain IgG C4NAR サメ類由来 NAR: New Antigen Receptor C5NAR ラクダ科H鎖抗体 一般的な抗体 ラクダ科H鎖抗体 発見者:Hamers-Casterman et al., 1993 Camel: 50-80% South american camelid: 10-25% VHH <15KDa scFv H鎖抗体可変領域 (抗原結合領域) 安定性が高い(熱・変性剤・pH) CDR1 L鎖可変部 H鎖可変部 CDR3 大腸菌等での大量生産が可 CDR2 親和性は通常抗体と同等 隠れたエピトープも認識可 加工が容易 黄色が相互作用に関与する 疎水性アミノ酸残基 基本特許が終了 6 一般的なモノクローナル抗体作製法 1975年にミルスタイン先生らにより発明されたハイブリドーマ法 (1984年ノーベル生理学・医学賞) 動物免疫作業 初回免疫 追加免疫 追加免疫 追加免疫 最終免疫 ~2ヶ月 細胞融合 & HAT選択 B細胞 短 有 ○ 親株 寿命 抗体産生 サルベージ回路 クローニング (ハイブリドーマの単クローン化) 抗体発現・精製 長 無 × HAT培地でのセレクション ハイブリドーマ ~1ヶ月 ~1ヶ月 7 抗体作製法の比較 ポリクローナル抗体 モノクローナル抗体 ハイブリドーマ法 ライブラリー法 • 期間 1~3ヶ月 • 期間 4~6ヶ月 • 期間 1~4週間 • 必要抗原量 数mg • 必要抗原量 数mg • 必要抗原量 ≦100mg • 動物免疫 • 動物免疫 • 動物免疫不要 • 親和性成熟 • 親和性成熟 • in vitro 親和性成熟法 • 自己反応性抗体除去 • 自己反応性抗体除去 • 交差反応性抗体の除去 • 抗血清からの抗体精製 • ハイブリドーマ作製技術 • 分子生物学的手法技術 • 複数のエピトープを認識 • 単一のエピトープを認識 • 単一のエピトープを認識 • 有限 / 個体差・ロット差がある • 無限 / ロット差が無 • 無限 / ロット差が無 • 自己、低免疫原性、抗毒物抗体 • 完全ヒト抗体作製可 動物飼育施設・経費 動物愛護 8 抗体ライブラリーとは Filamentous phage 抗体分子とその遺伝子をリンク 多様な抗体を表面に発現し、それぞれの抗体遺伝子情報とリンクさせた集団 集団の大きさ≒多様性 9 ライブラリー多様性の概念図 どんな餌(抗原)でも 良い魚(抗体)が釣れる!? 10 生体での抗体の多様性形成メカニズム 4つの多様性形成のメカニズム 遺伝子断片の再構成 接合部の不均一性 H鎖・L鎖の組合せ Vh Vh Vh V(D)J遺伝子再構成 Vh D D D D J J J (マウス V遺伝子: >100、D遺伝子: 約15、J遺伝子: 5) Vh VH: 体細胞超突然変異 CDR1 D CDR2 J CDR3 接合部分での塩基の追加あるいは欠失が起こる (TdTやエクソヌクレアーゼが関与) 11 VHHライブラリーの多様性創製戦略 CDR1 CDR3 B細胞 CDR2 mRNA cDNA 1st PCR Leader FR1 CDR1 FR2 CDR2 2nd PCR FR1 CDR1 FR2 CDR2 3rd PCR FR1 CDR1 FR2 CDR2 pPANA-01 PLac PelB SfiI FR3 CDR3 FR3 FR3 FR4 CDR3 CDR3 Hinge CH2 FR4 FR4 DgIIIp Stuffer SfiI/NotI 12 構築したVHHライブラリー 計算上のVHH完全長遺伝子の多様性 { ( 11頭アルパカ ) x 1x107 B細胞 } 2 ≒ 1x1016 Long hinge PCR #1 Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Short hinge PCR #1 Day 5 形質転換大腸菌数≒多様性:(4.0~4.2x109) x 5 ≧ 2x1010 13 VHHライブラリーの評価 CSAVRandomclone#01 CSAVRandomclone#02 CSAVRandomclone#04 CSAVRandomclone#05 CSAVRandomclone#06 CSAVRandomclone#07 CSAVRandomclone#09 CSAVRandomclone#10 CSAVRandomclone#11 CSAVRandomclone#12 CSAVRandomclone#13 CSAVRandomclone#14 CSAVRandomclone#15 CSAVRandomclone#16 CSAVRandomclone#17 CSAVRandomclone#18 CSAVRandomclone#19 CSAVRandomclone#20 CSAVRandomclone#21 CSAVRandomclone#22 CSAVRandomclone#23 CSAVRandomclone#24 aa aa aa aa aa aa aa aa aa aa aa aa aa aa aa aa aa aa aa aa aa aa 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRSILSINAM-G-WYRQAPGKQRELVARISSGSS-THYADSVKGRFTISRHNANNTVYL-QMNNLKPEDTAVYYCATLRVVSLD-PWEY-----VYDY-T-GQGTQVTVSSAHHSEDPTASAAELQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEFSGSIFFYK-MG-WYRQAPG-KQRELVANISTTGRPY-YADAVKGRFTISKDSAKNTVH-LM-NSLKPEDTAVYYCNA--R-YLLT------Y-------W-GQGIQVTVSSEPKTPKPQSASAA XXQLVESGGGFVQPGGSLRLSCTASGSIFGIVPM-G-WYRQAPGKQRDLVAMFTANGS-EWYAASVKGRFTISRDNAKNTVYL-QMNSLKPEDTGVYYCARCAGHVCFDVMDR-----DD-D-W-GQGTEVTVSSAHHSEDPTASAAQLQLVESGGGLVQTGDSLRLSCVYSGLT-FSEYGIAWFRQAPG-KEREGVSGISSSDGSTFYPNSVKGRFTISRDNAENTV-YLQMNSLKPEDTAVYYCAAR-GFAGLG-YSAH-E---YP-YW-GPGTQVTVSSAHHSEDPTASAAQVQLVESGGGVVQPGESLRLSCAATGFTFDYKGIA-WFRQVPG-KEREGVSCLTIYDGKTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTVY-LQMNSLEPEDTAVYYCHAE-GPWPGVN-----Y-------W-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA ELQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGFIHDDTTIG-WFRQAPG-KEREGVSCIGRRDGSTDYADSVKGRFTISRDNAKKTIF-LEMSRLKPEDTAVYYCNEK-VTTGQG-MA---HRTGNY--W-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA 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hinge IgG3-Short hinge IgG2-Long hinge IgG3-Short hinge IgG2-Long hinge IgG2-Long hinge IgG3-Short hinge IgG3-Short hinge IgG3-Short hinge IgG3-Short hinge IgG2-Long hinge IgG2-Long hinge Clone #24 NAKYGLGYGDPYEYDY 16 IgG3-Short hinge 135 125 135 136 131 137 125 129 132 130 137 132 137 125 141 139 133 139 139 135 134 134 14 ライブラリーからのスクリーニング法 (パニング:1ラウンド2日) 非結合ファージ除去 溶出 洗浄 抗原 結合ファージの溶出 ライブラリー 抗原との反応 次のラウンドへ 大腸菌へ感染 ファージ産生 抗体遺伝子の単離 抗エボラウィルス抗体 4.5 2nd パニング後に得た単クローンファージを用いたELISA Absorbance(O.D.490) 4.0 所要期間:6日 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 A1 A3 A5 A7 A9 A11 B1 B3 B5 B7 B9 B11 C1 C3 C5 C7 C9 C11 D1 D3 D5 D7 D9 D11 E1 E3 E5 E7 E9 E11 F1 F3 F5 F7 F9 F11 G1 G3 G5 G7 G9 G11 H1 H3 H5 H7 H9 H11 0.0 Ebora GP1 coat EbolaEBoV GP1 protein coat Ebola virus (Sudan) Glycoprotein / GP1 (mucin domain deleted) protein (aa Met1-Asp320, His Tag) VHH遺伝子解析による独立したクローンの選択 PCR によるVHH遺伝子増幅 ↓ HhaI で消化 ↓ 2% アガロースゲル電気泳動 HhaI 認識配列 GCGC CGCG 16 抗インフルエンザ抗体 HA(H1N1)特異的VHHの作製 2nd パニング後に得た単クローンファージを用いたELISA Absorbance (O.D.490) 2.0 1.5 1.0 0.5 A1 A3 A5 B1 B3 B5 C1 C3 C5 D1 D3 D5 E1 E3 E5 F1 F3 F5 G1 G3 G5 H1 H3 H5 A7 A9 B8 C7 C9 D8 E7 E9 F8 G7 G9 H8 A10 A12 B11 C10 C12 D11 E10 E12 F11 G10 G12 H11 0.0 H1 protein coat Human serum albumin coat Clone #I : KD = 4.947e-9 M I II I II I Clone #II:KD = 1.525e-9 M II 100 nM VHH 25 kDa 20 kDa 大腸菌での発現精製 50 nM VHH 25 nM VHH 12.5nM VHH 固定化抗原:Recombinant HA (Sino Biological Inc.), 290.2 RU 17 抗インフルエンザ抗体 広範な亜型結合性抗体の作製 1st panning 2nd panning 3rd panning A H1N1 (A/California/04/2009 ) Hemagglutinin Protein A H5N1 (A/Indonesia/5/2005) Hemagglutinin Protein A H7N7 (A/Netherlands/219/2003) Hemagglutinin Protein ヘマグルチニン • 少なくとも16種類 (H1~H16) • 細胞表面のシアル酸に結合して感染 • エンドソームと融合してゲノムを細胞内に挿入 Absorbance (O.D.490) 6 5 4 3 2 1 0 H1-HA1-3 H1-E9 H1 coat H1/5-G9 H5 coat H1/5-2E4 H7 coat H1/7-2B3 H1/7-2D1 NP coat 18 熱耐性の高いVHH単離法 特殊な耐熱性スクリーンング方法を検証 組織特異的なトロポニンアイソフォームの心筋トロポニンIと心筋トロポニンTは 心筋梗塞などにおける心筋損傷のバイオマーカーとして知られる トロポニン I CT アクチン トロポミオシン 2nd パニング後に得た単クローンファージを用いたELISA 耐熱性スクリーニング法由来 通常スクリーニング由来 2.5 2.0 1.5 1.0 cTnI coat H9 H11 H7 G11 G9 G7 F9 F11 F7 E9 E11 E7 D9 D11 D7 C9 C11 C7 B9 cTnT coat B11 B7 A9 A11 A7 H5 H3 H1 G5 G3 F5 G1 F3 F1 E5 E3 E1 D5 D3 D1 C5 C3 B5 C1 B3 B1 A5 0.0 A3 0.5 A1 Absorbance(O.D.490) 3.0 19 耐熱性 抗トロポニンT抗体 赤:耐熱性スクリーニングにより得られたVHHクローン 青:通常スクリーニングにより得られたVHHクローン 緑:一本鎖抗体(scFv) VHH VH VL VHH 一本鎖抗体 (scFv) 120 % binding 100 50% inhibition temp. (℃) 80 VHH-H-A1 75 VHH-H-A5 >80 VHH-H-A6 >80 40 VHH-A10 62 20 VHH-A11 >80 VHH-B7 51 scFv-01 46 scFv-09 52 scFv-11 54 60 0 30 VHH-HA1 VHH-B7 40 50 60 70 Treated temperature (oC) VHH-HA5 scFv-01 VHH-HA6 scFv-09 VHH-A10 scFv-11 80 VHH-A11 20 まとめ 既存抗体製品 開発期間が長く高コスト ・ 生産コストが高い ・ 安定性が悪い 発表技術 • ラクダ科H鎖抗体可変部(VHH)を利用 安定性が高い(熱・変性剤・pH) • ライブラリー法による迅速、低コスト開発 1~2週間で従来法では得られない抗体を開発できる • 大腸菌などを使用した、低コスト・大量生産 21 企業への期待 治療用や疾患検査用などは勿論ですが、 バイオセンサーとして医療分野以外への導入を加速したい VHHライブラリー構築 鳥型インフルエンザ SARS、MERS デング熱など(感染症) がん関連分子 リウマチ・アルツハイマー アレルゲン 環境因子 ・・・・・・・・・・・・・・, etc. ≧2x1010の多様性 抗原準備(標的選択) 様々な標的抗原に対して スクリーニング 1~2週間で 安価に大量生産できる 発現精製 安定なVHHを取得可能 VHHの評価・標識 製品化 アイデア・要望・用途に応じて迅速に安定・安価なVHHが得られる 22 本技術に関する知的財産権 • • 多様性に富むVHHライブラリーを所有 様々なスクリーニング系を所有 取得抗体を個別に特許化する方針です 共同研究開発を希望 23 産学連携の経歴 • • • • • Panasonic株式会社 (株)抗体工学研究センター イノベックスサイエンス株式会社 プロテックス株式会社 大手医療機器メーカー 研究費 • 第一回JSTマッチングプランナープログラム • 沖縄科学技術イノベーションシステム構築事業 24 お問い合わせ先 琉球大学 研究推進機構 研究企画室 上席リサーチ・アドミニストレーター 殿 岡 裕 樹 〒903-0213 沖縄県中頭郡西原町千原1番地 TEL:098-895-8703 FAX:098-895-8837 E-mail: [email protected] 25
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