Compact Disk(CD)型細胞単離デバイスを用いた単一細胞の遺伝子検出 Detection of the gene in the isolated cells utilizing a CD-shaped device for single cell isolation 09D5604 古谷 俊介 指導教員 久保 いづみ SYNOPSIS Recently, gene analysis for single cells on the microfluidic devices has been of great interest. For single cell analysis, a technique of rapid isolation of single cell from a large number of cells is essential to analyze cellular function of single cell. In this study, we have developed a CD-shaped device to isolate single cell from a large number of cells simply and rapidly. The cells were distributed in microchambers according to a Poisson distribution. In order to realize PCR or RT-PCR on the device, the device was fabricated from silicon and glass not to evaporate the entrapped solution in the microchambers. Amplification of Salmonella specific invA gene form single cell was confirmed on the CD-shaped device at 200 cells/μl of Salmonella enterica after single cell isolation and PCR. The selective detection of S. enterica was achieved from a mixture of S. enterica and E. coli. For Jurkat cell, hot cell-direct RT-PCR was enabled by using Tth DNA Polymerase, which is a thermostable polymerase and has high reverse transcription activity. The RT-PCR conditions on the device were optimized. After cell isolation and successive hot cell-direct RT-PCR on the device, fluorescent signals from RT-PCR products for single cells were detected at 200 cells/μl of Jurkat cell or less. As RT-PCR for a lot of single cells was possible on a single device, this technique is expected to confirm different cell states for many single eukaryotic cells including iPS cells, embryonic stem cells as well as somatic cells, in the future. Keywords: isolation; single cell; compact disk (CD); PCR; hot cell-direct RT-PCR; Salmonella; invA; Jurkat cell 1. 緒言 そこで本研究では、多数の細胞を迅速かつ簡単に単離するた 細胞は生物を構成する基本単位であり、生物の生理現象を研 めに、マイクロポンプとマイクロバルブを用いずに、単純にデ 究する上で、単一細胞内における遺伝子の発現解析が必要とさ バイスを CD のように回転させるだけで、遠心力によって単一 れている。これらを単一細胞で解析するには、迅速かつ容易に 細胞分離を行える CD 型細胞単離デバイスの開発を行った[6]。 細胞を１つ１つに分離し、その遺伝子情報を検出する技術が重 また、このデバイスにより単離された細胞が持つ特異的な遺伝 要となる。 子、または発現遺伝子をそのまま CD 型細胞単離デバイス上で 近年、半導体技術の発達により、様々な微細加工技術が確立 されてきた。それに伴い、2000 年頃から微小空間内でその独自 PCR[7]または RT-PCR[8]し、簡単かつ迅速な単一細胞内の遺伝 子の検出方法を確立する事を目的として研究を行った。 の特性を生かして化学反応を行う、マイクロ流体デバイスを用 本論文は５章から構成されている。第１章は本研究の背景、 いた研究が注目を集めるようになってきた。マイクロ流体デバ 及び意義を述べた序論である。第２章ではマイクロポンプを使 イスとは一般的に微小な流路を持った超小型装置の事であり、 用せずに単一細胞分離を可能にする CD 型細胞単離デバイスの その利点は、装置自体のサイズが小さくなるだけでなく、それ 設計と疑似細胞としてビーズ粒子を用いた粒子の単一分離の評 に伴った使用溶液の少量化、反応時間の短縮等があげられる[1, 価について述べた。第３章では PCR によってサルモネラ菌の特 2]。微少量の溶液を扱える事から、単一細胞レベルでのハンド 異遺伝子である invA を増幅することで、CD 型細胞単離デバイ リングが比較的容易になり、このマイクロ流体デバイスを用い ス上で単一細胞からの遺伝子検出の方法を確立した。第４章で た単一細胞分離の方法が提案されている[3-5]。様々なアイデア はヒト急性白血病 T 細胞である Jurkat cell を用いて、細胞単離 で細胞懸濁液から単一細胞への分離方法が考えられている。し 後、ハウスキーピング遺伝子の glyceraldehyde-3-phosphate かし、単一細胞分離を目的とするマイクロ流体デバイスの多く dehydrogenase（GAPDH ）の発現を新たに考案した hot は、マイクロポンプと呼ばれる微少量の液体を送液する装置と cell-direct RT-PCR によって検出した。第５章では結論として本 溶液の制御を行うためのマイクロバルブが必要である。そのた 研究を要約した。本研究は１つのデバイス上で迅速かつ簡単に め、装置が大きく複雑になるので、１つのデバイス上で簡単に、 細胞の単離が行え、多数の単一細胞の遺伝子を同時に検出する 多数の細胞を単離し、その遺伝子を同時に検出するという報告 初めての試みである。 はない。 目的の DNA 鎖を増幅する方法として、PCR は遺伝子解析の 分野で不可欠な方法となっている。単一分離された多数の細胞 2. CD 型細胞単離デバイスの設計と評価 2-1. CD 型細胞単離デバイスの設計 中の特定の遺伝子を同時に PCR することが可能になれば、ど 迅速かつ簡便な単一細胞分離を実現するために、遠心力によ の細胞がその遺伝子を持っているかを確認する事ができる。ま って送液が可能な CD 型細胞単離デバイスを作製した。CD 型細 た RT-PCR で遺伝子の発現を調べる事で、個々の細胞での発現 胞単離デバイスの直径は約 10cm で、中心から外側にかけてジ 量の違いを厳密に解析することが可能となってくる。または細 グザグにマイクロ流路を設けてある。このマイクロ流路の円周 胞毎の遺伝子の発現活性の違いなども検出する事が可能となる 方向に対して多数のマイクロチャンバーを配置した。ディスク と考えられる。 の中心付近の inlet に粒子懸濁液 1μl を入れ、CD 型細胞単離デ 可能である（F Fig. 1（A） ） 。１ １枚の CD 型細胞 胞単離デバイス ス上に 24 本のマイク クロ流路があり、マイクロ流路 路の幅は 100μm で厚 さは 46μm、マ マイクロチャン ンバーのサイズは は 180μm×120 0μm× 46μm（横幅× ×縦×厚さ）で１ １流路に 530 個のマイクロチャ ャンバ ーが配置可能で である（Fig. 1（B） ） 。 顕 微 鏡 観 察 用 CD 型 細 胞 単 離 デ バ イ ス は 流 路 を Polydimethylssiloxane(PDMS S)で作製した。まず初めに、シリコ シ ン基板上にフォ ォトレジストを を使用して、フォ ォトリソグラフ フィに よって流路パ パターンの鋳型 型を作製した。この鋳型を用 用いて PDMS で CD 型細胞単離デバ バイスのマイクロ流路を転写し し作製 した。これをガ ガラス基板と張 張り合わせて顕微 微鏡観察用 CD 型細 胞単離デバイス スを作製した。 ( (A) 300 200 100 number of chambers 分離され、それ れに伴ってビー ーズや細胞等の粒 粒子を単離する る事が 400 number of chambers バイスを回転させる事で、粒 粒子懸濁液がマイ イクロチャンバ バーに 12 20 10 00 (B) 8 80 6 60 4 40 2 20 0 0 0 1 2 3 number off beads 0 1 2 3 4 5 6 7 8 number of beads Fig. 2 Relationsship between thee efficiency of celll isolation and the Poissonn distribution. Thee bars show distrib butions of numbers of 3 μm beads in m micro chamber, while w the curves show Poisson P distributioon. (A): 400 parrticles/μL. (B): 4000 particcles/μL. 以上の結果から、 以 離デバイスを用い いて、直径 3μm m CD 型細胞単離 及び び10μm のビーズ ズは、 3000rpm で で30 秒間回転さ させるだけで、 ポア アソン分布に従っ って簡単かつ迅 迅速に単一分離さ されることが確 確 (A) 認さ された。 parrticle 3. サルモネラ菌 菌のシングルセ セル PCR CD 型細胞単離デ デバイスで粒子 子の単一分離が可 可能な事が確認 認 でき きたので、そのま まま分離されたチ チャンバー内で で PCR によって て (B) 細胞 胞の持つ特異遺伝 伝子を増幅し、サイクリングプ プローブ法によ よ り検 検出が可能か検討 討した。シングル グルセル PCR のモデルとして、 の 食中 中毒の原因菌の一 一種のサルモネ ネラ菌を分離し、 、その特異遺伝 伝 子で である invA を検 検出した。 Fig. 1 (A)): Design of a CD D-shaped device and a the scheme of the sinngle cell isolationn. (B): Details off microchamber and microochannel of CD-shhaped device. 細胞の単離後、直 細 直接 PCR を行う際には、PDM MS 製の CD 型 細胞 胞単離デバイスで では PDMS が気 気体透過性であるため、熱によ よ って て分離された溶液 液が蒸発してし しまう。そこで、 、シリコン基板 板 に反 反応性イオンエッ ッチング（Deep p-RIE）により作 作製した流路を を 2-2. 粒子の分 分離評価 ガラ ラス基板と陽極接 接合によって張 張り合わせて、PCR 用の CD 型 マイクロ流路 路に溶液が流れ れていく際に、懸 懸濁させた粒子 子がチ 細胞 胞単離デバイスを を作製した。このシリコン製の の CD 型細胞単 単 ャンバー内に確 確率的に分離す すると言う分離の の原理から、CD 型細 離デ デバイスを以後、PCR 用 CD 型 型細胞単離デバイ イスとする。流 流 胞単離デバイス ス上での粒子の の分離効率は、懸 懸濁液の単位体 体積当 路の の形状は前述の顕 顕微鏡観察用 C CD 型細胞単離デ デバイスとほぼ ぼ たりの粒子の存 存在確率を示す すポアソン分布に に依存すると考 考えら 同じ じで、マイクロ流 流路の幅は 100μ μm で厚さは 40 0μm、チャンバ バ れる。このポア アソン分布では は１つのチャンバ バーに入る粒子 子の数 ーサ サイズは 300μm m×200μm×40μm m（横幅×縦×厚 厚さ）とし、１ を k とした場合 合に以下に示す す式（1）のようになる。 流路 路に 313 個のマイ イクロチャンバ バーを配置した。 P( N = k ) = −m e m k! k （1） この こ PCR 用 CD D 型細胞単離デバ バイスの inlet に PCR 試薬と サル ルモネラ菌の混合 合溶液を 1μl 入 入れ、5000rpm で 30 秒間回転 転 この式で、m は各チャンバー ーに入る粒子数の平均値、つま まり、 させ せる事によって細 細胞単離を行った。その後、連続 続的に thermall チャンバー１つ つあたりの粒子 子数の平均的な存 存在割合を示す。 。 cycler を用いて 95℃ ℃で 2 分の溶菌 菌、続けて 95℃で で 5 秒、55℃で で そこで、原核 核生物の疑似細 細胞として、直径 径 3μm のビーズ ズ粒子 10 秒、 秒 72℃で 10 秒のサイクルで反 秒 反応させる事に によって PCR を を用いて検討を を行った。溶液の の送液にはスピ ピンコータ―を用 用いて、 行い い、サルモネラ菌 菌固有遺伝子で である invA 遺伝 伝子を増幅した。 3000rpm で 30 3 秒間回転させ せる事で、遠心力 力によって送液 液し、 PCR による増幅 幅産物の蛍光検出 出には、プローブ ブの DNA 鎖の の ビーズ粒子の の分離を行った。 。ビーズ粒子の の濃度を 40～4000 間に に RNA を挟み み込んだキメラプ プローブを用いる るサイクリング グ particles/μl で検討を行った結 で 結果、Fig. 2 に示 示すように、ビ ビーズ プロ ローブ法を使用し した。増幅産物 物ができる前は、 、キメラプロー ー 粒子の分離効率 率はどの濃度で でもポアソン分布 布にほぼ一致す する事 ブは はクエンチャー ーと結合している るために蛍光を を発しないが、 が確認された。 。 PCR R によって生成 成された増幅産物 物と結合すると、 、 RNase H によ よ また、直径 10μm のビーズ ズも単一分離が可 可能か確認した たとこ って てプローブが切断 断され、 蛍光を発 発するようになる(Fig. 3)。 PCR R ろ、直径 3μm m のビーズと同様 様に、ポアソン分 分布に従って分 分離さ 後、イメージングア アナライザーを を用いてチャンバ バーの蛍光強度 度 れる事が確認さ された。 確認する事で増幅 幅産物の検出を行 行った。 を確 invA A 遺伝子が増幅 幅され蛍光強度が が増加したもの のと考えられた。 蛍光 光強度の分布は 400 4 cells/μl では は、蛍光強度の４つグループが が あり り、蛍光強度は invA i 遺伝子の初 初期濃度に依存す する事から、そ れぞ ぞれサルモネラ菌 菌が 0、1、2、3 3 個ずつ入ってい いたと考えられ れ Fig. 3 Im mage of fluorescennt detection by cyycling probe. る。同様に 200 cellls/μl では、蛍光 光強度の３つのグ グループが確認 認 され れ、それぞれサル ルモネラ菌が 0、 、1、2 個入って ていたと考えら ら 始めに、ポジ ジティブコントロールを使用し して、CD 型細胞 胞単離 れる る。さらに、200 0 cells/μl の場合 合では 400 cellss/μl の場合に見 見 デバイス上での の PCR の検討と最適な PCR サイクル数の検 サ 検討を られ れた、0 個と 1 個の間の分布の重 個 重なりが見られ れなかったので、 行った。その結 結果、20 サイク クルまでは蛍光強 強度があまり増 増加し 200 cells/μl 以下の の濃度ではサルモ モネラ菌の入って ていないチャン ン ないが、20～4 40 サイクルで一 一気に蛍光強度が増加する事が が確認 バー ーと１つ入ってい いたチャンバー ーとの区別が可能 能であった。以 以 された。そこで で、本研究では は、40 サイクル終 終了後の蛍光強 強度を 上の の事から、 PCR 用 CD 型細胞単離 離デバイス上で で、 細胞単離後、 測定することに にした。 その のままシングルセ セル PCR が可能 能であることが確認された。 一般的なPC CR ではあらかじ じめ細胞から抽 抽出したDNA を試料 を また、大腸菌とサ ま サルモネラ菌の の間で選択性の検 検討を行った。 として加えて PCR を行う。しかし、 し 簡単かつ つ迅速にシング グルセ 大腸 腸菌のみを200 cells/μl c の濃度で でPCR 試薬中に に加えたものと、 ル PCR を行う うには、細胞から直接 PCR を行 行えると良い。そこ 大腸 腸菌とサルモネラ ラ菌を 100 cellss/μl ずつ PCR 試薬に加えたも 試 も で、 CD 型細胞 胞単離デバイス上 上でシングルセル ル PCR を行う前 前に、 のを を CD 型細胞単離 離デバイス上で で分離し、PCR による検出を行 に 行 PCR 試薬中に にサルモネラ菌 菌体を加え、サル ルモネラ菌から ら直接 った た。その結果、大 大腸菌のみのも ものでは蛍光強度 度の増加したチ チ invA 遺伝子の の PCR が可能で であるかを確認し した。その結果、PCR ャン ンバーは確認され れず、サルモネ ネラ菌と大腸菌を を混ぜたもので で による DNA の増幅とサイク クリングプローブ ブ法による蛍光 光強度 はサ サルモネラ菌の入 入ったと思われ れる数だけ蛍光強 強度が増加した た の増加の両方を を確認する事が ができた。 チャ ャンバーが確認さ された。この結果 結果から、PCR 用 CD 型細胞単 単 次に、サルモ モネラ菌を 400 0 cells/μl 及び 200 cells/μl の濃 濃度で PCR 試薬中に に懸濁し、 PCR 用 CD 型細胞単離 離デバイス上で で細胞 離デ デバイス上でPC CRにより特定の の菌だけを検出で できる可能性が が 示唆 唆された。 単離後、そのま ままシングルセ セル PCR を行っ った。PCR 後、マイ クロチャンバー ーの蛍光強度を を測定し、それぞ ぞれの蛍光強度 度ごと Number of microchambers にヒストグラム ムにまとめたも ものが Fig. 4 であ ある。 PCR 用 CD 型細 細胞単離デバイス ス上でシングル ルセル PCR によ よ る単 単一細胞内の遺 遺伝子の検出が が可能であった たので、次に、 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 (A) 0 cells 1 cell 2 cells 3 cells RT-P PCR により単 単一細胞の発現遺 遺伝子の検出が可 可能かを検討し し た。シングルセル RT-PCR R のモデ デルとして、ヒト急性白血病 T 胞である Jurka at cell を用いて てハウスキーピ ピング遺伝子の の 細胞 GAP PDH をターゲッ ットとして研究 究を行った。 PCR 用CD 型細胞 胞単離デバイス ス上でシングルセ セルRT-PCR を 0 00 500 600 700 800 900 100 00 1000 200 300 40 Class of flu uorescent intensiity (A.U.) Number of microchambers 4. Jurkat cell のシングルセ セル RT-PCR 行う うために、RT-PC CR 試薬中に Ju urkat cell を懸濁 濁し、細胞から ら 直接 接、 熱サイクルの のみでRT-PCRを を行う、 hot cell--direct RT-PCR R を考 考案した。一般的 的な逆転写酵素 素を用いた場合は は、１チューブ ブ 30 25 (B) 20 15 0 cells 1 cell 2 cells 内で で熱による細胞溶 溶解と逆転写を を行おうとすると と、逆転写酵素 素 が細 細胞溶解時の熱に によって失活し してしまうために に逆転写できな な い。本研究では、逆 逆転写活性を持 持つ耐熱性ポリメ メラーゼである る 10 Tth DNA polymeerase を用いる る事で１チュー ーブ内での hott 5 cell--direct RT-PCR R を可能とし、蛍 蛍光プローブを用 用いてその増幅 幅 0 産物 物を検出する事が が可能であった。 。 0 00 500 600 70 00 800 900 10 000 1000 200 300 40 Class off fluorescent inteensity (A.U.) Fig. 4 Hisstograms of fluorrescence intensitiies for different densities of o S. enterica. Thee density of S. ennterica was: (A) 400 cells/μ μL, (B) 200 cells//μL. The white, gray, g black, and striped barrs indicate 0, 1, 2,, and 3 cells, respeectively. 蛍光検出のための 蛍 のプローブには はダブルダイプロ ローブを用いた た。 この のプローブはその のままではクエ エンチャーによっ って消光してい い るが が、増幅産物に結 結合し、ポリメラーゼの 5’ヌク クレアーゼ活性 性 によ よって分解され、蛍光を発するようになる（F Fig. 5） 。 菌を含まないネ ネガティブコントロールの蛍光 光強度 サルモネラ菌 が PCR 用 CD D 型細胞単離デバ バイス上で 350 0 以下なので、 蛍 蛍光強 度が 350 を超 超えたものはサル ルモネラ菌が入 入り、PCR によ よって ye probe. Fig. 5 Image off fluorescent detecction by double dy Jurkat cell のシングルセル ル RT-PCR にもサ サルモネラ菌の のシン で 95％以上が単一 9 一細胞である事か から、 200 cells/μl 以下の濃度で で グルセル PCR R に用いたのと同 同様の PCR 用 CD 型細胞単離 離デバ は、蛍光強度の増加 加しているチャンバーの 95％ ％以上が Jurkatt イスを用いた。 。この PCR 用 CD 型細胞単離 離デバイスの inllet に cell の GAPDH 遺伝 伝子に対してシ シングルセル RT T-PCR が可能で で RT-PCR 試薬と Jurkat cell の混合溶液を の 1μ μl 入れ、 5000rp pm で あっ った結果だと考え えられる。 30 秒間回転さ させる事によって て細胞単離を行った。その後、連続 を増幅し、イメ メージングアナ ナライザーで蛍光 光強度を確認した た。 本研究ではま まず、CD 型細胞 胞単離デバイス ス上での PCR サイク サ ル時のアニール ル温度、PCR の熱サイクルの の時間を最適化 化し、 PCR サイクル ル毎の蛍光強度の の増加を確認した た。 50℃から 60 0℃の アニーリング温 温度で検討した たところ、54℃で で最も高い蛍光 光強度 を示す事が確認 認された。また た、PCR の熱サ サイクルの時間は は 10 秒から 30 秒で で行ったところ、 、 20 秒で最も高い い蛍光強度を示 示し、 の蛍光強度とほ ほぼ同等の値を を示した。そこで で、PCR は 94 4℃で 2… 10 50 0 N… 100 200 300 400 500 600 700 U.) Class of fluorescentt intensity (A.U different denssities of Jurkat ccells. The conceentrations of Jurkat cellss were 400, 2000, 100, 50, 10 ceells/μL. PCR サイクル ルによる蛍光強度 度の増加を測定したところ、蛍 蛍光強 度は 20 サイク クル目から上がり始め、30～40 サイクルで急 急激に クル数は 40 サイクルで行うこ サ こととした。 20 Fig. 7 Histo ograms of fluuorescent inten nsity for 20秒、 54℃で2 20秒、 72℃で20 0秒の熱サイクル ルで行うことに にし、 究では、確実に に細胞からの増幅 幅産物を検出す するために PCR R サイ 30 0 その時の蛍光強 強度はチューブ ブ内で行ったhott cell-direct RT--PCR 増加し、40 サイクルで飽和す サ する事が確認され れた。よって、本研 40 Density of cells (cells/μl) （42℃15 分） 、 PCR を行い、 J Jurkat cell 中の の GAPDH の mR RNA Number of microchambers 的に thermall cycler を用い いて細胞溶解（9 95℃10 分） 、逆 逆転写 5. 結論 マイクロポンプを マ を使用せず、簡 簡単かつ迅速に単 単一細胞分離を を 実現 現するために、C CD 型細胞単離 離デバイスを設計 計・作製した。 シングルセル ル RT-PCR を実 実現するために、 、Jurkat cell が CD CD 型細胞単離デバ バイスでは粒子径 径 1μm 程度の原 原核生物と粒子 子 型細胞単離デバ バイス上で単一 一細胞分離可能か か調べたところ、 、400 径 10～20μm 1 程度 度の真核生物の細 細胞のどちらも単 単一細胞分離す す ～10 cells/μl の濃度でポアソ ソン分布に従って て分離される事 事が確 るこ ことが可能だった た。原核生物の のサルモネラ菌に に対して、PCR R 認された（Fig g. 6） 。 用 CD C 型細胞単離 離デバイスを用い いて、単一細胞分 分離後、サルモ モ ネラ ラ菌特異遺伝子で である invA 遺伝 伝子を PCR によ より増幅し、サ サ イク クリングプローブ ブ法によって検 検出する事が可能 能であった。ま ま た、シングルセル PCR P に関して、大腸菌とサルモ モネラ菌との間 間 Jurka kat cell Fig. 6 Thee Jurkat cell was isolated i by CD-shhaped device at 5000 rpm m. Bar, 100 μm. で選 選択性を確認する る事に成功した た。さらに、逆転 転写活性を持つ つ Tth DNA polymera ase を使用する事で、１つのチ チューブ中で hott cell--direct RT-PCR R によって、J Jurkat cell 中の の GAPDH の mRN NA を増幅する る事に成功した。Jurkat cell を PCR 用 CD 型 細胞 胞単離デバイスで で単離後、そのま まま hot cell-dirrect RT-PCR の 次に、Jurkat cell を 10～4 400 cells/μl の濃 濃度で RT-PCR R 試薬 熱サ サイクルをかける ることによって、シングルセル ル RT-PCR に成 成 中に懸濁し、P PCR 用 CD 型細胞単離デバイ 型 イス上で細胞単離 離後、 功し した。この PCR R 用 CD 型細胞単 単離デバイスを を用いることで、 そのまま hott cell-direct RT T-PCR を行う事でシングル ルセル 簡単 単かつ迅速に細胞 胞単離を行う事 事ができ、多数の の細胞に対して て RT-PCR を行っ った。Hot cell-d direct RT-PCR 後、マイクロチ チャン 同時 時に RT-PCR を行えるので、iP を PS 細胞や幹細胞 胞を含む様々な な バーの蛍光強度 度を測定し、そ それぞれの細胞濃 濃度ごとにヒス ストグ 細胞 胞の状態を調べる る技術への、今後 今後更なる応用が が期待できる。 ラムにまとめた たものが Fig. 7 である。 ＿＿ ＿＿＿＿＿＿＿＿ ＿＿＿＿＿＿＿＿ ＿＿＿＿＿＿＿＿ ＿＿＿＿＿＿＿ 蛍光強度は 150 付近と 500 0 付近に二つの分 分布が確認され れた。 引用 用文献 Jurkat cell が入 入っていないネ ネガティブコントロール（NC）では [1] G. M. Whitesiddes, Nature, 442; 368-373 (2006) 蛍光強度が 35 50 以下を示すこ ことから、蛍光強 強度 350 以上の のもの [2] P. S. Dittrich ett al., Anal Chem., 78; 3887-3908 (2 2006) は Jurkat cell が入っており、GAPDH の mRNA m を RT-PC CR に [3] a Anal Chem., 778; 4925-4930 (2 2006) D. D. Carlo et al., きたものと考え えられる。また、 、蛍光強度の増 増加し よって検出でき [4] W-H. Tan et al.., Lab Chip., 8; 2559-266 (2008) ているチャンバ バーの数はポア アソン分布から計算される Ju urkat [5] M. Hosokawa et al., Anal Chem m., 83; 3648-3654 4 (2011) cell の入ってい いるチャンバー数 数とほぼ一致し し、 相関係数は0.9866 [6] S. Furutani et al., a Sensor Lett., 66; 961-965 (2008)) となった。 [7] S. Furutani et al., a Anal. Bioanal. Chem., 398; 299 97-3004 (2010) [8] S. Furutani et al., a Analyst., acceppted. さらに、200 0 cells/μl の濃度 度では細胞の入っているチャン ンバー
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