パーキンソン病細胞モデル研究 GeneArt® Precision TALsテクノロジーを用いた、 パーキンソン病患者ドナー由来iPSC株のゲノム編集 part 3 目次 3 研究概要 パーキンソン病とは 3 共同研究概要 4 5 手法 GeneArt® Precision TALsテクノロジー概要 5 iPSCにおけるゲノム編集のワークフロー 6 iPSCコロニーのスクリーニング法 8 GeneArt® Genomic Cleavage Detectionアッセイ ® TaqMan SNP Genotyping Assay ™ Ion PGM シーケンシング オフターゲット編集を検出するための エクソームシーケンシング 結果 8 9 10 12 13 MSA細胞株からα-シヌクレインノックアウト株の作製 13 編集されたMSA株におけるオフターゲット編集の スクリーニング 19 PD-3株におけるLRRK2 G2019S変異の修正 20 PD-3株におけるGBA N370S変異の修正 22 まとめ、結論、および今後の展開 24 参考文献 25 製品情報 26 さらに詳しい情報については、 当社ウェブサイト www.lifetechnologies.com/parkinsonsをご覧ください。 研究概要 パーキンソン病とは ドーパミン系 パーキンソン病（PD）は進行性の神経変性疾患であり、60 歳を超える人口 の 1% 、また全世界で 5 百万人 以 上が 罹 患しています [1] 。PD は主に黒 質の 前頭葉 線条体 ドーパミン作動性ニューロンが選択的に喪失することによって起こる病気 黒質 です。黒質ドーパミン作動性ニューロンの喪失により、まず動作障害がおこ りますが、進行すると認知機能にも影響を及ぼし、後期には多くの場合認 知症を伴います。PDには適切な細胞モデルがなく、これが PD 研究の大きな ボトルネックになっています。疾患メカニズムおよび薬剤標的を発見するた め、また治療法を突き止め、かつ開発するための新規モデルが緊急に必要 とされています。このようなニーズへ対応するものとして、疾患に罹患したド ナー由来の組織が、in vitro の疾患モデル構築へ向けた強力なツールとなっ ています。 腹側被蓋野 E s s e n t i a l 8 ™ M e d i u m で ビト ロ ネ ク チ ン上 に て フィーダーフリー培 養した人 工多能性幹 細胞（ iPSC） に対し、PSC 4-MarkerImmunocytochemistry Kitを 用 いて 核 DN A（青 色）および 多 能 性 マーカー SSE A 4 （緑色）とOCT4（赤色）の染色を行いました。 Life Technologies™ | lifetechnologies.com/parkinsons 3 培養 エンジニアリング 分化 キャラクタリゼーション 共同研究概要 2012 年、私 たちはカリフォルニア州 サニー ベール のパーキンソン研 究 所 と提 携し、同研究所で採 取した患者皮 膚生検由来の線 維 芽 細胞を用いた PD モ デルシステムの 開 発 を 行ってきました 。そして、これらの 線 維 芽 細 胞から、完全にキャラクタリゼーションされた人工多能性幹細胞（iPSC） を樹立しました。この iPSC から神 経 幹 細 胞（ NSC）の 作成 およびキャラ クタリゼーションを行いました。また、これらの NSC はドーパミン作 動 性 ニューロン、アストロサイト、またはグリアへ分 化可能 なことを 示しまし た。私たちは、これらの NSC を用い、PD に関連したフェノタイプを観察で きる一連の細胞アッセイを開発しました。本研究シリーズの 3 番目として、 ® GeneArt Precision TALs テクノロジー [2] を用い、一連の細胞株において 行った疾 患関連 遺伝 子 の改 変を行いました。ここで得られた 細 胞株によ り、PD 関連遺伝子における特定の変異について、疾患フェノタイプへの関 連を調べられるようになります。 α-シヌクレインのレベルが疾患に関連するフェノタイプに及ぼす影響につ いて調べるため、先ず、α-シヌクレインをコードする遺伝子、SNCA の 1コ ピーまたは両コピーを欠失（ノックアウト）した細胞株を、iPSC から作成し ました。iPSC は多系統萎縮症（MSA ）を患う62 歳の女性ドナーから樹立し たものです。MSA はパーキンソン病様疾患であり、既知の遺伝的危険因子 はなく、レビー小体と呼ばれるα-シヌクレインの蓄積が顕著であるという ® 特徴を持ちます[3]。GeneArt Precision TALsテクノロジーを利用し、非相 同末端結合（non-homologous end joining：NHEJ）修復メカニズムにより SNCA 遺伝子をノックアウトしました。その結果、2 種の細胞株が得られ、こ れにより患者由来 iPSCから分化した細胞が示すPD関連フェノタイプにおけ るα-シヌクレイン蓄積の関連を研究できるようになりました。 4 Life Technologies™ | Parkinson’s cell models LRRK2 G2019S および GBA N370S の変異が及ぼす影響を明らかにするた め、重 度の PD 症状を伴う61歳の男性ドナーから、両方の変異を持つ iPSC 株を樹立し、各変 異を 修正して野 生 型に戻す研究を行いました。LRRK 2 （leucine-rich repeat kinase 2）は大きなマルチドメインタンパク質であ り、GTPアーゼおよびキナーゼドメインを持つ触媒コアに、タンパク質-タン パク質相互作用ドメインが隣接しています。パーキンソン病におけるLRRK2 遺伝子の役割ははっきりとは解明されていませんが、LRRK2におけるいく つかの変異は PDに関連しており、最も高頻度に見られる変異は G2019S と されています[4]。GBA 遺伝子はグルコセレブロシダーゼをコードしており、 このタンパク質は正常なリソソーム機能に関わっています。GBA 遺伝子に N370S などの変異があると、グルコセレブロシダーゼの酵素活性が大幅に 低下または消失し、結果として有害なレベルのグルコセレブロシドおよび 関連物質が細胞内に蓄積されます。そして、組織および臓器の障害へとつ ながります。GBA における変異はパーキンソン病と関連しており、変異があ ® ると発症する確率が 5 倍になります [5] 。GeneArt Precision TALsテクノロ ジーを使用し、相同組換え修復（homology-directed repair：HDR）を介し た遺伝子編集によりLRRK2 および GBA 遺伝子のヘテロ接合変異をホモ接 合野生型に戻しました。親株および編集したiPSC 株から分化させた細胞を 用いて今後フェノタイプ研究を行う予定です。 手法 ® GeneArt Precision TALsテクノロジー概要 Transcription activator–like（ TAL ）エフェクタータンパク質は、植物病原 菌由来のタンパク質であり、植物への感染時には特定のDNA 配列へ結合し 転写調節因子として働きます（図1A ）。TAL の DNA 結合ドメインは、長さが 様々なアミノ酸リピートを持ち、各リピート内では、2 つのアミノ酸によって ターゲットDNA のどのヌクレオチドに結合するかが決まります。モジュール ドメイン構造を有し、またアミノ酸 -ヌクレオチド間の“結合のコード”が明 らかにされているため、様々な機能ドメインに結合したTALを含有する融合 タンパク質は、ゲノム上のローカスを非常に特異的にターゲットすることが ® ここでご紹介するゲノム編集のプロセスでは、truncated FokIヌクレアーゼ に融合したTALを使用しています（図1B）。FokIヌクレアーゼはホモダイマー として機能し、TAL 結合部位に挟まれた DNA において二重鎖切断を引き起 こします。切断部位を含む領域と相同な DNA が存在しない場合、細胞にも ともと備わっている機構が NHEJにより切断部位を修復しようとし、その結 果インデルと呼ばれる短い挿入または欠失が起こります。タンパク質コード 領域にこのようなインデルがあるとフレームシフト変異を起こし遺伝子破壊 （ノックアウト）に至ります。また切断部位を含む領域と相同なDNA が存在 できます。このアプローチを利用した GeneArt Precision TALs は、ヌクレ する状況下で二重鎖が切断されるとHDR が起こり、添加した DNA が切断部 アーゼ、アクチベーター、リプレッサー、クロマチン修飾因子、ゲノム標識、お 位に組み込まれます。このようにして、特定の塩基または配列を導入するこ よび架橋結合分子を部位特異的にデリバリーできます。 とができます。 B DNA 結合ドメイン 機能ドメイン FokI A 転写物 菌細胞 FokI TAL エフェクター 核 相同DNAを添加していない場合： 相同DNAを添加した場合： インデルを伴う非相同末端結合 修復 → 遺伝子破壊（ノックアウト） 相同組換え修復（HDR）による DNAの 挿入／置換 → 遺伝子編集 GeneArt® Precision TALsに関するさらに詳しい情報は、www.lifetechnologies.com/talsをご覧ください。 図1. GeneArt® Precision TALsテクノロジー。 （A）TAL エフェクタータンパク質は病原性細菌由来のタンパク質であり、植物への感染時には特定のDNA 配列に結合し転写調節因子 として働きます。 （B）TAL-FokIヌクレアーゼ融合体はホモダイマーとして働きDNAを切断します。1対のTAL-FokIがゲノム配列のターゲット部位をはさんで結合するよう設計されてお り、目的のローカスに二重鎖切断を起こします。この切断部位が NHEJによって修復されインデルが導入された場合、遺伝子のノックアウトが起こります。相同配列を持つドナーDNA の存在下では、HDR（相同組換え修復）によって切断が修復され、ゲノムに特定の遺伝子を導入することができます。 Life Technologies™ | lifetechnologies.com/parkinsons 5 iPSCにおけるゲノム編集のワークフロー 本研究のために開発した iPSC 編集のワークフローを図 2A に示します。ま ワークフローのこの部分は、編集された細胞の同定およびクローナルな集 ず、フィーダーフリー iPSCに、ドナー DNA の PCRフラグメント存在下または 団の単離を行うために非常に重要です。リカバリーしたコロニーのほとんど ® 非存在下で、GeneArt Precision TAL-FokIコンストラクトをエレクトロポ は、編集された細胞および編集されていない細胞が混ざった集団であるた レーションしました。エレクトロポレーションの後、リカバリーのため直ち め、コロニースクリーニングのステップを複数回行い、編集された細胞のク ® に細胞をマウス胎 仔線 維芽細胞（MEF ）上または Geltrex マトリックスで ローナルな集団を単離する必要があります。 コートしたディッシュにプレーティングしました。リカバリー後のコロニーを ピックアップし、編集が起こったものをスクリーニングしました。目的の編 集が起こった細胞の均一かつクローナルな集団を得るためにサブクローニ ングを行った後、単離したクローンをさらに増殖させ、多能性およびゲノム 完全性に関するキャラクタリゼーションを行いました。図2Bにはコロニース クリーニングのワークフローおよびターゲットゲノム部位の解析における重 要な第一段階を詳しく示しています。 A iPSCの培養 • iPSCを Geltrex® マトリックスでコート したディッシュ上、 Essential 8 ™ Medium 中で培養 • StemPro ® Accutase ® Cell Dissociation Reagentで細胞を解離 1∼2週間 2∼3週間 4∼6週間 エレクトロポレーション およびリカバリー コロニーの スクリーニング クローンの増殖 および キャラクタリゼーション • Neon ®トランスフェク ションシステムを使用し、 iPSCにGeneArt® Precision TALsおよび ドナーPCRフラグメント をエレクトロポレー ション Electroporation/ Recovery MEF • リカバリーのため、 上またはGeltrex® マトリックスでコート したディッシュに細胞を プレーティング 6 Life Technologies™ | Parkinson’s cell models • EVOS ® XL Imaging Systemを使用して コロニーをピックアップ • GeneArt® Genomic Cleavage Detection ® Kit、TaqMan SNP Colony Genotyping Assay、 Screening または Ion PGM ™ シー ケンサの結果により コロニーをスクリーニ ング • MEF上でKnockOut™ iPSC 培地を使用して、 またはGeltrex®マトリッ クス上でEssential 8 ™ Clone Medium を使用して Expansion/ クローンを増殖 •Characterization 多能性マーカー抗体、 TaqMan ® hPSC ScoreCard ™ Panel、 および EVOS ® FLoid ® セルイメージングステー ションを使用しクローン をキャラクタリゼーション 手法 B 解析のサブワークフロー StemPro ® Accutase ® による 処理でiPSCをはがし、 TAL-FokIペアを導入します 解析用の細胞を採取 します 十分に分離したコロニーを 得るため低密度で細胞を プレーティングします ゲノムDNAを抽出し ます 第1ラウンドのPCR 増幅を行います 1∼2 週間コロニーを増やし、 ピペットを用いてコロニーを 採取します 第2ラウンドのネス テッドPCR 増幅を 行います 各コロニーの半量を解析の ために残し、半量を増殖させます TaqMan ® SNP Analysis ジェノタイピング Expansion + 編集が起こった細胞を含む コロニーを、Accutase ® 試薬を 用いて解離し、低密度でプレー ティングして、スクリーニング の作業を繰り返しクローナルな集 団を単離します ® GeneArt® Genomic Cleavage Detection Ion PGM™ シーケンシング ™ 図2. iPSCにおけるゲノム編集のワークフロー。 （ A）Geltrex マトリックスコートプレート上で Essential 8 Medium 中にて培養したフィーダーフリーiPSCを thiazovivinで処理した後、 ® ® ® StemPro Accutase Cell Dissociation Reagentにより解離しました。解離させた細胞に、Neon トランスフェクションシステムを用いて TAL コンストラクトをドナー DNA 有りまた ® は無しでエレクトロポレーションしました。リカバリーのためMEF上またはGeltrex マトリックスでコートしたプレート上に低密度でプレーティングしました。1∼2 週間後、コロニーを ® ® ™ ピックアップしてスクリーニングを行い、GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit、TaqMan SNP Genotyping Assay、またはIon PGM シーケンサの結果に基づいてセレクショ （B）コロニースクリーニングのワークフロー。手作業 ンしました。最終的に得られたクローンを増やし、キャラクタリゼーションを行って多能性およびゲノム完全性を確認しました。 ® でコロニーを1/2に分割し、細胞の半量を解析し、残りの半量は解析が終了するまで培養を行いました。GeneArt Genomic Cleavage Detectionおよび PGMアッセイによりターゲッ ト部位における変化を確認するのに必要な感度を得るため、ゲノムDNA のPCR 増幅を行いました。得られた産物をここに示した3 種類のスクリーニング手法によって解析しました。な ® お、TaqMan SNP Genotypingアッセイは他のアッセイと異なりPCRを不要とする感度を有しています。 Life Technologies™ | lifetechnologies.com/parkinsons 7 iPSCコロニーのスクリーニング法 GeneArt® Genomic Cleavage Detectionアッセイ インデル ® ® GeneArt Genomic Cleavage Detection Kitを使用し、GeneArt Precision TALs ペアによって作成されたインデルの検出、または目的のローカスへ野 1 PCR増幅（精製なし） 生型の配列を導入したことによる変異配列の“修復”の検出を行いました。 図 3に本アッセイを模式的に示しています。本手法は、ヘテロ接合変異を形 成する導入変異を高感度に検出します。しかしながら、ヘテロ接合アレルか らホモ接合アレルへのわずかな配列変化の検出は難しい場合があります。 コロニー中に編集が起こった細胞が少数しかない場合は検出が極めて困難 ミスマッチ 2 変性および再アニーリング 3 ミスマッチの切断 4 アガロースゲル電気泳動と検出 になります。 ® 図 3. GeneArt Genomic Cleavage Detectionアッセイ。特定のDNA 配列におけるインデ ルまたは変異を検出するため、まず該当する領域を特異的なプライマーを用いて増幅し ます。2回目の nested PCRにより感度を向上させることができます。サンプルを加熱して PCR 産物を再アニーリングさせた後、インデルまたはその他の配列の変化を有するアン プリコンと配列の変化をもたないアンプリコンはヘテロ二重鎖を形成します。これらのヘ テロ二重鎖を、特定のエンドヌクレアーゼで処理すると、ミスマッチのあるDNA が切断さ れます。最終的に長さの異なるDNA 断片が 2 種類生じ、アガロースゲル電気泳動によって 変異を検出することができます。 8 Life Technologies™ | Parkinson’s cell models 手法 ® TaqMan SNP Genotyping Assay TaqMan® SNP Genotyping Assay は、ゲノムDNAを用いた1塩基多型 （SNP）ジェノタイピング解析を迅速かつシンプルに行う手法です。 A ® ワークフロー の 模 式図を図 4A に示します。2 種 類の TaqMan 蛍 光レポー ター プローブを使用し、アレルを識別します（図4B）。 B ® TaqMan Genotyping Assayの TaqMan®プローブの選択的なアニーリングにより アレル識別が可能になります 設計／購入 マスターミックス、アッセイ試薬、 およびサンプルを96ウェルプレート に注入します アレル識別プロット リアルタイムPCRを行います ® ™ TaqMan Genotyper Software を用いて解析を行います アレル2の相対的蛍光シグナル V F V アレル2 のホモ接合体 F ヘテロ接合体 V V F F テンプレート無しのコントロール アレル1のホモ接合体 アレル1の相対的蛍光シグナル ® ® ® 図4. TaqMan SNP Genotyping Assay。 （A）TaqMan SNP Genotyping Assay のワークフロー。TaqMan SNP Genotypingアッセイ、および TALによる編集のターゲット領域を含む ® ® ™ 400bp のアンプリコンを用い、QuantStudio 12K FlexリアルタイムPCRシステムによってジェノタイピングを行いました。結果の解析は TaqMan Genotyper Softwareで行いまし ® た。 （B）TaqMan SNP Genotyping Assay テクノロジー。2 種類の SNPアレルの識別（またはアレル識別）は、それぞれ1種類のアレルに特異的で、異なる蛍光リポータ―を持つ、2 種 ® 類のTaqMan プローブの選択的なアニーリングにより可能になります。PCR 増幅の際、プローブが対応するアレルにハイブリダイズすると、分解されて特異的な蛍光シグナルを生じま す。リアルタイムPCRを行っている間、各レポーターのシグナルは記録され、アレル識別プロットにプロットされます。アレル識別プロットでは、アレル1由来の相対的蛍光シグナルは X 軸に沿って、アレル2 由来の相対的蛍光シグナルは Y 軸に沿ってプロットされます。アレル1のホモ接合体のコロニーは X 軸に沿って、アレル2 のホモ接合体のコロニーは Y 軸に沿って図 示されます。ヘテロ接合体のコロニーは対角線上に図示されます。 Life Technologies™ | lifetechnologies.com/parkinsons 9 Ion PGM™シーケンシング ™ TAL による編集を迅速に検出および定量するため、Ion PGM システムによ るアンプリコンシーケンス法を開発しました（図5）。この手法では、1サンプ ルから数千のシーケンスリードが得られ、1回のシーケンスランで最大 96サ ンプルを処理することができます。本手法を用い、単離したiPSCコロニーが 目的の変異を持つ細胞を含んでいるか、またそのコロニーがクローナルな細 胞集団なのかまたは混合細胞集団であるか、そしてクローナルな細胞集団 が変異をホモ接合で持つのかまたはヘテロ接合で持つのかを決定すること ができました。 ™ 増幅したゲノム領域 ™ ライブラリーの調製 テンプレートの調製 ® シーケンス解析 （IGV など） Ion PGM システムによる ™ Ion Torrent シーケンシング ® 図 5. Ion PGM シーケンシングによる編集の検出および確認のためのワークフロー。GeneArt Genomic Cleavage Detection および TaqMan SNP Genotyping Assay に使用した ™ 400bp のアンプリコンをテンプレートとし、Ion PGM シーケンシング用に 200bp のアンプリコンを作製しました。このアンプリコンから、Ion Plus Fragment Library Kit および ™ ™ ™ Ion Xpress Barcode Adapterを用いてライブラリーを調製しました。続いてIon OneTouch 2 Systemおよび Ion OneTouch 200 Template Kit v2 DLを用い、ライブラリーからテンプ ™ ™ レートを調製しました。Ion PGM 200 Sequence Kitおよび Ion PGM システムを使用してライブラリーのシーケンシングを行いました。データの解析はIntegrative Genomics Viewer （IGV）などのソフトウエアで行いました[6] 。 10 Life Technologies™ | Parkinson’s cell models 手法 複数の遺伝学的解析手法を組み合わせることにより、TALによる編集のプロ セスをスリム化できます。表1では各手法の長所、短所、および推奨される使 用法を比較しています。 表1. 3 種類の遺伝学的解析手法の比較 手法 GeneArt® Genomic Cleavage Detectionアッセイ TaqMan® SNP Genotyping Assay Ion PGM ™シーケンシング 長所 短所 どのような場合に使用するか • 低コスト • DNAにおけるホモ接合状態のわずかな 変異を検出可能̶ NHEJまたはHDR 編集 • 低コスト • 迅速 • アレルステータスの変化を明瞭に識別 • 非定量的 • ヘテロ接合型からホモ接合型への • NHEJ 修復による編集を受けた • 集団中の全ての変化を検出可能 • 定量的な結果 • 他の手法に比べ高コスト • ワークフローが長い 編集の場合は検出が困難 コロニーの選別 • アッセイが設計されたアレル変化のみ • 相同的組換えによる編集を受けた を検出̶ NHEJ 修復のインデルを検出 しない場合あり コロニーの選別 • 2 次的なアッセイとして最適̶1次 スクリーニングで同定された集団 における編集の確認および定量 ビトロネクチン上、Essential 8 ™ Medium 中にて フ ィ ー ダ ーフ リ ー の 状 態 で 培 養 さ れ た 人 工 多 能 性 幹 細 胞（ i P S C ）に お い て 、 P S C 4-Mar ker Immunoc y tochemistr y K it を用い、核 DNA（青色）および多能性マーカーの SOX2（緑色）および TRA-1-60（赤色）を染 色し ました。 Life Technologies™ | lifetechnologies.com/parkinsons 11 オフターゲット編集を検出するためのエクソームシーケンシング ™ ™ TALベースの編集は、他の手法に比べてオフターゲットの切断が少ないと 報 告されています。MSA 患 者ドナーから 得た 細 胞 株にお いて、オフター ゲット現象の確認を試みました。編集された iPSC 株におけるオフターゲッ Ion AmpliSeq Exome Kitおよび Ion Proton シーケンサを用いてエクソー ™ ムシーケンシングデータを取得し、Ion Reporter Softwareで、望ましくな ト 編 集 の可能 性を 評 価するため、エクソームシー ケンシング を 行 い 、編 めのカスタム解析ワークフローを設計しました。 いオフターゲット切断として最も起こる可能性が高いインデルを同定するた 集された 細 胞 株 2 種 類の 全エクソンをそ の 親株と比 較しました（図 6）。 Ion AmpliSeq™ Exome Kit Ion Proton™ シーケンサ ™ Ion Reporter™ Software ™ 図 6. オフターゲット切断スクリーニング用のワークフロー。Ion AmpliSeq Exome Kit により、親株および編集された細胞株の Ion AmpliSeq エクソームライブラリーを調製し、 ™ ™ Ion Proton シーケンサでシーケンスしました。シーケンスデータはIon Reporter Cloud Softwareにアップロードし解析を行いました。標準的な腫瘍 vs正常（生殖細胞系）ワークフ ™ ローをベースとしてIon Reporter のカスタムワークフローを設計、実行しました。オフターゲット効果と思われる変異は続いてサンガーシーケンシングによる解析を行いました。 12 Life Technologies™ | Parkinson’s cell models 結果 MSA細胞株からα-シヌクレインノックアウト株の作製 α-シヌクレイン蓄積が他の PD 関連フェノタイプに与える影 響を研究する ® アレル上でコドン4に2bpの欠失を持つ細胞集団を含んでおり、フレームシフ ための 細 胞モデル構築を目的とし、GeneAr t Precision TALs を用いて ト変異により18アミノ酸ペプチドの後にストップコドンが導入されました。 SNCA 遺伝子を1コピーまたは両コピーとも欠失させた細胞株を樹立しまし た。翻訳開始点をターゲットとし、SNCA 遺伝子のエクソン 2 に結合するよ うTALペアを設計しました（図7A ）。TALペアを MSA 患者ドナー iPSCにエレ クトロポレーションし、リカバリーのためMEF フィーダー層に細胞をプレー ティングしました。スクリーニングした12 のコロニー中、2 つのコロニーが ® GeneArt Genomic Cleavage Detectionアッセイによってポジティブクロー ンと判定され（図7B）、これらはさらにサンガーシーケンシングによる確認 をおこないました（データ未掲載）。1つのコロニー（コロニー21）は、片方の もう1つのコロニー（コロニー30）は、片方のアレル上に12bp のインフレーム ® 図7. GeneArt Genomic Cleavage Detection Kitによるコロニーのスクリーニング。 （ A） SNCA の TALペア結 合 サイト。（ B）リカバーした iPSC コロニーからゲノム DNA を調 製 し、SNCA の編集ターゲット領域をカバーするnested PCR を行いました。PCR 産物（約 400bp）を変性し、再アニーリングさせました。編集が起こっている場合、ヘテロ二重鎖 が形成され、切断が起こります。切断酵素を加えなかったレーンはマイナス記号（–）で、 切断酵素で処理されたレーンはプラス記号（+）で示しています。コロニー21および 30 の サンプルでは、目的のサイズの切断産物がはっきりと見られ、TAL による編集の結果とし て、ミスマッチの存在が示されています。 欠失を持っており、結果としてタンパク質配列のうち、4アミノ酸のみが欠失 していました（本研究の目的には適さない変異でした）。コロニー21をさら にサブクローニングし、得られた娘コロニーを再び切断検出アッセイでスク リーニングしました（データ未掲載）。 A 290 SNCA エクソン2のターゲティング 300 310 320 330 340 350 GTGGTGTAAAGGAATTCATTAGCATGGATGTATTCATGAAAGGACTTTCAAAGGCCAAGGGAGTT Reverse SNCA TAL Forward SNCA TAL B - 10 + - 21 + - 25 + - 30 + - 5 + Life Technologies™ | lifetechnologies.com/parkinsons 13 MSA細胞株からα-シヌクレインノックアウト株の作製 （続き） SNCA 遺伝子のコドン4 に 2bp の欠失を持つ iPSC のクローナルな細胞集団 を得るため、元となるコロニー21を単離および再プレーティングした後、 ™ Ion PGM シーケンシングを行いました。図 8A に示す通り、親株では欠失は 検出されず、編集が検出されたオリジナルのコロニー21はヘテロ接合体で あり、2bp の欠失を示す細胞は 5% のみでした。コロニー21を増殖、解離、 再プレーティングした後、2bp の欠失を示すシーケンスリードが 24%に濃縮 されているコロニーを同定しました。Integrative Genomics Viewer（IGV） A Softwareで表示した、編集されていない細胞および編集された細胞のシー ケンスリードを図 8B に示します。この時点で、細胞は再び解 離、再プレー ティング、およびスクリーニングされており、シーケンスリードの 50%に2bp の欠失が見られるクローンがいくつかあり、ヘテロ接合の欠失を持つクロー ナルな細胞集団が得られたことが示されました。後の継代細胞を再びシー ケンスしたところ、同じ欠失を持つクローナルな細胞集団であることが確認 されました。 B IGV で表示した+/- 編集SNCA シーケンスを行ったサンプル 2bp欠失を示すリードの割合 親株（野生型） 0 編集された細胞プール（コロニー21） 4 娘コロニー 25 解離後の娘コロニー 50 後の継代細胞 50 ™ 編集されたクローン 編集されていない 親クローン SNCA SNCA 図8. Ion PGM シーケンシングによる、SNCA へテロ接合型欠失を持つクローナルなMSA iPSC 細胞集団のキャラクタリゼーション。 （ A）コロニースクリーニングの回数を重ねるごとに （B）IGV Softwareで積み重ね表示したSNCA 遺伝子エクソン 2 のシーケンスリード。黒 編集されたクローンが濃縮され、2bp の箇所の欠失でコールされる塩基の割合が増加しました。 色の横棒は、特定のリード中で欠失があった箇所を示します。編集されていない親細胞株と比較すると、SNCA の第 4アミノ酸における2bp欠失がはっきりと分かります。 A 14 Life Technologies™ | Parkinson’s cell models 結果 SNCA にシングルコピーの 2bp欠失を持つこの細胞株を使用し、遺伝子の両 コピーが破壊された 2 種類目の細胞株を作製しました。片アレルに欠失を持 つ iPSCクローンに、SNCA をターゲットとする前回と同じTALペアを再びエ レクトロポレーションし、リカバリーの後スクリーニングを行いました。こ の時は、特定部位におけるアレル変化を迅速かつ効率的に検出する方法と ® 2bp欠失および野生型の配列を検出するカスタムTaqMan SNP Genotyping Assay を設 計し、両アレル 欠 失コロニーのスクリーニングに使 用しました （図 9A ）。野生型のSNCA 配列を持たないコロニーを同定した後、このコロ ニーをサブクローニングし、娘コロニーの解析を行い、SNCA が両コピーと も破壊されたクローナルな細胞集団を単離しました（図9B）。 ® して、TaqMan SNP Genotyping Assayを利用しました。 A B Mutant control Mutant control Het control 1.9 Het control 1.9 Mutant allele Mutant allele ++ 0.9 SNCA -/- detected Clonal candidates 0.9 + No Template WT control No Template 0.3 1.4 + + + + + 0.4 ++ + + 1.4 WT control 0.4 0.8 1.3 WT allele 1.8 2.3 2.8 0.3 0.9 1.4 1.9 2.4 WT allele ® 図9. TaqMan SNP Genotyping Assayによる、両アレルSNCA 欠失を持つクローンのスクリーニング。 （A）第1ラウンドスクリーニングのアレル識別プロット。予想通り、第1スクリーニ ングではほとんどのコロニー（緑色）がヘテロ接合体（欠失なし1コピー、2bp欠失あり1コピー）でしたが、2 つのコロニーはホモ接合体（2bp欠失あり2コピー、丸で囲った中の×印）で した。WT control：親株のMSA 細胞株（欠失なし2コピー）。Mutant control：SNCA に2bp欠失を持つ（2bp欠失あり2コピー）テンプレート（ドナープラスミドより）。Het control：編集 ® （B）娘コロニーの第 2 ラウンド されていないテンプレート50%／変異を持つテンプレート50%（欠失なし1コピー、2bp 欠失あり1コピー）。No template：TaqMan 試薬および水のみ。 スクリーニングにおけるアレル識別プロット。第1スクリーニングで陽性だったコロニーを解離して低密度で再プレーティングしました。同じSNP ジェノタイピングアッセイにより娘コ ロニーをスクリーニングしました。両アレルに変異を持つクローナルな細胞集団の候補は、プロットの左側、青色の点で示されています。 Life Technologies™ | lifetechnologies.com/parkinsons 15 MSA細胞株からα-シヌクレインノックアウト株の作製 （続き） ® ™ プレーティングごとに行ったTaqMan SNP Genotyping Assay の結果を解析した後、候補コロニーにおいて Ion PGM シーケンシングを行い、クロナリ ティーの評価と第 2アレル欠失のキャラクタリゼーションを行いました。最終的に選択されたクローナルな細胞集団では、シーケンシングを行った結果、 元々の2bp欠失が全ての細胞に存在し、加えて半数のシーケンスでこれらの2 塩基に隣接する6 塩基が欠失していることが示されました（図10）。ここで同定 された変異はさらにサンガーシーケンシングにより検証しました。 A ヌクレオチド 欠失の割合 1 51 2 51 3 99 4 99 5 52 6 40 7 39 8 39 B IGVで表示したSNCA-/-編集 8 7 6 5 4 3 2 1 図10. 編集された SNCA-/-を持つiPSCクローンのIon PGM™シーケンシング。 （A）ヌクレオチドの位置ごとに示した、欠失を含むリードの割合。 （B）IGV Softwareにより、第 2アレルに8bp の欠失があることがはっきりと示されます。 製品ハイライト リアルタイムPCRの最高峰 QuantStudio® 12K FlexリアルタイムPCRシステム QuantStudio® 12K FlexリアルタイムPCRシステムは、最大限のスループット、柔軟性、および スケーラビリティを持つよう設計されたオールインワンの装置です。QuantStudio® 12K Flexシ ステムは、各コロニーにおける特定の変異の検出（図 4 および図9）、および二重変異体コロニー における多能性状態の評価（図11C）に使用されました。 より詳細な情報については www.lifetechnologies.com/quantstudio12kをご覧ください。 16 Life Technologies™ | Parkinson’s cell models 結果 ダウンストリーム実験をさらに行う前に、完全にキャラクタリゼーションされたSNCA +/– およびSNCA –/– 細胞株を作製しました。各細胞株は正常な核型を ® ™ 示し（図11A）、SSEA4 、Tra-1-81、Tra-1-60、および Oct4といった多能性マーカーを発現していました（11B）。TaqMan hPSC Scorecard Panelによる解析 の結果、編集されたクローンは多能性であることが示され、またこれらのクローンに由来する7日目胚様体（EB）は、三胚葉のマーカー遺伝子を全て発現し ていました（図11C） A C B Clone 21 (SNCA +/-) Clone 21 (SNCA +/-)—Oct4 SSEA4 DAPI Clone 21 (SNCA +/-)—Tra-1-60 Sox2 DAPI MSA iPSC Selfrenew Clone 32 (SNCA -/-) Clone 32 (SNCA -/-)—Oct4 SSEA4 DAPI Clone 32 (SNCA -/-)—Tra-1-60 Sox2 DAPI MSA EBs Ecto Meso Endo MSA.21 iPSCs Selfrenew Selfrenew Ecto Meso Endo MSA.21 EBs Ecto Meso Endo MSA.32 iPSCs 図 11. TAL により編 集された MSA 細 胞 株 の キャラクタリゼーション。（ A ）編 集 さ れ た MS A クロ ーン 21 （SNCA +/– ）およびクローン 32（SNCA –/– ）における細 胞 遺 伝 学 的 解 析 の 結 果 。G- バ ンドレベル の 解 ® 析で は 、クロ ーン異 常 は 検 出さ れませんでした 。（ B）Geltrex マトリックスでコートしたプレ ート上、 ™ Essential 8 medium のフィー ダーフリーで 培 養した iP SC（ MSA クローン 21および MSA クローン 32 ） を、PSC 4-Marker Immunocytochemistr y Kitを用いてここに示す通りOct4（赤色）、SSEA4（緑色）、 Tra-1-60（赤色）、Sox2（緑色）の染 色を行い、DAPI（ 青色）で核 DNA のカウンター染 色を行いました。 ® ® （C）TaqMan hPSC Scorecard Panel による多能性の解析。フィーダーフリーの iPSC は、TRI Reagent を ™ 加え室温で 5 分間インキュベートし培養プレート上で直接溶解しました。RiboPure RNA Purification Kitを ® ™ 使用し、ライセートからRNA を単離しました。SuperScript VILO Master Mixを用いて RNA を逆転写して ® cDNAを得ました。cDNAサンプルに TaqMan Gene Expression Master Mixおよびヌクレアーゼフリー水を ® ™ ® 添加し、TaqMan hPSC Scorecard Panel に加え、QuantStudio 12K Flexリアルタイム PCR システムで測 定しました。 Selfrenew Selfrenew Ecto Meso Endo MSA.32 EBs Ecto Meso Endo Selfrenew Ecto Meso Endo Life Technologies™ | lifetechnologies.com/parkinsons 17 MSA細胞株からα-シヌクレインノックアウト株の作製（続き） 全ての iPSC 株からα-シヌクレインタンパク質は検出はできませんでした。 A MSA SNCA +/- clone 21 MSA parental MSA SNCA -/- clone 32 そのため、SNCA のノックアウトをタンパク質レベルで確認しました。細胞株 を神経幹細胞に分化させてから免疫細胞化学およびウエスタンブロッティ ングによる解析を行い、両測定法において、SNCA +/– 株はその親株に比べ てα-シヌクレインタンパク質が減少しており、SNCA –/– 株ではα-シヌクレ インタンパク質が検出されませんでした（図12A およびB）。 ® 図12. SNCA ノックアウトの確認。 （ A ）Gibco PSC Neural Induction Medium を使用 し、フィーダーフリーにて iPSC を神経幹 細胞（NSC）へ分 化させました。NSC を固定、 透 過 処 理した 後にα- シヌクレイン（緑 色）の 染 色を行 いました。核 DNA は DAPI（ 青 ® ® 色）で染色しました。染色後、EVOS FLoid セルイメージングステーションを用い、同 じ設 定の露出時間、輝度、コントラストで画像を取得しました。（B）NSC のペレットは M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent に再懸濁しました。各サンプルにつ ® いて等量のタンパク質を Novex 10–20% Tris-Glycine Mini Protein Gelにロードしまし た。ウエスタンブロッティングにはブロッキング溶液で希釈した1次抗体（2 μg/mL αシヌクレインマウスモノクローナル抗体 (クローン Syn 211) および 0.25 μg/mL GAPDH マウスモノクロ ーナル 抗体 ( クロ ーン 25 8) ）および 2 次 抗体（ 2 μ g /mLヤ ギ 抗 マウス IgG(H+L) 、アルカリホスファターゼコンジュゲート）を使用し、インキュベート後、BCIP/ NBTによりバンドを検出しました。 B 1 2 3 4 GAPDH α-synuclein 製品ハイライト スピーディーに蛍光3色イメージング EVOS® FLoid®セルイメージングステーション 染色したiPSC および NSC の蛍光画像はEVOS ® FLoid®セルイメージングステー ションで撮影しました。3 カラーチャンネルにより、多重染色の可視化および画 像の重ね合わせを簡単に行えます。 より詳しくは www.lifetechnologies.com/floidをご覧ください。 18 Life Technologies™ | Parkinson’s cell models 1. 2. 3. 4. Unedited (SNCA +/+) Edited (SNCA +/-) Edited (SNCA -/-) Protein ladder 結果 編集されたMSA株におけるオフターゲット編集のスクリーニング TALベースの 編 集により、ター ゲット部位 以 外 の 場 所で 意 図しない インデルが 生じてい ないかを 調 べ る ™ ため、Ion Proton シー ケン サを 用いて 親 株 および 編 集され た株 の 全エクソンをシー ケンスしました 。 ™ Ion Reporter Softwareによりシーケンス結果を解析したところ、編集されたMSA 株ではオフターゲット効果 と思われるインデルが 6か所のみ見つかり、これらは全てホモポリマー領域に存在していました。これら6か所 のシーケンスリードを目視で確認したところ、これらのインデルは誤検出されたものであることが分かりまし た。サンガーシーケンシングを行った結果、同じ配列が親株および編集されたMSA 株の両方に存在すること が示されました。結論として、編集された 2 つのMSA 株では、全エクソンにわたりオフターゲットインデルは検 出されませんでした。 製品ハイライト 微量DNA から、迅速なエクソームシーケンス Ion Proton™シーケンサ Ion Proton™ シーケンサは、TAL 編集によるオフターゲット効果の 評価に使用しました。 より詳しくは www.lifetechnologies.com/protonをご覧ください。 Life Technologies™ | lifetechnologies.com/parkinsons 19 PD-3株におけるLRRK2 G2019S変異の修正 PD 関連フェノタイプにおけるLRRK2 G2019S およびGBA N370S 変異の役 ® 割を研究するための細胞モデル構築を目指し、GeneArt Precision TAL に よって 編 集 さ れ 、前 述 の 変 異 を 野 生 型 に修 正した i P S C 株 を 作 製し ました 。L R R K 2 G 2 019 S 変 異 を 修 正して 野 生 型 へ 戻 す た め に は 相 同 A 20 Life Technologies™ | Parkinson’s cell models 6050 6060 6070 6080 ATGCTGCCATCATTGCAAAGATTGCTGACTACGGCATTGCTCAGTACTGCTGTAGAATGG ATGCTGCCATCATTGCAAAGATTGCTGACTACAGCATTGCTCAGTACTGCTGTAGAATGG Forward LRRK2 TAL Reverse LRRK2 TAL 500bp…GCTGACTACGGCATTGCTCAGTACT…500bp (~1kb donor fragment) ® 胞集団のクロナリティーを確認しました。 6040 ATGCTGCCATCATTGCAAAGATTGCTGACTACRGCATTGCTCAGTACTGCTGTAGAATGG 組 換 えを 介 した 編 集 が 必 要 で あ り、これ に は 変 異 の あ る 領 域 を 挟 む Gene A r t Precision TA L s ペ アと、目 的 の 修正後 配 列 を 持 つ 1kb のド ナー DNA を 使 用し、ヌクレオチドの 1つを A から野 生 型の G へ 編 集します ® （図 13A ）。LRRK2 修正の第 1スクリーニング では、GeneAr t Genomic Cleavage Detectionアッセイにおいて、140 個中、2 個のコロニー（1.4%）が 陽性でした（図13B、コロニー26および27）。これらのコロニーをサブクロー ® ニングし、TaqMan SNP Genotypingアッセイにより再スクリーニングしま ™ した（図13C）。陽性コロニーにおいてIon PGM シーケンシングを行い、細 6030 B 結果 C Allelic discrimination plot Homozygous Mutant – control 3.3 Parental – Heterozygous Mutant 2.8 ++ Allele 2 2.3 1.8 ++ 1.3 ++ +++ + Edited colonies identified + Edited daughter colonies confirmed + No Template – negative control + ++ 0.3 ++++ + + 0.8 + 図 13. LRRK2 G2019S を持つ PD 患者ドナー iPSC から野 生型へと修正した細胞株の作 製。（ A ）PD 細 胞 株におけるLRRK 2 G2019S 領域の配列。TALペア結 合 サイトは 赤 の 下 線 で 示 さ れて いま す。TA L は 、野 生 型 の シー ケンスとそ の 前 後 5 0 0bp の 配 列 を 持 つ、1kb の 精製 PCR フラグメントと共に、細 胞へエレクトロポレーションされました。 ® （B）GeneArt Genomic Cleavage Detectionアッセイによるコロニーのスクリーニン グ。スクリーニングを行った140 個のコロニーのうち、コロニー26 および 27 ではミスマッ チによる切断産物がほとんど見られず、ヘテロ接 合変異の大部分がホモ接 合野 生 型へ ® 修正されたことが示されます。 （C）TaqMan SNP Genotyping Assay の結果、クローン 26 、27 およびその娘コロニー（赤色）は、アレル識別プロットにおいて野生型コントロー ル（野 生 型ドナープラスミドまたは HEK293 細胞の野 生 型テンプレート）と同じ領域に ™ プロットされ、ホモ接合の野生型アレルを持つことが示されました。 （D）Ion PGM シー ケンシングの結果、ヘテロ接 合体の親株（53% G）から、コロニー26では修正された塩 基が主となり（93% G）、最終的には 3 種の娘コロニーで、編集された箇所がホモ接合体 （100% G）の状態になったことが明らかになりました。 0.3 0.8 1.3 1.8 2.3 2.8 Homozygous Wild Type – control Allele 1 Homozygous Allele 2/Allele 2 Undetermined + Legend Homozygous Allele 1/Allele 1 Heterozygous Allele 1/Allele 2 D 野生型（G） 変異型（A） 親株̶ヘテロ接合体 53 47 LRRK2 が編集されたコロニー26 93 7 編集されたコロニーの娘コロニー1 100 0 編集されたコロニーの娘コロニー2 100 0 編集されたコロニーの娘コロニー3 100 0 シーケンスを行ったサンプル Life Technologies™ | lifetechnologies.com/parkinsons 21 PD-3株におけるGBA N370S変異の修正 TAL によるGBA N370S 変 異 の野 生 型 へ の 修正にも HDR を 利 用します。 GBA の場合、N370S 領域に完 全な相同性を持つ pseudogene 、GBAP1 が 存 在するため編集が困難になります。pseudogene を避けるため、N370S ターゲット領域下流の非 相同性領域に結合するようTALペアを設計し（図 14A ）、スクリーニング用には pseudogene と非 相同的な領域に PCR プラ イマーを設計してGBA からのアンプリコンのみが生じるようにしました。 ® TaqMan SNP Genotyping Assay による第1スクリーニングでは 48 個中1個 （2%）のクローンが編集に陽性であり、細胞集団の大半が野生型へと傾い ていました（図14B）。 このコロニーをサブクローニングし、クローナルな細胞 集団を単離しまし ™ た。陽性コロニーにおいてIon PGM シーケンシングを行い、GからAへの修 正株のクロナリティーを確認しました（図14C）。 MSA 株と同様に、2 つの編集された PD 患者ドナー iPSC 株をキャラクタリ ゼーションし、核型が正常であること、およびすべての多能性マーカーを発 ® 現し得ることが示されました（免疫細胞化学、TaqMan hPSC Scorecard ™ Panelによる。データは未掲載）。 A GCGCCTTT GTCT CTTT GCCTTT GTCCTT ACCCTAGAA CCT CCT GT ACCAT GT GGT CGGCT GGA CCGA CT GGA A CCTT GCCCT GAA CCCCGAA GGA GGA CCCAA TT GGGT GCGT AA CT T T GT CGA CA GT CCCAT CAT T GT A GA CA T CA 9020 GBA GBAP1 9030 9040 9050 9060 9070 9080 9090 9100 9110 9120 9130 9140 9150 9160 GCGCCTTT GTCT CTTT GCCTTT GTCCTT ACCCTAGAA CCT CCT GT ACCAT GT GGT CGGCT GGA CCGA CT GGA A CCTT GCCCT GAA CCCCGAA GGA GGA CCCAA TT GGGT GCGT AA CT T T GT CGA CA GT CCCAT CAT T GT A GA CA T CA GAGCCTTT GTCT CTTT GCCTTT GT CCTT ACCCT AGAACCT CCT GT ACCAT GT GGT CGGCT GGA CCGA CT GGA A CC-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------CAT CAT T GT A GA CA T CA Forward GBA TAL Reverse GBA TAL 500bp…GTCCTTACCCTAGAACCTCCTGTACCATGTGGTCGGCTGGACCGA…500bp (1kb donor PCR fragment) 図14. GBA N370Sを持つPD患者ドナーiPSCから野生型へと修正した細胞株の作製。 （ A）PD 細胞株におけるGBA N370S の配列（上）および pseudogene GBAP1 の配列（下）。TALペ アの結合サイトは赤の下線で示してあります。野生型の配列およびその前後 500bp の配列を持つ1kb の精製 PCRフラグメントと共に TALを細胞へエレクトロポレーションしました。 ® （B）TaqMan SNP Genotyping Assay によるコロニーのスクリーニング。アレル識別プロットにおいて、1回めにスクリーニングした48コロニー（緑色）のうち、1つのコロニー（コロ ニー10）がホモ接合の野生型コントロール側へ移動しているように見られました。このクローンをサブクローニングした後、2回めのスクリーニングでは、アレル識別プロットにおいて より多くのコロニーが野生型コントロール（野生型のドナープラスミド）と同じ領域にプロットされました。 （C）ヘテロ接合体の親株、第1スクリーニングのコロニー10 、コロニー10 の ™ ™ 娘コロニー、および娘コロニーを継代した細胞において検出された変異の割合を示すIon PGM シーケンシングの結果。いくつかの娘コロニーについてはIon PGM シーケンシングを 繰り返し行いました。クローン10 ∼12では、変異のあった箇所において野生型の塩基 Tがほぼ100% を占め、クローナルな細胞集団であることを示しています。 22 Life Technologies™ | Parkinson’s cell models 結果 B First round C Allelic discrimination plot Mutant control シーケンスを行ったサンプル 変異の割合 2.4 Allele 2 1.9 Het control 親株̶へテロ接合体 56 GBA が編集されたコロニープール 23 編集されたコロニーの娘コロニー 1 後の継代細胞 1 1.4 GBA +/+ detected (colony 10) 0.9 0.4 No Template WT control 0.9 0.4 1.4 1.9 2.4 Allele 1 Homozygous Allele 2/Allele 2 Undetermined + Legend Homozygous Allele 1/Allele 1 Heterozygous Allele 1/Allele 2 Second round Allelic discrimination plot Mutant control 2.4 + Allele 2 1.9 1.4 Het control 0.9 WT control No Template + + 0.9 0.4 1.4 1.9 2.4 Allele 1 Homozygous Allele 2/Allele 2 Undetermined + Legend Homozygous Allele 1/Allele 1 Heterozygous Allele 1/Allele 2 + + + ++ + 0.4 Life Technologies™ | lifetechnologies.com/parkinsons 23 まとめ、結論、 および今後の展開 ® 今回ご紹介した研究では、GeneArt Precision TALs テクノロジーを使用 作製した細胞株が真に“アイソジェニック”であることを確かにするため、 し、アイソジェニックな iPSC 株 パネルを作製しました。親株となった MSA 親株の MSA 患者ドナー細胞株および 2 種類の派生細胞株においてエクソー 患者ドナー iPSC 株から、α-シヌクレインの発現が低下している細胞、また ムシーケンシングを行い、オフターゲット切断によって生じたインデルの は発現していない細胞の、2 種類の派生細胞株を作製しました。これらの細 有無をスクリーニングしました。腫瘍サンプルと正常サンプルの比較 用に 胞株は、MSA 疾患モデルの構築に有用なだけでなく、α-シヌクレインのレ 設計されたバイオインフォマティクスのワークフローを使用しました。その ベルが疾患関連フェノタイプに及ぼす影響をより良く理解するために役立 結果、全ての細胞株の全エクソンにおいて、SNCA 遺伝子内の特定のター つと考えられます。LRRK2 およびGBA 遺伝子に変異を持つ 2 つめの親株か ゲット部位を除いて、新規のインデルは見られませんでした。LRRK2 および らは、これらの変異間の相乗効果が疾患関連フェノタイプに与える影響を GBA を編集するために使用された相同組換えでもエラーが起こる可能性が より良く理解するため、2 つの変異を別々に野生型へ戻しました。今後の研 あるため、今後これらの細胞株においてこのようなオフターゲット効果の調 究では、両方の遺伝子を修正して野生型に戻した細胞株の作製があげられ 査を行う予定です。 ます。 今回使用したTALベースの編集手法に加え、最近では他の編集手法がその ことに注力しています。これまでに神経幹細胞（NSC）の段階で使用できる コストおよび使いやすさの点から大きな注目を集めています。特にCRISPR アッセイの開発について述べましたが、究極的にはこれらの細胞を中脳ドー ベースのテクノロジーは、遺伝 子 ター ゲティングコンストラクトのデザイ パミン作動性ニューロンに分化させてフェノタイプを比較することを目指し ンがシンプルであり（ターゲットに対して完全な相補性を持つ比較的短い ています。今回ご紹介した研究では、iPSCに最適化されたTALベースの編集 RNA 鎖が切断酵素を目的の部位にガイドします）、サイズの大きいTAL コン ワークフローを開発し、その中で 3 種類のゲノム解析手法をコロニーのスク ストラクトに比べると大幅に低いコストで作製可能であることから、高い関 リーニングに利用し、編集されたクローンを効率的に同定しました。また、 心が持たれています。さらに、CRISPRベースの編集はターゲットローカス エクソームシーケンシングを利用し、オフターゲット効果のスクリーニング の切断効率がより高いことが報告されています[7] 。実際に、CRISPRシステ および解析を行いました。私たちは研究コミュニティーにおいてプロトコー ムを使用してSNCA ローカスをターゲットとする検討実験を行ったところ、 ルおよび知見を広く共有することで、TALベースの iPSCゲノム編集を成功さ 調べたコロニーの半分以上で目的のローカスに切断が起こっていました。 せ、生理学的に意味のあるモデルを構築し、そしていつの日かパーキンソン しかし、現行の CRISPR テクノロジーにどの程度のオフターゲット効果があ 病などの疾患が治癒されることを願っています。 るかはまだ明らかでなく、本研究においては真にアイソジェニックな細胞株 を得ることが重要であったため、細胞株の作製にはTALシステムを採用しま した。 24 現在私たちは、今回作製した細胞株におけるフェノタイプの違いを比較する Life Technologies™ | Parkinson’s cell models References 1. 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Life Technologies™ | lifetechnologies.com/parkinsons 25 製品情報 iPSC、MEF、およびNSCの培養 サイズ ® Countess Automated Cell Counter 1 instrument Geltrex® LDEV-free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Essential 8™ Medium Thiazovivin C10227 1 mL 5 mL A1413301 A1413302 500 mL A1517001 10 mg 3845 StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent 100 mL A1110501 D-PBS, Ca2+/Mg2+ free 500 mL 14190144 Basic FGF, Recombinant Human Protein 10 µg PHG0264 Gibco® Mouse Embryonic Fibroblasts (Irradiated) 1 mL S1520100 DMEM with GlutaMAX -I (High Glucose) 500 mL 10569010 Fetal Bovine Serum (FBS), Certified, Heat Inactivated 100 mL 10082139 MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100 mL 11140050 GlutaMAX -I Supplement 100 mL 35050061 KnockOut™ DMEM/F-12 500 mL 12660012 KnockOut Serum Replacement 500 mL 10828028 Gibco® PSC Neural Induction Medium 500 mL A1647801 Versene Solution 100 mL 15040066 ™ ™ ™ Mouse(ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts 1mL ゲノム編集 サイズ ® GeneArt Precision TALs A24903 製品番号 lifetechnologies.com/tals ® GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit 20 reactions A24372 NEW GeneArt ® CRISPR Nuclease Vector with OFP Reporter Kit 10 reactions A21174 10 reactions A21175 ® NEW GeneArt CRISPR Nuclease Vector with CD4 Enrichment Kit コロニーのスクリーニング ® Neon Transfection System PureLink® PCR Purification Kit ® サイズ 製品番号 1 each MPK5000 50 preps ® Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit 20 reactions ® BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 5,000 reactions EVOS ® XL Imaging System 1 instrument ® E-Gel EX Agarose Gels, 2% 20 gels Custom TaqMan® SNP Genotyping Assay, Human ™ ™ Life Technologies™ | Parkinson’s cell models K310001 450245 4337457 AME3300 G402002 lifetechnologies.com/taqmansnp ™ Ion PGM System (includes Ion PGM Sequencer and PGM Torrent Server) 26 製品番号 1 system 4462921 コロニーのスクリーニング（続き） QuantStudio® 12K Flex Real-Time PCR System サイズ 1 system TaqMan® Genotyper™ Software ™ Ion Xpress Barcode Adapters 33-48 Kit Ion Library Quantitation Kit ™ Ion OneTouch 200 Template Kit v2 DL Ion PGM™ 200 Sequencing Kit ™ Ion OneTouch 2 System Ion AmpliSeq™ Exome Kit lifetechnologies.com/quantstudio lifetechnologies.com/genotyper Integrative Genomics Viewer (IGV) Ion Plus Fragment Library Kit 製品番号 http://www.broadinstitute.org/igv 10 reactions 4471252 1 kit 4474518 250 reactions 4468802 10 reactions 4480285 1 kit 4474004 1 system 4474779 8 exomes 4487084 ™ Ion Proton System lifetechnologies.com/proton Ion Reporter™ Software lifetechnologies.com/ionreporter キャラクタリゼーション ® ™ サイズ 製品番号 TaqMan hPSC Scorecard Panel, Fast 96-well 2 x 96-well plates A15876 TaqMan® hPSC Scorecard™ Panel, 384-well 1 x 384-well plate A15870 ® ® EVOS FLoid Cell Imaging Station TRI Reagent® Solution RiboPure™ RNA Purification Kit ® ™ SuperScript VILO Master Mix TaqMan® Gene Expression Master Mix Nuclease-Free Water 1 instrument 4471136 100 mL AM9738 50 preps AM1924 250 reactions 1 x 5 mL (200 reactions) 1 tube (1.75 mL) 11755250 4369016 AM9914G PSC 4-Marker Immunocytochemistry Kit 1 kit A24881 PSC (OCT4, SSEA4) Immunocytochemistry Kit 1 kit A25526 PSC (SOX2, TRA-1-60) Immunocytochemistry Kit 1 kit A25525 M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent 25 mL 250 mL 1L 78503 78501 78505 Novex® 10-20% Tris-Glycine Mini Protein Gels, 1.0 mm, 10 well 250 mL EC6135BOX Alpha Synuclein mAb, Mouse (Syn 211) GAPDH Mouse Monoclonal Antibody (clone 258) 1L 328100 1 box 437000 Membrane Blocking Solution 100 µg 000105 Goat Anti-Mouse IgG (H+L), Alkaline Phosphatase Conjugate 100 µg G21060 Life Technologies™ | lifetechnologies.com/parkinsons 27 パーキンソン研究所・臨床センターについて 今から25 年前、熱意にあふれたパーキンソン病専門家のグループが、より良いパーキンソン病研究および 治療提供を行うことを目指しました。そこでは標準的な医師と患者の関係を超えた医療を行います。患者 は治療プランの作成におけるパートナーとなり、ご自身のクオリティ・オブ・ライフを改善し、疾患に立ち向 かい疾 患を管理するための新しい戦略を見いだします。心のこもったケアと最新の研究を連携させ、答え のケア、臨床研究、および基礎研究を1施設にまとめた、米国で唯一の独立非営利団体です。我々の在り方 が持つ長所ゆえに、最高のケアを提供し、有望な科学を前進させることができ、そしておそらく最も重要な 点として、ケアおよび科学とそれをつなぐ全てを統合するためのユニークな体制を我々は備えています。こ れが、今私たちが「我々の好循環」と呼ぶものであり、私たちの活動の中心にいるのは、パーキンソン病を 抱える人たちとそのご家族なのです。 を探求し、新しい治療・療法を開発し、究極的には治癒を目指すのです。その結果として誕生したのがパー さらに詳しい情報についてはThePI.orgをご覧ください。 キンソン研究所・臨床センターでした。 その道程で私たちは、他には存在しない唯一のものを築きました。私たちの施設は、パーキンソン病を抱 えて生きる人々が治療を受けると同時に、パーキンソン病の科学と医学を確実に変え続けていくであろう 研究において重要な役割を果たすことができる場所なのです。我々は、パーキンソン病に関して世界最高 Life Technologies™ 製品について ™ Life Technologies 製品は、Thermo Fisher Scientific の強力なブランドの一つとして、科学的研究、遺伝 子解析、そして応用化学分野の最先端で活躍されるお客様に、高品質で革新的な製品とサービスを提供い たします。 さらに詳しい情報についてはwww.lifetechnologies.comをご覧ください。 さらに詳しい情報については、当社ウェブサイト www.lifetechnologies.com/parkinsons をご覧ください facebook.com/LifeTechnologiesJapan @LifetechJPN 研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。 標準販売条件はこちらをご覧ください。 www.lifetechnologies.com/TC For Research Use Only. 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