質問３：質問２で「はい」と回答された技術で、大変だと感じることや苦労している ことなどがございましたら、ご記入下さい。 特になし。ただし、必要が出たときに本当に個体に戻せるのか、未経験なので不安である。 A. 凍結胚の場合：一部を融解、体外培養により胚盤胞へ発生するか否かのチェックをお勧めします。 凍結精子の場合：一部を融解、精子の運動性をチェックしてください。できれば、２～３匹の雌マウス から採取した未受精卵を用いて、受精の有無の確認をお勧めします。 上記を行っておけば、それら凍結胚・精子から確実に個体へ戻すことが可能です。 時々ではあるが、マウス生産業者によって IVF 成績に差が出ることがある。 一機関では把握しきれないので、全国（国動協）レベルでその様な動向があるかの情報があると参考に したい。 A. マウス生産業者のみならず、導入したときのコロニーによっても IVF 成績に差が出ます。 なお、CARD では、最近、開発した FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM を併用することで、ほとん どすべての系統で 80～90%以上の安定した受精率が得られています。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 系統によって成績が酷く悪いことがある。異なった凍結方法で作成された胚の受け入れが難しい。 A. CARD では、最近、開発した FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM を併用することで、ほとんど すべての系統で 80～90%以上の安定した受精率が得られています。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 主に、海外からの凍結胚は緩慢凍結法あるいは二段凍結法、国内では簡易ガラス化法（DAP213 による方 法および EFS による方法）で凍結されています。 送られてきたそれぞれの凍結胚には、必ず、融解マニュアルが付いてきます。そのマニュアル通りに融 解すれば、比較的良好な胚の生存率が得られます。 また、練習用サンプルが送られてくる場合がありますので、必ず、それを用いて融解練習を行ってから、 目的とする系統の胚を融解してください。 なお、外部より送られてきた凍結胚からの産子作製については、CARD の有償バンクもご利用頂けます。 http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/japanese/gyoumu/ebank/secretfee.html 子宮内胚移植での技術面、胚の導入場所、胚の成長の不均一など A. マニュアルをご参照ください。 http://www.transgenic.co.jp/products/mice-product/manual.php 体外受精で受精率が低い場合、透明体部分切開や ICSI を行っていないため、受精卵の回収数がとても少 なくて困る。 A. 体外受精に FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM の併用をお勧めします。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 元々、授精率の低い精子の凍結保存で、融解後の受精率が、やはり低く、透明帯部分切開・穿孔法を行 っている。 A. 精子凍結保存に FERTIUP 保存液、体外受精には FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM の併用を お勧めします。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html PMSG 投与から 2cell を得るまでのスパンが長いので事前に計画を練る必要がある。 A. 現在のところ、２細胞期胚の採取は、PMSG（卵胞発育）→hCG（排卵）→交配あるいは体外受精の行 程が必須です。 ホルモン投与が土日祭日にかかってしまう場合には、あらかじめ準備した凍結未受精卵の利用を勧めま す。 CARD では、このようなケースにおいて、凍結未受精卵を用いて体外受精を行っています。 胚の融解において、胚の回収率が上がらない。また、回収胚にバラバラになっていたり、死滅している 胚が多くみられる。 胚の培養において、生体内の胚よりも培養した胚のほうが、胚盤胞期胚になるまでに時間が長くかかっ てしまう。 A. 自施設で凍結した胚については、定期的に融解・訓練することで回収率が向上します。一方、他施 設から導入した凍結胚については、送られてきたマニュアル通りに行っても、回収率が悪いケースがあ ります。 しかしながら、回収率と得られた形態的正常胚の質には相関がないので、回収された正常胚を移植すれ ば、産子が得られると思います。 一般的に、体内受精由来胚に比べて、体外受精由来胚の体外培養による胚盤胞への発生速度は遅い。 しかしながら、KSOM で培養することにより、かなり発生速度が改善されます（速くなります）。 凍結精子を用いて個体化する際には、凍結胚の個体化より発生率が安定しないため、希望する産仔数に 合わせて、体外受精時に使用する♀の数を決めるのに苦労する。 A. FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM を併用することで、凍結精子でもほとんどすべての系統 で 80~90%以上の安定した受精率が得られています。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html なお、移植技術のレベルおよびレシピエントのコンディションにもよりますが、CARD における産子への 平均発生率（産子数／移植胚数×１００）は約５０％です。 系統差による作業効率の違い ホモで維持している系統で凍結受精卵を貯める事（卵子保存がまだ未熟のため） A. 詳細は、[email protected] へお問い合わせください。 <詳細は、[email protected] へお問い合わせください。> 顕微受精（ICSI）を導入したいが、費用と時間が無く取り組めていない。 生殖工学技術は基本的に組換え動物で用いているが、作業の結果は系統（Tg、 KO、バックグラウンド） により大きく左右されることがあるので、もう少し安定する方法や材料があればと願っている。 A. アンケート調査結果にもありますように、ルーチンワークとして顕微受精（ICSI）を実施している 施設は少ないようです。 また、定期的に実施しないとせっかくマスターした技術でも、一定レベルを保持できませんので、その 辺も考慮した上での導入をお勧めします。 具体的なケースをお知らせ頂ければ、適切な回答を差し上げることができると思います。 問い合わせ先：[email protected] <問い合わせ先：[email protected]> 精子の凍結保存で、融解後の生存率・受精率が低い。 A. 精子凍結保存に FERTIUP 保存液、体外受精には FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM の併用を お勧めします。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 技術員を雇用することができないため、凍結保存が不定期になっている。 A. 多少費用がかかりますが、CARD 有償バンク http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/japanese/gyoumu/orderexsecret.html あるいは他の民間業者の利用を勧めます。 体外受精をこちらの大学で依頼しているが、混んでいてすぐにやってもらえない。 熊本大学でやってもらってもよいが、マウスの搬入時に要求される微生物チェックの項目が多く、実質 上外からのマウスの搬入が出来ない。 A. 熊大 CARD の有償バンクをご利用頂き、胚を作製・凍結、凍結胚（あるは冷蔵胚）を貴大学に送り、 貴大学で移植することにより、産子を作製することが可能です。 精管結紮オスマウスやメスマウスを飼うスペース等が限られ、偽妊娠マウスの作製が発生工学実験の律 速となっている。 ブリーダーから購入する方法もあるが、大学が遠方のため、思うように購入できない。 A. 現在では、新鮮胚でも凍結融解胚でも１～３日間冷蔵保存が可能であり、その移植成績も変わりま せん。 一日に作製されるレシピエント数が限られているのであれば、胚の冷蔵保存を行なえば、４日間（胚作 製当日、保存後１，２，３日目）の胚移植が可能です。 http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/japanese/gyoumu/teion/lowtemptransp.html 受精率や融解率の向上(現状で 80%の成績を 90%以上の成績にコンスタントに上げること) A. FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM の併用をお勧めします。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 精子保存してもそこから個体化する機会がなかなかないので、どの程度うまくいっているか分からない 点に少し不安があります。 A. 一部を融解、精子の運動性の確認をチェックしてください。できれば、２～３匹の雌マウスから採 取した未受精卵を用いて、受精の有無の確認をお勧めします。 体外受精において、マウスの系統によっては受精率が低く、必要になるマウスの数が多くなってしまう。 A. 新鮮精子、冷蔵精子、凍結精子すべてにおいて、体外受精には FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM の併用するときわめて高い受精率が得られます。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 受精卵を解凍して得られる胚の数にばらつきがあり、解凍技術が安定しない。 移植はうまくいったと思うのに、妊娠していない。 基本的なところでは、キャピラリーがうまく作れない。やり始めると、月に 2、3 回はしますが、休むと けっこう間が空きますので、また最初からとなり、いろいろと大変と感じるところが多いです。 A. 定期的に胚を融解し、一定の融解技術レベルを維持することが大切です。 きちんと偽妊娠させた レシピエントを移植に用いてください。 通常、精管結紮雄と交配させ、膣栓（プラグ）を確認した雌をレシピエントに用いますが、移植すると きに卵管膨大部が腫れているかを必ずチェックしてください（排卵しているか否か）。 膨大部が腫れていないレシピエントに移植した場合、妊娠しない可能性があります。 理由：レシピエントの膨大部が腫れていなかった→排卵していなかった可能性がある→卵胞が形成されな い→機能黄体が形成されない→黄体ホルモンが分泌されない→妊娠維持ができない。 キャピラリーをランプの炎で加熱し、十分に軟らかくなった時点で、炎の手前で左右に引き延ばします。 キャピラリーを素早く引き延ばすと細く、ゆっくり引き延ばすと太くなります。その加減は、何度か練 習して感覚を覚えてください。慣れれば、一定の太さのキャピラリーの作製が可能となります。 どの ような技術でもそうですが、定期的に実施しないと一定以上の技術レベルは維持できません。最低でも 月に２～３度の定期的な実施をお勧めします。 なお、キャピラリーは、九動株式会社からも販売されています。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/medium_pr.pdf 体外受精卵の凍結後の移植成績があまり良くない。 A. 融解後の生存性が低くても、形態的正常胚をレシピエントに移植すれば、産子を得ることができま す。 しっかりプラグが付いたかつ膨大部の腫れたレシピエントを使用してください。 卵管采への移植 A. CARD では、経卵管壁卵管内胚移植を行っております。従来の経卵管采胚移植よりも簡単で種々の利 点があります（出血が起こらない。ピンセットで摘んでも卵管組織が挫滅しないなど）。 是非、お試しください（Exp.Anim.41(3), 387~388, 1992）。 過排卵誘起の際のホルモン処理を１回で済ませることができると便利ですが・・・ A. 現在のところ、PMSG で卵胞を発育させ、hCG で排卵させる方法が最も確実で安定した方法です。 卵管移植は易しくはないが、数少ない経験から、移植用のガラス管のサイズ、先の形等が大きく手技に 影響していることが分かってきました。 しかし卵管移植用に適したサイズのガラス管を作るのも，そう易しくはないようです。 移植用の ICR マウスの発情前期の良いのがなかなかつかまらないので、必要以上に数多く ICR 雌を購入 せざるをえません。 しかし、これもある程度週齢が行き過ぎるとどうもあまり良くないようで、結構なマウスの無駄が生じ ています。 ただ、来期からの実習用では大量の移植用マウスを必要とするので、半量のホルモン注射をするつもり でいます。 なお、まだ卵管灌流、凍結精子からの体外受精を行っていないので、この手技を磨く必要があると思っ ています。 A. キャピアリーをランプの炎で加熱し、十分に軟らかくなった時点で、炎の手前で左右に引き延ばし ます。 キャピアリーを素早く引き延ばすと細く、ゆっくり引き延ばすと太くなります。 卵管移植に用いるキャピアリーは、切開した卵管内部口径より一回り細いものが適しています。何度か キャピアリー作製の練習をして、その感覚を覚えてください。 慣れれば、一定の太さのキャピアリーの作製が可能となります。 発情前期の雌を効率的に見つける方法は、毎日、夕方の一定時間（午後３～５時）に雌の外陰部を良く 観察することです。 外陰部が赤く大きく腫脹する個体は、なかなか見つけられないかも知れませんが、毎日良く観察すると、 発情前期の外陰部の腫れている個体を見つけやすいと思います。 なお、発情周期に関係なく、PMSG7.5IU 投与４８時間後に精管結紮雄と同居させ、膣栓（プラグ）を確認 した雌をレシピエントとして用いることも可能です。 上記技術を持ち合わせた人材の育成 A. 生殖工学技術は体外受精、胚・精子の凍結保存、胚移植などの技術を組み合わせることによって、 初めて効率的な応用が可能となります。 従って、中長期の人材の育成が極めて大切です。 共通利用施設なので、体外受精成績の悪い系統（BALB/c など）で依頼されたときに困ります。 ある程度実験に繁用な系統なら確実に受精卵がとれる体外受精方法が開発されると大変ありがたいで す。 A. ほとんどの系統の新鮮精子および凍結精子すべてにおいて、体外受精には FERTIUP 精子前培養液お よび CARD MEDIUM を併用すると、きわめて高い受精率が得られます。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 業務ベースなのでテクニシャンが辞める際の引き継ぎなどがどちらかというと大変です。技術の継承（に 時間がかかる点）が難しいです。 A. 体外受精、胚・精子の凍結保存、胚移植などの組み合わせてルーチンワークで実施していくために は、技術を習得したテクニシャンが必須です。 テクニシャンの養成にはある程度時間がかかるのは、やむを得ません。技術の引き継ぎは、時間をかけ て行うべきだと思います。 なお、トランスジェニック社より、生殖工学技術 CD マニュアルも販売されております。 http://www.transgenic.co.jp/products/mice-product/manual.php 習得した技術の継承。ノックアウトマウス作成などをおこなった後、解析の段階では必要度が低下して しまう。 外注や研究所の研究支援施設への依頼では、経費が高すぎることおよび時間がかなりかかってしまうこ とが問題である。 また B6 の ES 細胞を用いたいが、これも制約をきびしくしている。 A. 自前で行うか外注するかは、一長一短があり、難しい問題です。各施設で判断するしかないと思い ます。 数日間、その作業に束縛される。 A. 精子、未受精卵、受精卵、各発生段階の胚を一時的に凍結保存、都合の良い時間に合わせて融解す ることで、臨機応変な作業の遂行が可能になると思われます。 具体的な内容をお聞かせいただければ、ご相談に応じます。 連絡先：[email protected] <連絡先：[email protected]> 年々、生殖工学に関連する技術支援の要望が高まっているが、技術者を確保するのに苦労している。（技 術的な苦労とは違いますが） A. どこの施設でも、生殖工学技術を有する技術者のニーズは、年々、増加しております。 技術研修などに参加して、生殖工学技術の習得が必須と思います。また、積極的に生殖工学技術をアピ ールし、周囲からの理解を図ることをお勧めします。 以前は、B6 の凍結精子の IVF 成績がほとんど０％だったため、ICSI などを行わなければならなかったの ですが、現在、その問題点は、中潟先生らが開発された培地のおかげで随分改善されたようですね。 実際、生殖工学実施者として大変ありがたく思っています。私達の研究所では、BALB の遺伝子改変マウ スを使われている研究者が多数いらっしゃいます。 その関係で、BALB の遺伝子改変マウスを使っての IVF の要望が多い状況です。 勉強不足で申し訳ありませんが、その培地を使って BALB の凍結精子の IVF 成績はどの程度なのでしょう か？（もし宜しければ教えて下さい。） A. BALB においても、FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM を併用すれば、８０％程度の受精率が 得られます。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 時々成績が悪くなる（特に産仔率）が、原因不明なことが特に困る。 必要数の偽妊娠メスマウスを計画的に準備することができず、移植が予定通り進まない。 少数のメスマウスで効率良く確実にプラグがつくようするにはどのようにしたらいいのか？ A. 発情前期の雌を的確に見分けることが大切です。効率的に見つける方法は、毎日、夕方の一定時間 （午後３～５時）に雌の外陰部を良く観察することです。 外陰部が赤く大きく腫脹している個体は、なかなか見つけられないかも知れませんが、毎日良く観察す ると、外陰部が赤く腫れている発情前期の個体を見つけやすくなります。 なお、発情周期に関係なく、PMSG７.5IU 投与４８時間後に精管結紮雄と同居させ、膣栓（プラグ）を確 認した雌をレシピエントとして用いることも可能です。 なお、現在では、新鮮胚でも凍結融解胚でも１～３日間冷蔵保存可能であり、その移植成績も変わりま せん。 一日に作製されるレシピエント数が限られているのであれば、胚の冷蔵保存を行い、翌日か翌々日に胚 移植可能です（４日間：胚作製当日、保存後１，２，３日目の移植が可能）。 実施している技術については、特に問題はない。 ただ、未実施の技術に関していうと、精子の凍結保存は試験的に行っていたが、融解後の受精率が低く 安定的にマウス作成ができていないという問題に遭遇している。 A. FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM の併用をお勧めします。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 技術内容に関することとは異なりますが、当施設の現状では実際に生殖工学技術を利用する機会が少な いので、せっかく学んだ技術を忘れてしまうのではないかと不安に感じています。 飼育管理業務との兼ね合いもあり練習の場を十分確保できていないのが実状ですが、出来るだけ練習す る機会を設けようと思っています A. 定期的な実施をお勧めします。 卵管内胚移植を行っているが、移植マウスにより産仔数が大幅にばらついてしまう（１～１２匹）。 A. 膣栓を確認した（膨大部の腫れも確認）レシピエントの卵管に、経卵管壁卵管内胚移植法にて確実 に胚を移植すれば、比較的安定した移植成績が得られると思います。 精子の凍結保存で、融解後の受精率が低いこと。・たまに移植での出産後、食殺されるケースがある点。 A. 精子凍結保存に FERTIUP 保存液、体外受精には FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM の併用を お勧めします。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 食殺には、様々な要因が考えられます。リッターサイズが少なかったり（１～３匹）した場合、分娩遅 延が起き、レシピエントがナーバスになり食殺してしまうケースが多くみられます。 また、分娩直後の飼育環境による原因もあります。例えば、分娩直後、頻回にレシピエントや産子に触 れたり、金属音を発したりすると、食殺の原因になりますので、注意が必要です。 なお、出産前後１週間はケージ交換をしない。また、マウスハウスの利用や、育児ケージを紙で囲うな どで暗くするなどの工夫をお勧めします。 精子の凍結保存で、融解後の受精率が低いことがありましたが、その後は順調です。 A. 精子凍結保存に FERTIUP 保存液、体外受精には FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM の併用を お勧めします。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 凍結精子の実施にあたり、精子濃度に依存的に体外受精の成績が左右される場合が多い。 大学の卒業研究等において生殖工学技術を用いるため技術の習得には一定の時間を要する。 A. 精子凍結保存に FERTIUP 保存液、体外受精には FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM の併用を お勧めします。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 生殖工学技術は体外受精、胚・精子の凍結保存、胚移植などの技術を組み合わせることによって、初め て応用が可能となります。 従って、学生の指導においてもある程度時間がかかるのは、やむを得ません。 Tg マウス、KO マウス等の作成をしていますが、採卵数が一定しないため無駄が多い。動物室の環境等の 問題も有ると思いますが、気候などにかなり左右されるようです。 凍結卵融解後の卵の生存率が一定でない。 IVF 時、マウス系統？によって受精率が低い事が有る。 A. 一度に大量の前核期受精卵、８細胞期胚、桑実胚、初期胚盤胞などをあらかじめ、凍結保存してお き、DNA や ES のインジェクションあるいは ES と８細胞期胚の共培養時に融解して使用することをお勧め します。また、最近では、受精卵や胚の短期間（１～４日）の冷蔵保存も可能です。 定期的に凍結胚を融解することをお勧めします。 新鮮精子、冷蔵精子、凍結精子すべてにおいて、体外受精には FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM を併用するときわめて高い受精率が得られます。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 体外受精で受精率が悪い系統がいる。 精子凍結保存の融解後の生存率が悪い系統がいる。 A. 新鮮精子、冷蔵精子、凍結精子すべてにおいて、体外受精には FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM の併用するときわめて高い受精率が得られます。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html あえて言うならば、各生殖工学の技術の手法というよりも、系統差に対する技術の限界でしょうか。 A. 具体的な詳細をお知らせ頂ければ、回答致します。 連絡先：[email protected] <連絡先：[email protected]> アグリゲーションキメラで、Balb/c の胚を Recipient の ICR の子宮に戻しているが、着床率がよくない。 テストとして、ICR 胚を ICR に戻すと自然分娩までいったので手技的問題ではないと考えているが。 また、子宮移植について、卵を子宮にいれるときのキャピラリーの入れ方が難しいと感じる。27G の針 で穴を空ける時、どこまで針を入れてよいのかわからない時がある。 もともと子宮は管なので深く針は入れる必要はないと思うが、キャピラリーを入れようとすると入って いかない。 A. BALB/c アグリゲーションキメラ胚の ICR recipient 子宮への移植については、今後検討していきた いと思います。 子宮移植について、CARD では、子宮壁から 27G 針を５mm 程度、穿刺することにより、穴を開けています。 なお、キャピアリーを子宮腔に挿入する場合、子宮角先端をピンセットでつまみ、手前に引き延ばすこ とで、子宮角が直線状になり、キャピラリーの挿入が容易になります。 ICSI の技術習得が出来ていないので，凍結精子を使用する際に，体外受精で得 られる胚が少なかった場 合のその後の対応に不安がある。 A. ICSI は熟練が必要であるのみならず、技術レベルを維持するために、定期的な実施が必須です。 体外受精には、FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM の併用をお勧めします。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 胚の融解操作で融解後の発生の割合が低いことがある。卵管に胚移植を行うが、移植される雌マウス（偽 妊娠）の数の確保が思ったように揃わないことがある。 DNA マイクロインジェクションの操作では、機材のコンディション（針の状態、装着角度など）によるも のが大きいと感じる。 A. DAP213 を用いた簡易ガラス化保存法で凍結した場合、融解時、チューブへのシュークロース添加の タイミングが重要です。 http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/japanese/gyoumu/ebank/thaw.htm 現在では、新鮮胚でも凍結融解胚でも１～３日間冷蔵保存可能であり、その移植成績も変わりません。 一日に作製されるレシピエント数が限られているのであれば、胚の冷蔵保存を行い、翌日か翌々日に胚 移植可能です（４日間：胚作製当日、保存後１，２，３日目の移植が可能）。 ご指摘のように、DNA マイクロインジェクションの操作は、機材のコンディション、特にインジェクショ ンニードルが重要なポイントと思います。 胚保存に関しましては、融解移植試験を行っています。ですが、精子保存に関しましては、融解移植試 験を行うとなると、IVF を行うことになるかと思いますので、現在の作業量からしまして、現実的ではあ りません。 CARD の方では、どのようにされているのでしょうか？ A. CARD では、凍結保存した精子ストローを１本融解、２匹の過排卵処理雌マウスから採取した卵子を 用いて体外受精を行い、受精能をチェックしております。 また、得られた２細胞期胚は体外培養により、胚盤胞までの発生を観察しています。 何れにしても、最低限、精子凍結ストローを１本融解して、活力を確認することをお勧めします。 精子の凍結保存で、融解後の受精率が低い。透明帯部分切開・穿孔法や顕微授精(ICSI)の技術を持って いないのでこの方法はとれない。 精子・胚の凍結保存等の知識が方ほど、その精子・胚が凍結に耐えられたのかどうか。生体復元の確認 作業を行うべきではないかという声がある。また、長期保存に関しては定期的に起こして確認すべきと の見解もある。これをすべて行うと作業量が莫大に増えるので、凍結保存のメリットが薄れるようにも 思う。これらの見解者を納得させられないか、困っている。 手順通りに行った凍結胚でも融解時、胚の回収率（死滅胚・潰れた胚・透明帯が外れた胚などが多い） にばらつきがある。 凍結時、何が悪いのか。融解時の問題なのか。 問題点が分からず困っている。 A. 精子凍結保存に FERTIUP 保存液、体外受精には FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM の併用を お勧めします。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html CARD では、以下を確認する意味で凍結胚の生体復元作業を実施しております。 １ 産子へ発生するか？ ２ 生まれた産子が病原微生物に感染していないか？ ３ 遺伝子改変マウスの場合、生まれた産子へ導入遺伝子が伝達されているか？ ＊しかし、上記のチェックが困難な場合は、簡便法として、一部の胚を融解し、胚盤胞までの発生をチ ェックするだけでも、問題ないと思います。 長期保存に関しては定期的に起こして確認することはしておりません。 理由：液体窒素（-196℃）に凍結保存すれば、細胞の代謝活性はほとんどすべて停止します。唯一問題 となるのは、宇宙あるいは地下からの放射能の影響です。 しかし、これら自然界の放射能の１００倍量の放射線を２年間、凍結胚に照射後に凍結胚を融解・移植 して得られた産子には、全く影響が見られなかったという実験報告があります（つまり、２００年は OK）。 また、CARD でも１０年以上凍結保存した胚から正常な産子が得られており、移植胚の産子への発生率も、 凍結後直ちに融解・移植ものと比べて、何ら変わらないことを確認しています。 手順通りに行った凍結胚でも融解時、胚の回収率にばらつきがある点について、一概には言えませんが、 一番考えられる原因は、融解時のチューブへのシュークロース添加のタイミングと思います。マニュア ルを熟読ください。 http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/japanese/gyoumu/ebank/thaw.html 胚を液体窒素中で保存する点が大変だと感じておりま す。通常の培養細胞のように-80 度で長期保存で きれば大変楽になると思います。 A. 凍結胚を-８０℃で保存した場合、１週間程度は生存性が変わりませんが、それ以降保存すると漸 次生存性が低下し、-８０℃での１年以上の保存は不可能です（日本畜産会報、47(10), 580～587, 1976））。 凍結精子の場合、-８０℃で４ヶ月程度は活力および受精能は低下しませんが、それ以上の保存では、や はり、活力および受精能が低下します（（Exp.Anim.50(1), 83～86, 2001）。 なかなか安定した結果が得られない。（受精率が高かったり低かったり、移植した卵の着床率が高かっ たり低かったり） 透明帯部分切開・穿孔法や ICSI をしたいので習う機会が欲しい A. 定期的な実施をお勧めします。 透明帯部分切開・穿孔法や ICSI の研修については、今後検討したいと思います。 培養液は自前で調製-ストックしているが、安定した品質がなかなか保障できない。 凍結精子による IVF の成績が低いうえ安定せず、手技の問題かラインの問題かがはっきりしない。凍結 胚の融解回収率が低い（50％）。 A. 培養液・保存液等は以下で販売しております。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html http://www.ark-resource.co.jp/seihin/cryopreservation-liquid/ なお、手技については、オンラインマニュアルをご参照ください。 http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/japanese/kenkyu/sigen/manuals.html また、凍結胚の融解成績が低い原因について一番考えられることは、融解時のチューブへのシュークロ ース添加のタイミングと思います。 マニュアルを熟読ください。 http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/japanese/gyoumu/ebank/thaw.html 生殖工学技術を依頼される機会が少ないため、学んできた技術を劣化させないようにするにはどうした らよいか苦慮しています。 A. 定期的な実施をお勧めします。 技術的なことではありませんが，異動する研究者の遺伝子組換え生 物等の授受に際して，手続きがたい へん （すなわち，移転先で申請 が承認されなければ異動できないなど）で，何とかならないものかと思って います。 A. カルタヘナ等のルールがありますので、事務手続きはやむを得ないと思います。 卵を数えていると眠くなる 単為発生を高率で起こしてしまう系統が有り、前核２つを確認するのがうっ とうしかった ICR を使うと、受精日はいいのに、翌日、fragmentation を起こしてぐちゃぐちゃになっ てしまう割合が多い。アポっているのか？ICR 用の良い培地有りませんか？ A. 卵子を１０個ずつグループ分けすると、カウントが比較的容易です。 また、体外受精日の夕方、卵子内の前核を確認することは、単為発生卵の有無をチェックする上で、き わめて大切なことです。 必ず、卵子内に前核が２つあることを確認してください（単為発生卵の場合は、前核が１つ）。 体外受精した卵子の異常については、ICR 系統というより、雌マウスの週齢によるところが大きいと思い ます。 すなわち、１６週齢以上の老齢雌マウスを用いると、卵子のクオリティーが著しく低下し、退行卵や異 常分割卵の割合が増えます。 ８～１５週齢の雌マウスの使用をお勧めします。 体外受精の受精率が安定しない。 A. FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM の併用をお勧めします。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 129 系統で受精率が悪く凍結ができないことがある A. FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM の併用をお勧めします。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html Balb バック系統発生率のバラつき A. FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM の併用をお勧めします。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 排卵数の少ない動物や、精子があまりとれない動物の受精卵保存をしなければならないときに、卵の確 保のために多くの動物を必要とする。 A. 排卵数の少ない動物や精子があまりとれない動物からの受精卵の採取については、過排卵処理後、 雄と交配して膣栓を確認した雌の卵管を灌流することにより行うことをお勧めします。 凍結保存精子の融解後の受精率が低い A. 精子凍結保存に FERTIUP 保存液、体外受精には FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM の併用を お勧めします。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 精子の凍結保存で融解後の受精率が低く、業務として立ち上げられない A. 精子凍結保存に FERTIUP 保存液、体外受精には FERTIUP 精子前培養液および CARD MEDIUM の併用を お勧めします。 http://www.kyudo.co.jp/Fertiup/FER-TOP-jp.html 感染動物棟、胚操作室、SPF 動物室が別の建物で外を通って移動しなければならないこと A. 冷却した M2 などに、摘出した卵管を入れて移動させることにより、卵管内の卵子や胚へのダメー ジを緩和することが可能です。 全て１人で行っているため、他に技術を積極的に学んでくれる人材がいないこと A. 貴施設内にも生殖工学に興味のある方が、必ずおられると思います。積極的に生殖工学技術をアピ ールし、周囲からの理解を図ることをお勧めします。 透明帯切開・穿孔法や顕微授精に高額な機械、熟練した技術が必要なこと A. 透明帯部分切開・穿孔法や ICSI の研修については、今後検討したいと思います。 融解後の生存率 うのが安定しない。 マニュアルでの液体窒素から出し、中の溶液を出し 30 秒後シュークロース添加とい 少し早目の方が、うまくいくときが多い。 A. 凍結胚を融解するラボの温度によって、シュークロースを添加するタイミングが前後すると思いま す（概ね３０秒前後ですが、室温が高ければ早めに、低ければ遅めになります）。 保存液がガラス化→脱ガラス化へ変わる時期（透明であった保存液が白濁する）が目安ですので、各ラボ でご検討ください。 受精卵融解後の回収率がとても悪く苦労しています。受精卵の数もそうですが、受精卵が壊れてしまっ ているものも多く、凍結保存の行程に問題があるのかもしれませんが、何が原因か良く分からない状況 です。 A. DAP213 を用いた簡易ガラス化保存法で凍結した場合、融解時、チューブへのシュークロース添加の タイミングが重要です。 以下のマニュアル通りに実施してください。 http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/japanese/gyoumu/ebank/thaw.html
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