道衛研所報 Rep. Hokkaido Inst. Pub. Health, 55, 49-53（2005) 北海道産野生植物などの抗がん活性スクリーニング試験と 活性成 の単離・同定 An In Vitro Screening Test for Anti-cancer Components of Wild Plants in Hokkaido 兼俊 明夫 藤本 啓 井上 勝一 青栁 光敏 姉帯 正樹 佐藤 正幸 Akio KANETOSHI, Shoichi INOUE, M asaki ANETAI, Toru FUJIMOTO, M itsutoshi AOYAGI and Masayuki SATO ；anti-cancer component（抗がん活性成 Key words：screening test（スクリーニング試験） ；lung cancer cell（肺がん細胞） plant（野生植物） これまでに著者らは，抗がん剤及びその代謝活性物質の ） ；wild を 10mg/mL DMSO 溶液としスクリーニング試験に供し た． 血中濃度モニタリングによる副作用軽減のための研究 や 抗がん剤の作用機序 及び薬剤耐性機序の解明 について 薬用植物の未利用部位など：衛生研究所薬用植物園にて， 研究を行ってきた．これらの成果は抗がん剤によるがん治 植栽されている薬草の未利用部位など 28種 29試料を同様 療のための基礎的資料となったが，より安全で有効な新規 に 70％アセトン抽出した．アセトン留去後水層を塩析し， 抗がん剤の開発や臨床応用は現在も強く望まれているもの 酢酸エチル層にエキスを転溶した．酢酸エチルを乾固し， と えられる．これまでに開発された抗がん剤には植物活 性成 に由来するものも多く，本道に自生する多種・特異 残 を 10mg/mL DMSO 溶液とし，スクリーニング試験 に供した． な植物資源中には未利用の新規活性物質の存在が期待され ２．培養肺がん細胞 る．北海道に自生する野生植物にはアイヌ民族が伝承有用 スクリーニング試験には３種類のヒト肺がん細胞株 ， 植物（薬用・食用植物など）として利用したものが多いが， PC-3腺がん細胞，PC-6小細胞がん細胞及び PC-10 扁平 それらについて抗がん活性のスクリーニング試験が行われ 上皮がん細胞を用いた．いずれの細胞も 10％ウシ胎児血 たという報告はない．そこで，本研究では，抗がん剤開発 清添加 RPM I1640 培養液を用いて 37℃の５％炭酸ガス培 のための基礎的知見を得ることを目的として，アイヌ民族 養器で維持培養した． の伝承有用植物 129種 243試料及び本道に導入が期待され る薬用植物の未利用部位など 28種 29試料について，肺が ３．抗がん活性スクリーニング試験法（MTT アッセイ） 2.2×10 個/mL に調製した細胞浮遊液 90μL を，96 ん培養細胞を用いたインビトロでの抗がん活性スクリーニ マイクロプレートの各ウェルに播種した．37℃の炭酸ガス ング試験を行い，活性成 の単離・構造決定を行うととも 培養器で 48時間前培養した後，段階希釈した抽出エキス に，活性成 の作用機作についても若干の検討を行った． を 10μL ずつ加え，さらに 48時間培養後に新鮮な培養液 方 を 100μL ずつ添加した．72時間培養後（エキス添加５日 法 後）に 0.1M のコハク酸を含有する 4mg/mL の 3（4,5- １．試 料 dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H -tetrazolium アイヌ民族伝承有用植物：胆振管内白老町，江別市大麻， bromide（MTT）溶液 20μL を各ウェルに加え，さらに 札幌市篠路及び定山渓で採取した野生植物など 129種類を 部位別に ４時間培養した．培養上清を吸引除去し，DMSO を 100 μL ずつ加え，細胞内に生成した M TT のホルマザン体を け た 243試 料 に つ い て，重 量 比 約 ５ 倍 量 の 70％アセトンに 24時間浸漬し，エキスを抽出した．抽出 可溶化した．生成したホルマザン量（生細胞数に比例す 液をロータリーエバポレーターで，濃縮乾固した後，残 る）は，マイクロプレートリーダーを用い，450nm の吸 光度を測定することで求めた．各抽出エキス濃度における 生細胞の割合を半対数グラフ上にプロットし，対数関数の 北海道大学大学院地球環境科学研究科（現 札幌東徳州会病院オンコロ ジーセンター） 近似式を算出し，IC50 値（細胞生存率が 50％となるよう 49 なエキス濃度）を求めた． ンゴミシ（蔓） ，ナナカマド（若葉・若芽），ニガキ（葉）， ４．活性物質の 離精製法及び HPLC 条件 エキスは，ワコーゲル C-200によるシリカゲルカラム ハマナス（果実）など 46試料がインビトロでの抗がん活 クロマトグラフィー（45mmφ×180mm），キーゼルゲル PC-10細胞にのみインビトロで抗がん活性を示した．近 年，シャク（根茎）からは，インビトロでのスクリーニン 性 を 示 し た．ま た，No.33チ シ マ ア ザ ミ（地 上 部）は 60HF254 アルミシートによるシリカゲル薄層クロマトグ ラフィー及び 取用 HPLC で，順次 画操作を行った． グ試験で抗がん活性物質としてデオキシポドフィロトキシ 取用 HPLC 条件 カラム：Inertsil Prep-ODS カラム （20mmφ×250mm） ，移動相：アセトニトリル／水／リ ンが単離されており ，クサノオウからはウクラインとい ン酸＝90：10：0.1，流速：4.0mL/min，検出波長：240 れらのことから，本報における３種の肺がん細胞を用いた nm． 析 用 HPLC 条 件（フェオ ホ ル ビ ド 誘 導 体 の インビトロでのスクリーニング試験法は抗がん活性を有す う抗腫瘍活性を持つアルカロイドが単離されている ．こ 析） る植物成 の探索に有用であることが示唆された． カ ラ ム：TSKgel ODS-80Ts カ ラ ム（4.6mmφ×250 ，移動相：アセトニトリル／水＝80：20，流速：1.0 mm） ついで，薬用植物の未利用部位など 29試料について同 様に抗がん活性スクリーニング試験を行った．薬用植物群 mL/min，検出波長：240nm，カラム温度：40℃． ５．質量 析及び NMR 測定 にはタンニンなどの非特異的に細胞毒性を発現する成 が β-ペルタチンの質量 析は島津 QP-5050 型ガスクロマ トグラフ質量 析計を用いて直接導入法にて，EI-MS 析を行った．また，フェオホルビド誘導体 の NM R 測 した後，酢酸エチル層にエキスを転溶させた．酢酸エチル 多く含まれるため，70％アセトン抽出液のアセトンを留去 抽出によりエキス成 は数倍程度濃縮されることから， 定 は DM SO-d に 溶 解 し，日 本 電 子 製 ECP400 型 NMR IC50 値が 10μg/mL 以下の場合を有効とした．その結果， ４試料に抗がん活性が認められ，セイヨウオキナグサ（地 を用いて行った． 上部）エキスが最も強い抗がん活性を示した（表２）．そ ６．フローサイトメトリーを用いた細胞周期の測定 の IC50 値 は，PC-3で 0.7μg/mL，PC-6で 0.7μg/mL 細胞を 2.2×10 個/mL に調製し，20mm ディッシュに 及び PC-10で 1.0μg/mL であった（２回測定の平 値）． 1.8mL ずつ播種した後，37℃で 48時間前培養した．培 モッコウに関しては Jung ら や Sun ら が，シコキオー 養後，抗がん活性スクリーニング試験の 10倍濃度の活性 ル類やコスツノライドなどに培養がん細胞に対する抗がん 画 を含む培養液を 200μL ずつ加え，24時間後にトリプ 活性が認められたことを報告している． シン処理により細胞を単離し，75％エタノールで４℃，一 ２．活性成 の 画と同定 夜固定した．洗浄後，100μg/mL の RNase で RNA を消 スクリーニング試験結果や野生植物の資源量などを勘案 化し，さらに 100μg/mL のヨウ化プロピジウムで DNA し，アイヌ民族の有用植物ではナナカマド（若葉・若芽） を 染 色 し た．フ ローサ イ ト メーターは コール ター社 の 及びチシマアザミ（地上部）の２種について，薬用植物の EPICS を用い，約１万個の細胞を測定して DNA ヒスト グラムを得た．DNA ヒストグラムは付属のコンピュー 未利用部位についてはセイヨウオキナグサ（地上部）及び ターソフトを用い解析した． を行った． 結果及び カラスビシャク（地上部）の２種について活性物質の 画 セイヨウオキナグサ地上部 3.9kg から 70％アセトン抽 察 出エキスを調製し，アセトン留去後水層を塩析して酢酸エ １．スクリーニング試験 チル層にエキスを転溶し，酢酸エチル抽出エキス 42.3g アイヌ民族伝承有用植物 129種 243試料について，３種 のヒト肺がん培養細胞を用いてインビトロでの抗がん活性 スクリーニング試験を行った結果，38種 51試料に抗がん 活性が認められた（表１）．なお，細胞生存率が 50％とな るようなエキス濃度（IC50 値）が 20μg/mL 以下の場合 を活性ありと判定した． このスクリーニング試験の結果，インビトロではあるが， ３種類の肺がん細胞すべてに抗がん活性を示したのは， No.7エゾノサワアザミ（根）と No.29シャク（根茎）の ２種であった．ついで，No.12オニシモツケ（地上部）に は PC-6と PC-10細胞に，No.20クサノオウ（地上 部） には PC-3と PC-6細胞に対するインビトロでの抗がん活 性が認められた．さらに，PC-6細胞に対しては，イチイ （葉，枝） ，エゾノウワミズ ザ ク ラ（枝） ，ウ ラ ジ ロ タ デ 図 1 β-ペルタチン及び活性成 の推定化学構造 β-Peltatin：β-ペルタチン，Active component I：カラスビシャク エキスの抗がん活性成 ， ：未詳部 （根） ，クリ（果実，葉，枝） ，トチノキ（種子） ，チョウセ 50 表 1 抗がん活性を示したアイヌ民族伝承有用植物名及び部位（38種 51試料) No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 植物名及び部位 イケマ（果実） イチイ（葉） イチイ（枝） ウラジロタデ（根） エゾノウワミズザクラ（枝） エゾノコリンゴ（果実） エゾノサワアザミ（根） エゾミソハギ（地上部） エゾミソハギ（根） エビガライチゴ（果実） オオイタドリ（種子） オニシモツケ（地上部） カシワ（果実） カシワ（葉） ガマ（穂） カラハナソウ（花穂） カラハナソウ（根） カラハナソウ（根茎） クサソテツ（地上部） クサノオウ（地上部） クリ（果実） クリ（葉） クリ（枝） クロミノウグイスカグラ（果実) ゲンノショウコ（地上部） コウホネ（根） サンショウ（葉） サンショウ（枝） シャク（根茎） ショウブ（地上部） ダイコンソウ（地上部） ダイコンソウ（根） チシマアザミ（地上部） チョウセンゴミシ（蔓） ツリフネソウ（地上部） ツルコケモモ（果実） トチノキ（種子） トドマツ（種子） ナナカマド（若葉・若芽） ニガキ（葉） ノダイオウ（塊根） ノリウツギ（地上部） ハマナス（果実） ハマナス（果実） ハマナス（果実） ハマナス（葉） ハマナス（枝） ホザキナナカマド（枝） ヤブマメ（地上部） ヤマブドウ（蔓） ワラビ（根） 学 名 Cynanchum caudatum Taxus cuspidata Polygonum weyrichii Prunus padus Malus baccata var. mandshurica Cirsium pectinellum Lythrum salicaria Rubus phoenicolasius Reynoutria sachalinensis Filipendula kamtschatica Quercus dentata Typha latifolia Humulus lupulus var. cordifolius Matteuccia struthiopteris Chelidonium majus var. asiaticum Castanea crenata Lonicera caerulea var. amphyllocalyx Geranium nepalense subsp. thunbergii Nuphar japonicum Zanthoxylum piperitum Antheriscus aemula Acorus calamus Geum japonicum Cirsium kamtschaticum Schisandra chinensis Impatiens textori Vaccinium oxycoccus Aesculus turbinata Abies sachalinensis Sorbus commixta Picrasma quassioides Rumex longifolius Hydrangea paniculata Rosa rugosa Sorbaria sorbifolia var. stellipila Amphicarpaea edgeworthii var. japonica Vitis coignetiae Pteridium aquilinum var. latiusculum PC-3 N N N N N N ＋ N N N N N N N N N N N N ＋ N N N N N N N N ＋ N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N PC-6 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ N ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ PC-10 N N N N N N ＋ N N N N ＋ N N N N N N N N N N N N N N N N ＋ N N N ＋ N N N N N N N N N N N N N N N N N N PC-3 ＋ ＋ N ＋ PC-6 ＋ ＋ ＋ ＋ PC-10 ＋ ＋ ＋ ＋ PC-3：PC-3腺がん細胞，PC-6：PC-6小細胞がん細胞，PC-10：PC-10扁平上皮がん細胞． ＋：IC50 値が 20μg/mL 以下． N：影響なし． 表 2 抗がん活性を示した薬用植物名と部位 No. １ ２ ３ ４ 植物名及び部位 セイヨウオキナグサ（地上部） カラスビシャク（地上部） モッコウ（地上部） モッコウ（根） 学 名 Pulsatilla vulgaris Pinellia ternata Saussurea lappa PC-3：PC-3腺がん細胞，PC-6：PC-6小細胞がん細胞，PC-10：PC-10扁平上皮がん細胞． ＋：IC50 値が 10μg/mL 以下． N：影響なし． 51 図 2 フローサイトメトリーによるデオキシポドフィロト キシンの細胞周期に及ぼす影響 図 3 フローサイトメトリーによるカラスビシャク活性画 の細胞周期に及ぼす影響 Control：対照群，0.1μg/mL：デオキシポドフィロトキシン添加群， G ：G 期（DNA 合成準備期）細胞群，G ・M ：G ・M 期（細胞 裂準備期・細胞 裂期）細胞群 Control：対照群，1.0μg/mL：カラスビシャク活性画 添加群， G ：G 期（DNA 合成準備期）細胞群，G ・M ：G ・M 期（細胞 裂準備期・細胞 裂期）細胞群 を得た．n-ヘキサン／80％メタノールで ビシャク（地上部）エキスの活性画 性画 である 80％メタノール層画 配した後，活 をシリカゲルカラム の PC-6肺がん細胞 の細胞周期に及ぼす影響をフローサイトメトリーにて調べ クロマトグラフィー，HPLC にて順次精製した．質量 たものである．その結果，デオキシポドフィロトキシンで 析における M ピーク（m/z 414）及び EI マスフラグメ ントグラムから β-ペルタチン（図１）と推定される活性 は，G ・M 期（細胞 裂準備期・細胞 裂期）の細胞が 増加し，G 期（DNA 合成準備期）のがん細胞が減少し ていくことが示された．増殖中の細胞は G 期（DNA 合 成 36.3mg を単離した．近 年，Mimaki ら は，ヒ ロ ハオキナグサ（根）から，β-ペルタチン及び数種のサポ ニンを抗がん活性成 として単離している． 成準備期)→ S 期（DNA 合成期)→ G 期（細胞 裂準備 ついで，カラスビシャク地上部の 3.5kg から酢酸エチ ル抽出エキス 16.9g を得た．エキスを n-ヘキサン／80％ このことから，デオキシポドフィロトキシンなどの抗がん 期)→ M 期（細胞 裂期）の細胞周期を繰り返している ． アセトニトリルを用いて 配操作を行った．80％アセトニ 活性を有するリグナン化合物は G ・M 期で細胞増殖を停 止させがん細胞を死滅させていく作用機作が えられた． トリル層をロータリーエバポレーターで溶媒留去し，残っ 一方，２種のフェオホルビド誘導体を含有する活性画 た水層を塩析して酢酸エチル層に転溶し，活性画 を得た．この活性画 及び を から 2.8g では，G ・M 期の細胞は増加せず，G 期の細胞のみが一 定時間後に減少していくことが明らかとなった．このこと 取用 HPLC にて活性成 離した．収量は活性成 が約 220mg，活性 から，２種のフェオホルビド誘導体はデオキシポドフィロ が約 90mg であった．活性成 は NM R スペク トルより図１に示すような化学構造を有するフェオホルビ トキシンなどとは全く異なった作用機作により抗がん活性 成 ド誘導体であることが推定された．活性成 を示していることが明らかとなった． もほぼ同様 なお，本研究の一部は平成 14∼16年度の北海道立衛生 の構造を有するものと推測された． 研究所一般試験研究 抗がん剤によるがんの化学療法に関 ついで，チシマアザミ地上部及びナナカマド（若葉・若 芽）エキスの活性画 を HPLC にて する研究―新規抗がん剤開発のための基礎的研究― とし 析したところ，カ ラスビシャクで認められた抗がん活性成 て行われたものである． 及び をそれ 文 ぞれ，５：２及び 18：１の割合で含有していた．このこ とからチシマアザミ及びナナカマドの抗がん活性成 はカ 1) 高田寛也，兼俊明夫，高岡和夫，井上勝一：基礎と臨床， 30，51（1996） 2) 大塚 彦，井上勝一，兼俊明夫：第 56回日本癌学会 会 記事，56，617（1997） 3) Ohtsuka K, Inoue S, Kameyama M , Kanetoshi A, Fujimoto T, Takaoka K, Araya Y, Shida A：Lung Cancer, 41, 187 (2003) 4) Inoue S, Ito M, Mizuno S, Isobe H, M iyamoto H, Kawakami Y, Ohnuma T；Anal. Quant. Cytol. Histol., 10, 243 (1988) 5) Inoue S, Takaoka K, Endo T, M izuno S, Ogawa Y, Yoshida M , Ohnuma T：Lung Cancer, 17, 85 (1997) 6) 中村光博，梅原 薫，宮瀬敏男，黒柳正典，野口博司：日 ラスビシャクの活性成 と同じ２種のフェオホルビド誘導 体であることを確認した． ３．活性成 による細胞周期に及ぼす影響 これまでに著者らはヒノキアスナロ葉から抗がん作用を 示すリグナン化合物，デオキシポドフィロトキシン及び β -ペルタチン-A メチルエーテルを単離し，その作用機作 について検討した結果を報告している 献 ．さらには本 研究においても，セイヨウオキナグサ地上部から同様に抗 がん活性を示すリグナン類の β-ペルタチンを単離した． 図２及び図３はデオキシポドフィロトキシン及びカラス 52 本薬学会第 116年会講演要旨集第２ 冊，182（1996） 7) Uglyanitsa KN, Nefyodov LI, Doroshenko YM , Nowicky JW, Volchek IV, Brzosko WJ, Hodysh YJ： Drugs Exp. Clin. Res., 26, 341 (2000) 8) Jung JH, Kim Y, Lee CO, Kang SS, Park JH, Im KS： Arch. Pharm. Res., 21, 153 (1998) 9) Sun CM ,Syu WJ,Don MJ,Lu JJ,Lee GH：J.Nat.Prod., 66, 1175 (2003) 10) M imaki Y, Kuroda M, Asano T, Sashida Y：J. Nat. Prod., 62, 1279 (1999) 11) Kanetoshi A, Fujimoto T, Hayashi T, Hori Y,Aoyama M , Saito N, Tsuda M , M ori M ：Natural M edicines, 52, 444 (1998) 12) 綿貫郷子，井上勝一，兼俊明夫：第 56回日本癌学会 会 記事，56，596（1997） 13) 綿貫郷子，井上勝一，兼俊明夫：第 57回日本癌学会 会 記事，57，645（1998） 14) Watanuki S, Masuzaki T, Inoue S, Kanetoshi A： Abstract of 3rd International Congress on Lung Cancer, 263 (1998) 15）日本生化学会編：新生化学実験講座 18巻，東京化学同人， 東京，1990，p.325 53
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