第81回日本薬理学会年会 03,17‐19,2008 新規BBBモデルの機能評価 A New BBB Model: Testing Specific Function ｖ ○中川慎介1,2、 Mária A. Deli2,5、 川口裕子3、 清水谷健志3、 下野貴宣2、 山口万貴子2、 片岡泰文2,4、 丹羽正美1,2 . e‐mail: shin3@nagasaki‐u.ac.jp 1. 長崎大院・医歯薬・薬理学1（医）、 2. ファーマコセル㈱ 3. 大日本住友製薬・薬物動態研究所・探索薬物動態研究部 4. 福岡大・薬・薬学疾患管理学、 5. ハンガリーサイエンスアカデミー in vitro BBB 再構成系 ～BBB キット～ astrocytes (A) 3～5年 2～3年 5,000～ 化合物 の数 10,000化合物 5 ～ 10化合物 10,000 1 化合物 10,000 BBBの構成細胞である脳毛細血管内皮細胞、ペリサイト、ア ストロサイトを共培養し、生体内の BBB に近似した BBB in vitro 再構成モデル（BBBキット）を構築した。 pericyte リード 薬物標的 化合物 の同定 発見 ｖ リード 化合物 最適化 前臨床 試験 申請 承認 臨床試験 ｖ Blood In vitro で作用が発見された中枢神経性疾患の治療薬候補であっても、実験動物に 投与すると、その多くは脳に存在する関門である血液脳関門（Blood‐Brain Barrier; BBB）のために脳内に移行できず、実際の治療薬になり得ない。 Carrier mediated transport Paracellular transport amino nucleosides acid water‐soluble agents Hexose glucose 薬物の BBB 透過性は化学構造や分子量などから予め判断できず、脳内への移行性に 一定の法則性を見出すことはできない。 中枢神経作用薬の開発、適正な薬物治療のためには、生体の複雑な BBB と等価の システムを用いて、薬物の透過性を予測することが重要である。 200 a Shaking methods astrocyte a, b a, b, c 300 pericytes Percoll Take off the meninges Capillary nestin 0 E00 E0A EA0 E0P EP0 EAP EPA Adsorptive transcytosis Receptor‐mediated transport ｖ albumin, other plasma proteins Rat cerebral endothelial cells Efflux transporters LDL, insulin, transferrin ZO‐1 claudin‐5 α‐SM actin LDL receptor vWF 3週齢Wistarラットより前脳を摘出後、酵素・遠心処理し、毛細血管片を分離し、collagene type4 と fibronectine でコーティングした dish で培養した。培養液には、10% plasma‐derived bovine serum (PDS )/DMEM‐F12 に1.5 ng/mL basic fibroblast growth factor(bFGF), 100μg/mL heparin, insulin (5 μg/ml), transferrin (5 μg/ml), sodium selenite (5 ng/ml) (insulin‐transferrin‐ sodium selenite media supplement)を加えた. vinca alkaloids, cyclosporin A RAGE LDL receptor NG2 proteoglycan endothelial cells 遠心後 Rat cerebral pericytes MRP1 MDR 毛細血管片には一部ペリサイトが含まれており、コーティングなしの培養皿で10%FBS/DMEM にて培養するとペリサイトのみが増殖する。 ペリサイトは突起を有する多角形をしており形態的に内皮細胞と識別可能である。 Brain 脳内移行性を簡便に検定する検査キット（BBBキット）があれば、膨大な費用と時間 をかけて行われている創薬研究の効率化が図られ、より即応的で確実な創薬のスク リーニングが達成でき、中枢神経作用薬の開発に貢献できる。 GFAP blood pericyte Tight junction GLUT1 TJ endothelial cell 100 MRP 脳側 CNT2 効果発揮 LAT1 astrocyte 2‐day rats MDR 5～10年 3 astrocytes 3‐week rats OAT 前臨床試験 ap < 0.01 vs. E00 bp < 0.01 vs. EPA cp < 0.01 vs. EAP dp < 0.01 vs. EP0 ep < 0.01 vs. E0P fp < 0.05 vs. EP0 400 a, b, c pericytes (P) a, b, c, f endothelial cells (E) OATP 創薬研究 血管側 初代培養細胞 2 Day 5 TEER EPA 臨床試験 OATP 中枢神経作用薬の開発 候補薬 b, c, d, e 1 TEER (Ω×cm2) 背景・目的 Elimination of nuclear arms ! No more Nagasaki, no more Hiroshima ! Rat cerebral astrocytes アストロサイトは生後2日齢のラットよりshaking methodを用いて分離した。 培養液には10%FBS/DMEMを用いた。 結果 1~ 凍結・解凍~ 機能評価 4 EVOM Transendothelial electrical resistance (TEER) BBB キットの凍結と解凍 TEER をEVOM resistance meter (World Precision Instruments)を用いて測定した。測定値はΩ×cm2で表した。TEERはイオン移動 の指標であり、その値が高いもの程バリア機能が高いことを示している。 BBBキットの長期保存および輸送を可能とするため、凍結保存方法を構築し、 その機能評価を行った。 astrocytes RBEC 解凍後のTEERの 経時変化 TEER （Ω×cm2） 内皮細胞、アストロサイトを 凍結保存液で懸濁して播種 約2時間後、RBEC培養液1に交換 RBEC培養液2に交換 ディープリーザーへ 4日後、使用可能 ‐80℃ ディープフリザー (D) 120 TEER （% of time-0） (C) 400 200 100 0 3 4 5 6 7 8 4 12 24 保存期間 (week) efflux: Pgp, influx: OCTN1, OCTN2, PEPT1 91.7 + lipophil and high protein binding 99.6 89.6 passive hydrophilic 87.6 + passive lipophilic carbamazepine 236 + passive lipophilic 85.1 midazolam 326 + passive lipophilic, highly permeable, Pgp substrate 84.2 propranolole 296 + passive lipophilic 81.9 zolpidem 382 + passive lipophilic 71.7 212 90 87.5 - passive hydrophilic, weak base 97.1 252 - efflux 95.4 180 - organic anion, efflux (Oat1, Oat2) 94.2 epinastine 286 - efflux 94 358 - efflux (Pgp) 93.2 538 - efflux: Pgp, OATP1A2 93.1 362 - efflux (Pgp) 88.2 warfarin 346 - lipophil and high protein binding 79.8 quinidine 783 - efflux 72.8 + 923 - 781 - 420 - 909 - 491 - 300 + paroxetine 375 + buspirone chlorpromazine 422 + 355 + sertraline paclitaxel loperamide loratadine amiodarone cyclosporin 343 + 854 - 514 - 383 - 682 - 1,203 - lipophil and high protein binding, Pgp inhibitor efflux efflux efflux efflux efflux 69.8 63.6 63.1 62.3 53 52.1 64.6 62.7 57.7 53.5 51.2 44.4 100 39.4 32.3 18.7 38.4 38.3 16 4 1.6 0.1 40 60 ｔime (min) Volume(μL) PSe A A - membrane surface area 12-well Transwell clear insert: A = 1 cm2 = 10-4 m2 Pe = PSe (µl/min) / A (cm2) = 10-9 m3 / min / 10-4 m2 = 10-5 m/min = 10-3 cm/min= Pe / 60 = cm/s 80 10 10 1.0 PS mem R2 = 0.813 CNS+ drugs ｖ 39.7 20 ） (high protein binding prednisone fexofenadine hydrocortisone + 376 efflux lipophil and high protein binding passive lipophilic lipophil and high protein binding passive lipophilic passive lipophilic efflux efflux efflux: ABCG2 efflux efflux Influx: NET lipophil and high protein binding, Pgp inhibitor but not Pgp substrate, lipid soluble passive hydrophilic efflux, Pgp substrate/inhibitor 0 warfarin 226 448 0 1 PS total Pe (cm/min) PS total [C]A – abluminal tracer concentration VA – volume of abluminal chamber [C]L – initial luminal tracer concentration Recovery rate (%) transport PS mem 100 indomethacin midazolam carbamazepine antipyrin carisoprodol phenytoin caffeine zolpidem atenolol cimetidine acetylsalicilic acid + 6 day PStotal – slope of the clearance curve for BBB kit PSmem – slope of the clearance curve for cell-free filter PS dimension: µl/min = 10-9 m3/min 200 epinastine passive lipophilic + + 346 5 day 1 PS e membrane BBB kit 300 fexofenadine acetylsalicilic acid passive lipophilic + 358 + 408 [C]L cimetidine + 260 + 434 [C]A × VA Volume (μL) = quinidine 188 410 4 day 5 sulpiride prednisone hydrocortisone antipyrin carisoprodol indomethacin caffeine risperidone fluvoxamine trazodone fluoxetine hydroxyzine haloperidol vincristine digoxin prazosin vinblastine verapamil nortriptyrine 0 1 cm/s) ± 252 TEER (Ω×cm2) 200 150 100 2 透過係数の算出 in vitro Pe 341 MW CNS 350 凍結BBBキットを解凍後、4～6日目でTEER値及びsodium fluorescein の透過性に大差はなかった。(G) (10-6 sulpiride phenytoin name 300 凍結BBBキットのロット間でのTEER値は、 150～320 Ω×cm2 であったが、このTEER値の差は、 sodium fluorescein とEvans’ blue albumin の透過性に大きな影響を与えなかった。(E, F) 1 400 Recovery rate (%) 250 300 4 凍結BBB キットは24週間保存しても、TEER値に変化がなく、半年間の保存が可能であった。(D) BBBキットの精度を確認するために、既存薬物 40 種類を用いて透過性検定を行った。 検定化合物（各 1μM）を管腔側に入れ、20,40,60 分後に脳側に漏れ出てきた薬物濃度を測 定し、回収率及び透過係数を算出した。 transport 200 400 6 解凍後の時間 既存薬物40種類の透過性検定 MW CNS 150 500 凍結BBBキットは解凍後8日目まで高いTEER値を保っており、4日目以降は200 Ω×cm2以上を示した。(C) 結果 2~ Drug permeability assay~ name 0 TEER 凍結による、内皮細胞及びアストロサイト、ペリサイトの機能障害はみられなかった。(B) 60 解凍後の時間 (Day) 0 Na‐F Pe 8 凍結BBBキットは、非凍結BBBキットのTEER値と同レベルであり、凍結による機能障害はなかった。(A) 凍結BBBキットの 保存期間 80 0 2 解凍後4,5,6日目のTEERとPe 10 凍結BBBモデル 100 300 4 EPA ** p<0.01 vs E00 ## p<0.01 EOA 0 Day3 EP0 Day2 ‐80℃ 37℃に温めた培地を加える 200 150 100 0 E00 0 pericyte ペリサイトの播種 6 100 100 凍結BBBキット コーティング ** Pe (10-6 cm/s) 150 ｖ ** 200 8 300 Na-F Pe (10-6 cm/s) BBBキットの解凍 保存（‐80℃） （1 week ~ 24 week) 200 ** in vivo Papp※ (10-6 cm/s) BBBキットの凍結 BBB キットの解凍 300 Na‐F EBA Day 4 Lot.9 +hydrocortisone (500nM) BBB キットの凍結 300 (G) TEERとPe相関 10 400 ## (F) (E) Lot間におけるTEERのばらつき 構成細胞機能への影響 TEER (% of E00) + puromycin (4μg/mL) pericytes (B) 凍結によるBBBキット 非凍結BBBキット 凍結BBBキット Lot.8 5 Lot.10 4 Lot.7 3 Lot.6 2 Lot.5 1 Lot.3 0 4 Lot.1 Lot.2 3 TEER （Ω×cm2） 2 TEER (% of E00) 1 TEER （Ω×cm2） 0 Lot.4 凍結、非凍結 BBBキットの比較 (A) Day sodium fluorescein (Na‐F, 376Da) 内腔側にsodium fluorescein （Na‐F , MW:376Da ）及び Evans’ blue albumin（EBA , MW:67kDa）を入れその透過性を検討した。 Na‐F は細胞間隙を透過する物質の指標で、EBA は経細胞性輸送の指標である。 凍結/解凍方法 Isolation of Rat brain microvascular endothelial cells (RBEC) Evans’ blue albumin (EBA, 67kDa) Transcellular transport and paracellular transport 0.01 indomethacin propranolol quinidine 0.1 paroxetine vinblastine hydrocortisone 0.01 digoxin vincristine cimetidine 0.001 0.01 CNS- drugs 回収率（recovery rate)の算出 caffeine 1 ※文献値より 0.10 1.0 10 100 in vitro Pe (10-6 cm/s) 薬物の溶解性や吸着等の問題による判定ミスを防ぐため、回収率（recovery rate)を算出した。 luminal 中枢作用性薬物と非中枢作用性薬物は透過係数により判別可能である。 BBBキットで得られた化合物の透過係数と文献値より得られた in vivo 値は良好な相関関係を示した。 [luminalt=60 ] + [abluminal t=60] ×100 Recovery rate (%) = [luminal abluminal t=0 ] Transwell® membraneの検討 Conclusion 6 7 Transwell®内での長期保存が可能な凍結方法を構築した。 Transwell® Permeable Supports Evans' Blue Albumin FITC-Dextran 4,000 sodium fluorescein 700 membrane 0.4μm 4×106 pores/cm2 3401 Polycarbonate (PC) 0.4μm 1×108 pores/cm2 3462 Polyester (PE) 3.0μm 2×106 pores/cm2 3402 Polycarbonate (PC) 3.0μm 2×106 pores/cm2 ** ｖ 500 300 100 polyester (PE) membrane Polycarbonate membrane の 3.0μm の pore sizeを 持つ Transwell® は大分子の透過性にも対応した membrane であり、その TEER 値は polyester membrane よりも高値を示した。 80 Pe (10-6 cm/s) Pore density Polyester (PE) TEER (Ω×cm2) # polycarbonate (PC) membrane Pore size 3460 70 endothelial cells 60 pericytes 50 astrocytes 40 Transwell® 30 Filter ｖ PharmaCo‐Cell Company Ltd. compounds 20 luminal 10 abluminal e‐mail : [email protected] URL:http://www.pharmacocell.co.jp brain capillary 0 PE-0.4μm PC-0.4μm PE-3.0μm 0 BBB kit BBBキットで得られた化合物の透過係数と文献値より得られた in vivo Papp 値は良好な相関関係を示し、 実用的な薬物脳内移行性検定システムであることが実証できた。 membrane PC-3.0μm BBBキットは新薬開発、薬物相互作用による副作用判定、既存薬の改良による脳内移行性の判定、 病態モデルを用いた病態解析などに利用でき、理想的な BBB in vitro 再構成モデルである。
© Copyright 2024 Paperzz
