アルコールの肝における高比重リポ蛋白代謝に及ぼす影響

(
8
0
2
)
奈医誌(]. N
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.A
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s
.
)4
0，802-810，平 1
アルコールの肝における高比重リポ蛋白代謝
に及ぼす影響に関する研究
奈良県立医科大学第 3内科学教室
藤森由佳子
STUDYO NTHEROLEOFTHELIVERINALCOHOLINDUCED
ALTERATIONOFHIGHDENSITYLIPOPROTEINMETABOLISM
YUKAKOFUJIMORI
The3rdDψa
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dNovember3
0，1989
Summary: The e
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and7w
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)(P<0.001
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緒
ー
国
1
9
7
7年
， Y
ano ら1)はハワイ在住の日本人を対象に曙
i
d
e
r
i
c
h リポ蛋白からの t
u
r
no
v
e
rの充進9)，などが想
定されているが未だ明らかではない.
告した.その後，アノレコーノレの比較的少量長期飲用が，
肝は， HDLの合成，異化およびその機能発現に必要な
l
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e(LCAT) の産生な
どを介して HDL代謝に深く関わっている臓器であり，
その障害時には種々の HDL代謝異常が観察されてい
i
g
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ip
o
p
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巴i
n (HDL)ないし HDL
血中 h
る10)11).また，肝はアノレコーノレ代謝においても中心的な役
c
h
o
l
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t
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r
o
l (HDL-ch) を上昇させるという報告が相次
ぎ2)3)既に F
raminghams
t
u
dy
4)等で虚血性心疾患の反危
割を果たしており，その影響によって特有の肝障害をお
好品と冠硬化症発生の関係について疫学調査をおこない，
アノレコーノレは冠硬化症の発生に負の相関を示すことを報
険因子であることが指摘されてきた H
DL-chの上昇と
アノレコーノレ飲用との関係が注目されるに至った.
アノレコール飲用による HDL上昇の機序については，
r
i
g
l
y
c
町田
肝または腸での合成の場加 8)一円異化の遅延 8)，t
こすことも多い.
そこで著者は，アノレコーノレ飲用による HDL代謝の変
化における肝の役割について， HDLの主要構成成分で
I
Iとの関連を中心に臨床的
あるアポリポ蛋白 A-I，A
ならびに実験的検討をおこなった.
アルコーノレの肝における高比重リポ蛋白代謝に及ぼす影響に関する研究
対象と方法
1.臨床的検討
対象はすべて男性で，飲酒家恒例c1日エタノーノレ消
(
8
0
3
)
00mlに対し
い
，ローターは RP-65T を用いた.血清 1
5% EDTA溶液 (pH7
.
0
) を 1ml加え， 1
0，
000rpm
4Cで 3
0分間遠心をおこない，浮上したカイロミクロン
0
ample 1
0
0ml に対し 9
.
8g の
を除去した.その後， s
0g以上，飲酒歴 5年以上〉である. HBs抗原陽
費量 4
NaClを加え (d=1
.0
6
3
) チューブに 9mlずつ分注し，
性例，輸血歴を有する例，糖尿病合併例は対象から除外
3
0，
0
0
0rpm1
6Cで 1
6時間違心をおこない，上層の v
e
r
y
0
した. これらに一般肝機能検査，腹部超音波検査，腹部
lowd
巴n
s
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nおよび lowd
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巴i
n
computedtomography(CT)検査を施行し，さらに異
分画を除去した.残りの液状面より 1~1. 5cm 下でチュ
常が認められた者について腹腔鏡，肝生検をおこない 3
ーブスライスし， s
ample1
0
0mlに対し 1
9gの NaBrを
群に分類した.すなわち A 群は肝障害のない 1
9例 (
2
8
0，
0
0
0
加え (d=1.21)チューブに 6.4mlずつ分注し， 4
~65 歳，平均年齢 41 歳)， B群は肝硬変を除く慢性肝障
4時間遠心をおこない，上層 1mlを採取し
rpm1
6Cで 2
害を有する 35 例 (26~74 歳，平均年齢 44 歳入 C 群は肝
a
m
p
l
eを
同操作を 2回繰り返して精製した.その後 s
硬変を有する 7 例 (37~57 歳，平均年齢 50 歳〉である.
0
.
9% NaClで透析をおこなった.次にエタノーノレ・エ
0
これらで血清 HDL-ch
，アポリポ蛋白 A-I および A
ーテノレ (3 :2) 法で脱脂し，粉末状のアポ HDLを得
I
I(A-1，A-II)を測定した. HDL-chは燐タングステ
た.そのアポ HDL を
， 8 M 尿素および 0
.
0
0
1M の
ン酸 Mg++法同(沈殿試液は HDL-ch沈殿試液，栄研
EDTAを含む T
r
i
sHCl(pH8
.
6
) に溶解し，同ーの緩
化学を使用し，発色にはデタミナ TCS
，協和メディクス
ephadexG-200のカラムにかけて，ゲノレ炉過を
衝液で s
を用いた.)で測定し，A-I，A-IIは一元免疫鉱散法
S
F
1
0
0，アドバン
おこない，フラグションコレクター (
(SRID)13)アポ A-Iプレート，アポ A
I
Iプレート，第
テック東洋株式会社〕にて 3mlすやつに分割採取し . A
一化学薬品〕で測定した.
I はフラクションナ γ パー 57~60 で最大ピ -!l を有す
また，別に非飲酒家の慢性肝炎 11 例 (35~67 歳，平均
る分画として得られた (
F
i
g
.1).得られた分割は 0
.
0
1M
年齢 4
9歳)
1
とも同様の検討をおこない，健常対照として
T
r
i
s
-HCl(
p
h8
.
6， 0
.
0
0
1M の EDTAを含む〉緩衝液
非飲酒家 10 例 (26 歳 ~49 歳，平均年齢 43 歳〉を用い
i
a
f
l
omembraneU M
で透析をおこない尿素を除去後， D
2をもちいて Amicon52型セノレ中で、限外炉過法により
た.
2
. 実験的検討
ラット初代培養肝細胞を用いて，エタノーノレ(ETOH)
の A-I産生への影響を検討した.
a) 動物および試薬
Sprague-Dawley(S-D)系ラットは，日本 SLC株式
会社より購入した.
濃縮した.以上のようにアポ HDLから脱脂して得られ
た A-Iを 8 M尿素を含むポリアクリノレアミドゲノレを支
持体としてディス F電気泳動をおこなったところ単一の
F
i
g
.
2
)
.
パンドを形成した (
c
)抗血清の作製
r
巴u
ndの compl巴t
ea
d
j
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v
a
n
t
前述の A-Iを等量の F
L
[
3，4
，5
-H(N)]一Leucine(>1
4
0Ci/mmoI)は，
とよく混和して，家兎の足指皮内にタンパク量として 1
NewEnglandNu
c
l
e
a
rRes巴a
r
c
hP
r
o
d
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c
t
sより購入し
mg注射して感作させた. 3週間後に追加免疫として l
3
-2mgを Freundの c
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m
p
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tとともに管筋
た.
C
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s
e (Sigma Type 1)は Sigmac
h
e
m
i
c
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l
company，St
.L
o
i
s，USA より， Ca2+および M2+を含
内に注射し，その 7日後に全採血し，抗ラット A-I血清
を作製した.抗ラット A-I血清は免疫電気泳動により，
u
l
b
e
c
c
oの PBS液 (PBS(
ー
)
)
， Hanks液
，
まない D
ラット全血清に対して HDLに相当する一本の沈降線の
HEPES緩衝液 (
p
h7
.
3
)，W
i
l
l
i
a
m
s
'E培地，ペニシリ
F
i
g
.
3
)
. 抗血清は 2mlずつサンフeノレチュー
みを示した (
ン G(
PC-G) は
， FlowL
a
b
o
r
a
t
o
r
i
e
sI
n
c
.USAより，
ブに分けー 7
5Cの冷凍庫で保存した固抗ラットアノレブミ
abora
ファンギゾン R (アンホテリシン B) は GIBCOL
ン血清は C
a
p
p
e
l社製をもちいた.
0
t
o
r
i巴s
，NewYork
，USA より，硫酸ストレプトマイシ
d) ラット肝細胞の初代培養
ン (SM) は明治製薬より購入した.
2
4時間絶食後の体重 2
0
0gの S-D系雄性ラットを用
b) ラットアポリポ蛋白 A-Iの分離・精製
体重 150~200
gの S-D系雄性ラットの新鮮プール血
いて， C
o
l
l
a
g
e
n
a
s
e潅流法 15)と低速遠心法により肝実質
細胞を分離した.
清から S
canu ら14)の方法に準じて HDLを分離した.
ラットにネンブターノレ〔輸入販売元大日本製薬株式会
超遠心機は，日立製作所 8
5P-73型分離用超遠心機を用
社)0.3mlを腹腔内に注射して麻酔し開腹した.門脈を
(
8
0
4
)
藤森由佳子
切開しカニューレ(東レ・ホスピタノレサプライハツピ←
35mm径の Falconc
u
l
t
u
r
ed
i
s
hに 1X1
05細胞/cm2 の
キャス 1
8G) を挿入し，そのまま 30ml/minの流速で
濃度で播いた.培養液には PC-G000μ/m
l
)
， SM(
1
0
0
ベリスクポンプを作動させ 3TCに保温した 0.5mM
μg/ml
)，ファンギゾン R (0.25μg/m
l)を添加した.培
EGTAを含む PBS (-)を潅流し続けた.この状態で
養は，
4-5分濯流を続け， Hanks液に 0
.
0
5%となるように
ーター中でおこなった. 2
4時間培養後，血清および、ホノレ
5%CO29
5%空気を気相として 3TCインキュベ
溶解したコラゲナーゼ溶液 (
2
0
0ml)に交換し再び潅流を
モンを含まない W
illiams'E培地に変更し，さらに 1
2時
始め 10-20分後，肝臓各葉をハサミで切り離しシャーレ
閲培養後実験に用いた.
に移した.肝を軽く細分した後，先太の駒込めピベット
d) ETOH添加実験
で軽く 2-3回ピベッテッング L， 2-3枚のガーゼを
培養液中に分泌された A-Iおよびアルブミン量を測
v
重ねた細胞炉過器〔池本理化〕で炉過した. ヨ液を 50ml
定するため二種の方法〔短時間培養系および長時間培養
0gX1分間の低速遠心を 3回おこ
細胞遠心管に集め， 5
系〉で検討した.
ない，ほぼ均ーな肝実質細胞を得た.分離肝細胞の v
i
a
-
b
i
l
i
t
yは
，
トリパンブルー染色試験で 9
5%以上であっ
た.その肝実質細胞を 1
0%仔牛血清， 1μMデキサメサ
ゾン
1μMインスリン， 10mMHEPES緩衝液を含む
なお培養液への ETOH添加量は， ETOH添加 2時間
後での細胞の
v
i
a
b
i
l
i
t
y および遊離酵素活性 (LDH，
GOT，GPT)に変化のみられなかった 100mMまでとし
た (
T
a
b
l
e1
)
.
まず短時間培養系では， L-[
3，4
，
5
-3H(N)
一
]Leucine5
W
i
l
l
i
a
m
s
'E 培地に 5x105細胞 /mlの濃度に浮遊し，
0.
0
.
0
.
1
5
0
.
1
0
1
0
2
0
3
0
4
0
5
0
6
0
7
0
8
0
9
0
1
0
0 1
2
0
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F
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s were separated by density gradient
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n and
nT
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d 8M
chromatographedonS巴phadexG-200 i
巴a
.
u
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Table1
.Enzymea
c
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u
te
t
h
a
n
o
l(ETOH)
ETOH
10mM
ETOH
20mM
ETOH
100mM
ETOH
200mM
3
.
7
9
9
.
5土 4
1
0
4
.
5士3
9
.
3
6
6
.
3士1
7
.
6
1
:1
2
.
3
5
9
.
3:
2
2
3
.
8土 3
6
.
8
4
55土 4
.
5
.
2
4
7
.
2士4
4
3
.
5:
1
:4
.
4
4
9
.
3土 6
.
7
8
7
.
0土 8
.
9
3
.
5:1:1.0
.
6
3
.
8士0
4
.
0土1.4
5
.
0土 0
.
8
78土1.0
¥ ¥ Control
LDH
(
IU/
l
)
GOT
(
IU/
l
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GPT
(
IU/
l
)
目
Mean士s
.D
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f4e
x
p
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i
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s
目
(
8
0
5
)
アノレコーノレの肝における高比重リポ蛋白代謝に及ぼす影響に関する研究
i/
mlを含み， 1
0，2
0， 1
0
0m Mの各濃度に ETOH
μC
ュベートし，さらにヤギ抗家兎 γ ブロプリン抗体(1/
を加えた培養液で肝細胞を 2時間細胞した.その後細胞
1
0希釈) 1
0
0
μ
Iを加え 4'
cで 24時間インキュベートし
00μIを PBS(pH6
.
8
) 200μlで希釈し，
液を回収し， 1
た.その後 2
0
0
0Xg，1
5分間遠心し，得られた沈澄を 0
.
1
家兎抗 A-I血清(1/1
0
0希釈) 100μlまたは家兎抗ア
% sodiumdodecyls
u
l
f
a
t
巴を含む PBSで 5回洗浄し
cで 48時間インキ
ノレブミン血清 0/100希釈〕を加え 4'
た.沈溢は 1NNaOHで溶解し，
5mlのシンチレーシ
ョン溶液 (
U
n
i
v
e
r
G
e
lI
I;Nakaraic
h
e
m
i
c
a
l
s，Kyoto，
J
a
p
a
n
)を加え，その放射活性を液体、ンンチレーションカ
ウンター (mod
巴1L
S-7500，BeckmanI
n
s
t
r
u
m
e
n
t
sI
n
c
.，
Brea，C
a
l
if)で測定した.
0，2
0，1
0
0m Mの各濃
次に長時間培養系で、も同様に 1
4時間毎に交換し， 4日
度に ETOHを加えた培養液を 2
M
i
n
i
c
o
n，
目の培養液を分離して，これを蛋白濃縮器 (
Amicon，D
iv
i
s
i
o
no
fW.R
.GraceandC
o
.，Danvers，
M
a
s
s
.
)にて 1
0
0倍濃縮した後， SRIDでアポ蛋白および
g
a
r
.
アルブミンの定量をおこなった.平板ゲノレは 1% a
A-I
o
s
巴に抗血清をそれぞれ 1%
混じて用いた.
3
. 検定方法
データーはすべて平均(土標準偏差〉で表現し，有意
差検定には分散分析および S
t
u
d
e
n
tの t
t
e
s
tを用いた.
結果
1.臨床的検討
1)飲酒家における血清
HDL-ch， A-，
1 A-I
I値
(
T
a
b
l
e2
，F
i
g
.4
)
血清 HDL-chは
， A 群では，健常対照に比べて有意
な上昇を示した .B群では対照に比べて有意に低下し，
C群ではさらに著明な低下を認めた.
A-1は HDL-ch と同様の変動傾向を示した.すなわ
ち
A 群では対照に比べて有意な上昇を示した .B群で
は対照との有意差はみとめなかった .C群では対照と比
べて有意に低下していた.
A-IIは対照と比べて A 群
， B群ともに有意差はない
が
，
A
B
C群では著明な低下を示した.
2)各群における血清 HDL-ch，A-1，A-I
I値の相関
F
i
g2
.P
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l
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c
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B
)
.
(
T
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b
l巴 3
)
目
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0
anti-ratwholeserum
←
rat wholeserum
anti-ratapo. A-1 serum
0
A群および C群では HDL-chは
， A-1との聞に有意
F
i
g
.
3
.Immunoelectrophor
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i
cp
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主
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Component
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.
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.
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.
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s
.
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.A-1v
s
.
a
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o
.A-I
I
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*
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6
6
8
目
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4
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n=37
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.
2
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.
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*
0
.
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.
2
8
6
6
*Pく 0
.
0
5
判
目
(
8
0
7
)
アルコーノレの肝における高比重リポ蛋白代謝に及ぼす影響に関する研究
な正の相関を示したが， A-IIとは有意な相関を示さなか
の培養液中に分泌された A-Iへの [
'
H
JL
e
u
c
i
n
eの取
I
った . B群およびヌす照群では， HDL-chと A-1，A-I
り込みは， 100mMまで濃度依存性に増加し， 100mMに
の聞に有意な相関は認められなかった.対照群と B群お
おいて有意な増加を認めた.一方アノレブミンへの [
'
H
Jー
よび C 群において A-Iと A-IIの間には，有意な正の
Leucine の取り込みには，有意な変化はなかった (
F
i
g
相関が認められた
5
)
.
3) B 群の組織学的分類と HDL-ch，A-，
1 A-I
I値
ETOH添加後 4日目の培養液の SRIDの計測から，
A-Iおよびアノレブミンの定量値の平均とその比を検討
の関係 (Tabl巴~
，A-1，A-I
Iともに対
非特異的変化群では， HDL-ch
すると， A-1は ETOH20mM添加群でピーク値を示
，A-1
照と差を認めなかった.脂肪肝群では， HDL-ch
しており，アルブミン量に対する比率で、も明らかに増加
は対照と差がなく， A-IIは増加傾向を示した.肝線維症
していた (
Table5
)
.
考
群では， HDL-ch
， A-1，A-I
Iともに低下傾向にあり，
察
とくに A-IIの低下は有意で，肝硬変 (C群〉に近い傾
向を示した.飲酒家慢性肝炎群では， HDL-ch
， A-1，
今回の成績では，飲酒家における血中 HDL-chの上昇
A-IIいずれも非飲酒家慢性肝炎群とのくには差を認め
は肝障害のない群にのみ見られ，肝障害を有する群では
なかった.
むしろ低下する傾向を示し，とりわけ肝硬変では著明な
2
. 実験的検討
低下を示した.以上のことより，肝障害の有無およびそ
ラット初代培養肝細胞において， ETOH添加 2時間後
の重症度が HDL-ch の重要な変動因子であることが示
Table4
. Seruml
e
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fHDL-ch.，
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目
*
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唆された.また HDLの主要な構成蛋白である A-1，
本研究では， HDL-chおよび A-Iの上昇は正常肝機
A-IIについてみると，肝障害のない群で A-Iのみ増加
能を示した群にのみ認められただけであり，肝硬変を除
が認められ，しかもそれが HDL-chの変動と良い相関を
く軽度慢性肝障害群とした B群では，対照と有意差を認
示したことより， HDL-chの上昇は A-Iの増加と密接
めないとしづ成績を得た.この際，軽度肝障害群に何を
u
l
l
y
1
6
)らも，肝
な関係を有しているものと考えられた. H
含めるかが重要な問題であると考えらたので， B群をさ
障害のない飲酒家での HDL-chは，非飲酒家のそれより
らに組織分類別に 4群に分け， HDL-ch
，A-1およびA
30-40%高く，その値は飲酒家と正の相関を示すと報告
I
Iについて検討を加えた.非特異的変化群および脂肪肝
巴v
e
n
y
i問らは，重症肝障害を伴わない飲酒家
している .D
群では， HDL-ch
，A-1，A-I
Iともに非飲酒家群と有意
n
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lおよび s
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sを含む群〉
群 (
差を認めなかったのに対し，肝線維症群では HDL-ch
，
a
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s，
で HDL は上昇し，重症肝障害 (
A-1，A-I
Iともに低下しており，とくに A
I
Iは有意に
c
i
r
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h
o
s
i
sを含む群〉を伴う飲酒家では HDLの上昇を認
低下し，肝硬変群に近い値を示した.慢性肝炎群では，
u
h
a
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l
1
8
)らも，正常肝および
めないと報告している. D
HDL-ch，A-1，A-I
Iの値は飲酒家と非飲酒家の聞では
重症肝障害を伴わない欽酒家群 (
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da
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ほとんど差がなく， HDL増加に働くアノレコールの作用
h
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l
i
ch
e
p
a
t
i
t
i
sを含む群〉で， A-I，A-II， HDL，の
はこのような慢性実質性肝障害では消失するものと考え
-IIの上昇は HDL
，の上昇
上昇を報告し， A-1および A
られた.肝硬変群では従来の報告日)と同様に， HDL-ch
，
，は，肝障害を重
によるものと推察している.また HDL
A-I，A-IIの低下とくに A-IIの著明な低下を認めた.
症化するに従い低下したと報告している
P
o
y
n
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)らは，飲酒家 5
8
1例において，正常肝および肝
(
8
0
9
)
アルコーノレの肝における高比重リポ蛋白代謝に及ぼす影響に関する研究
線維症を伴わない脂肪肝で A-Iの有意な上昇を認め
2) エタノーノレは，ラット橋養肝細胞のアポワポ蛋白
線維化の出現で明らかに A-Iは低下すると報告してお
A-Iの産生を特異的に元進させた.以上より，アノレコー
り，アノレコールによる肝での A-Iの生合成の誘導が，線
ノレによる血中 HDLの増加には，肝でのアポリポ蛋白 A
維化により低下するものと考察している -1の合成充進が重要な役割を呆たしているものと考え
今回の臨床的検討において，飲酒者での HDL-chの上
られた.
昇は，肝での A-I産生の増加に関係があることを示唆
する成績が得られた.しかし，なお小腸での合成， TG-
本論文の要旨は，第 2
8回日本消化器病学会大会，第 1
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回日本肝臓病学会西部会，第 7回アノレコーノレ代謝と肝研
による修修も否定できない. L
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)らは，慢性アノレコーノレ
究会において発表した.本研究の研究費の一部は文部省
投与ラットを用いた実験で，血清中の t
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科学研究費 (
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) によった.
HDL-chの上昇傾向ならびに潅流肝からの HDL-chの
稿を終わるに臨み，終始御懇篤なる御指導，御校閲を
増加傾向を認めたと報告している.そこで著者は培養肝
賜った恩師辻井正教授に深甚の謝意を捧げるとともに，
細胞を用いた i
nv
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o実験系を用いて，アノレコーノレが肝
御助言，御校闘を賜わった生化学教室神谷知弥教授，な
に直接作用して A-I産生を増加させ得るかどうかを検
らびに病態検査学教室中野博教授に深謝致します.ま
討した.
た本研究の遂行にあたって常に御指導，御助力をいただ
その結果，培養肝細胞による A-Iの産生はエタノー
いた病態検査学教室岡本康幸講師ならびに御助力をいた
ノ
レ
を 100mM添加して 2時間後で有意な増加を示した
だいた第 3内科学教室福井博講師ならびに教室の諸兄
が，アノレプミンの産生は変動しないとしづ成績を得た圃
に感謝の意を表します.)
このことより，肝細胞の A-I産生の増加はアノレコーノレ
の直接作用によるものであり，また A-Iに特異的な反
応であることが窺われた.さらに 4日間培養後の SRID
による検討でも， A-1産生はエタノーノレ 20mM添加群
文
献
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