Istraživanja genoma čoveka
I. Novaković
Nasledna osnova čoveka
• Podeljena je u 23 para hromozoma
– + DNK u mitohondrijama
99.9995%
0.0005%
Organizacija humanog genoma
HUMANI GENOM
GENOM JEDRA
3000 Mb
oko 30.000 gena
geni i srodne sekvence
(~30%)
MITOHONDRIJALNI GENOM
16,6 Mb
37 gena
DNK van gena
(~70%)
13 gena za i RNK
22 gena za tRNK
2 gena za rRNK
Jedinstvene ili srednje
repetitivne sekvence
kodirajuca DNK
(~10%)
geni u jednoj ili par kopija
npr.: za hormon rasta,
insulin, distrofin
nekodirajuca DNK
(~90%)
familije gena
clanovi u tandemskom nizu
npr.: za rRNK, tRNK
snRNK, histone
clanovi rasuti u genomu
npr.: geni za globinske lance,
imunoglobuline, kolagen
pseudogeni
fragmenti gena
introni, sekvence koje
se ne prevode itd.
jedinstvene sekvence
ili mali broj kopija
(~80%)
srednje do visoko repetitivne
sekvence
(~20%)
tandemska ili netandemska ponavljanja
rasuti ponovci
Genetički-DNK polimorfizam
 Humani genom:
3x109 parova
9 bp
3x10
nukleotida
svaki 1000. nukleotid
je polimorfan
 Razlike u nukleotidnom sastavu tj. gradji DNK
koje se sreću u populaciji zdravih ljudi
 f alela > 1%, hetrozigoti > 2%
 Genetički markeri, DNK profil, predispozicija za
bolest...
Tipovi DNK polimorfizma
 Polimorfizam pojedinačnih nukleotida (SNP)
AAGGT
C ili T
 Različiti broj uzastopnih
ponovaka (VNTR, CNV)
 Deleciono/insercione varijante
GTTC
(CA)25 = ALEL 5
(CA)20 = ALEL 4
(CA)15 = ALEL 3
(CA)10 = ALEL 2
(CA)5 = ALEL 1
Izvori DNK za analizu

Biološki materijal u kome su
ćelije sa jedrom:








krv
horionske resice,
amnionska tečnost,
krv iz pupčanika
bris bukalne sluzokože
trag telesne tečnosti
koren dlake
...
PCR – lančana reakcija polimerizacije
molekula DNK
PCR (
umnožavanje odredjenog
segmenta DNK pomoću
enzima Taq polimeraze
Real-time PCR
Sekvenciranje DNK
“Genski čip”
- test hibridizacije na mikroploči
“Genski čip”
- test hibridizacije na mikroploči
Genetička osnova bolesti
• Hromozomske aberacije
• Monogenske bolesti
– AD, AR
– X vezano
– preko mtDNK
• Poligenske bolesti
monogenske
forme
poligenske/multifaktorske forme
Rodoslovna stabla
muškarac
žena
brak u srodstvu
dvojajčani blizanci
nepoznat pol
jednojajčani blizanci
brak
aficirana osoba
mrtva osoba
prenosilac X-vezane
recesivne osobine
bez potomstva
heterozigot za
mutaciju koja se
prenosi autozomima
proband
Mutacije gena
– Delecije = gubitak dela ili celog gena
– Duplikacije/insercije = “višak” dela gena
– Supstitucije (point mutacije) = zamena jednog
para baza drugim parom
– Povećanje broja ponovaka u genu
Rezultat:
Protein za koji je gen zadužen je
IZMENJEN ili ODSUTAN
Segregaciona analiza
• Na koji način se svojstvo-bolest prenosi u
porodici?
• Da li način prenošenja odgovara nekom
od Mendelskih načina nasleđivanja:
•AR, AD
•XR, XD
•Y
Mapiranje gena =
određivanje mesta tj. pozicije u genomu
METODE MAPIRANJA GENA
funkcionalno
poziciono
1,2
2,3
protein
RNK
1,3 1,4 3,4
2,4
1,4
DNK
Linkage analiza
Lod skor > 3
Linkage analiza –
analiza vezanosti
• Zajedničko nasleđivanje dve (ili više)
osobina
– Osobina + osobina
• Osobina + bolest
• Bolest + bolest
Odgovorni geni
se nalaze na istom
hromozomu
Analiza vezanosti =
Analiza polimorfnih DNK markera u genomu
Lod skor
• Lod > 3
verovatnoća vezanosti lokusa
= 103 : 1 = 1.000 : 1 (
• Lod < -2
verovatnoća vezanosti lokusa
= 10-2 : 1 = 0,01 : 1
Fahrov sindrom
Idiopatska kalcifikacija bazalnih
ganglija
Am. J. Hum. Genet. 65:764–772, 1999
Identification of a Locus on Chromosome 14q for Idiopathic
Basal Ganglia Calcification (Fahr Disease)
Daniel H. Geschwind,1,2 Maxim Loginov,1,2 John M. Stern2
1Neurogenetics Program and 2Department of Neurology, UCLA
School of Medicine, Los Angeles
starost početak glavni simptomi
III-15a
III-18
III-26
IV-7
IV-25
IV-27
IV-32
IV-45
IV-49
IV-51
V-4
V-74b
V-75b
V-83
V-84
73
76
70
50
52
58
43
46
41
40
38
29
28
10
9
60
70
58
23
37
*
36
37
40
18
*
12
13
6
5
Parkinsonizam, distonija
Parkinsonizam
disfagija, Parkinsonizam
psihoza, Parkinsonizam
fokalna distonija, tremor, napadi panike
grčevi, jerking
ataksija, tremor
fokalna distonija, disfagija
Parkinsonizam
tremor pri pisanju, fokalna distonija, horea
fokalna distonija, grčevi
fokalna distonija, tremor
Tremor, disfagija
disfagija, fokalna distonija
Tremor, distonija
*početak ne (10–20 years, by history).
a Pozitivan CT, poznata klinička slika, ali nije ispitivan
(deceased).
b Verovatno aficiran (negativan CT, <30 god.)
Mapiranje gena =
određivanje mesta tj. pozicije u genomu
Mapiranje gena =
određivanje mesta tj. pozicije u genomu
14q13-21
Gen kandidat….
Genomics 84 (2004) 577–586
Cloning, genomic structure, and expression profiles of TULIP1
(GARNL1), a brain-expressed candidate gene for 14q13-linked
neurological phenotypes, and its murine homologue
Thomas Schwarzbraun,a John B. Vincent,b Axel Schumacher,b Daniel H.
Geschwind,c Joao Oliveira,c Christian Windpassinger,a Lisa Ofner,a Michael
K. Ledinegg,a Peter M. Kroisel,a Klaus Wagner,a and Erwin Peteka,*
a Institute of Medical Biology and Human Genetics, Medical University of Graz, Harrachgasse 21/8,
A-8010 Graz, Austria
bNeurogenetics Section, Centre for Addiction and Mental Health, Clarke Division, 250 College
Street, Toronto, ON M5T 1R8, Canada
c Department of Neurology and Neurogenetics Program, David Geffen School of Medicine,
University of California at Los Angeles,
Los Angeles, CA 90095, USA
Ali...
American Journal of Medical Genetics Part B (Neuropsychiatric Genetics)
147B:1319–1322 (2008)
Brief Research Communication
Exclusion of Linkage to Chromosome 14q in aLarge South Tyrolean
Family With IdiopathicBasal Ganglia Calcification (IBGC)
Claudia Be´u Volpato,1* Alessandro De Grandi,1 Ebba Buffone,2 Irene
Pichler,1 Uwe Gebert,3 Gunther Schifferle,4
Rudolf Scho¨nhuber,2 and Peter P. Pramstaller1,2,5
1Institute of Genetic Medicine, European Academy, Bolzano, Italy
2Department of Neurology, Central Hospital, Bolzano, Italy
3Department of Radiology, Marienklinik, Bolzano, Italy
4Department of Radiology, Central Hospital, Bolzano, Italy
5Department of Neurology, University of Lubeck, Lubeck, Germany
J Mol Neurosci (2009) 39:346–353
2q37 as a Susceptibility Locus for Idiopathic Basal Ganglia
Calcification (IBGC) in a Large South Tyrolean Family
Claudia Béu Volpato, Alessandro De Grandi, Ebba Buffone, Maurizio Facheris,
Uwe Gebert, Günther Schifferle, Rudolf Schönhuber, Andrew Hicks &
Peter P. Pramstaller
Mapiranje gena za ICBG
FS2
22
13
11
32
33
21
FS 9
FS9
42
24
11
12
33
11
FS 7
FS7
21
23
14
33
22
21
FS5
23
33
13
22
31
11
FS 6
FS 2
FS3
25
14
15
31
32
21
FS 5
D14s596
D14s1014
D14s75
D14s306
D14s288
D14s259
FS1
24
12
12
33
31
21
FS6
35
34
35
21
12
11
FS 3
FS 1
FS 4
FS4
24
22
12
13
11
21
FS8
52
42
51
11
21
12
FS 8
Analiza vezanosti u porodici iz Srbije
q = 0.00
D14s596 -3.36
D14s1014 -2.998
D14s75 -3.132
D14s306 -6.573
D14s288 -3.345
D14s259 -5.876
haplotip -5.706
Kostić Vladimir, M. Lukić-Ječmenica, I. Novaković, V. Dobričić, L. Brajković,
M. Krajinović, C. Klein, A. Pavlović: Exclusion of linkage to chromosomes
14q, 2q37 and 8p21.1-q11.23 in a Serbian family with idiopathic
basal ganglia calcification. J Neurol. 2011;258(9):1637-42.
Wang C, Li Y, Shi L, Ren J, Patti M, Wang T, de Oliveira JR,
Sobrido MJ, Quintáns B,
Baquero M, Cui X, Zhang XY, Wang L, Xu H, Wang J, Yao J,
Dai X, Liu J, Zhang L, Ma H, Gao Y, Ma X, Feng S,
Liu M, Wang QK, Forster IC, Zhang X, Liu JY
"Mutations in SLC20A2 link familial idiopathic basal ganglia
calcification with phosphate homeostasis". Nat Genet 44 (February 2012).
8p12-p11
Sodium-dependent phosphate transporter 2
PIT-2, inorganic phosphate transporter
Mutations in SLC20A2 are a Major Cause of Familial Idiopathic
Basal Ganglia Calcification
Neurogenetics, November 2012
F1 Family
F5 Family
c.508delT
c.583_584delGT
ICBG porodica iz Srbije
• Nema mutacije u SLC20A2 genu!
• GENETIČKA HETEROGENOST!
NATURE METHODS, VOL.5 NO.1, JANUARY 2008
Next-generation sequencing transforms today’s biology
Stephan C Schuster
Poligenske bolesti
Genetička
osnova
fenotip
(više parova gena)
Faktori sredine
Studije asocijacije
Udruženost genskih polimorfizama sa
nekom od poligenskih bolesti.
Sklonost tj.
podložnost!
Pristupi u izučavanju multifaktorske
osnove bolesti
• Studije asocijacije
Učestalost polimorfizma:
bolesni
:
zdravi
Geni
kandidati
Čitav
genom
Izbor gena-kandidata
– Na osnovu poznavanja etio-patogenetskih
činilaca
– Geni identifikovani u analizama vezanosti
– Geni identifikovani kod animalnih modela
Alzheimer-ova demencija
– ApoE polimorfizam
e4 alel
PREDISPOZICIJA!
– ranije obolevanje (e4/e4, e4/e3) !
– 50-75% heterozig. NE OBOLEVA!
– drugi geni, faktori sredine...
genotip
AD
Kontr.
AD
Kontr.
e4/e4, e4/e3, e4/e2
64%
31%
47%
17%
e3/e3, e2/e3, e2/e2
36%
69%
53%
83%
SAD
Japan
Studije asocijacije u čitavom genomu
(Genome Wide Association Studies, GWAS)
Studije asocijacije čitavog genoma
(Genome Wide Association Studies, GWAS)
• Simultana analiza >10.000 SNP
• Microarray tehnologija
(genski čip)
GWAS i Alzheimerova bolest
GWAS i Alzheimerova bolest
GWAS i Alzheimerova bolest
GWAS i Alzheimerova bolest
GWAS i Alzheimerova bolest
GWAS i Alzheimerova bolest
• Meta analiza 12 GWAS studija
• + 5,043 ispitanika sa Mayo klinike
(2,455 AB : 2,588 K)
“Investigation of 15 of the top candidate
genes for late-onset Alzheimer’s disease”
Belbin et al, 2011
GWAS i Alzheimerova bolest
• BIN1, bridging integrator-1
• CLU, clusterin
ili complement lysis inhibitor (CLI)
• CR1,complement receptor
• EXOC3L2,
exocyst complex component 3-like 2
• PICALM
phosphatidylinositol binding clathrin
assembly protein
imunomodulacija
unutraćelijski
transport
GWAS i Alzheimerova bolest
• TNK1, tyrosine kinase, non-receptor, 1
• GAB2, GRB2-associated-binding protein 2 (adapter,
aktivator fosfatidil inozitol kinaze 3)
• LOC651924
PSEUDOGEN, sličan sa
Ubiquitin-like 1-activating enzyme E1B
• GWA_14q32.13,
• PGBD1, piggyBac transposable element derived 1
• EBF3, early B-cell factor 3
Regulator ćelijskog ciklusa, TSG
“A genome-wide survey of human
short-term memory”
• 909.622 lokusa
• Faza 1: Švajcarska (333 ispitanika)
– Faza 2: Švajcarska (254 ispitanika)
– Faza 3: Nemačka (922 ispitanika)
– Faza 4: Srbija (523 ispitanika)
A Papassotiropoulos etal,
2010
“A genome-wide survey of human
short-term memory”
rs6731900
rs565348
rs10930201
rs11235714
rs2278729
Hromozom
Gen
2
rs225344
11
SCN1A
(sodium channel, voltage-gated, type I, alpha subunit)
21
…Funkcionalna NMR
SCN1A (rs10930201) genotip:
AC
AA
"A genome-wide survey and functional brain
imaging study identify CTNNBL1 as a memoryrelated gene"
• CTNNBL1 = Beta catenin like protein 1
• Hromozom 20
A Papassotiropoulos etal,
, 2011.
Problemi kod studija asocijacije
• Nekonzistentnost rezultata usled:
– Različite brojnosti ispitivanih populacija
– Geografskih/etničkih specifičnosti
– Razlika između polova
– Sadejstva gen-gen i gen-sredina
“Missing heritability”
B. Maher, Nature, 2008
Moguća objašnjenja
• Rešenje nam je “pred nosom”
• Odgovorne su retke varijante SNPs, koje
GWAS ne analiziraju
• Ključne su CNV (copy number variations)
a ne SNP
• U pitanju je vrlo složena interakcija gena i
sredine, kroz generacije...
Sinteza proteina:
transkripcija i translacija
DNK
RNK
G*
translacija
AAAAAA
obrada
Era OMIKS-a
• Genom
– Egzom (sve kodirajuće sekvence)
•
•
•
•
•
Transkriptom
Proteom
Metabolom
Interaktom
….