“บัณฑิตล้ านนา ก้ าวสู่วิชาการระดับชาติและสากล”
งานวันวิชาการนักศึกษาระดับบัณฑิตศึกษา คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ พ.ศ. 2550
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
การแยกบริสุทธิ์สารโพลีฟีนอลในไวน์ แดงสยามมัวส์ และศึกษาประสิ ทธิภาพการออกฤทธิ์ยบั ยั้ง
การเจริญเติบโตและการชักนาการตายแบบอาปอบโตซิสในเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดและมะเร็งปอด
ชนิดเซลล์เล็ก
Purification of polyphenols of Siamois® red wine and study of their
efficacy of antiproliferative and apoptosis-inducing activity against
erythromyelogenous leukemic and small cell lung carcinoma cell lines
วิภพ สุ ทธนะ, สมาน เดชสุ ภา, ไพบูลย์ เรื องพัฒนพงศ์, มนตรี ตั้งใจ, วินิจ ช้อยประเสริ ฐ, วรวรรณ ปรารมภ์,
สมพงษ์ ศรี บุรี, สุ ชาติ โกทันย์ และ สารี มัน่ เขตต์กรน์*
Wipob Suttana, Samarn Dechsupa, Paiboon Reungpatthanaphong, Montree Tungjai, Winit
Choiprasert, Vorawan Prarom, Sompong Sriburee, Suchart Kothan, and
Samlee
Mankhetkorn*
Laboratory of Physical Chemistry, Molecular and cellular Biology (PCMCB), Department of
Radiologic Technology, Faculty of Associated Medical Sciences, Chiang Mai University,
Chiang Mai, Thailand.
*E-mail:[email protected], Fax: (665)394-9207
บทคัดย่อ
ใ น ก า ร ศึ ก ษ า นี้ ไ ด้ ท า ก า ร วิ เ ค ร า ะ ห์
แยกบริ สุทธิ์ สารโพลีฟีนอลในไวน์แดงสยามมัวส์ปริ มาณและศึกษาความสามารถในการยับยั้งการเจริ ญเติบโ
ตของเซลล์มะเร็ งเม็ดเลือดขาวและมะเร็ งปอดชนิ ดเซลล์เล็กที่ไวและดื้อต่อยา (K562, K562/adr, GLC4 และ
GLC4/adr) พ บ ว่ า ผ งไวน์ แ ด งส ยาม มั ว ส์ ป ระ ก อ บ ด้ ว ยส าร ก ลุ่ ม ฟ ล าโวน อ ยด์ ก รด ฟิ น อ ลิ ก
และโปรแอนโธไซยานิ ดิ น โดยคิ ด เป็ นมวลรวม 45% ของน้ า หนัก แห้ ง โดยส่ วนประกอบหลัก ได้แ ก่
เคอร์ ซิ ติ น (IC50; K562 = 10 ± 0.8 M and GLC4 = 22 ± 1.6 M), เคอร์ ซิ ติ น ไกลโคไซด์ (IC50;
K562 = 6 ± 1 M and GLC4 = 8 ± 1 M) และแคมป์ เฟอรอล (IC50; K562 = 13.2 ± 0.8 M and
GLC4
=
20.6
±
1.6
M)
และโมเลกุ ล ดังกล่ าวสามารถยับ ยั้งการเพิ่ ม จานวนของเซลล์ม ะเร็ งที่ ด้ื อต่ อยาได้ดีก ว่าเซลล์ที่ ไวต่อยา 2
เท่าและการผสมสารสกัดจากไม้มะเม่าสามารถยับยั้งการเพิ่มจานวนของเซลล์มะเร็ งได้ดีกว่าไวน์แดงสยามมั
ว
ส์
อ
ย่
า
ง
เ ดี
ย
ว
และยัง พบอี ก ว่ า ผงไวน์ แ ดงสยามมัว ส์ ส ามารถชั ก น าให้ เซลล์ ม ะเร็ ง เกิ ด การตายแบบอาปอบโตซิ ส
ซึ่ งมีโมเลกุลฟลาโวนอยด์เป็ นสารออกฤทธิ์ หลักและมีตาแหน่งการออกฤทธิ์ ที่ไมโตคอนเดรี ยของเซลล์
Abstract: The chemical analysis and separation of polyphenols of Siamois® red wine and
their potential inhibition of leukemic and small lung carcinoma cell growth were studied. The
“บัณฑิตล้ านนา ก้ าวสู่วิชาการระดับชาติและสากล”
งานวันวิชาการนักศึกษาระดับบัณฑิตศึกษา คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ พ.ศ. 2550
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Siamois® red wine powder was composed of flavonoids, phenolic acids and
proanthocyanidin and the total polyphenolic contents is 45% of dried weight powder.
Quercetin (IC50; K562 = 10 ± 0.8 M and GLC4 = 22 ± 1.6 M), quercetin glycoside (IC50;
K562 = 6 ± 1 M and GLC4 = 8 ± 1 M) and kaempferol (IC50; K562 = 13.2 ± 0.8 M and
GLC4 = 20.6 ± 1.6 M) were majority found. These molecules exhibited two fold of
antiproliferative activity against MDR cells compared with their corresponding parental cells.
The mixture of mamoa wood extract and Siamois® red wine show higher antiproliferative
activity than Siamois® red wine alone. In addition, Siamois® red wine powder induces
apoptosis in all cell lines and flavonoids were proposed as their active molecules by which
mediate action at mitochondria of cells.
Introduction: Over the past decades, searching for new drugs for using in oncology has
refocused on natural polyphenols including phenolic acids, flavonoids, tannins. The
flavonoids consists of various groups of natural low molecular weight polyphenolic
compounds which can be found in all vascular plants. Flavonoids exert a wide range of
biological activities including antioxidant, anticarcinogenic, antiproliferative and antiviral
actions. Moreover flavonoids, such as genistein, apigenin, and quercetin, are also known as
apoptotic inducers and MDR modulators. In addition, a huge of reports demonstrated that red
wine drinking has been associated with the decrease in risk of cancers such as lung, colon,
and breast. In this study, the physicochemical properties, cytotoxic and apoptosis-inducing
activity of Siamois® red wine and mamoa wood extracts against both parental cancer cells
(erythromyelogenous leukemic, K562 and small cell lung carcinoma, GLC4 cells) and their
corresponding drug-resistant cell lines (K562/adr and GLC4/adr) were investigated.
Methodology: The Siamois® red wine used in this experiment was made of purple grapes
(Vitis vinifera Portugieser) by Laboratory of Physical Chemistry, Molecular and Cellular
Biology (PCMCB), Faculty of Associated medical Sciences, Chiangmai University,
Chiangmai, Thailand. The wine was lyophilized and kept under N2-saturated atmosphere at
-20 ºC. Mamoa wood (Antidesma thwaitesianum Müll.Arg.) of 5 years age, were collected
from Amphor Muang, Kalasin Province, Thailand. The compounds were extracted using a
hydroethanolic solution, 1 kg of air-dried wood during 5 months was extracted after soaking
for 2 weeks in 2.5 liter of 12 % ethanol. The mixture solution was shaken daily, then filtered
using Whatman no.4 (Merck) prior to lyophilization and analysis. The crude extracts were
primarily separated using opened column chromatography and characterized using
spectrophotometer. Acid butanol hydrolysis will be applied to confirm whether fractions
obtained from opened column chromatography are the proposed condensed tannins. The
analysis of polyphenol composed in crude extracts was performed using HPLC.
Cytotoxicity assay. Cells were incubated in culture medium in 24 well plates with various
concentrations of compounds at 37 oC in a humidified atmosphere of 5% CO2 for 72 hours,
then the number of cells was determined using MTT assay.
Apoptosis assay. Cells were incubated in culture medium with various concentrations of
crude extracts at 37 oC in a humidified atmosphere of 5% CO2 for 24 hours and treated cells
were collected and stained with Annexin V conjugated with FITC and PI (apoptosis detection
“บัณฑิตล้ านนา ก้ าวสู่วิชาการระดับชาติและสากล”
งานวันวิชาการนักศึกษาระดับบัณฑิตศึกษา คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ พ.ศ. 2550
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------kit from R&D Systems). Flow cytometry analysis was performed in a Coulter Epics XLMCL (Coultronics France SA) and cells were evaluated on 5000 events per sample.
Results, Discussion, and Conclusion: The lyophilized of Siamois® red wine was composed
polyphenols and the main polyphenols were anthocyanins, flavonols, phenolic acids, catechin,
epicatechin, and proanthocyanidin units. All compounds accounted for 45% of polyphenolic
powder in weight. These polyphenols efficiently inhibited cell growth against 4 cancer cell
lines (K562, K562/adr, GLC4 and GLC4/adr) with higher efficient in drug-resistant cells
than their corresponding parental cells. Early apoptotic cells were detected at about 30 min
for quercetin and kaempferol, at a longer time this decreased slightly while necrotic cells
increased. There is evidence from measurements made in whole cells that there is decrease in
the m as measured by fluorescent probes during initiation of the apoptotic cascade, and
that, this is accompanied by the release of cytochrome c from mitochondria to cytosol. This
signifies an existing transition/check point, switching cell submission to apoptosis or necrosis
which obviously detected for quercetin. The mitochondria play a central role on drug-induced
cell death is confirmed. Overall our results demonstrate that natural flavonoids of Siamois®
red wine are of interest to study as anticancer agents in particular to circumvent the MDR
phenomena.
References:
(1) Gurjeet, K., Marinella, R., Francis, R., Usha, R.P. (2006) Thromb. Res. In Press,
Corrected Proof, Available online 28 February 2006.
(2) Dolara, P., Luceri, C., De Filippo, C., Femia, A.P., Giovannelli, L., Caderni, G.,
Cecchini, C., Silvi, S., Orpianesi, C., Cresci, A. (2005) Mut. Res. 591, 237-246.
(3) Kothan, S, Dechsupa, S, Moretti, J. L, Vergote, J, Mankhetkorn, S. (2004) Can. J.
Physiol. Pharmacol. 82, 1084-1090.
(4) Liu, R. H. (2004) J. Nutr. 134 (12 Suppl), 3479S-3485S.
Keywords: Polyphenol, cytotoxicity, apoptosis, multidrug-resistance (MDR), Siamois® red
wine.