Action de la 'dicarnitine' sur la croissance et
Tossification d'ebauches de tibias et de femurs
d'embryons de poulet cultives in vitro
par
SUZANNE LIEBECQ-HUTTER1
Institut d'Histologie et Laboratoire de Pathologie et
Therapeutique Generates de I'Universite de Liege
AVEC UNE PLANCHE
INTRODUCTION
LA carnitine naturelle (/3-hydroxy-y-butyrobetaine)
(CH3)3 = N+-CH 2 -CHOH-CH 2 -COOdecouverte dans les extraits de viande (Gulewitsch & Krimberg, 1905) a ete
reconnue identique a la vitamine B T presente dans l'extrait de levure ou de
foie nitre" sur charbon (Fraenkel & Blewett, 1947; Fraenkel, Blewett, & Coles,
1948), pour la larve de Tenebrio molitor par Carter, Bhattacharyya, Weidman,
& Fraenkel (1952 a et b). Le dimere synthetise (Bicarnesine Labaz) resulte de
l'esterification de la fonction alcool d'une molecule de carnitine par la fonction
acide d'une autre molecule (Dechamps, Buu-Hoi, Le Bihan, & Binon, 1954):
(CH3)3 = N - C H 2 - C H O H - C H 2 - C O
Cl
O
I
HOOC-CH 2 -CH-CH 2 —N = (CH3)3
Cl
Cette 'dicarnitine' racemique a la meme action vitaminique que la carnitine
pour le Tenebrio molitor (Leclercq, 1954).
D'autre part, Leclercq (1950) avait reconnu a la vitamine T de Goetsch (1946)
une action favorisant la croissance des larves de Tenebrio molitor. Cette vitamine T est extraite des termites et d'autres insectes ainsi que de champignons
{Penicillium, Torula, Hypomyces). Knoth (1952) a demontre qu'elle favorise la
croissance desfibroblastesde la rate de cobaye en culture, moins cependant que
1
Author's address: Laboratoire d'Histologie et d'Embryologie de I'Universite de Liege, 20 rue
de Pitteurs, Liege, Belgium.
[ J. Embryol. exp. Morpta. Vol. 4, Part 3, pp. 279-298, September 1956]
280
S. LlfiBECQ-HUTTER—ACTION DE LA 'DICARNITINE'
l'extrait embryonnaire. Cette preparation de vitamine T est trop impure pour
Ton puisse attribuer ses effets a une substance identique a la carnitine.
La carnitine est tres largement repandue dans la nature, particulierement dans
les tissus animaux (Fraenkel, 1951,1953,1954). L'embryon de poulet de 12 jours
pesant 4 g. en contiendrait 44-88 yug. /g. de tissu sec (Fraenkel, 1953). Son intervention n'a pu jusqu'a present etre mise en evidence chez les Vertebres. La
culture organotypique nous a permis de realiser les conditions particulierement
favorables pour deceler l'effet de cette substance in vitro sur la croissance et la
differentiation des ebauches de tibias et de femurs d'embryon de poulet. En
effet, la culture d'un organe tel qu'une ebauche osseuse permet de le soustraire
aux diverses influences nerveuses et humorales de l'organisme. De plus, les elements nutritifs peuvent etre controles. Pour mettre en evidence un facteur de
croissance, il est essentiel, comme le remarque Chevremont (1942-56), d'offrir a
la culture un milieu ni trop riche ni trop pauvre: tres favorable a la croissance, le
milieu ne permet plus a une substance supplemental de montrer une action
quelconque; trop deficient, l'addition de cette substance est insuffisante a re*tablir
une croissance normale. Cet etat de carence partielle etait d'autant plus necessaire a realiser que l'extrait embryonnaire, principal constituant du milieu de
culture, contient de la carnitine comme nous venons de le preciser. Nous pouvions evidemment offrir un milieu entierement synthetique comme l'ont fait
Wolff et ses collaborateurs (1953 a et b), mais les croissances minimes, les anomalies et les pycnoses trop nombreuses que nous avons observees en l'essayant ne
nous ont pas autorisee a travailler dans ces conditions qui ne correspondaient
pas a nos desiderata pour cette recherche. Nous devions done diluer l'extrait
embryonnaire (20 a 200 fois). Nous avons ete ainsi capable d'observer regulierement l'effet de la 'dicarnitine' sur la croissance et sur l'ossification des ebauches
osseuses in vitro.
Trois criteres d'experiences nous ont permis d'apprecier ces effets. L'augmentation lineaire a ete evaluee par des mesures pendant la culture. L'analyse de
l'ossification a ete faite par des mesures de l'epaisseur maximum de l'os periostique forme dans des coupes histologiques. Enfin une vaste numeration des
mitoses dans 1'ebauche entiere nous a donne un tableau du rythme de la croissance in vitro et de la localisation des mitoses dans les ebauches cultivees.
TECHNIQUES ET METHODES
Culture des tibias et femurs
Les ebauches de tibias et de femurs d'embryon de poulet sont prelevees au
76me jour d'incubation dans l'oeuf, dissequees soigneusement et deposees a la
surface du milieu solide selon la technique du verre de montre en chambre
humide (Fell & Robison, 1929). Les repiquages ont lieu tous les deux ou trois
jours.
La dicarnitine racemique est introduite dans le liquide de dilution entrant
SUR LES EBAUCHES OSSEUSES IN VITRO
281
dans la preparation du milieu nutritif. La solution est sterilisee au filtre Seitz.
Une part aliquote de liquide de dilution entre dans la preparation des temoins
correspondants.
Milieux synthetiques. Deux types de milieux synthetiques ont ete essayes:
celui de Bergmann & Niemann (1936) tel que l'utilisent Wolff et ses collaborateurs (Wolff, Haffen, Kieny, & Wolff, 1953; Kieny, 1953), et un melange des dix
acides amines essentiels de Rose dans les concentrations indiquees par White
(1946). Dans les deux cas les solutions d'acides amines etaient additionnees a
volume egal d'une gelose (1 pour cent) dans le liquide de Gey. Les lavages et les
dilutions sont faites au liquide de Tyrode ou au liquide de Pannett et Compton.
Nous n'avons pas ajoute de penicilline ni d'acide paraminobenzoiique au milieu
de Bergmann et Niemann (B/10) comme l'ont fait Wolff et ses collaborateurs
(Wolff, Haffen, Kieny, & Wolff, 1953ft; Kieny, 1953).
L'un et l'autre de ces milieux ont du etre abandonnes car nous avons obtenu
des croissances minimes, peu distinctes des allongements par imbibition (temoins
composes de Tyrode seul), des gonflements anormaux du cartilage hypertrophie
et de trop nombreux noyaux en pycnose.
Milieux naturels. Le caillot sur lequel sont deposees les ebauches est constitue
d'un volume de plasma de coq, de preference non heparine et d'un volume d'extrait embryonnaire (3 gouttes). Ce dernier est prepare selon Fell & Robison
(1929), c'est-a-dire au cours de chaque seance de repiquage a l'aide d'un embryon
de 11 jours. Le liquide de Pannett et Compton est remplace par le liquide de
Tyrode, aussi bien pour la preparation de l'extrait embryonnaire que pour les
lavages et les dilutions.
L'extrait embryonnaire est dilue de 20 a 200 fois selon les besoins de l'experience.
Fixation et colorations des pieces
Les ebauches sont fixees au Zenker acetique apres lavage dans le liquide de
Tyrode. Les coupes sont faites longitudinalement a 6 p d'epaisseur. La coloration d'Azan est utilisee pour l'examen histologique des pieces, particulierement
pour l'analyse du perioste. Seules les coupes passant par le centre de la diaphyse
sont retenues. La coloration a l'hematoxyline picro-ponceau est utilisee pour le
compte des mitoses. Toutes les coupes en serie de l'ebauche entiere sont alors
soigneusement recueillies.
Mensuration des pieces osseuses
Les ebauches vivantes sont mesurees a l'aide d'un oculaire micrometrique
place dans la loupe montee. Ceci permet une mesure journaliere de l'augmentation lineaire pendant la culture in vitro sans avoir a deplacer les objets, les
conditions d'aseptie etant respectees. Les resultats sont exprimes en pour cent
d'augmentation lineaire.
L'analyse du perioste est faite sur les coupes. L'epaisseur maximum d'os
forme est mesuree sans tenir compte des assises defibroblasteset d'osteoblastes.
282
S. LlfiBECQ-HUTTER—ACTION DE LA 'DICARNITINE'
Cette mesure est faite en plagant un oculaire micrometrique dans le microscope.
Les resultats sont exprimes en /*.
Compte des mitoses
Les mitoses sont comptees dans l'ebauche entiere, soigneusement coupee en
serie a 6 /x d'epaisseur. Toutes les coupes sont recueillies. Des controles arithmetiques ainsi que des mesures des dimensions des cellules nous ont autorisee
a ne pratiquer les comptes de mitoses que dans une coupe sur trois. Un carton
delimitant un carre precis est place dans l'oculaire. Un compteur a mitoses
nous permet d'enregistrer les quatre phases de la division cellulaire. Les resultats
ont ete notes separement pour les epiphyses et pour la diaphyse (perioste).
Le nombre des cellules permettant d'etablir les index mitotiques est evalue en
comptant les champs (carre place dans l'oculaire) de 3 types de cellules: cartilage
a petites cellules, cartilage a grandes cellules, perioste (assises defibroblasteset
d'osteoblastes). Des controles effectues au hasard ont toujours donne les memes
valeurs approximatives pour ces trois types de cellules. II n'a jamais ete tenu
compte du tissu conjonctif proliferant autour des ebauches en culture. Cette
evaluation du nombre des cellules est pratiquee toutes les 6 coupes.
ACTION DE LA DICARNITINE SUR L'AUGMENTATION LINEAIRE
Dans une premiere serie d'experiences, des ebauches de tibias et de femurs
sont cultivees en presence de trois concentrations de dicarnitine (2-5, 0 25, et
0025 mg./I.). Seule la premiere de ces concentrations permet d'observer une
augmentation lineaire superieure a celle des temoins (voir tableau 1), deja apres
7 jours de culture. Les deux concentrations inferieures donnent des courbes de
croissance se confondant avec celles des temoins.
TABLEAU 1
Augmentation lineaire obtenue apres 7 jours de culture en presence de trois
dilutions d'extrait embryonnaire
Dilution
finale
d'extrait
embryonnaire
1/2
1/20
1/200
Tibias
Temoins
Femurs
2-5 mg.ll.
dicarnitine
/o
0/
/o
70
43
15
83
57
35
Temoins
%
55
37
15
25 mg.ll.
dicarnitine
V
/o
62
47
20
Sept concentrations de dicarnitine allant de 15 a 25 mg./l. sont ensuite
essayees sur des tibias et des femurs cultives pendant 7 jours sur plasma (1/2)
et extrait embryonnaire dilue (1 /20, 1 /100, et 1 /200).
Les concentrations correspondant a 25 et 5 mg./l. de dicarnitine permettent
une elongation superieure a celle des temoins pour les ebauches cultivees sur
SUR LES EBAUCHES OSSEUSES IN VITRO
283
extrait embryonnaire 1 /20 (ecarts des pour cent d'augmentation lineaire par rapport a ceux des temoins: 3,15, 15, 6, 28, et 28). Les concentrations superieures
et inferieures de dicarnitine donnent aussi des courbes de croissance se confondant avec celles des temoins.
Des resultats similaires sont obtenus pour les ebauches cultivees sur extrait
embryonnaire 1/100. On remarque cependant que l'augmentation lineaire varie
dans un rapport inversement proportionnel a la longueur initiate de l'ebauche et
l'effet de la dicarnitine varie de la meme facon. Plus l'ebauche est petite, plus elle
s'accroit et plus elle est sensible au stimulus qu'apporte la dicarnitine.
B. TEMOINS "RICHES"
25.MG./L.
A. TEMOINS "PAUVRES"
5 MC./L
I0MG./L.
2 5 MC./L.
7-5 MC./L
2 MG./L.
FIG. 1. Effet de 6 concentrations de dicarnitine sur la silhouette
debauches cultivees en milieu 'pauvre'.
A. Temoins cultive"s sur milieu 'pauvre': plasma 1/2, extrait embryonnaire 1/200 (temoins r£els des Ebauches cultivees en presence
de 5 mg./l. dicarnitine).
B. Te'moins cultive"s sur milieu 'riche': plasma 1/2, extrait embryonnaire 1/2.
Toutes les Ebauches trait^es par la dicarnitine sont cultivees sur le
milieu A.
Les silhouettes des e~bauch.es ont ete decalque'es sur des photographies prises avant la fixation.
Si on ne considere que l'augmentation lineaire superieure a celle des temoins,
les resultats des ebauches cultivees sur extrait embryonnaire 1 /200 ne confirme
plus ce qui vient d'etre enonce. En effet, aux concentrations elevees de 25, 10,
7-5 mg. II, les ecarts de ces pourcentages avec ceux des temoins sont respectivement de 53, 18, et 28. Dans les essais precedents, l'aspect morphologique des
ebauches en culture restait normal et toujours comparable a celui des temoins.
Ces ebauches cultivees etaient conformes en outre aux descriptions donnees par
Fell & Robison (1929). Sur cet extrait embryonnaire 1/200, les temoins sans
dicarnitine sont tres freles, allonges et plus du tout comparables aux ebauches
cultivees sur extrait embryonnaire 1 /2 (voir figure 1 dans le texte). II est a noter
que la dicarnitine aux concentrations de 25 et 5 mg. /I. change considerablement
l'aspect morphologique des ebauches cultivees dans ces conditions. Si aucune
augmentation lineaire superieure a celle du temoin n'a pu etre constatee (ce
284
S. LIEBECQ-HUTTER—ACTION DE LA 'DICARNITINE'
dernier lui-meme montrant un developpement anormal sur ce milieu pauvre),
l'aspect, la forme, l'epaisseur des ebauches cultivees en presence de 5 a 25 mg. /I.
de dicarnitine sont davantage comparables a l'aspect, la forme et l'epaisseur des
temoins cultives sur extrait embryonnaire non dilue (1/2) (voir figure 1 dans le
texte). Les memes concentrations de dicarnitine qui, en milieu nutritif plus riche
permettent de deceler une elongation superieure a celle des temoins, rendent ici
aux ebauches cultivees sur un milieu tres appauvri presque l'aspect qu'elles
auraient sur un milieu normal. Les coupes histologiques de ces ebauches confirment ces observations; leur analyse sera rapportee plus loin.
En resume, les concentrations de dicarnitine racemique necessaires pour
obtenir une augmentation lineaire superieure d'un tiers a deux tiers environ a
celle des temoins correspondent a 25 et 5 mg. /I.
ANALYSE DE L'EFFET DE LA DICARNITINE SUR
L'OSSIFICATION PERIOSTIQUE
Un grand nombre d'ebauches (61) ont ete mises en culture sur plasma (1/2,
dilution finale) et extrait embryonnaire (1 /200, dilution finale) en presence de
6 concentrations de dicarnitine racemique allant de 2 a 25 mg. /I.
3 *•
O 40
30
-
p
b
z
20
-
D
Z 10
X
-
<
3
<
0
(21)
5
7-5
10
25 DICA
"JftlTINE
NOMBRE D'OBSERVATIONS:
(10)
(9)
(5)
(7)
(6j(8)
2 25
FIG. 2. Effet de 6 concentrations de dicarnitine sur l'epaisseur
maximum d'os pe"riostique forme1 apres 7 jours de culture sur
milieu carence' (plasma 1/2, extrait embryonnaire 1/200). En
ordonn^es: moyennes des mesures d'epaisseur maximum d'os±
l'erreur standard de la moyenne.
Ces conditions de culture ont permis de demontrer que la dicarnitine semble
suppleer, partiellement du moins, a la carence du milieu et retablit l'aspect morphologique d'ebauches cultivees dans de meilleures conditions nutritives (voir
figure 1 dans le texte). Apres 7 jours de culture, les pieces sontfixees,coupees,
colorees et examinees histologiquement. Rien de particulier n'est a remarquer
au niveau des epiphyses constitutes de cartilage a petites cellules. D'emblee
SUR LES EBAUCHES OSSEUSES IN VITRO
285
l'aspect du perioste attire l'attention. L'assise des fibroblastes et l'assise d'osteoblastes sont plus importantes en presence de 2-5 et 5 mg. /I. de dicarnitine. Surtout, une large couche d'os est deja formee incluant parfois des osteoclastes alors
qu'elle est quasi inexistante dans les temoins. Les microphotographies de la
planche 1 en donnent un exemple. Cette couche d'os est toutefois repartie sur
toute la longueur de la diaphyse et non pas seulement en formant le 'sablier' que
Ton rencontre dans l'os in vivo.
Des mesures de cette couche d'os, faites sans tenir compte des assises de fibroblastes et d'osteoblastes, sont prises sur les coupes histologiques. Les tibias et les
femurs n'ont pas ete distingues l'un de l'autre pour cette analyse. Ces mesures
rassemblees permettent de faire une analyse statistique en appliquant le test't'
de Student. Les moyennes et leurs erreurs standard sont representees a la figure
2 dans le texte. Cette analyse permet de conclure que l'effet de 2 5 et 5 mg. /I. de
dicarnitine est hautement significatif (P < 001). L'effet de 7 5 mg. /I. est encore
significatif (0 02 < P < 0 05). La probability des plus hautes doses depasse 0 2
et 0 3. La concentration de 5 mg. /I. de dicarnitine semble etre la plus active pour
la stimulation de l'ossification periostique.
EFFET DE LA DICARNITINE SUR L'ACTIVITE MITOTIQUE
Frequence et localisation des mitoses
Pour completer et verifier les resultats enonces ci-dessus, une large etude de
l'effet de la dicarnitine racemique sur le nombre des mitoses a ete entreprise.
Toutes les ebauches de tibias et de femurs de cette serie d'experiences ont ete
cultivees sur plasma (1/2) et extrait embryonnaire (1/20). Cette dilution moyenne
de l'extrait embryonnaire a ete choisie car, sans appauvrir trop l'apport en
elements nutritifs, elle en limite les reserves et permet de deceler tres regulierement en presence de dicarnitine une augmentation lineaire superieure a celle des
te"moins.
La concentration de dicarnitine offerte est de 25 mg./l. Celle de 5 mg./l. n'a
pas e'te retenue de preference a la precedente, malgre les resultats obtenus a
l'analyse enoncee ci-dessus pour l'ossification periostique. Ceux-ci n'ont ete
connus que lorsque les cultures d'ebauches preparees en vue du compte des
mitoses 6taient deja achevees et leurs coupes en train d'etre pratiquees.
Les temoins sont toujours tres soigneusement etablis en cultivant les ebauches
de l'autre patte du meme embryon. Des controles, tant pour les differences possibles d'augmentation lin^aire que pour le nombre des mitoses entre les ebauches
droites et gauches, ont ete satisfaisants. Deux a trois ebauches ont ete cultivees
puis comptees pour chaque jour de culture (1,2,3,4, 5, et 7 jours). L'etude des
femurs est moins complete, mais permet de confirmer celle des tibias (voir figure
3 dans le texte).
Les courbes obtenues permettent de suivre le rythme de la croissance des
ebauches in vitro. En effet, a premiere vue, on remarque la chute considerable
5584.3
U
286
S. LlfiBECQ-HUTTER—ACTION DE LA 'DICARNITINE'
du nombre des mitoses des le premier jour de culture. La dicarnitine attenue
cette chute et permet de conserver un minimum de 600-700 mitoses au cours
de la culture. Apres 1 jour de culture, l'activite mitotique est maintenue a plus
des 3/4 en presence de dicarnitine (1577 mitoses en moyenne) alors qu'elle est
tombee a presque la moitie chez les temoins correspondants (1138 mitoses en
moyenne).
^
B
2500
2500
2000
XI
OI500
"\
1000
V
V
-9"~o
500
•
12 3 4
JOURS
FIG. 3. Frequence des mitoses apres differentes dure"es de culture.
A. Tibias. B. Femurs.
Points noirs et traits pleins: temoins: plasma 1/2, extrait embryonnaire 1/20.
Points clairs et pointilles: idem+ 2-5 mg./l. dicarnitine.
Points entre parentheses: e"bauches cultive'es en conditions
spe"ciales: 4 jours de culture, pas de repiquage; 5 jours de culture,
2 repiquages aux 2&me e t 4&me jours; 7 jours de culture, 2 repiquages tardifs aux 4«ne e t 6feme jours.
2
3 4 5 6 7
JOURS
Lesfigures4 et 5 dans le texte precisent la frequence des mitoses au niveau
des epiphyses et au niveau du perioste. Aucune mitose n'a ete observee dans le
cartilage hypertrophie du centre de la diaphyse, sauf in vivo ou elles representent
un tres faible pourcentage de l'ensemble.
Si l'effet de la dicarnitine se marque encore sur le nombre des mitoses au
niveau des epiphyses, cet effet est beaucoup plus net au niveau du perioste. Chez
les temoins, la chute du nombre des cellules en division est rapide et considerable:
apres un jour, il ne reste qu'1/3 en moyenne des mitoses et apres trois jours,
6 pour cent seulement du nombre des mitoses initiates se retrouvent dans le
perioste. La dicarnitine permet de maintenir une moyenne de 45 pour cent du
nombre des mitoses initiates pendant les 4 premiers jours de la culture.
Les repiquages dont l'effet est visible au 4feme jour ameliorent sensiblement la
situation chez les temoins. Sans vouloir avancer qu'ils ne sont pas du tout aussi
necessaires en presence de dicarnitine, leur effet influence moins la frequence
SUR LES EBAUCHES OSSEUSES IN VITRO
287
A
2000
500-
1500 ' \ \ 8
3 IOOO
A
z
o\
o
(o)
V*
500
2
3 4 5 6
JOURS
7
12
3 4 5 6
JOURS
7
FIG. 4. Frequence des mitoses dans les e*piphyses et dans le pdrioste des
tibias apres differentes dur^es de culture.
A. Epiphyses. B. Perioste.
Points noirs et traits pleins: te"moins: plasma 1/2, extrait embryonnaire
1/20.
Points clairs et pointilles: idem+ 2 5 mg./l. dicarnitine.
Points entre parentheses: voir tegende de la figure 3.
0
12
3 4
JOURS
0
12
3 4
JOURS
FIG. 5. Frequence des mitoses des epiphyses et du perioste des f6murs
apres differentes durees de culture.
A. Epiphyses. B. Perioste.
Points noirs et traits pleins: te'moins: plasma 1/2, extrait embryonnaire 1/20.
Points clairs et pointilles: idem + 2 5 mg./l. dicarnitine.
288
S. LlfiBECQ-HUTTER—ACTION D E LA ' D I C A R N I T I N E '
des mitoses, celle-ci etant moins ralentie en presence de dicarnitine. Les points
indiques entre parentheses sur les courbes illustrent bien l'effet stimulant des
repiquages. Au 46me jour, l'absence de repiquage fait tomber la frequence des
mitoses au niveau du perioste (figure 4 dans le texte) aussi bien en absence qu'en
presence de dicarnitine. Dans les epiphyses et dans l'ebauche entiere, l'absence
de repiquage n'a pas marque de changement sur la frequence des mitoses. Les
points entre parentheses du 56me jour, pour lesquels deux repiquages avaient ete
pratiques, indiquent une reprise de l'activite mitotique dans l'ebauche entiere.
A
15
14
1
*"
13
B
.
I
12
—^
1
•
i
8
Q 6
X 'i
4
•
3
2
\
o
<o>
Jv
^
\
\
/•\-/>"\
* \ /
V^ X
o
/
/
•
V c, ^ < ^ •
1
0
1 2
3
4
5
6
7
0
1 2
3
4
JOURS
FIG. 6. Index mitotique des pe"riostes de tibias et de femurs apres
diff^rentes dure"es de culture.
A. Tibias. B. Femurs.
Points noirs et traits pleins: te"moins: plasma 1/2, extrait embryonnaire 1/20.
Points clairs et pointilles: idem+ 2 5 mg./l. dicarnitine.
Points entre parentheses: voir tegende de la figure 3.
Enfin, une culture de 7 jours ayant subi deux repiquages plus tardifs que d'habitude est plus riche en mitoses que les autres cultures du meme age.
La figure 6 dans le texte indique l'index mitotique obtenu pour le perioste.
Cette facon d'exprimer les resultats n'a pas ete retenue systematiquement car
elle introduit un facteur d'erreur supplementaire, celui de 1'evaluation du nombre
des cellules. De plus, le nombre total des cellules est l'image retardee de la frequence des mitoses et ceci peut dans certains cas fausser l'interpretation.
En resume, la dicarnitine augmente l'activite mitotique in vitro; l'effet en est
surtout marque au niveau du perioste ou elle permet de maintenir un rythme de
la division cellulaire representant 45 pour cent de ce qu'il etait in vivo.
SUR LES EBAUCHES OSSEUSES IN VITRO
289
Repartition des phases de la division cellulaire
Au cours de l'etude decrite ci-dessus, les quatre phases de la mitose ont ete
soigneusement distinguees et notees. Outre les images de plaque equatoriale, les
EPIPHYSES
30
PERIOSTE-
20
II I I
10
111
60
50
40
30 L
^
10
n
40
30
20
10
12345
7
I2345
7
12345
JOURS
7
12345
7
FIG. 7. Repartition des pourcentages moyens des quatre phases de la mitose
dans les e"piphyses et le pe"rioste apres differentes dure'es de culture.
p=prophases, M=me'taphases, A = anaphases, T=t61ophases.
Hachures: te"moins: plasma 1/2, extrait embryonnaire 1/20.
Wanes: idem+ 2 5 mg./l. dicarnitine.
Les numerations n'ont pas 6t6 faites au 6 6me jour.
groupements de Chromosomes en l'absence de nucleoles (prometaphases) ont ete
compte'es comme des metaphases. Les images ou les noyaux sont reconstitues
290
S. LlEBECQ-HUTTER—ACTION DE LA 'DICARNITINE'
mais ou les cytoplasmes ne sont pas encore separes completement en deux cellules distinctes sont comptees comme des telophases. Nous avons rassemble ces
resultats, en avons calcule les pourcentages moyens arm de savoir si la dicarnitine
intervenait ou non dans la repartition normale des phases mitotiques. D'autre
part, cette analyse permet egalement de controler chez les temoins si cette repartition se maintient au cours de la culture et si elle est comparable dans les epiphyses et au niveau du perioste.
Les resultats des pourcentages moyens sont represented a la figure 7 dans le
texte. Comme ces pourcentages sont etablis sur des nombres tres differents les
uns des autres (nombre total des mitoses comptees par epiphyse ou diaphyse
d'une ebauche) une representation graphique a permis de controler si ce facteur
peut modifier considerablement la variation du pourcentage moyen ainsi calcule,
ce qui ne semble pas le cas. Les pourcentages indiques a lafigure7 dans le texte
sont done calcules pour chaque jour de culture, sur les totaux de chaque phase
additionnes et rapportes au nombre total des mitoses comptees.
D'emblee, il ne semble pas que la dicarnitine ait une influence sur la repartition des phases, si ce n'est que les metaphases sont moins abondantes et qu'au
contraire, les telophases sont mieux representees. La dicarnitine aurait tendance
a donner une image plus normale de l'ensemble (voir discussion).
L'examen des pourcentages des prophases apporte une indication etonnante.
Le nombre des prophases est presque le double dans le perioste de ce qu'il est
dans les epiphyses. Ceci est marque aussi bien en presence qu'en absence de
dicarnitine. Cette difference est compensee par une petite diminution des metaphases et une tres legere diminution des telophases dans le perioste.
II faut noter 1'augmentation du pourcentage des metaphases, surtout marquee
dans les epiphyses des temoins. Plus la culture est agee, plus il y a de metaphases
enregistrees. L'inverse se retrouve pour les anaphases et les telophases qui
deviennent plus rares en fonction de l'age des cultures. La encore, pas d'interference due a la dicarnitine si ce n'est que cette observation est moins frappante.
It ne faut pas oublier en interpretant ces resultats que 1'augmentation du pourcentage d'une phase de la mitose correspond a l'allongement de la duree de cette
phase.
En resume, si les observations d'anomalies dans la repartition des phases de
la mitose sont attribuables au 'handicap' de la mise en culture des ebauches et
de la duree de celle-ci, la dicarnitine n'intervient pas, si ce n'est pour attenuer ces
anomalies. La confrontation de ces donnees avec celles d'autres auteurs trouvera
sa place dans la discussion qui suit.
DISCUSSION
Nous regrettons que des milieux synthetiques n'aient pu etre utilises pour
l'etude decrite ci-dessus. Us auraient permis de controler l'apport en elements
nutritifs et eventuellement de remplacer l'un d'entre eux par la dicarnitine
racemique, en particulier les donneurs de methyle. L'hypothese deja emise par
SUR LES fiBAUCHES OSSEUSES IN VITRO
291
le groupe de Fraenkel (Carter, Bhattacharyya, Weidman, & Fraenkel, 1952ft)
que la carnitine participerait a la transmethylation in vivo aurait pu ainsi etre
verifiee in vitro. Verly & Bacq (1954) ont cependant demontre par une vaste
experience de nutrition que la dicarnitine racemique est un mauvais donneur
de methyle pour le jeune rat blanc, comparativement a la choline.
La recherche a ete orientee non plus sur la comprehension de l'incorporation
4 0
III
z
z
u30
\\
o
°
o
\ .
o 20
0
0
\
.
•z
<
y
o
o 10
o
\
CO
10
</>
N.
0
o\
o
\^
20
30 \
TE'MOINS
40>J
\°
FIG. 8. Droite de regression de l'effet de la dicarnitine sur l'e"paisseur
d'os periostique forme.
Abscisses: epaisseur maximum d'os periostique des temoins.
Ordonnees: surplus d'epaisseur maximum d'os periostique du a la
presence de 5 mg./l. de dicarnitine.
Les points clairs represented les valeurs experimentales. Les points
noirs sont les points d'intersection avec les axes de la droite la plus
probable, calculee par la regie des moindres carres (pour details, voir
Snedecor, 1946).
et du metabolisme de la dicarnitine mais sur l'observation de ses effets sur la
croissance et la differenciation des ebauches en culture. Soulignons que l'action
de la dicarnitine est ainsi demontree pour la premiere fois chez les Vertebres.
Outre la mise en evidence de Faction tres reguliere de la dicarnitine favorisant
l'augmentation lineaire, l'ossification periostique et l'activite mitotique, cette
recherche a apporte une contribution a la comprehension generate du mode de
croissance des tibias et des femurs en culture, en particulier du role important
qu'y joue le perioste.
Des observations et des analogies de details seront d'abord exprimees dans
cette discussion et des relations plus generales seront rapportees ensuite.
Malgre les precautions de mise en incubation comparables, il n'a pas ete possible d'obtenir regulierement des embryons de taille egale. Des facteurs incontrolables interviennent: saison, mue des poules, vitalite des ceufs. II semble
exister un rapport inverse entre la longueur initiate de l'ebauche mise en culture
292
S. LlfiBECQ-HUTTER—ACTION DE LA 'DICARNITINE'
et ses possibilites d'accroissement. Plus l'ebauche est petite et peu differenciee,
plus elle est susceptible de s'allonger et d'etre sensible a l'action stimulante de
la dicarnitine.
On remarque de meme que l'effet de la dicarnitine sur Possification periostique
est d'autant moins marque que cette ossification est amorcee, comme le montre
la figure 8 dans le texte. La correlation qui lie l'effet stimulant de la dicarnitine
a l'epaisseur maximum d'os des temoins peut s'exprimer par une droite de
regression (droite la plus probable) calculee par la regie des moindres carres.
Le coefficient de correlation (coefficient angulaire de la droite) est negatif
(r = - 0-754); l'ecart de la droite par rapport a Phorizontale est statistiquement
significatif (/ = 3 295; 001 < P < 002). Autant qu'on puisse en juger, il ne se
fait guere d'ossification periostique chez les temoins dans ce milieu tres dilue.
Les ebauches qui ici temoignent d'une ossification deja avancee en l'absence de
dicarnitine proviennent probablement d'embryons chez lesquels cette ossification a eu lieu in vivo. Aussi, la correlation negative peut-elle s'expliquer de deux
manieres: (a) les conditions ont ete favorables a une ossification in vitro chez les
temoins, (b) les ebauches avaient deja amorce cette ossification in vivo avant
leur prelevement. Quelle que soit la cause de l'etat des temoins, l'effet de la
dicarnitine se marque comparativement moins quand ceux-ci ont une belle
ossification periostique. II aurait peut-etre ete avantageux de cultiver des
e'bauches d'embryons incubes 5 ou 6 jours au lieu de 7, tant pour l'etude de
l'allongement que pour celle de la differenciation.
Rappelons que les comptes de mitoses ont toujours ete pratiques sur des
ebauches cultivees sur plasma et extrait embryonnaire, ce dernier dilue 1 /20.
L'image du rythme de croissance qu'offre cette estimation de l'activite mitotique
est celle d'ebauches deja en etat d'inferiorite non seulement par la mise en culture, mais encore par un apport en substances nutritives relativement pauvre.
Jacoby, Trowell, & Willmer (1937) demontrent que l'enrichissement en extrait
embryonnaire reduit la periode intercinetique. De plus, la duree des mitoses est
plus longue quand la concentration en extrait embryonnaire est basse. Ce
dernier point pourrait expliquer l'accumulation des metaphases observees en
fonction de l'age des cultures. II aurait ete interessant de savoir ou se situerait
la moyenne des mitoses d'une ebauche cultivee sur extrait embryonnaire entier
ou mieux encore d'une ebauche cultivee sur un milieu enrichi en glucose et
glycerophosphates tel que celui utilise par Fell & Mellanby (1952) pour leur
etude sur l'hypervitaminose A. Cependant, notre milieu relativement carence a
permis de mieux deceler les points vulnerables des ebauches cultivees et surtout
met mieux en evidence Faction favorisante d'un facteur de croissance, tel que la
dicarnitine etudiee ici.
La repartition des phases de la division cellulaire reflete egalement le mode de
croissance in vitro. Les pourcentages de ces phases varient avec la duree de la
culture: les metaphases augmentent avec l'age des cultures alors que les anaphases et les telophases diminuent.
SUR LES fiBAUCHES OSSEUSES IN VITRO
293
Le tableau 2 dans le texte confronte les pourcentages moyens obtenus avec
ceux de Chevremont (1956), Bucher (1948), et Jacobson (1954) pour des cultures
de tissus; ce dernier auteur donne probablement une autre definition de l'anaphase que Chevremont et Bucher. En additionnant les pourcentages obtenus,
& l'anaphase et a la telophase, on arrive a un chiffre de meme ordre de grandeur
pour les trois auteurs; il faut toutefois rappeler que nos numerations sont faites
TABLEAU 2
Repartition des phases de la mitose dans des cellules et des ebauches osseuses
cultivees in vitro
Prophases Metaphases Anaphases
V
°/
/o
Fibroblastes et myoblastes d'embryon de poulet (cultures vivantes) Chevremont, 1956) .
Fibroblastes de lapin (cultures
fixees) (Bucher, 1948)
OstSoblastes d'embryon de poulet
(cultures fixees) (Jacobson, 1954)
fibauches de tibias (coupes de cultures) :
fipiphyses temoins
„
dicarnitine .
Pe"riostes temoins
„
dicarnitine .
/o
Telophases
°/
/o
/o
6
44
Total des
mitoses
comptees
11
39
—
18 5
34-5
5-6
41-4
6 000
15-18
36-38
21-23
23-27
—
110
10-9
190
199
540
51-5
47-8
44-9
4-7
5-2
5-6
5-6
25-6
32-4
22-8
29-3
7 313
10 216
815
1 758
sur des coupes histologiques, un certain nombre de telophases peuvent eventuellement etre ainsi reparties sur 2 coupes et etre interpreters soit comme
metaphases, soit comme noyaux intercinetiques. Ceci pourrait dans une certaine
mesure expliquer nos chiffres eleves de metaphases et bas de telophases. II est
cependant peu vraisemblable que cette erreur d'interpretation due au materiel
d6bite en coupes puisse entrainer une difference de plus de 10 pour cent. Les
conditions de culture (extrait embryonnaire 1 /20) relativement pauvres ont pu
ralentir la duree des mitoses comme le signalent Jacoby, Trowell, & Willmer
(1937) et provoquer ainsi une accumulation anormale de metaphases. II est possible que ces apports varient dans les differents tissus ainsi que parait l'indiquer
l'ecart des pourcentages de prophases dans le perioste et les epiphyses des memes
e"bauches.
L'etude ci-dessus apporte un argument experimental de plus a la deuxieme
hypothese qu'exprime Lacroix (1949) dans sa monographic: 'le perioste repartit
son e*tirement sur toute sa longueur'. La frequence des mitoses est en effet tres
e"galement repartie sur tout le perioste. De plus, en milieu dilue, l'effet de la
dicarnitine se marque par une ossification a ce niveau tres marquee et reguliere sur
294
S. LIEBECQ-HUTTER—ACTION DE LA 'DICARNITINE'
toute la longueur. La concordance des resultats obtenus par les deux methodes
d'investigation est remarquable. L'effet de la dicarnitine qui d'abord se marque
par une recrudescence de l'activite osteogenique du perioste dans les ebauches
cultivees sur extrait embryonnaire tres dime, permet aussi de maintenir pendant
quelques jours une activite mitotique dans le perioste correspondant a 45 pour
cent de ce qu'elle est in vivo. La carence en elements nutritifs provoque, en
l'absence de dicarnitine, une chute considerable de l'activite mitotique generate,
mais surtout marquee dans le perioste ou il ne reste apres trois jours de culture
que 6-7 pour cent de l'activite in vivo. Une reprise des divisions cellulaires a lieu
des qu'un repiquage renouvelle l'apport en elements nutritifs. Cette reprise est
surtout marquee egalement au niveau du perioste. Si Ton procedait a des
repiquages quotidiens, Ton ameliorerait vraisemblablement la croissance et la
differentiation des ebauches en culture.
Comment faut-il interpreter les pourcentages de prophases plus eleves dans le
perioste que dans les epiphyses? Ce chiffre ne semble pas etre influence par le
nombre total des mitoses comptees qui, lui, reflete l'activite mitotique reelle, pas
plus que par Faction de la dicarnitine. II n'est pas vraisemblable qu'une erreur
d'interpretation puisse interferer ici car les numerations dans les epiphyses et
dans le perioste ont ete faites tres parallelement, sans distinction aucune et sur
le meme materiel.
II semble done que l'etat du perioste soit un bon critere d'examen d'une
ebauche cultivee in vitro. II est certain que la situation peripherique de celui-ci
explique en partie ces observations. Les mitoses, sans que leur localisation ait
TABLEAU 3
Augmentation du nombre total des cellules apres 7 jours de culture
fibauche e n t i r e
fipiphyses
.
.
Perioste
Cartilage hypertrophie
.
.
Temoins
Dicarnitine
/a
/o
55
55
46
92
62
50
80
130
ete precisee, paraissent dans l'ensemble plus frequentes en bordure des epiphyses
qu'au centre. II n'est pas surprenant que l'activite mitotique du perioste soit plus
elevee dans des ebauches chez lesquelles on a observe une augmentation lineaire
superieure. L'apport d'un facteur stimulant tel que la dicarnitine se fait au
niveau des fibroblastes et l'allongement du perioste doit preceder celui de
l'ebauche entiere ou lui etre simultane. Les approximations des nombres totaux
des cellules dans les differentes ebauches etudiees en absence et en presence de
dicarnitine (voir tableau 3) permettent d'observer que la moyenne d'accroissement en cellules du cartilage hypertrophie est presque doublee par rapport h
SUR LES EBAUCHES OSSEUSES IN VITRO
295
celle des autres tissus de l'ebauche apres 7 jours de culture. La dicarnitine change
ces valeurs seulement dans la diaphyse ou elles passent de 46 a 80 pour cent dans
le perioste et de 92 a 130 pour cent dans le cartilage hypertrophie. Notons que ce
tissu n'est le siege d'aucune activite mitotique. Ceci serait en accord avec l'idee
que l'allongement se fait par retirement du perioste sur toute sa longueur entrainant une formation de cartilage hypertrophie aux depens du cartilage a
petites cellules des epiphyses. II est arrive a plusieurs reprises qu'une ebauche
cultivee sur dicarnitine ayant marque une augmentation lineaire superieure a
celle du temoin, totalise un moins grand nombre de cellules ou un nombre
similaire a celui du temoin. Dans ces cas, le nombre des cellules du cartilage
hypertrophie est plus grand que chez les temoins, alors que celui des petites
cellules du cartilage est moins important; le perioste lui-meme totalise un plus
grand nombre de cellules. Pour cette raison encore, il n'aurait pas ete correct
d'exprimer tous les resultats en index mitotiques.
Ces observations semblent indiquer que dans le cas present, les phenomenes
de croissance ne sont point separes des phenomenes de differentiation mais, au
contraire, lies et dependants l'un de l'autre.
RESUME
1. Nous avons cultive des ebauches de tibias et de femurs d'embryons de
poulet ages de 7 jours en l'absence et en presence de dicarnitine racemique. Le
caillot etait forme de plasma de coq et d'extrait embryonnaire, ce dernier parfois
dilue de 20 a 200 fois.
2. En presence de 25 et 5 mg./l. de dicarnitine, l'augmentation lineaire des
ebauches osseuses est superieure d'un tiers a deux tiers a celle des temoins
lorsque l'extrait embryonnaire est non dilue ou dilue de 20 a 100 fois. Avec de
l'extrait embryonnaire dilue a 1 /200, aucune augmentation lineaire superieure
a celle des temoins n'est constatee, mais l'aspect morphologique des ebauches
est presque comparable a celui d'ebauches cultivees sur extrait embryonnaire
non dilue.
3. L'examen histologique des ebauches cultivees en presence de dicarnitine
sur extrait embryonnaire dilue a 1 /200 revele une ossification periostique plus
avancee que dans les temoins. Les mesures de l'epaisseur maximum d'os periostique forme et leur analyse statistique prouvent que l'effet de 2-5 et 5 mg./l. de
dicarnitine est hautement significatif. Sur extrait embryonnaire moins dilue,
cette difference n'est pas decelable.
4. Le compte des mitoses pratique sur des ebauches cultivees de 1 a 7 jours
sur extrait embryonnaire dilue a 1/20 revele une action reguliere et favorisante
de la dicarnitine (2 5 mg. /I.) sur l'activite mitotique, surtout dans le perioste. A
ce niveau, la dicarnitine maintient pendant 4 jours une activite mitotique de 45
pour cent de ce qu'elle etait in vivo, alors que celle-ci est tombee a 6 pour cent
en 3 jours de culture chez les temoins. L'utilite de repiquages frequents est
demontree.
296
S. LlfiBECQ-HUTTER—ACTION DE LA 'DICARNITINE'
5. Le pourcentage des prophases est plus eleve dans le perioste que dans les
epiphyses. La frequence des metaphases augmente, celle des anaphases et des
telophases au contraire diminue en fonction de l'age des cultures. La repartition
des phases de la mitose semble peu influencee par la dicarnitine.
6. Apres 7 jours de culture (extrait embryonnaire 1/20), le nombre des cellules
est davantage augmente dans le cartilage hypertrophie de la diaphyse que dans
les autres tissus. La dicarnitine modifie peu le nombre total des cellules de
l'e'bauche entiere, mais double presque le nombre des cellules du perioste et
renforce encore l'augmentation du nombre des cellules du cartilage hypertrophie.
SUMMARY
1. Tibias and femurs of 7-day-old chick embryos were cultivated in the
absence and in the presence of racemic dicarnitine on a solid medium (fowl
plasma + embryo extract, the latter usually diluted 20- to 200-fold).
2. The growth in length of the bones was increased by 1/3 to 2/3 in comparison
with the controls, when 2 5 and 5 mg. /I. of dicarnitine was added and when the
embryo extract was not diluted more than 100-fold. With embryo extract diluted
200-fold, the shape of the bone was abnormal. Dicarnitine in this case restored
the normal shape without increasing the elongation.
3. Dicarnitine in a medium containing embryo extract diluted 200-fold was
found to increase the maximal thickness of the periosteal bone in comparison
with the controls. This effect was statistically highly significant in the case of
dicarnitine concentrations of 2 5 and 5 mg./l. The effect was not found with
non-diluted embryo extract.
4. Mitoses were counted in tibias and femurs cultivated in vitro for periods
of 1 to 7 days. 2 5 mg./l. dicarnitine was shown to promote mitotic activity. In
the periosteum, it maintained for 4 days a mitotic activity equal to 45 per cent,
of the mitotic activity in vivo. In vitro controls retained only 6 per cent, of this
activity. The usefulness of frequent transfers was demonstrated.
5. The percentage of prophases was higher in the periosteum than in the epiphyses. The relative frequency of metaphases increased with the age of the
cultures. The frequency distribution of the phases of mitosis was shown to be
very little changed by dicarnitine.
6. After 7 days of culture, the number of cells was more increased in the
hypertrophie cartilage than in other tissues. Dicarnitine did not much increase
the total number of cells; there was practically no effect on the number of cells
of the epiphyses but a large increase in the number of cells of the periosteum
and of the hypertrophie cartilage was observed.
REMERCIEMENTS
L'auteur exprime sa gratitude au Professeur et a Madame Maurice Chevremont
pour leurs conseils avises et l'interet qu'ils n'ont cesse de marquer au cours de
SUR LES EBAUCHES OSSEUSES IN VITRO
297
cette recherche. Elle remercie vivement M. Jean Lorquet qui a prepare les
coupes histologiques. Elle est reconnaissante aux Laboratories Labaz d'avoir
aimablement mis la dicarnitine a sa disposition.
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EXPLICATION DE LA PLANCHE
FIG. A. Perioste de l'Sbauche de tibia t^moin, cultive"e sur plasma 1/2 et extrait embryonnaire
1/200.
FIG. B. PSrioste de l'^bauche de tibia cultivee sur plasma 1/2 et extrait embryonnaire 1/200 +
5 mg./l. dicarnitine.
Les coupes longitudinales sont colore'es par la m^thode d'Azan. Grossissement: 382-5 x .
(Manuscript received 22:xi:55)
J. Embryol. exp. Morph.
Vol. 4, Part 3
B
)
.'
a
x
' •
FIG.
1
FIG.
S. LIEBECQ-HUTTER
2