Les injections localisees en chimioteratogen&se
par
P.
ANCEL1
Institut de Biologie physico-chimique, Paris
AVEC DEUX PLANCHES
INTRODUCTION
N o u s avons recherche, depuis 1938, en collaboration avec Mme Lallemand,
l'effet teratogene de nombreuses substances chimiques en deposant sur l'embryon, apres 16 a 48 heures d'incubation, une goutte de la solution a etudier
(Ancel, 1950). Ces injections generates de 1/20 c.c. s'etalent sur tout l'embryon;
elles ont mis en evidence l'ebauche electivement sensible a chacune des substances chimiques teratogenes etudiees, mais elles ne permettent pas de decouvrir toutes les ebauches sensibles a une meme substance et de produire toutes
les malformations que chacune de ces substances est capable de faire apparaitre,
parce que la dose necessaire pour leser certaines d'entre elles est superieure a
celle qui determine la mort prematuree de l'embryon, avant que le diagnostic de
la malformation puisse etre pose avec securite. Des injections localisees de tres
petits volumes d'une solution concentree nous ont ainsi semble pouvoir mettre
en evidence certains faits que les injections generates ne permettaient pas de
decouvrir.
L'appareil utilise pour effectuer ces injections localisees a ete decrit precedemment ainsi que son mode de fonctionnement (Ancel & Houget, 1954). Nous
exposerons ici certains des resultats obtenus pour montrer leur utilite dans
l'etude de differents problemes interessant le developpement de rembryon de
Poule. Us concernent: (1) la determination de la dose teratogene; (2) l'etude des
mecanismes de Faction teratogene des substances chimiques; (3) l'utilisation de
ces substances dans l'etude de la mecanique embryonnaire; (4) la realisation de
certaines malformations: ectrosomie, symelie, exencephalie.
DETERMINATION DE LA DOSE TERATOGENE
Lorsque les substances teratogenes sont injectees dans le blanc ou le jaune de
l'oeuf, il n'est pas possible de connaitre la dose qui a penetre dans l'ebauche dont
la lesion est cause de la malformation. Le depot d'une goutte (1/20 c.c.) de la
solution d'une substance sur un embryon age de deux jours ne le permet pas non
1
Author's address: Institut de Biologie physico-chimique, 13 rue Pierre Curie, Paris Ve, France.
[J. Embryol. exp. Morph. Vol. 2, Part 4, pp. 293-307, December 1954]
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P. ANCEL—LES INJECTIONS LOCALISEES
plus parce que la majeure partie de cette goutte n'arrive qu'indirectement a
l'ebauche par l'mtermediaire de l'aire vasculaire et peut subir auparavant des
modifications susceptibles de faire varier son pouvoir teratogene. Les injections
localisees sur l'e'bauche sensible, si elles sont susceptibles de faire p&ietrer
directement la solution dans l'ebauche, doivent done permettre d'etablir la dose
teratogene avec une meilleure approximation. Les experiences ont ete faites
avec la colchicine. Les injections generates ont montre que la malformation
typique de cette substance est la strophosomie. L'ebauche electivement sensible
dont la lesion provoque la malformation est situee chez un embryon age de 48
heures sur la ligne mediane dorsale, un peu au-dessous du point d'emergence des
vaisseaux omphalo-mesenteriques (ebauche S). Les injections localisees ont ete
faites en ce point (Fig. 1 dans le texte). Les solutions utilisees renfermaient toutes
FIG. 1. Schema d'un embryon avec aire vasculaire apres 53 heures
d'incubation.
la meme dose (00125y), mais les quantites variaient avec la concentration depuis
1/8 mm.3 jusqu'a 10/8 mm.3 Une injection de 1/8 mm.3 d'une solution de concentration 1:10,000 sur l'ebauche S a fait apparaitre non seulement des strophosomes mais aussi des ectrosomes caracterises par l'absence du bourgeon caudal
et des membres inferieurs. Cette malformation comporte une lesion plus forte
que celle necessitee pour produire la strophosomie. Trente pour cent d'ectrosomes et 20 pour cent de strophosomes ont ete ainsi obtenus. Avec la concentration 1:20,000,11 pour cent d'ectrosomes et 33 pour cent de strophosomes; avec
EN CHIMIOTERATOGENESE
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la concentration 1:50,000, pas d'ectrosomes et 27 pour cent de strophosomes;
avec la concentration 1:100,000, 9 pour cent de strophosomes.
Le pouvoir t^ratogene d'une meme dose (00125y) diminue done avec la
concentration; ce sont d'abord les ectrosomes qui n'apparaissent plus, ils sont
remplaces par des strophosomes, puis le nombre de ces derniers diminue progressivement.
En injection generate, une goutte (50 mm.3) d'une solution de concentration
1:200,000 donne de 25 a 30 pour cent de strophosomes. La dose injectee est de
0-25y. En injection localisee, nous avons obtenu la meme proportion avec la
concentration 1:50,000, done avec une dose de 00125y environ. Avec des
concentrations plus fortes, cette meme dose a un effet teratogene plus intense
(50 pour cent d'ectrosomes et strophosomes avec 1:10,000). La meme proportion de 25 a 30 pour cent pourrait done etre obtenue avec des doses encore plus
faibles. Nous n'avons pas cherche a les etablir experimentalement, notre but
etant seulement de montrer les avantages des injections localisees sur les autres
techniques pour etablir la dose teratogene. Les resultats obtenus suffisent pour
montrer que la dose cherche'e serait de quelques milliemes de gamma.
M £ C A N I S M E S DE L'ACTION D E S S U B S T A N C E S T E R A T O G E N E S
L'augmentation du pouvoir teratogene de la colchicine par concentration de
la solution mise en evidence dans le paragraphe precedent peut n'etre pas
uniquement due au fait de cette concentration, mais a ce que, quoiqu'injectees
sur l'embryon, certaines parties de la solution s'etalant sur l'aire transparente et
l'aire vasculaire n'amenent a l'ebauche la substance teratogene que par l'intermediaire du sang, et cela d'autant plus que les solutions injectees sont plus
grandes pour une meme dose. Des experiences ont ete faites pour connaitre dans
quelle mesure ce facteur pouvait intervenir.
(a) Experiences faites avec la colchicine
Elles ont consiste a comparer l'effet teratogene obtenu par des injections d'une
meme solution en egale quantite sur l'ebauche S ou sur l'aire vasculaire. Ces
injections ont ete faites a des embryons provenant d'oeufs incubes pendant 53
heures a 38°. Ils possedaient 26 somites environ, le pli cephalique de l'amnios,
facile a reperer au moment de l'injection, se trouvait au-dessus du point d'emergence des vaisseaux omphalo-mesenteriques et plus ou moins rapproche de la
ligne horizontale coupant en deux parties egales l'espace situe entre ce point
d'emergence et la partie inferieure du coeur. La circulation du sang etait tres
active dans une aire vasculaire bien developpee (Fig. 1 dans le texte).
Les injections faites a ce stade sur l'ebauche S avec une substance coloree
comme la trypaflavine a la concentration de 1:250 avec une quantite de 1/8
mm.3 font apparaitre une petite tache ronde dont le diametre est un peu superieur a celui de l'dbauche et empiete legerement sur l'aire transparente. Avec
des quantites de plus en plus grandes, l'injection s'etale sur l'embryon et sur
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P. ANCEL—LES INJECTIONS LOCALISEES
l'aire vasculaire. Des experiences preliminaries ont aussi ete faites pour savoir
s'il etait possible de concentrer une injection de 1/2 mm.3 sur l'aire vasculaire
en l'injectant a egale distance du sinus annulaire et de l'embryon de chaque
cote de lui. Les injections de solutions de trypaflavine ont montre que, dans ces
conditions, ni l'embryon ni le sinus n'etaient atteints par la tache produite.
Les experiences ont alors ete faites en injectant 1/2 mm.3 d'une solution a
1:20,000 sur l'ebauche S d'un lot d'embryons et la meme quantite de la meme
solution a un autre lot sur l'aire vasculaire, une moitie de cette quantite de
chaque cote de l'aire vasculaire a droite et a gauche de l'embryon (Fig. 1 dans le
texte). Soixante oeufs ont ete ainsi traites; 49 pour cent de strophosomes ont ete
obtenus apres injection sur l'ebauche S et aucun apres injection sur l'aire vasculaire. La concentration utilisee avait ete choisie parce qu'elle ne donne pas de
morts prematurees (avant le cinquieme jour).
Pour connaitre d'une maniere plus precise la diminution de l'action teratogene par injection sur l'aire vasculaire, de nouvelles experiences ont ete faites.
Des solutions de meme concentration sont injectees en quantites differentes
sur l'embryon et sur l'aire vasculaire. En utilisant une solution de concentration
1:10,000 donnant 50 pour cent de malformations (ectrosomes, strophosomes,
celosomiens) apres injection de 1/8 mm.3 sur l'ebauche S, on a obtenu 55 pour
cent de malformations apres injection de 10/8 mm.3 sur l'aire vasculaire. La
quantite de solution injectee doit done etre presque 10 fois plus grande pour
produire approximativement le meme effet teratogene. Autrement dit, le passage
de la colchicine dans le sang diminue son pouvoir teratogene, de 10 fois environ.
Ce resultat incite a comparer nos deux techniques d'injection des substances
teratogenes.
(b) Comparaison entre les deux techniques d'injections generates et d''injections
localisees
Lorsqu'on laisse tomber sur l'embryon une goutte (1/20 c.c.) d'une solution
d'une colorant vital apres 48 heures d'incubation, on constate que l'embryon et
l'aire vasculaire se colorent, mais dans certains cas meme lorsque toute faute de
technique parait avoir ete evitee (dessiccation apres ouverture trop prolongee
avant l'injection, embryon pas au centre de l'orifice de la coquille, inclinaison de
cet orifice, goutte tombant de trop haut ou pas exactement au centre), une partie
seulement de l'embryon et de l'aire vasculaire se colore; en outre, une partie de la
solution peut s'etaler en dehors du sinus annulaire sur le blastoderme. Or, comme
nous venons de le signaler, les injections faites sur l'aire vasculaire sont moins
actives que celles faites sur l'embryon. Celles qui sont localisees au blastoderme
le sont encore moins. L'experience nous a en effet montre qu'en injectant sur le
blastoderme, en dehors du sinus annulaire, 10/8 mm.3 de la solution qui fait
apparaitre 55 pour cent de malformations en injection sur l'aire vasculaire, on
n'obtient aucune malformation.
Les differences dans les resultats obtenus sur les divers embryons d'un meme
EN CHIMIOTfiRATOGENESE
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lot experimental apres injection generate peuvent done etre en partie imputables
a la technique. Les injections, localisees a une ebauche embryonnaire, de petites
quantites de solution ne comportent pas cette cause d'erreur; faites au contact
de la membrane vitelline sous la couche d'albumine, elles diffusent moins et
beaucoup plus regulierement autour du point d'injection. Cette technique des
injections localisees apparait done comme la meilleure pour mettre en evidence
les variations individuelles dans la sensibilite d'une ebauche a une substance
teratogene.
(c) Recherches experimentales faites avec diverses substances
Nous avons reproduit les trois varietes d'experiences faites avec la colchicine
en utilisant la ricine, la trypaflavine et une saponine pure blanche (Schuchardt).
1. Comparaison entre les effets d'une mime dose injectee sur I'embryon avec
des concentrations differentes au stade de 48 heures. Les resultats obtenus sont
de meme ordre que ceux signales avec la colchicine et montrent l'effet activant de
la concentration. Ricine: 1/8 mm.3 d'une solution de concentration 1:10,000
a donne 65 pour cent de malformations (ectrosomes, strophosomes, celosomiens)
et 10/8 mm.3 d'une solution de concentration 1:100,000 seulement 16 pour cent.
Dans les memes conditions, 1/8 mm.3 d'une solution de trypaflavine a 1:250 a
fait apparaitre 75 pour cent de malformations (celosomie, anourie, malformation
des membres) et 10 pour cent avec 8/8 mm.3 d'une solution a 1:2,000. Pour la
saponine, 90 pour cent de malformations (ectrosomie, strophosomie, celosomie,
malformations du bourgeon caudal et des membres) avec 1/8 d'une solution a
1:1,000 et seulement 8 pour cent avec une concentration de 1:8,000.
2. Comparaison des effets teratogenes produits par I'injection de 112 mm.3
d'une meme solution sur I'embryon et sur Vaire vasculaire. Les experiences de
ce genre faites avec la colchicine sur des oeufs incubes pendant 53 heures avaient
donne comme resultat 50 pour cent de malformation pour les injections sur
I'embryon et 0 pour cent pour celles faites sur l'aire vasculaire. Ces memes experiences faites avec nos trois nouvelles substances, chacune sur 50 a 90 embryons, ont donne* des resultats de meme ordre.
Ricine: solution de concentration 1:20,000 injectee sur I'embryon 49 pour
cent de malformations et 0 pour cent sur l'aire vasculaire. Pour la trypaflavine
a 1:1,000, 71 pour cent contre 0, et pour la saponine a 1:2,000, 74 pour cent
contre 0.
3. Comparaison entre les effets teratogenes obtenus avec des quantites differentes d'une meme solution. 118 mm? sur I'embryon (ebauche S) et 1018 mm.3
sur l'aire vasculair (518 mm? de chaque cote). La colchicine avait donne 50
pour cent de malformations avec 1/8 mm.3 sur I'embryon et 55 pour cent avec
10/8 mm.3 sur l'aire vasculaire. Les chiffres correspondants obtenus avec la
ricine a la concentration de 1:10,000 ont ete de 56 contre 49; pour la trypaflavine, de 66 contre 33 a la concentration de 1:400 et pour la saponine de 63
contre 45 a la concentration de 1:1,500.
298
P. ANCEL—LES INJECTIONS LOCALISEES
4. Discussion. En somme, pour ces quatre substances, le nombre des malformations apres injection de 1/8 mm.3 sur l'embryon est, sauf pour la colchicine, plus grand que celui des malformations determinees par l'injection de 10/8
mm.3 de la meme solution sur Paire vasculaire, mais les ecarts entre les chiffres
obtenus different avec les substances. La comparaison entre eux pour chaque
substance fait apparaitre, pour les injections sur l'embryon, un excedent en pour
cent de 7 pour la ricine, de 33 pour la trypaflavine, de 18 pour la saponine et une
diminution de 5 pour la colchicine.
Une remarque doit tout d'abord etre faite au sujet de la saponine. Pour obtenir
une proportion de malformations qui ne soit pas inferieure a 50 pour cent avec
1/8 mm.3 injecte sur l'embryon, nous avons du utiliser une concentration de
1:1,500. L'injection de 10/8 mm.3 de cette solution a determine une lesion de
l'aire vasculaire au point d'injection et une retraction de cette aire autour du
point marque par une tache grise. Cette injection a aussi entraine une forte
mortalite avant le cinquieme jour (40 pour cent). Ces morts precoces presentaient
pour la plupart des courbures anormales (lordoses et scolioses) et ont ete
comptes comme porteurs de malformations. Us presentaient un orifice amniotique adherent a l'aire vasculaire retractee. II est done possible que ces courbures
anormales soient dues a un facteur mecanique et que des lors la proportion des
malformations dues a l'action de la saponine sur une ebauche organique apres
passage dans le sang soit inferieure a 45 pour cent, chiffre obtenu dans nos experiences. A ce sujet, nous avons cherche a eviter les lesions etendues de l'aire
vasculaire dues a la quantite de solution injectee (10/8 mm.3). Cette quantity
a ete reduite a 1/8 mm.3 et la concentration augmentee (1:150 au lieu de
1:1,500) pour conserver la meme dose. Dans ces conditions nouvelles, les malformations se sont reduits a 27 pour cent. La difference entre les proportions de
malformations obtenues apres injection sur l'embryon (63) et sur l'aire vasculaire
(27) est alors de 36, chiffre un peu superieur a celui donne par la trypaflavine.
II est en outre evident que nos resultats concernant les differences observees
entre nos quatre substances au point de vue des modifications de leur pouvoir
teratogene apres injection dans les vaisseaux sanguins ne peuvent etre qu'approximatifs. Pour etablir ces differences avec precision, il faudrait realiser de
nombreuses experiences dans lesquelles varieraient les concentrations et les
quantites de solutions injectees. II apparait cependant que le passage dans le sang
ne diminue pas au meme degre le pouvoir teratogene de toutes les substances.
Ce resultat peut s'expliquer par une captation de la substance injectee en proportions differentes par l'ebauche dont la sensibilite est recherchee et les autres
ebauches organiques. II peut etre du aussi a une destruction dans le sang des
substances injectees, d'intensite variable avec chacune d'elles. Dans le premier
cas, les resultats indiqueraient une electivite plus grande de la colchicine pour
l'ebauche etudiee que pour les autres substances et dans le second une destruction moins rapide dans le sang.
EN CHIMIOTERATOGENESE
299
Quoiqu'il en soit de ces hypotheses, nos experiences nous permettent de conclure que la localisation de Pinjection sur une ebauche a augmente au minimum
de pres de dix fois le pouvoir te'ratogene de chacune des substances utilisees
par rapport a 1'injection sur le reseau capillaire de l'aire vasculaire.
La question se pose alors de savoir si un semblable phenomene se produit avec
toutes les substances teratogenes. Certains faits permettent de penser que la
reponse pourrait etre negative.
L'existence des malformations realisees en carencant en certaines substances
le regime nutritif de la mere chez les Mammiferes et de la femelle pondeuse chez
les Oiseaux permettent en effet de penser que des substances non directement
teratogenes, contrairement a celles que nous avons etudiees, peuvent le devenir
en se combinant dans l'organisme avec d'autres, indispensables au deVeloppement de certaines e"bauches, realisant ainsi une carence en les detruisant ou les
inactivant.
Les travaux de divers auteurs ont pu permettre de poser cette hypothese.
Ackermann & Taylor (1948), cherchant a detruire l'acide nicotinique a l'aide
de l'inhibiteur 3-acetylpyridine, ont obtenu des malformations du bee et de la
micromelie qu'empechaient d'apparaitre des injections supplementaires de nicotinamide. Landauer (1948), Zwilling & de Bell (1950), Landauer & Rhodes
(1952) ont constate que ces memes malformations produites par l'insuline,
l'ese'rine et la sulfanilamide pouvaient aussi etre empechees par la nicotinamide,
l'acide pyruvique et divers autres corps. L'acide borique produit les memes effets
teratogenes qui sont empeches par la nicotinamide et divers composes polyhydroxyles (Landauer, 1952).
Ces recherches ont ete faites en injectant les substances chimiques teratogenes
dans le jaune de l'ceuf. Les malformations obtenues avec ces substances, quelle
que soit la voie de leur introduction dans l'embryon, sont differentes de celles
que produisent les substances e*tudiees par nous dans ce present travail. Ce sont
essentiellement des malformations achondroplasiques semblables a celles qu'ont
fait apparaitre certaines carences dans la nourriture maternelle.
Dans nos conditions experimentales, des substances indirectement teratogenes, e'est-a-dire produisant des malformations par carence, ne pourraient agir
qu'apres passage dans le sang; la comparaison des effets teratogenes obtenus par
injection sur l'ebauche sensible et sur l'aire vasculaire permettrait alors de reconnaitre ces substances, car, contrairement a celles que nous avons etudiees, leurs
effets teratogenes seraient les memes que leur solution soit injectee sur l'^bauche
sensible ou dans le sang. Mais cette etude presente des difficultes en ce qui concerne la realisation de bonnes conditions experimentales. Des experiences semblables a celles que nous avons faites avec nos quatre substances ne peuvent en
effet leur etre etendues; les limites en etant marquees soit par la solubilite de la
substance, soit par le degre d'activite teratogene de 1/8 mm.3 de sa solution.
Nous n'avons done pas aborde actuellement l'etude de la realisation des malformations par carence dues a 1'injection de certaines substances chimiques. En
300
P. ANCEL—LES INJECTIONS LOCALISEES
ce qui concerne les substances que nous avons etudiees, les malformations
qu'elles produisent apparaissent en somme dues a leur penetration sans transformation prealable dans une ebauche organique et a la sensibilite elective de
certaines ebauches pour la substance injectee. Les injections generates et les
injections localisees a l'aire vasculaire mettent en evidence l'6bauche hypersensible pour chacune de ces substances et les injections localisees font connaitre
le degre de cette sensibilite.
Nous allons maintenant rapporter quelques faits concernant l'utilisation des
injections localisees dans l'etude d'autres problemes.
LES INJECTIONS LOCALISEES DANS L ' E T U D E DE LA
MECANIQUE EMBRYONNAIRE
Ces injections ont mis en evidence un phenomene de regulation dans le developpement de l'amnios et une action de certaines substances chimiques sur la
rotation de l'embryon.
(a) Action de la trypaflavine sur le developpement de l'amnios
Le capuchon cephalique apparait vers la trentieme heure de l'incubation et le
caudal se forme vers la cinquantieme. Ces deux capuchons se rejoignent et se
soudent l'un a l'autre vers la soixante-dixieme heure a la hauteur des membres
inferieurs ou a lieu la fermeture temporairement marquee par un petit orifice
remplace par une petite tache blanche. La trypaflavine a ete utilisee pour arreter
le developpement du capuchon cephalique parce que cette substance agit electivement sur l'amnios comme nous l'avons montre anterieurement a l'aide des
injections generates (Ancel, 1950).
Les injections ont ete faites a des embryons ages de 40 a 48 heures ou de 30 a
34 heures. Pour les premiers, Paiguille de verre a ete mise en contact sur la ligne
medio-dorsale avec le bord libre du capuchon cephalique. 1/4 de mm.3 d'une
solution a 1:1,000 a ete injecte. Pour les jeunes stades, l'injection a ete faite en
avant de la tete ou de chaque cote des vesicules optiques. Les injections ont varie
de 1/4 a 1/2 mm.3 de solutions de concentration 1:1,000 a 1:3,000 (doses 008
a 0-25y).
Les embryons examines a la 726me heure de l'incubation montrent, pour la
plupart, un orifice amniotique dont la dimension et la situation varient avec les
individus. La limite superieure des plus grands orifices se trouve sur la tete et
l'inferieure sur l'ebauche des membres inferieurs. Tous les degres de rapprochement des deux limites superieure et inferieure du trou amniotique anormalement
persistant peuvent se rencontrer. Ces orifices se retrecissent progressivement
dans les jours qui suivent etfinissenthabituellement par disparaitre. A leur place
apparait la petite tache blanche marquant le point de fermeture de l'amnios. Sa
situation est tres variable et peut se trouver jusque sur la tete. Dans certains cas
persiste au cinquieme jour un orifice amniotique sur le dos ou meme sur la tete
de l'embryon. Le membre superieur droit peut passer au travers. Ces experiences
EN CHIMIOTERATOGENESE
301
montrent que l'ampleur du developpement du capuchon caudal de l'amnios est
d6terminee par celle du capuchon cephalique et que le developpement normal
est uniquement du a ce que la formation du capuchon cephalique precede celle
du capuchon caudal. Elles montrent aussi qu'un developpement complet et
bien proportionne de l'amnios peut se realiser grace a un phenomene regulateur,
malgre* une deficience obtenue experimentalement.
(b) La rotation de Vembryon et Vorientation de l'allantoide
L'embryon de Poule, primitivement a plat ventre sur le jaune, execute autour
de son axe cephalo-caudal un mouvement de rotation qui le couche sur le cote
gauche. Ce mouvement s'amorce au niveau de la tete, vers la 33feme heure de
l'incubation, progresse vers la queue et se termine vers la 726me heure.
L'allantoide apparait alors que la queue est encore presque a plat et sort par
le cote* droit de l'embryon.
Des injections de 1/4 a 1/2 mm.3 de trypaflavine en solution de 1:1,000 a
1:3,000 ont ete faites a gauche de la tete d'embryons ages de 30 a 34 heures.
Dans 20 pour cent des cas (13 sur 64), on a observe une rotation de la tete dans
le sens inverse de la normale, la region cephalique et la partie superieure du
corps se couchant sur le cote droit. La queue s'est couchee comme normalement
sur le cote gauche et l'allantoide est sortie a droite de l'embryon. De semblables
injections ont ete faites a la 48<ime heure a des embryons dont la tete etait normalement couchee sur le cote gauche, mais elles etaient localisees a gauche de la
queue, a la hauteur des membres inferieures, cette derniere etant encore a plat a
ce stade. Dans 16 pour cent des cas, la queue s'est couchee sur le cote droit et
l'allantoide est sortie & gauche de l'embryon (Fig. A, Planche 1). On a ainsi
obtenu des embryons tordus dans le sens oppose aux precedents realises par une
injection a gauche de la tete. Dans chacun de ces deux cas, la rotation en sens
anormal peut n'etre que temporaire.
Ces rdsultats confirment que la rotation de la tete et de la queue de l'embryon
ne sont pas obligatoirement solidaires l'une de l'autre; ils montrent que l'allantoide sortie ventralement apparait a droite ou a gauche suivant le cote sur lequel
se couche l'embryon et qu'elle n'est pas un facteur de la rotation de la queue.
Nous avons, a ce sujet, observe sept cas demonstratifs dans lesquels l'allantoide
n'etait pas sortie comme normalement du cote oppose a celui ou l'embryon a
couche sa partie caudale. Dans quatre d'entre eux, la tete de l'embryon s'est
couche*e a gauche comme normalement, mais la queue s'est couchee a droite;
1'allantoide est alors sortie a gauche, mais dans les jours suivants la queue s'est
couchee a gauche et l'allantoide n'a pas suivi le mouvement. L'embryon s'est
alors trouve entierement couche a gauche mais avec l'allantoide derriere lui.
Dans les trois autres cas, l'inverse s'est produit. La tete s'est anormalement
couchee sur le cote droit et la queue sur le gauche; l'allantoide est done sortie a
droite comme normalement mais dans les jours suivants la queue s'est aussi
couchee a droite; 1'allantoide ne participant pas a ce mouvement elle s'est trouvee
302
P. ANCEL—LES INJECTIONS LOCALISEES
derriere Pembryon (Fig. B, Planche 1). L'absence de solidarity entre la position
de l'allantoide et le mode de rotation de la queue ainsi observee montre que cette
rotation n'est pas dirigee par l'allantoide.
L'action des injections localisees sur la formation de l'amnios et la rotation de
l'embryon montre que ces injections peuvent etre utilisees avec fruit dans l'etude
de la mecanique embryonnaire.
MISE EN EVIDENCE DE LA SENSIBILITE DE CERTAINES
EBAUCHES A SUBSTANCES CHIMIQUES
Lorsqu'on fait penetrer dans l'embryon une substance chimique electivement
teratogene, soit par injection generale, soit par injection localisee sur l'aire
vasculaire, on met en evidence la sensibilite de certaines ebauches organiques
pour cette substance. Avec une faible dose, une seule ebauche est lesee et donne
une malformation dite typique. Avec de plus fortes doses, certaines autres
ebauches sont aussi lesees et donnent des malformations dites secondaires.
D'autre part, plus la dose s'eleve, plus le nombre des morts precoces augmente.
Avec des doses tuant en 48 heures la plupart des embryons, on voit quelquefois
apparaitre certaines malformations indiquant que la dose necessaire pour les
obtenir est voisine de la dose letale. Le nombre des malformations secondaires
apparait done limite* par la sensibilite a la substance des ebauches dont la lesion
amene la mort (coeur et sang). Les injections localisees a diverses regions embryonnaires devront done permettre d'obtenir avec une substance donnee des
malformations qu'elle produit rarement ou meme jamais en injection generale
mais a la condition que la dose utilisee soit inferieure a la dose letale. Voici trois
exemples de la realisation de malformations par ce procede, l'ectrosomie, la
symelie, et l'exencephalie.
(a) Realisation de l'ectrosomie
L'ectrosomie, caracterisee par l'absence de la partie inferieure du tronc, n'est
apparue que tres rarement dans nos experiences d'injections generates et seulement avec quelques rares substances. A l'aide d'injections localisees, nous avons
obtenu cette malformation avec quatre substances: la colchicine a la concentration de 1:10,000 en a donne 875 pour cent, le cacodylate a celle de 1:10, 666
pour cent, la trypaflavine a 1:250,83 3 pour cent et la saponine pure Schuchardt
a 1:500, 62-5 pour cent. Les injections ont ete faites apres 48 heures d'incubation sur la ligne mediane dorsale a egale distance de l'extremite de la queue au
point d'emergence des vaisseaux omphalo-mesenteriques.
Les ectrosomes obtenus sont morts entre le Teme et le 96me jour. Us ne depassent
pas ce stade parce que l'absence de la partie caudale s'accompagne de l'absence
de l'allantoide, mais la partie cephalique est normalement developpee. On peut
decrire differents degres de la malformation (Ancel, 1953). Le plus faible est
constitue par l'absence de la partie du corps situee au-dessous d'une limite rasant
le bord superieur des ebauches des membres inferieurs. Dans le plus fort degre,
EN CHIMIOTERATOGENESE
303
les membres ainsi que les parois du corps font defaut, il ne reste que la tete a
laquelle se trouvent appendus les organes thoraciques et abdominaux. Le tube
digestif persiste bien developpe jusqu'au pedicule vitellin; le foie, l'estomac, et la
rate n'ont jamais fait defaut (Fig. C, Planche 1).
(b) Realisation de la symelie
L'obtention de cette malformation necessite la lesion d'une ebauche localisee
sur la ligne mediane dorsale, entre les ebauches des deux membres inferieurs.
L'arret de developpement de cette ebauche, s'il est tres marque, amene la fusion
des deux membres, donnant ainsi naissance a un membre unique pourvu d'orteils
normalement developpes (Fig. D, Planche 2). Ce membre unique peut etre plus
ou moins lese et former seulement un diverticule pourvu ou non d'orteils minuscules caracteristiques des sirenomeles (Fig. E, Planche 2). La fusion peut enfin
ne porter que sur la partie proximale des membres inferieurs qui restent distincts
dans leurs parties distales (symeloides), accoles l'un a l'autre ou separes avec ou
sans lesion (Fig. F et G, Planche 2).
Les symeliens ont ainsi pu etre ranges en trois groupes: symeles, sirenomeles
et symeloides. Ceux que nous avons obtenus forment une serie allant des symeloides a deux membres ecartes aux symeles parfaits. Certains peuvent arbitrairement etre ranges dans le premier ou le deuxieme groupe et d'autres dans le
deuxieme ou le troisieme.
Pour obtenir la symelie par injection localisee, nous avons d'abord utilise la
colchicine (Ancel, 1951). Lorsque cette substance arrive a l'embryon age de 48
heures par injection dans le sang de l'aire vasculaire de nombreux strophosomes
peuvent apparaitre, mais pas de symeles quelles que soient les doses utilise"es.
L'augmentation des doses necessaires pour produire la strophosomie n'aboutit
qu'a la mort trop prematuree des embryons pour permettre un diagnostic de
syme'lie. Les injections generates faites apres 34 ou 48 heures d'incubation ont
seulement fait apparaitre dans quelques cas un accolement entre les deux membres inferieurs releves sur le dos chez des strophosomes et permettant a la rigueur
de les ranger dans les symeloides.
Les injections localisees ont ete faites apres 34 a 48 heures d'incubation. La
quantite injected a ete de 1/4 mm.3 de solutions de 1:10,000 a 1:100,000 de
colchicine. Nous avons obtenu 13 symeliens: 4 symeles, un sirenomele et 8
symeloides dont 4 a membres accoles et 4 a membres ecartes. Le plus age des
symeles est mort a 18 jours et le plus age des symeloides a 10 jours. Nous avons
ensuite cherche a obtenir la symelie avec d'autres substances. Elles ont ete utilise*es dans les memes conditions experimentales que la colchicine. Les concentrations ont varie pour la ricine de 1:10,000 a 1:40,000; pour le cacodylate de
sodium de 1:10 a 1:30; pour la saponine de 1:1,000 a 1:3,000, et pour la
trypaflavine de 1:1,000 a 1:250. Les quantites injectees ont varie de 1/8 a 1/2
mm.3 Les resultats obtenus ont ete resumes dans le tableau 1.
Les resultats avec nos quatre nouvelles substances sont done egaux ou inferieurs a ceux obtenus avec la colchicine. Au total, 35 symeliens divises en 12
304
P. ANCEL—LES INJECTIONS LOCALISEES
symeles, 7 sirenomeles et 23 symeloides. La proportion des symeliens a un
membre obtenus par rapport au total des symeliens a ete de 38-4 pour cent pomla colchicine, de 22 2 pour la ricine, de 28 5 pour le cacodylate et de 50 pour cent
pour la saponine, au total 34-2 pour cent.
TABLEAU
Substances
Colchicine .
Ricine
Cacodylate Na
Saponine S .
Trypaflavine
1
Nombre
d'embryons
%de
Symeliens
Symeles
Sirenomeles
Symeloides
135
63
75
58
65
9-6
7
9-3
10
0
4
0
1
0
0
1
2
1
3
0
8
7
5
3
0
Ce resultat est a rapprocher de celui de E. Wolff (1936) qui, sur le meme objet,
a obtenu a l'aide des rayons X 9 symeles a un membre sur 33 symeliens, soit 27-2
pour cent.
Quelques autres points nous paraissent en outre meriter de retenir l'attention.
Ce sont, d'une part les resultats negatifs donnes par la trypaflavine qui a fait
apparaitre des celosomiens et des embryons porteurs de malformations des
membres mais aucun symelien, d'autre part la difficulte d'obtenir des symeles
avec orteils bien developpes. Dans deux cas seulement, ce fait a ete constate sur
nos cinq embryons ranges dans les symeles et dans la statistique de Wolff on ne
trouve que 2 de ces symeles contre 7 sirenomeles. Ces resultats montrent que la
sensibilite des ebauches des membres inferieurs est tres voisine de celle de
l'ebauche dorsale situee entre elles et mettent en evidence 1'extreme difficulte
de localiser Faction d'un agent physique ou chimique sur cette ebauche mediane
sans atteindre celles qui la bordent. La reussite d'un symele complet parait ainsi
due, dans nos experiences, non pas a une localisation exceptionnellement parfaite de Finjection, mais a une sensibilite exageree chez un individu de cette
ebauche mediane par rapport a ses voisines. Pour obtenir une forte proportion
de symeles, il semble done necessaire de trouver une substance pour laquelle
l'ebauche mediane serait plus sensible que les ebauches des membres inferieurs.
Dans ces conditions, nous n'avons pas juge utile de chercher des conditions
experimentales meilleures pour obtenir une plus forte proportion de symeles
avec les substances que nous avons etudiees.
(c) Realisation de Vexencephalie (Fig. H, Planche 2)
Des injections localisees faites sur la tete au stade de 34 heures nous ont permis
d'obtenir des exencephales. L'absence de la voute du crane et de la peau qui la
recouvre caracterise cette malformation qui, a notre connaissance, n'a ete
signalee chez la Poule ni a l'etat spontane ni apres action d'agents physiques
ou chimiques. Chez ces exencephales, la dure-mere etait presente et Fencephale
normalement developpe. Certains d'entre eux ont atteint le dernier jour de
EN CHIMIOTERATOGENESE
305
l'incubation; Us presentaient le meme developpement que les temoins. L'exencephalie a ete ainsi obtenue a l'aide de diverses substances: la colchicine a la
concentration de 1:30,000, la ricine a la meme concentration, la saponine S a
celle de 1:2,000 etla trypaflavine a 1:3,000. Les quantites injectees ont ete de 1/8
et de 1/24 mm.3 Diverses malformations de la tete, symetriques et asymetriques,
ont ete en outre obtenues. Leur etude sera fait ulterieurement.
Nous tenons cependant a signaler combien il est facile d'obtenir l'exencephalie
pure, malformation symetrique et bien localisee sans aucune autre malformation
de la tete, contrairement a ce que nous avons observe pour la symelie.
CONCLUSIONS
Les injections localisees de substances chimiques a de jeunes embryons de
Poule peuvent donner des resultats que ne permettent pas d'obtenir les autres
techniques utilisees dans l'etude de certains problemes de teratogenese.
I. Determination de la dose teratogene a l'aide de la colchicine
Une meme dose injectee sur une ebauche electivement sensible dont la lesion
provoque la formation de la strophosomie s'est montree d'autant plus active
qu'elle est contenue dans une plus petite quantite de solvant. La substance injectee parait done penetrer directement dans l'ebauche et son activite etre
fonction de sa concentration.
II. Mecanisme de Vaction de quatre substances teratogenes
Trois varietes d'experiences ont ete faites avec la colchicine, la ricine, la trypaflavine et une saponine. Des resultats de meme ordre ont ete obtenus avec ces
quatre substances. La premiere variete met en evidence l'activation du pouvoir
teratogene par la concentration de la dose. La seconde montre que ce pouvoir
est plus grand apres injection sur l'ebauche embryonnaire sensible que sur le
rdseau capillaire de l'aire vasculaire, et la troisieme amene k cette conclusion que
l'augmentation de ce pouvoir est au minimum de pres de 10 fois, mais avec des
differences de degre suivant les substances. La comparaison des effets teratogenes obtenus par injection sur l'ebauche sensible avec ceux determines par
l'injection dans le sang pourrait ainsi permettre de classer les substances teratogenes d'apres la perte d'activite que leur ferait subir leur passage dans le sang.
Elle permettrait aussi de reconnaitre les substances non directement teratogenes
mais realisant des malformations en privant l'organisme de substances indispensables au developpement de certaines ebauches.
III. Les injections localisees dans l'etude de la mecanique embryonnaire
1. Elles permettent de mettre en evidence un phenomena regulateur dans le
developpement de l'amnios: suppleance du capuchon cephalique par le caudal.
2. Elles agissent sur la rotation de l'embryon et peuvent coucher la tete sur le
cote* droit, le corps se couchant sur le gauche ou inversement suivant les points
ou ont ete localisees les injections. Certaines d'entre elles montrent que l'allantoiide n'est pas le facteur de la rotation de la partie inferieure du corps.
306
P. ANCEL—LES INJECTIONS LOCALISEES
IV. Mise en evidence de la sensibilite de certaines ebauches a des substances
chimiques
Les injections localisees ont fait apparaitre des malformations que ne produisent pas les autres techniques (symelie, exencephalie) et ont realise dans de
fortes proportions (80 pour cent) une malformation (ectrosomie) obtenue tres
rarement par les injections generales. II apparait ainsi qu'avec ces injections
generales, la sensibilite de certaines ebauches organiques pour une substance
chimique est masquee par celle, plus forte, de l'appareil circulatoire dont la
le*sion entraine la mort prematuree de l'embryon avant que puisse apparaitre la
malformation provoquee par l'arret de developpement de ces ebauches.
V. Valeur des injections localisees
Ces injections peuvent etre utilisees dans deux buts essentiellement differents:
la mise en evidence de l'ebauche la plus sensible a la substance injectee et la
destruction d'une ebauche determinee. Dans le premier cas, les injections doivent etre localisees a l'aire vasculaire, elles presentent sur les injections generales
les avantages que nous avons signales en comparant les deux techniques. Dans
le second cas, les injections obtenues avec notre appareil donnent des resultats
dependant de la concentration de la substance, de la quantite de solution injectee
et de la nature de la substance. Les injections effectuees avec des quantity de
1/8 a 1/24 mm.3 sont superieures aux agents physiques comme la chaleur, souvent utilisee avec l'aiguille rougie, le galvano ou le thermocautere, et elles paraissent avoir une valeur egale a celle des faisceaux paralleles de rayons X au point
de vue de la localisation. La nature de l'agent utilise qui ne joue pas avec les
agents physiques peut au contraire avoir une grande importance et permet, dans
certains cas, d'obtenir des resultats que les rayons X n'ont pas donnes. L'exemple
de l'arret de developpement localise du capuchon cephalique de l'amnios sans
lesion de l'embryon par la trypaflavine est du en effet, non seulement a la localisation, mais au fait qu'au stade ou l'injection a ete pratiquee l'amnios est
l'ebauche la plus sensible a la trypaflavine. La technique de ces injections peut
done progresser dans deux directions differentes, d'une part en utilisant des
instruments permettant la reduction de la quantite de solution injectee tout en
conservant aux injections leur caractere de regularite, et d'autre part par la
decouverte de substances teratogenes auxquelles seraient electivement sensibles
les ebauches dont on cherche a arreter le developpement sans troubler revolution
des autres parties de l'embryon.
SUMMARY
Localized injections of chemical substances on to young chick embryos have
provided new data on the determination of the teratogenic dose, on the sensitivity
of certain embryonic rudiments, on the mode of teratogenic action of various
chemical substances and on certain problems of embryonic mechanisms.
Vol. 2, Part 4
J. Embryol. exp. Morph.
P. ANCEL
Planche 1
Vol. 2, Part 4
J. Embryol. exp. Morph.
P. ANCEL
Planche 2
EN C H I M I O T E R A T O G E N E S E
307
T R A V A U X CITfiS
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E X P L I C A T I O N DES P L A N C H E S
PLANCHE 1
FIG. A. Embryon age de 6 jours, tete couchee a gauche, partie caudale a plat, allantoide
a gauche. Le capuchon cephalique de l'amnios est au-dessus des membres superieurs, pas de
capuchon caudal. Trypaflavine: 1:2,000.
FIG. B. Embryon age de 5 jours, couche sur le cote droit avec allantoide a droite. Trypaflavine
1:2,000.
FIG. C. Trois ectrosomes ages de 8 jours. A gauche, ceiosomien dont les membres sont dirig^s
vers le dos (colchicine). Au milieu, malformation des membres superieurs reduits a une petite
saillie pointue (cacodylate de sodium). A droite, tete a laquelle est appendu un paquet d'organes,
pas de parois du corps ni de membres ni d'amnios (trypaflavine).
PLANCHE 2
FlG. D. Trois syme'liens obtenus avec la colchicine. A gauche, embryon £g6 de 8 jours avec
un membre bifurque". Au milieu (7 jours) deux membres soude's. A droite (6 jours) deux membres
ecartes.
FIG. E. Symeiien a un membre avec orteils rudimentaires, age de 9 jours, obtenu par la
saponine.
FIG. F. Symeioide a membres separes dans leur partie distale, age de 7 jours, obtenu a l'aide
de la ricine.
FIG. G. Symeiien a un membre pourvu de trois orteils, age de 18 jours, strophosome obtenu
avec la colchicine.
FIG. H. Exencephale age de 19 jours. Trypaflavine 1:1,000. 1/24 mmc. apres 34 heures d'incubation.
{Manuscript received 3:v: 54)
5584.4