/. Embryol. exp. Morph. Vol. 38, pp. 1-18, 1977
Printed in Great Britain
Etude ultrastructurale des
stades precoces du developpement du membre
posterieur de Pleurodeles waltlii Michah.
(Amphibien, Urodele)
ParM. LAUTHIER1
Laboratoire de Biologie du Developpement, Universite Pierre et Marie Curie
et Laboratoire de Cytologie experimental du CNRS
SUMMARY
An ultrastructural study of the early stages of development of the hind limb-bud has been
carried out in Pleurodeles waltlii Michah. The most interesting results concern the structure
of the epidermis and the evolution of the dermo-epidermal boundary in the limb-bud.
At every level of the limb-bud, the mesoderm draws near to the epidermis due to filopodia
that penetrate the basal fibrous layer which becomes progressively disorganized; this can be
considered as the establishment of interactions between epidermis and mesoderm. Some
subepithelial cells with dense bodies participate in the disorganization of the basal fibrous
layer.
There is no special epidermal feature at the limb-bud apex. However, the ultrastructural
uniformity of the epidermis (which can be related to its histoenzymological uniformity) does
not exclude a morphogenetic role of that epidermis.
The absence of any apical differentiation of the Pleurodeles hind limb-bud as well as the
absence of a strictly localized disorganization of the basal fibrous layer and the closeness of
the mesoderm and epidermis, are discussed. It is suggested that, if in Urodela the epidermis of
the limb-bud plays a morphogenetic role, the whole epidermis is concerned and not only its
apical part as in Amniotes. The differences observed at the level of the hind limb-bud between
Urodela and the other Tetrapods could be related to the strikingly different chronological
appearance of the toes in the two groups.
INTRODUCTION
L'analyse ultrastructurale de la morphogenese des bourgeons de membre des
Amphibiens a ete recemment effectuee chez deux Anoures: Bufo regularis
(membres anterieur et posterieur), par Balinsky (1972), et Xenopus laevis (membre
posterieur), par Kelley & Bluemink (1974) et par Tarin & Sturdee (1974). A
notre connaissance, il n'existe pas encore de donnees sur l'ultrastructure des
ebauches des membres des Urodeles. Nous nous proposons dans ce travail
1
Adresse postale de Vauteur: Laboratoire de Cytologie experimental du CNRS, 67, rue
Maurice Giinsbourg, 94200 Ivry, France.
2
M. LAUTHIER
d'etudier, par le moyen de la microscopie electronique, le developpement des
jeunes bourgeons du membre posterieur de l'Amphibien Urodele Pleurodeles
waltlii Michah.
Chez les Amphibiens, l'existence d'interactions entre le mesoderme du bourgeon de membre et son revetement epidermique, semblables a celles demontrees chez le Poulet (revue in Zwilling, 1961), ont ete raises en evidence experimentalement chez les larves de quelques Anoures (Rarta fusca: Steiner, 1928;
Xenopus laevis: Tschumi, 1957) et de quelques Urodeles {Ambystoma mexicanum
et Triturus sp.: Filatow, 1928; Balinsky, 1931 et Rotmann, 1933; Triturus
taeniatus'. Steiner, 1928). Chez le Poulet, la zone morphogenetiquement active
de l'epiderme est differenciee en une crete apicale, mais la presence d'une telle
structure est discutee chez les Amphibiens. Un epaississement apical epidermique a bien ete decrit au niveau du membre posterieur chez certains Anoures
{Xenopus laevis: Tarin & Sturdee, 1971; Alytes obstetricans, Bombina variegata,
Rana temporaria, R. esculenta, Bufo bufo et B. calamita: Stebler, 1973), toutefois il n'est pas evident qu'il soit equivalent a celui du Poulet ou des Mammiferes. En revanche, chez les Urodeles, jamais un epaississement epidermique
apical n'a ete signale au cours de la morphogenese des membres et, nous meme,
nous n'en avons pas observe chez le Pleurodele au niveau des bourgeons de
membre anterieur et posterieur en developpement (Lauthier, 1974); recemment
Sturdee & Connock (1975), a la suite d'etudes histologiques en microscopie
optique et d'une observation au microscope a balayage, concluent egalement a
l'absence d'une telle structure au niveau des membres anterieurs de Notophthalmus cristatus et de N. vulgaris. Selon Amprino (1972), il n'est pas evident
que l'epiderme apical joue, chez le Poulet, un role particulier dans l'induction
de l'accroissement du mesoderme sous-jacent.
II nous a paru interessant de realiser une etude ultrastructurale du developpement du bourgeon du membre posterieur d'un Amphibien Urodele, et de rechercher quelles lumieres une telle etude peut apporter sur le probleme des
interactions entre l'epiderme et le mesoderme du membre.
MATERIEL ET METHODES
(A) Materiel
Les pontes utilisees sont issues d'animaux eleves au laboratoire. Notre etude
porte sur les phases precoces du developpement depuis le debut de l'accumulation des cellules mesodermiques jusqu'au moment ou commence la differenciation du squelette et des muscles. Nous avons defini, a l'aide de coupes sagittales
des bourgeons de membre, un certain nombre de stades bases sur la mise en place
du materiel mesodermique et sur la forme du bourgeon. Nous avons etabli
secondairement leur correspondance avec ceux de la table chronologique du
developpement de Gallien & Durocher (1957) (Fig. 1).
(1) Stade 0: (stade 34 de la table de Gallien & Durocher) (Fig. 1A). Au
Ultrastructure du membre posterieur du Pleurodele
niveau du territoire presomptif des membres posterieurs (14eme et 15eme
segments musculaires comptes a partir de la capsule otique: Balinsky, 1933;
Lauthier, 1971), aucune differentiation morphologique n'est encore decelable;
en particulier il n'y a pas encore d'accumulation de cellules mesodermiques
entre 1'epiderme et la somatopleure.
(2) Stade I: (stades 35 a 40) (Fig. 1B). Le bourgeon de membre n'est pas
encore visible exterieurement. On observe un debut d'accumulation de cellules
mesodermiques entre 1'epiderme et la somatopleure.
(3) Stade II: (stade 41) (Fig. 1C). L'ebauche des membres posterieurs est a
peine visible exterieurement.
(4) Stade III: (stade 42) (Fig. 1D). Les cellules mesodermiques forment un
amas ou el les s'orientent concentriquement.
(5) Stade IV: (stade 43) (Fig. IE). Le bourgeon de membre est conique et
bien visible exterieurement.
(6) Stade V: (stades 44 a 46). Ce stade est subdivise en stades intermediaires
Va et Vb (Fig. I F et G). Le bourgeon de membre devient cylindrique. On
observe le debut de la differenciation precartilagineuse du stylopode qui est
represente par un amas plus dense de cellules au centre du mesoderme.
(7) Stade VI: (stade 47) (Fig. 1H). L'extremite du membre s'aplati en forme
de palette. L'etude histologique montre un debut de chondrification du femur
(Lauthier, 1970).
Des larves ont ete prelevees a chaque stade, depuis le stade 0 jusqu'au stade Vb.
Au total, 21 larves ont ete etudiees: 1 au stade 0, 6 au stade I, 3 au stade II, 2 au
stade III, 6 au stade IV et 3 au stade V.
(B) Methodes
Les larves sont anesthesiees a l'aide de MS 222 (Sandoz) et fixees: soit au
glutaraldehyde a 2,5 % dans un tampon phosphate Sorensen a 0,1M (pH 7,4),
soit au glutaraldehyde a 2,5 % dans un tampon cacodylate de sodium a 0,1 M
(pH 7,4) additionne de saccharose (1,1 g pour 100 cm3). Les animaux sont disseques dans le fixateur et nous conservons seulement la portion du corps ou se
trouvent les membres posterieurs. Apres 1 h de fixation, les specimens sont rinces
rapidement dans le tampon correspondant et post-fixes pendant 1 h au tetroxyde
d'osmium a 1 % dans le tampon. Deux larves au stade I ont ete fixees pendant
1 h au glutaraldehyde a 2 % dans un tampon cacodylate de sodium a 0,05 M
contenant 2 % d'acide phosphotungstique (PTA) et ajuste au pH 7,4 avec
NaOH a 0,01 N. Apres un rapide rincage dans le meme tampon, les pieces ont
ete post-fixees au tetroxyde d'osmium a 1 % dans un tampon cacodylate de
sodium a 0,1 M (pH 7,4) sans PTA.
Les pieces sont ensuite dehydratees par l'ethanol, incluses dans l'araldite
apres passage dans l'oxyde de propylene et coupees sur un ultra-microtome
Porter-Blum MT 2A. Les coupes sont contrastees par l'acetate d'uranyle (2,5 %
dans l'ethanol a 50 %, pendant 4 min a la temperature du laboratoire), puis par
3
M. LAUTHIER
Ultrastructure du membre posterieur du Pleurodele
le citrate de plomb pendant 5 min. Les observations et les cliches ont ete
realises sur un microscope Philips EM 201 et sur un microscope RCA EMU
3C. Nous avons effectue des reconstructions du bourgeon du membre posterieur
aux differents stades, a l'aide de microphotographies au grossissement 1500.
Ces reconstructions nous ont permis de faire un reperage exact des differentes
zones du bourgeon de membre. L'epiderme du flanc a ete observe dans la
zone situee entre la partie dorsale de la base du membre et la ligne laterale.
RESULTATS
(A) Uepiderme
Aucune differenciation epidermique particuliere n'a ete observee dans la
region apicale du bourgeon de membre et il n'a pas ete trouve de difference
cytologique remarquable, ni aux differents nivaeux (dorsal, apical et ventral)
du bourgeon, ni aux differents stades pour chacun de ces niveaux. En outre,
sauf en ce qui concerne 1'evolution des hemidesmosomes, l'epiderme du membre
ne differe pas de l'epiderme du flanc.
L'epiderme des membres posterieurs (comme l'epiderme du flanc) est
constitue par une double couche de cellules aplaties. La jonction des cellules
de la couche profonde avecla frontiere qui separe l'epiderme du mesoderme est
assuree par des hemidesmosomes. Au stade 0, les hemidesmosomes apparaissent
FIGURE 1
Stades precoces du developpement du bourgeon du membre posterieur du
Pleurodele. Fig. 1A-E: coupes transversales d'embryons de Pleurodele, au niveau du
bourgeon du membre posterieur; Fig. 1F-H: coupes sagittales du bourgeon de
membre posterieur (Fig. A-G: coupes semi-fines dans l'araldite: 0,5 /im d'epaisseur;
Fig. H: coupe dans la paraffine: 7,5 /tm d'epaisseur).
(•fc): emplacements ou ont ete observees les cellules a inclusions denses sur differents bourgeons.
(A) Stade 0. Aucune differenciation morphologique du membre n'est encore decelable. CjCoelome; C.W., canal de Wolff; Ep., epiderme; Int., intestin; My., myotome;
s., somatopleure.
(B) Stade I. Debut de l'accumulation des cellules mesodermiques sous l'epiderme.
Mes., cellules mesodermiques.
(C) Stade II. L'ebauche du membre devient visible exterieurement. Mes., cellules
mesodermiques; V., vaisseau sanguin.
(D) Stade III. Les cellules mesodermiques forment un amas ou elles s'orientent
concentriquement. Mes., cellules mesodermiques.
(E) Stade IV. Le bourgeon de membre est conique. C.L., cellule de Leydig.
(F) Stade Va. Le bourgeon de membre devient cylindrique.
(G) Stade Vb. Le bourgeon de membre est cylindrique; noter le debut de la
la differenciation cartilagineuse du femur. Eb.Fe., ebauche du femur.
(H) Stade VI. Le membre est aplati en palette; noter l'etat de chondrification du femur. Eb.Fe., ebauche du femur.
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M. LAUTH1ER
Fig. 2. La front iere entre l'epiderme et le mesoderme.
(A) Stade 0 (niveau du merabre). Les hemidesmosomes sont de simples epaississements de la membrane plasmique des cellules profondes de l'epiderme. A ce stade,
les granules adepidermiques sont tres denses aux electrons et la couche fibreuse
basale est encore bien organisee. Noter les filaments d'interconnection des fibres de
collagene (petites fleches). C.f.b., couche fibreuse basale; Ep., epiderme; G.A.,
granules adepidermiques; H., hemidesmosomes; L.d., lamina densa; L.I., lamina
lucida; M., mesoderme.
(B) Stade Vb (niveau du flanc). A ce niveau, les hemidesmosomes ont une organisation caracteristique et la couche fibreuse basale reste toujours bien organisee. Les
granules adepidermiques sont peu denses aux electrons a ce stade. Noter les filaments
qui traversent la lamina lucida (filaments d'ancrage Ax) et la presence dans la couche
fibreuse basale, defibrillesindividuelles (fibrilles d'ancrage A2) rencontrees aussi bien
au niveau du membre qu'au niveau du flanc. Ax, filaments d'ancrage Ax; A2,
fibrilles d'ancrage A2; C.f.b., couche fibreuse basale; Ep., epiderme; G.A., granules
adepidermiques; H., hemidesmosomes; M, mesoderme.
comme de simples epaississements de la membrane plasmique des cellules
profondes (Fig. 2 A). Par la suite, ils gardent cette structure primitive au niveau
de l'epiderme du bourgeon ou ils se rarefient; par contre au niveau de l'epiderme
du flanc, ils s'organisent progressivement jusqu'a presenter une organisation
caracteristique (Fig. 2B). Des cellules de Leydig sont dispersees dans l'epiderme;
elles sont separees du milieu exterieur et de la frontiere epiderme-mesoderme
par des extensions des cellules superficielles et profondes. Elles apparaissent au
cours du stade I et leur nombre s'accroit progressivement pendant la suite de la
Ultrastructure du membre posterieur du Pleurodele
Fig. 3. Evolution de la couche fibreuse basale a l'apex du bourgeon de membre.
Noter la diminution d'epaisseur et la disorganisation progressive de la couche
fibreuse basale (cette evolution ne se rencontre pas seulement a l'apex, mais a tous les
niveaux: dorsal, apical et ventral du bourgeon de membre).
(A) Stade II. C.f.b., couche fibreuse basale; Ep., epiderme; M., mesoderme.
(B) Stade IV. C.f.b., couche fibreuse basale; Ep., epiderme; M., mesoderme.
(C) Stade Vb. C.f.b., couche fibreuse basale; Ep., epiderme; F.M., filopode mesodermique; M., mesoderme.
vie larvaire (elles disparaissent au moment de la metamorphose de I'epiderme:
Kelly, 1966). Au stade IT, elles sont plus nombreuses au niveau du flanc qu'au
niveau des membres posterieurs ou elles sont reparties regulierement. Aux
stades ulterieurs, elles deviennent tres nombreuses le long de I'epiderme du
flanc. Elles sont toujours presentes dans l'epiderme des membres ou elles se
regroupent essentiellement dans les parties dorsale et ventrale de la base des
membres (Fig. IE).
(B) La frontiere entre Vepiderme et le mesoderme
Entre I'epiderme et le mesoderme, on observe un ensemble de structures
acellulaires qui constituent la 'membrane basale' observee en microscopie
photonique. De I'epiderme vers le mesoderme on rencontre: la lamina lucida, la
lamina densa et la couche fibreuse basale.
M. LAUTHIER
0,5/im
Fig. 4. Poussees du mesoderme vers l'epiderme (niveau de l'apex du bourgeon).
(A) Stade I. Les filopodes mesodermiques penetrent vers l'epiderme a travers la
couche fibreuse basale encore bien organisee. C.f.b., couche fibreuse basale; Ep.,
epiderme; F.M., filopode mesodermique; G.A., granules adepidermiques; H.,
hemidesmosomes; M., mesoderme.
(B) Stade III. Noter la penetration d'un filopode mesodermique le long d'un
faisceau defibresassociees parallelement entre elles (fibres d'ancrage A3). A3, fibre
d'ancrage A3; C.f.b., couchefibreusebasale; Ep., epiderme; F.M.,filopodemesodermique; M., mesoderme; V.p., vesicule de pinocytose.
(C) Stade Va. Les filopodes mesodermiques sont tres proches de l'epiderme.
Noter la diminution d'epaisseur et la disorganisation de la couche fibreuse basale
ainsi que la disparition des granules adepidermiques. C.f.b., couchefibreusebasale;
Ep., epiderme; F.M., filopodes mesodermiques.
Noter que Ton ne rencontre jamais d'hemidesmosomes presentant une organisation
caracteristique et que les granules adepidermiques deviennent moins denses aux
electrons a partir du stade I.
(1) La lamina lucida (Fig. 2A) (selon Tarin & Sturdee, 1974). Cest une zone,
transparente aux electrons, situee entre la membrane plasmique des cellules
profondes de l'epiderme et la lamina densa. EUe contient des granules, disposes
en chapelet, dont le diametre varie entre 25 et 65 nm (Fig. 2 A) et qui deviennent
moins denses aux electrons a partir du stade I auniveau du bourgeon (Fig. 4) et
au niveau du flanc (Fig. 2B); ils disparaissent a l'apex du bourgeon dans les
stades tardifs (Fig. 4C). Apres fixation au PTA, les granules presentent toujours
Ultrastructure du membre posterieur du Pleurodele
9
un contour spherique et un aspect granuleux. Des filaments traversent la
lamina lucida entre les granules et relient les hemidesmosomes a la lamina densa.
Ces filaments sont bien visibles surtout au niveau du flanc ou les hemidesmosomes sont bien organises (Fig. 2B). La lamina lucida a une epaisseur qui varie
de 50 a 75 nm.
(2) La lamina densa (Fig. 2 A) (selon Tarin & Sturdee, 1974). Cest une zone
dense aux electrons, d'aspect granuleux, situee entre la lamina lucida et la
couche fibreuse basale. Elle a une epaisseur qui varie de 10 a 25 nm.
(3) La couchefibreusebasale (Fig. 2 A) ('basal lamella' de Kelley & Bluemink,
1974). Elle est constitute par un grand nombre de couches de fibres de collagene
d'un diametre de 10 a 20 nm paralleles entre elles et orientees orthogonalement
d'une couche a l'autre; de plus, elles sont reliees les unes aux autres par de tres
fins filaments (Fig. 2 A). La couche fibreuse basale est traversee occasionnellement a tous les stades et a tous les niveaux du membre et du flanc, par deux
sortes de structures perpendiculaires a la lamina densa: d'une part, desfibrilles
individuelles (peu frequentes) situees au voisinage de la lamina densa, qui
entrent en contact avec elle (Fig. 2B) et ont un diametre d'environ 20 nm,
d'autre part, &zs faisceaux de fibres associees parallelement entre elles (Fig. 4B).
Ces faisceaux ont une largeur approximative de 130 nm. Us entrent en contact
avec la lamina densa.
Au niveau du bourgeon de membre, l'agencement des fibres de collagene de la
couche fibreuse basale se desorganise progressivement en direction del'epiderme,
a partir du stade I (Fig. 3). L'epaisseur de la couche fibreuse basale diminue a
l'apex du bourgeon au cours du developpement (Fig. 3). Au niveau du flanc, la
couche fibreuse basale reste intacte au cours du developpement (Fig. 2B).
(C) Le mesoderme
Au stade I, les cellules mesodermiques situees sous l'epiderme du bourgeon,
emettent des filopodes qui commencent a penetrer dans la couche fibreuse basale
encore bien organisee. Dans la suite du developpement, celle-ci se desorganise
progressivement et les filopodes, de plus en plus nombreux, penetrent de plus
en plus vers la lamina densa (Fig. 4). Au stade V, les filopodes arrivent presque
au contact de la lamina densa (Fig. 3C et 4C). La penetration des filopodes a
travers la couche fibreuse basale n'est pas specifique de l'apex, mais se rencontre
a tous les niveaux du bourgeon du membre; en revanche, nous ne l'avons jamais
observee au niveau du flanc. Quelquefois, les filopodes s'insinuent a travers les
fibres de collagene en longeant les faisceaux de fibres attaches perpendiculairement a la lamina densa et decrits plus haut (Fig. 4B).
A tous les stades du developpement du jeune bourgeon de membre, nous
observons parmi les cellules mesodermiques, la presence de quelques cellules a
la morphologie particuliere (Figs. 1 et 5). Ces cellules ont un noyau multilobe et
leur cytoplasme est caracterise par la presence d'inclusions denses aux electrons
(110 a 140 nm de diametre) et de vesicules plus claires (50 a 90 nm de diametre).
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M. LAUTHIER
Ultrastructure du membre posterieur du Pleurodele
11
Leur cytoplasme contient egalement des grains qui ont l'aspect caracteristique
des grains de glycogene, et detresnombreusesmitochondries. Jusqu'au stade III,
elles sont localisees dans la partie proximale du membre (Fig. 1B-D); plus
tard, elles sont retrouvees sous l'epiderme oil elles participent a la desorganisation de l'agencement des fibres de collagene de la couche fibreuse basale (Figs.
IE, G e t 5A-B).
Dans le mesoderme apical, nous n'avons jamais observe desinus marginal.
DISCUSSION
(A) L'epiderme du bourgeon de membre
L'epiderme du bourgeon du membre posterieur du Pleurodele ne presente pas
de structure particuliere au cours de son developpement; en particulier, nous
n'avons pas observe d'epaississement epidermique apical. Seuls les hemidesmosomes presentent quelques particularites dans leur evolution. Us se rarefient au
niveau du membre (comme le decrivent Kelley & Bluemink chez le Xenope) et
ne s'y organisent jamais (Fig. 4) comme ils le font au niveau du flanc (Fig. 2B).
Nos observations corroborent les conclusions de Tarin & Sturdee qui considerent
les epaississements occasionnels de la membrane plasmique des cellules profondes au niveau du bourgeon de membre du Xenope comme des stades jeunes
du developpement de ces structures. En revanche, si chez le Pleurodele les
hemidesmosomes restent ties peu organises au niveau du bourgeon, ils ne disparaissent pas totalement dans les stades tardifs comme chez le Xenope (Kelley
& Bluemink, 1974).
L'uniformite structural de l'epiderme est a rapprocher de celle de ses reactions histoenzymologiques observees en microscopie photonique et decrites
ailleurs (Geraudie & Lauthier, 1972; Lauthier, 1974). L'epiderme du bourgeon
de membre du Pleurodele differe de celui des Amniotes ou l'apex est differencie en
une crete epidermique qui possede des caracteres ultrastructuraux et histoenzymologiques permettant de la distinguer du reste de l'epiderme du bourgeon.
L'absence de differentiation epidermique apicale est d'autre part a rapprocher
de l'absence de sinus marginal dans le mesoderme (rappelons que Sturdee &
Connock (1975) n'ont pas observe non plus de sinus marginal a l'apex du
membre anterieur des Urodeles: Notophthalmus cristatus et N. vulgaris, alors
FIGURE 5
Rapports des cellules a inclusions denses {-k) avec la couche fibreuse basale.
(A) Stade IV. (*), cellules a inclusions denses; C.f.b., couche fibreuse basale; Ep.,
epiderme; M., mesoderme.
(B) Detail de lafigureA.Noter la disorganisation de la couchefibreusebasale par les
filopodes de la cellule a inclusions denses. C.f.b., couche fibreuse basale; Ep.,
epiderme; F., filopodes de la cellule a inclusions denses.
(C) Stade Vb. (•*•), cellule a inclusions denses; C.f.b., couche fibreuse basale; Ep.,
epiderme; M., mesoderme.
12
M. LAUTHIER
qu'il est present dans les autres classes de Vertebres chez lesquels une crete
apicale epidermique a ete trouvee.
L'uniformite ultrastructurale et histoenzymologique de l'epiderme du bourgeon du membre posterieur du Pleurodele n'exclut pas cependant que l'epiderme
interagisse avec le mesoderme du membre. Ce que Ton observe au niveau de la
frontiere epiderme-mesoderme suggere en effet que des interactions existent
entre les deux tissus.
(B) La frontiere entre Vepiderme et le mesoderme
(1) La lamina lucida
(a) Au niveau de l'epiderme du bourgeon de membre (et du flanc), la lamina
lucida est traversee par des filaments qui relient les hemidesmosomes a la
lamina densa (Fig. 2B). Ces filaments correspondent aux filaments d'ancrage
Ai decrits par Nakao (1974) chez Rana rugosa. De tels filaments d'ancrage sont
observes egalement chez Ambystoma mexicanum et chez Triturus sp. (revue in
Nakao, 1974) et chez Xenopus laevis (Kelley & Bluemink, 1974). Krawczyk &
Wilgram (1973) decrivent de tels filaments au cours de la morphogenese in vivo
des hemidesmosomes dans la peau de Souris en cours de cicatrisation ou ils
relient la membrane plasmique des keratinocytes a la lamina densa.
(b) La presence de granules adepidermiques dans la lamina lucida a deja
ete signalee chez les Amphibiens Urodeles et chez les Poissons (revue in Watanabe & Tachibana, 1973; Tachibana & Watanabe, 1973; Tachibana, 1975 et
Geraudie (1977), et chez les Amphibiens Anoures (revue in Nakao, 1974;
Kelley & Bluemink, 1974 et Tarin & Sturdee, 1974). Ces granules adepidermiques sont spheriques chez les Urodeles et chez les Poissons, Divers auteurs
(revue in Tachibana & Watanabe, 1973) les decrivent chez les Anoures comme
etant lamellaires; Kelley & Bluemink et Tarin & Sturdee les decrivent egalement
chez le Xenope, comme etant constitues de lamelles superposees. D'apres
Nakao, ils presentent chez Rana rugosa une structure lamellaire mais seulement
apres une fixation avec du PTA. Chez le Pleurodele, nous n'avons pas observe
de modification de structure apres une fixation avec du PTA: les granules ont
garde leur aspect spherique deja decrit chez les Urodeles. Le fait qu'ils deviennent moins denses aux electrons a partir du stade I est a rapprocher de la
delamination progressive des granules notee chez le Xenope, a partir du stade
46, par Kelley & Bluemink. Leur changement d'aspect chez le Pleurodele
traduit sans doute la meme degradation progressive des granules. Cependant,
chez le Xenope, cette alteration (qui atteint son maximum au stade 48) est
localisee uniquement au niveau du membre, alors que chez le Pleurodele elle
affecte egalement l'epiderme du flanc. Nous n'avons aucune information particuliere quant a leur constitution chimique chez le Pleurodele, mais recemment
Tachibana (1975) a montre chez Hynobius tokyoensis que l'acide periodique et
la lipase degradent partiellement les granules adepidermiques, et qu'ils sont
completement digeres sur des coupes traitees successivement par la phospho-
Ultrastructure du membre posterieur du Pleurodele
13
lipase C, la neuraminidase et la lipase. De tels granules ne sont pas observes
chez les Amniotes et leur origine et leur fonction ne sont pas actuellement
demontrees.
(2) La lamina densa
Nous n'avons pas observe, ni les discontinuites de la lamina densa decrites
dans le membre anterieur du Poulet par Jurand (1965) et par Ede, Bellairs &
Bancroft (1974) sous la crete apicale epidermique, ni sa disparition signalee
chez la Truite par Geraudie (1977) au niveau de la pseudo crete apicale
epidermique dans la nageoire pelvienne. Jurand pense que ces discontinuites de
la lamina densa faciliteraient les interactions entre la crete apicale epidermique
et le mesoderme. Mais de telles discontinuites de la lamina densa n'ont pas
ete decrites non plus, ni chez le Poulet (Berczy, 1966) et chez l'Homme (Kelley,
1973), ni chez les Amphibiens Anoures etudiees (Bufo regular is: Balinsky, 1972,
et Xenopus laevis: Kelley & Bluemink, 1974, et Turin & Sturdee, 1974).
(3) La couchefibreusebasale
II est interessant de remarquer qu'une telle organisation des fibres de collagene de la couche fibreuse basale, ne se rencontre que chez les Anamniotes
(Poissons, Urodeles, Anoures). Chez les Amniotes, cette zone est remplacee par
un espace rempli par un materiel lache fibreux. D'apres Jurand (1965), chez la
Souris et chez le Poulet, ce materiel ne serait pas constitue de collagene:
cependant Smith, Searls & Hilfer (1975) mettent en evidence la presence de
fibres de collagene chez le Poulet. Raynaud et al. (1974), chez l'Orvet et chez le
Lezard vert, decrivent un materiel fibrillaire ou filamenteux.
(a) Les fins filaments qui relient entre elles les fibres de collagene (Fig. 2 A)
sont egalement observes chez le Xenope par Kelley & Bluemink apres traitement par le rouge de ruthenium. Us contribuent a l'arrangement orthogonal des
fibres par le moyen de liaisons hydrogene et d'interactions ioniques (Myers,
Highton & Rayns, 1973).
(6) Lesfibrilles individuelles (Fig. 2B), correspondent aux fibrilles d'ancrage A2
decrites par Nakao chez Rana rugosa. Elles sont presentes aussi bien au niveau
de l'epiderme du membre qu'au niveau de l'epiderme du flanc mais sont peu
frequentes; elles entrent en contact avec la lamina densa. Elles sont signalees
egalement chez Xenopus laevis par Kelley & Bluemink et par Tarin & Sturdee.
(c) Les faisceaux de fibres associees parallelement entre elles (Fig. 4B) correspondent aux fibres d'ancrage A 3 decrites par Nakao chez Rana rugosa. Us sont
presents aussi bien au niveau de l'epiderme du membre qu'au niveau de l'epiderme du flanc. Us n'ont pas ete decrits chez les autres Amphibiens mais semblent
etre equivalents aux filaments d'ancrage en faisceaux observes par Kallman,
Evans & Wessels (1967) chez le Poulet.
(d) Evolution de la couche fibreuse basale au cows du developpement. A partir
du stade I nous observons au niveau du membre, et seulement a ce niveau, une
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EMB 38
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M. LAUTHIER
alteration de l'arrangement orthogonal des couches de fibres de collagene qui
progresse vers l'epiderme (Fig. 3). Ce phenomene n'est pas propre a la region
apicale mais se rencontre a tous les niveaux du bourgeon. Une telle disorganisation est decrite chez tous les Amphibiens etudies (Xenopus laevis et Bufo
regular is). Quelle est la cause de cette disorganisation? Pour Kelley & Bluemink, il est probable qu'une enzyme degradant les acides glycoaminoglycanes
est produite pendant les stades jeunes de la morphogenese (probablement par
les cellules mesodermiques) et qu'elle affaiblit les filaments qui connectent les
fibres. Chez le Pleurodele, elle est provoquee en partie par les cellules subepitheliales a inclusions denses issues de la partie proximale du membre (Fig. 5 A,
B). Ces cellules ressemblent a des macrophages mais nous n'avons cependant
jamais observe dans ces cellules (ni dans les cellules mesodermiques qui penetrent
dans la couche fibreuse basale) des vacuoles contenant du collagene ingere.
Kelley & Bluemink ont observe a partir du stade 46 chez le Xenope, sous la
couche fibreuse basale de la base du membre, des cellules semblables; selon
eux, egalement, elles contribuent au remodelage de la couche fibreuse basale. II
est interessant de comparer la disorganisation de la couche fibreuse basale au
niveau du membre, en cours de morphogenese, a celle qui se produit au niveau
de la queue du tetard de Rana catesbiana au cours de sa resorption induite par
la thyroxine; Usuku, Honya, Oyamada & Ogata (1974) montrent une penetration
identique de la couche fibreuse basale par des cellules mesodermiques et par des
cellules qui ressemblent a des macrophages. Dans ce cas, cependant, le cytoplasme de ces cellules contient des vacuoles qui renferment des fibres de collagene, ce qui suggere une activite phagocytaire qui pourrait etre simultanee a une
degradation des fibres de collagene dans l'espace extracellulaire; en effet dans les
memes conditions metamorphiques, chez Rana pipiens et chez R. catesbiana,
Davis, Jeffrey, Eisen & Derby (1975) montrent que l'apparition de collagenase et
la degradation du collagene sont concomitantes.
L'extreme diminution d'epaisseur de la couche fibreuse basale a l'apex des
stades tardifs (Figs. 3C et 4C), pourrait expliquer l'attenuation de la reaction
phosphatasique alcaline observee, aux memes stades, dans la region apicale au
niveau de la 'membrane basale' (Lauthier, 1974).
(C) Le rapprochement du mesoderme et de Vepiderme
Chez le Pleurodele, la disorganisation de la couche fibreuse basale s'accompagne, a tous les niveaux du bourgeon, d'une penetration progressive vers l'epiderme des filopodes des cellules mesodermiques sous-jacentes (Fig. 4). A partir
du stade III, denombreux filopodes sont presque au contact de la lamina densa.
Des observations comparables ont ete effectuees chez le Xenope et chez le
Crapaud. Balinsky, en 1957, se referant a Fapparition de membre surnumeraire
sur le flanc de Triturus cristatus consecutive a la transplantation de la capsule
otique, a suggere que le collagene de la couche fibreuse basale pourrait constituer
une barriere a des interactions entre le mesoderme et l'epiderme; la destruction
Ultrastructure du membre posterieur du Pleurodele
15
de cette barriere resultant de la greffe permettrait la formation d'un membre
surnumeraire dans une zone qui peut potentiellement edifier un membre. Le
rapprochement progressif du mesoderme et de l'epiderme auquel on assiste
chez le Pleurodele (comme chez le Crapaud et chez le Xenope), peut etre
interprets comme l'etablissement d'une disposition particuliere des deux categories cellulaires, capable de favoriser d'eventuelles interactions dont la realite
et le role morphogenetique devront etre demontres experimentalement.
Tarin & Sturdee (1974) notent que, dans les systemes etudies par un certain
nombre d'auteurs ou des interactions de nature inductrice sont demontrees,
il n'y a jamais qu'une petite quantite de collagene entre les tissus concernes par
les interactions. Chez les Amniotes, et en particulier chez le Poulet ou des interactions inductrices localisees a l'apex du membre ont ete demontrees, il n'y a pas
de couche de fibres de collagene epaisse et organisee sous l'epiderme, et des
filopodes des cellules mesodermiques sont egalement tres proches de la lamina
densa sous la crete apicale epidermique (Jurand, 1965: membre anterieur de la
Souris; Kelley, 1973: membre anterieur de l'Homme; Raynaud et al. 1974:
membre anterieur de l'Orvet et du Lezard vert et Ede etal. 1974: membre anterieur du Poulet). Deplus, Smith ef a/. (1975) suggerentune relation entre l'accumulation de fibres de collagene sous l'ectoderme du flanc du Poulet, apreslestade
20, et la perte de la faculte qu'a alors le flanc de pouvoir assurer le developpement d'un membre surnumeraire quand on y greffe du mesoderme du territoire
presomptif de membre (Kieny, 1968).
II est important de remarquer qu'un tel rapprochement du mesoderme et de
l'epiderme par l'intermediaire de filopodes des cellules mesodermiques se rencontre aussi au cours de Porganogenese de la nageoire pelvienne de la Truite
(Geraudie, 1977) et dans de nombreux autres systemes d'organogenese ou des
interactions entre l'epiderme et le mesoderme sont impliquees (pancreas:
Kallman & Grobstein, 1964; glandes salivaires: Grobstein & Cohen, 1965;
molaire: Slavkin et al. 1975; tubules renaux: Saxen, 1975; Lehtonen, 1975;
epithelium pigmentaire retinien: Newsome, 1975).
Ainsi il apparait que l'epiderme du bourgeon du membre posterieur des
Urodeles presente des caracteres originaux. L'absence de differenciation
epidermique apicale (morphologique et histoenzymologique) et le fait qu'il
n'y a pas de niveau privilegie du membre ou ont lieu la disorganisation des
couches de fibres de collagene et le rapprochement de l'epiderme et du mesoderme suggerent que, si des interactions existent entre les deux tissus, celles-ci
auraient lieu a tous les niveaux du membre et non seulement a son extremite
apicale comme chez les Amniotes ou l'epiderme apical possede des caracteres
structuraux et histoenzymologiques qui le differencient du reste de l'epiderme.
Dans l'etat actuel de nos connaissances cette hypothese peut s'etendre a l'ensemble des Urodeles puisque, chez les especes etudiees en microscopie photonique et en microscopie a balayagejamaisaucune structure epidermique apicale
particuliere n'a ete decrite, et que jamais aucune propriete histoenzymologique
propre a l'epiderme de l'apex n'a ete signalee.
2-2
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M. LAUTHIER
Enfin, on ne peut manquer de relier, d'une part, la difference constatee a
l'apex du bourgeon de membre entre les Urodeles et les autres Tetrapodes et,
d'autre part, la difference dans la sequence d'apparition des doigts qui est prepostaxiale chez le Pleurodele (Lauthier, 1971) et inverse chez les Anoures et
chez les autres Tetrapodes (Holmgren, 1949, et Milaire, 1974).
RESUME
L'etude ultrastructurale des stades precoces du developpement du bourgeon du membre
posterieur a ete effectuee chez Pleurodeles waltlii Michah. Les resultats les plus interessants
concernent la structure de l'epiderme et 1'evolution de la frontiere epiderme-mesoderme du
bourgeon de membre.
A tous les niveaux du bourgeon de membre le rapprochement progressif, au cours du
developpement, du mesoderme et de l'epiderme par l'intermediaire des filopodes qui penetrent a travers la couche fibreuse basale dont l'agencement des fibres de collagene se desorganise progressivement, peut etre interprets comme Petablissement d'interactions entre l'epiderme et le mesoderme. Des cellules a inclusions denses, subepitheliales, participent a la
desorganisation de la couche fibreuse basale.
II n'y a pas de differenciation epidermique particuliere a l'apex. Cette uniformite ultrastructurale de l'epiderme (qui est a rapprocher de son uniformite histoenzymologique) n'exclut
pas cependant que l'epiderme du bourgeon de membre du Pleurodele ait un role morphogenetique.
L'absence de differenciation epidermique apicale du bourgeon du membre posterieur du
Pleurodele et l'absence d'une zone particuliere du membre ou a lieu la desorganisation de
l'agencement desfibresde collagene et le rapprochement du mesoderme et de l'epiderme, sont
discutees. 11 est suggere que si l'epiderme du bourgeon de membre joue un role morphogenetique chez les Urodeles, tout l'epiderme est concerne et non seulement celui de l'extremite
apicale comme chez les Amniotes. Les differences observeesau niveau du bourgeon du membre
posterieur, entre les Urodeles et les autres Tetrapodes, sont reliees a la difference dans la chronologie de l'apparition des doigts dans les deux groupes.
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