/ . Embryo!, exp. Morph. Vol. 34, 3, pp. 609-632, 1975
Printed in Great Britain
609
Effets de la vinblastine sur la
morphogenese du pied de Fembryon de poulet.
Aspects histologiques
Par MADELEINE KIENY1
Laboratoire de Zoologie, Universite scientifique et medicate de
Grenoble (Directeur: Professeur P. Sengel)
SUMMARY
Vinblastine was injected into the amniotic cavity of 6-5-day-old chick embryos. Acropods
werefixed0,2, 3-5, 6,12,18, 24, 36 and 48 h after treatment and 1 /*m thick sections were prepared from the region of digit IV and interdigit III-IV. Cell counts were mainly performed
in a distal zone (see Fig. 2) comprising the ectodermal apical ridge, the distal non-ridge ectoderm and the distal underlying mesoderm.
In control non-treated embryos, the mitotic index does not vary significantly in either
of the three tissues between 6-5 and 8 days except for a temporary increase at 7 days in the
mesoderm. In treated embryos, the mitotic index increases rapidly in the non-ridge ectoderm
and in the mesoderm to a maximum of 44 and 35% respectively, 18 h after injection, after
which it decreases almost as rapidly to a level of about 15 % 36 h after injection. In the apical
ridge ectoderm, the increase of the mitotic index is much slower and reaches its maximum
value of about 30 % only 36 h after injection. This suggests that most of the cells participating
in the AER do not arise within the ridge but are generated in more proximal zones of the
ectoderm.
Due to mitotic arrest, the number of mesodermal cells is thus decreased to approximately
half the normal value within 36 h and the AER disappears earlier than normal. These alterations are the direct cause of the hypophalangy observed at the morphological level.
A particular distribution pattern of arrested mitoses is revealed: in the digital as well as
in the interdigital mesoderm, the majority of blocked metaphases is located in a dorsal and
a ventral wing-shaped subectodermal 500 /*m long area whose thickness is maximal at the
level of the marginal sinus and gradually decreases in proximal direction. In the central-part
of the mesoderm blocked mitoses are relatively rare.
The present results are discussed in view of the recent literature on the morphogenetic
processes of limb development.
INTRODUCTION
Injectee a 6,5 jours d'incubation a l'embryon de poulet, la vinblastine,
alcaloide derive de la pervenche (Vinca rosed), engendre en particulier des
malformations du pied dont les orteils, quoique generalement griffus, sont
hypodeveloppes (Kieny, Pautou & Mugnier, 1973) (Figs. 1-6). L'hypophalangie
frappe plus frequemment et plus profondement (absence d'un plus grand
nombre de phalanges) l'orteil IV que l'orteil III et plus frequemment et plus
1
Adresse de Vauteur: Laboratoire de Zoologie, Universite scientifique et medicale de
Grenoble, B.P. 53, 38041 Grenoble Cedex - France.
610
MADELEINE KIENY
Vinblastine time-effect on distal foot tissues
611
profondement ce dernier que l'orteil II. L'orteil I manifeste une frequence et
une intensite de malformations voisines de celles de l'orteil III. Ce qui montre
qu'un orteil est d'autant plus affecte par le traitement qu'il lui reste a accomplir
une part plus grande de son programme morphogenetique. Rappelons que la
composition squelettique des orteils I, II, III et IV est respectivement de 2, 3,
4 et 5 phalanges et qu'au moment de l'injection seule la phalange basale des
orteils II, III et IV est en voie de chondrification (Pautou, 1975a) (cf. Fig. 9 A).
Ce memoire a pour but de rapporter les effets immediats de la vinblastine
sur les tissus acropodiaux. Comme, outre son action toxique generate, la
vinblastine bloque temporairement toute activite mitotique, ces experiences
fournissent des donnees nouvelles sur la proliferation cellulaire dans les tissus
acropodiaux.
MATERIEL ET METHODES
Des embryons de poulet de race Leghorn blanche ou issus d'un croisement
Wyandotte x Rhode Island Red ont a recu 6,5 jours d'incubation une injection
intra-amniotique de sulfate de vinblastine (VELBE, Ets E. Lilly) (0,5 fig dissous
dans 0,05 ml de solution de NaCl a 9%0). Quarante-huit pieds droits ont ete
preleves entre 2 et 48 h apres l'injection, doublement fixes a la glutaraldehyde et
au tetroxyde d'osmium (Pautou & Kieny, 1971a) et inclus dans l'Epon. Pour
s'assurer que l'alcaloide a effectivement atteint les tissus autopodiaux et y a
cause les perturbations habituelles de la necrose morphogene, les pieds gauches
contralateraux ont ete colores supravitalement au bleu de Nil.
Vingt-neuf embryons non injectes ont servi de temoins. Les pieds droits ont
ete fixes et traites comme les pieds correspondants des embryons injectes. Apres
coloration au bleu de Nil, les pieds gauches contralateraux sont classes selon
les stades de la necrose morphogene de Pautou (1975fl) (Fig. 9).
L'examen histologique porte uniquement sur la partie laterale du pied qui
comprend l'orteil IV et l'espace interdigital III-IV. Des coupes semi-fines
(1 jiim d'epaisseur) paralleles au plan contenant a la fois l'axe dorso-ventral et
FIGURES 1-6
Morphologie externe et interne de pieds atteints d'hypomorphose a des degres
divers apres traitement a la vinblastine (0,5 /tg par embryon a 6,5 jours).
Fig. 1. Vue plantaire d'un pied droit temoin de 14 jours d'incubation. Formule
phalangique 2345.
Figs. 2 et 3. Pieds gauche et droit d'un meme embryon en vue plantaire. Tous les
orteils sont nantis d'une griffe. Celle de l'orteil IV est fortement reduite. Les deux
pieds ont la meme constitution phalangique (1233) (Fig. 3).
Figs. 4-6. Pieds gauche et droit d'un meme embryon en vue dorsale (Fig. 4) et
plantaire (Fig. 5). La griffe des orteils IV ne s'est pas developpee. Les membranes
interdigitales sont normalement regressees. Les deux pieds ont la meme constitution
phalangique 1222 (Fig. 6). Noter la forme acuminee des phalanges terminales.
(Gx5.)
39
EMB
34
612
MADELEINE KIENY
l'axe proximo-distal de l'autopode ont ete realisees dans 5-13 regions espacees
de 30-50/tm, a raison d'une vingtaine de coupes dans chacune d'elles (Fig. 7).
Les coupes sont colorees au bleu de methylene selon Richardson, Jarett & Finke
'700-1000//m
Fig. 7. Representation schematique de l'extension maximale de la region etudiee
histologiquement. Les coupes ont ete faites dans les zones hachurees a raison d'une
vingtaine de coupes dans chacune d'elles. La region etudiee a toujours approximativement la meme profondeur proximo-distale (700-1000 /tm), mais sa largeur varie selon
les cas de 400-1000 [im environ. L'autopode represents ici est au stade Fde Pautou
(1974, 1975 a).
(1960). Elles mesurent de 700 a 1000 (im de long et sont partagees, pour le
denombrement des cellules et la commodite de la description en trois zones:
distale, subterminale et proximale (Fig. 8). Les comptages sont effectues a
Vinblastine time-effect on distal foot tissues
613
Tinterieur de la zone distale, delimitee par un rectangle de 210 /*m de long et
140 /tm de large. (11 s'agit du champ photographique du photomicroscope Zeiss
au grossissement 40/1, 25/3, 2 = x 160). L'apex de la coupe est place dans ce
100
200
300
400
500
-
700
->800
Fig. 8. Schema d'une coupe semi-fine a travers l'extremite des tissus acropodiaux
sur laquelle est representee la zone distale ou ont ete effectues les denombrements
cellulaires. Dans cette zone on distingue le mesoderme distal (Md), l'ectoderme distal
banal (non apical) (Ed) et l'ectoderme apical (Ea, en pointille). d, face dorsale,
v, face ventrale; Sm, sinus marginal.
champ de fac.on qu'il soit tangent au grand cote du rectangle en un point situe
approximativement au milieu de la longueur (Fig. 8). On denombre les noyaux
des cellules ordinaires et les cellules bloquees en metaphase dans le mesoderme
39-2
614
MADELEINE KIENY
distal, l'ectoderme banal distal et dans l'ectoderme apical. Cet ectoderme apical
est delimite arbitrairement comme il est indique sur la Fig. 8 en utilisant comme
reperes les diagonales superieures du champ photographique. Les extremites
libres de ces diagonales, distantes de 40 [im, sont placees sur la membrane
basale de facon que l'apex de la crete soit localise a peu pres au milieu de la
longueur du champ. Ainsi, l'ectoderme apical comprend la majeure partie,
mais non necessairement la totalite de la crete apicale ectodermique. En regie
generate, tout noyau ou metaphase bloque(e) traverse(e) par les diagonales est
compte(e) comme faisant partie de l'ectoderme apical; de meme, tout noyau ou
metaphase bloque(e) a cheval sur les limites du champ photographique est
compte(e) comme appartenant a la zone distale. La zone subterminale, dans
laquelle quelques comptages cellulaires ont aussi ete effectues, s'etend proximalement a la zone distale jusqu'a environ 500 /tm de l'apex de l'acropode. Sa limite
distale coincide ainsi generalement avec le sinus marginal. Enfin, la zone proximale s'etend en-deca de la zone subterminale jusqu'a une distance de 800 a
1000 /im de l'apex.
Fig. 9. Representation schematique de trois stades (A, G et H) du developpement
normal de l'autopode (Pautou, 1974, 1975a) auxquels il est fait allusion dans le
texte. Le stade A, 6,5 jours d'incubation, correspond au moment de 1'injection.
La densite cellulaire a ete determinee en comptant, sur des photographies de
la zone distale de coupes histologiques au grossissement x 700, les noyaux a
l'interieur de trois carres de 35 mm de cote chacun (ce qui correspond a 50 /im
reels). Ces trois carres delimitant une superficie totale de 75.000 /*m2 sont places
de maniere a inclure la plus grande partie des cellules mesodermiques distales,
l'un immediatement sous la crete apicale ectodermique, les deux autres sous
6,5 j
+ 6h
+ 12h
+ 18h
+ 24 h
+ 36h
Age
5(46)*
3(40)
3(45)
5(99)
3(55)
5(90)
Nombre
moyen
total de
cellules
Nombre Nombre
moyen de moyen
cellules en total de
mitose
cellules
Index
mitotique
Ectoderme banal distal
0,08
0,19
0,20
0,16
0,14
0,11
effectues.
30,39
30,32
26,38
28,47
23,44
21,36
0,25 ± 0,32
0,61 ±0,58
0,74 ± 0,47
0,57 ±0,27
0,59 ± 0,34
0,53 + 0,20
Index
mitotique
Ectoderme apical
Nombre Nombre
moyen de moyen
cellules en total de
mitose
cellules
0,88
69,61
1,29 ±0,68
1,04 ±0,26
1,80 ±0,21
1,03
70,71
1,45 + 0,33
2,36 ±0,83
1,13
64,13
1,76 ±0,62
1,76 ±0,36
1,39
71,31
1,96 ±0,44
1,39 ±0,21
1,27
64,91
1,95 ±0,19
1,30 ±0,26
0,85
61,37
1,43 ±0,65
comptages ont ete
le nombre de coupes sur lesquelles les <
Index
mitotique
Mesoderme distal
162,33
1,68
2,90
161,91
3,93
171,67
3,35
190,93
2,36
169,66
2,25
173,94
* Entre parentheses,
Nombre
moyen de
cellules
Nombre
d'embryons en mitose
r
Tableau 1. Index mitotique des tissus distaux de Vacropode entre 6,5 et 8 jours d'incubation
O\
issues
616
MADELEINE KIENY
J
18
Vinblastine time-effect on distal foot tissues
617
Tectoderme dorsal et ventral de part et d'autre du sinus marginal. La densite
cellulaire est exprimee par le nombre moyen de noyaux par 1000 /tm2.
RESULTATS
Us sont presentes dans l'ordre chronologique des fixations qui ont ete
effectuees 2, 3£, 6, 12, 18, 24, 36 et 48 h apres Finjection de vinblastine. Us sont
fondes, d'une part, sur la description des tissus acropodiaux distaux sur une
longueur allant de 700 a 1000 /m\ de l'extremite distale du pied, et, d'autre part,
sur le denombrement des cellules dans une petite portion apicale, situee grosso
modo au-dela du sinus marginal comme il. est indique sur la Figure 2; ces
donnees numeriques sont consignees dans le Tableau 2 et sont a comparer a
celles qui concernent les tissus acropodiaux des embryons temoins non traites
(Tableau 1).
A. Temoins
(1) Etat des tissus au moment de Vinjection (stade depart a 6,5 jours d'incubation) (Tableau 1 et Fig. 10). Le mesoderme situe entre le niveau du sinus
marginal et la crete apicale ectodermique est constitue de cellules etoilees
mesenchymateuses; leur densite moyenne, calculee sur 14 coupes de six
embryons differents est de 15,97 ± 1,61 noyaux par 1000 jam2 dans une coupe
longitudinale semifine de 1 /im d'epaisseur. II n'y a pas de difference de densite
ni de morphologie cellulaire entre le mesoderme apical du rayon digital IV et
celui de 1'espace interdigital III-IV. L'ectoderme bistratifle est constitue d'une
assise basale aux cellules cuboides laissant entre elles de nombreuses lacunes
intercellulaires et d'un periderme aux cellules pavimenteuses aplaties. Au
niveau de la crete apicale, l'ectoderme est epaissi par l'allongement des cellules
de l'assise basale dont les noyaux s'etagent sur trois ou quatre couches. Le
periderme, quant a lui, est constitue a 1'apex de la crete par des cellules plus
hautes et plus serrees qu'ailleurs. L'activite mitotique de l'ectoderme distal banal
est legerement superieure a celle du mesoderme, mais est beaucoup plus elevee
que celle de l'ectoderme apical ou les cellules en mitose sont exceptionnelles
(Fig. 19 b).
(2) Evolution histologique des temoins au cours des 48 h suivantes (entre 6,5 et
8,5 jours). L'histologie des temoins ne subit aucune modification notable
jusqu'a 8 jours d'incubation, c'est-a-dire jusqu'au stade G de Pautou (Pautou,
1974, 1915a) (Fig. 9G et 18) inclus. Jusqu'a 8 jours, c'est-a-dire avant que la
FIGURES
10-18
Effet de la vinblastine sur les tissus de la zone distale (voir Fig. 8) de 1'acropode en
fonction du temps ecoule apres Pinjection. Les coupes sont representatives
d'echantillons fixes 2 h (Fig. 11), 6 h (Fig. 12), 12 h (Fig. 13), 18 h (Fig. 14), 24 h
(Fig. 15) et 36 h (Figs. 16 et 17) apres l'injection. La figure 10 represente le stade de
depart a 6,5 jours et la figure 18 un temoin non injecte a 8 jours d'incubation. Sm,
sinus marginal.
618
MADELEINE KIENY
(a)
40
§ 30
8.
20
Ectoderme distal banal
10
Ectoderme apical
*•
I
0
(6,5 j)
* Mesoderme distal
I
2 3,5 6
12
18
24
36
heures
(7,5 j)
Fig. 19. Variation du pourcentage de cellules en mitose (metaphase) en fonction de
la duree d'incubation, apres l'injection de vinblastine (a) et chez les temoins non
traites (b). La duree totale d'incubation est indiquee entre parentheses. Les barres
verticales represented la deviation standard de la moyenne.
Vinblastine time-effect on distal foot tissues
619
necrose morphogene ne s'installe dans le mesoderme distal, la densite cellulaire
de ce dernier ne varie pas, mis a part une augmentation passagere significative
a 7,25 jours (17,58 ±0,90 noyaux/1000 /mi2 denombres sur 19 coupes de trois
embryons). L'ectoderme banal conserve sensiblement le merae aspect. La crete
apicale ectodermique digitale ou interdigitale garde a peu pres la meme epaisseur, mais le nombre des cellules apicales diminue en fonction du temps, diminution qui atteint 30% a 8 jours (Tableau 1).
C'est a 48 h (8,5 jours - stades H (Fig. 9H) et I de Pautou) apres le stade de
depart, qu'apparaissent des modifications importantes. Dans le mesoderme
de l'espace interdigital, de nombreuses cellules sont pycnotiques, en voie de
necrose ou deja necrosees (Pautou & Kieny, 1971 b; Kieny & Sengel, 1974)
(Fig. 27). II s'agit de la necrose dite ponctuelle qui atteint au stade H la portion
apicale du mesoderme interdigital. Dans l'ectoderme apical, affaisse, on trouve
egalement des cellules necrotiques, d'abord dans le periderme, ensuite dans
1'assise basale, ou la disposition caracteristique en eventail s'estompe, puis
disparait. Cette necrose apicale affecte simultanement plusieurs cellules ectodermiques et se distingue ainsi nettement de la necrose sporadique qu'on observe
toujours dans la crete apicale ectodermique a tout stade de son existence
(Jurand, 1965). Dans l'ectoderme banal dorsal et ventral de la membrane
interdigitale, les signes de degenerescence cellulaire sont egalement abondants.
De nombreuses cellules peridermiques presentent des noyaux pycnotiques et un
cytoplasme en voie de vacuolisation; ces cellules superficielles boursouflees
seront rejetees par desquamation. 11 n'est pas rare de rencontrer des cellules
superficielles spheroides d'une section 3-4 fois superieure a celle d'une cellule
normale, contenant sur une meme coupe jusqu'a six vacuoles necrotiques, dont
le contenu diflfere generalement de l'une a l'autre. II va d'une cellule en degenerescence peu etrecie, dans laquelle on reconnait le noyau pycnotique caracterise par ses calottes ou flaques osmiophiles, jusqu'a des residus qui n'emplissent
plus la vacuole (Fig. 29). Ces cellules douees d'heterophagie seront vraisemblablement, a leur tour, eliminees par exfoliation. Cette activite heterophagique a ete verifiee a l'echelle ultrastructurale (Kieny & Pautou, resultats
inedits).
Dans l'axe digital, les cellules mesodermiques situees immediatement sous la
crete apicale ectodermique, affaissee aussi a cet endroit, s'accolent etroitement
les unes aux autres formant ainsi les conglomerats annonciateurs d'une prochaine activite phagocytaire (Fig. 26) (Pautou & Kieny, 1971a). Dans certains
cas d'ailleurs et selon l'endroit ou passe la coupe, des phagocytes en activite se
trouvent immediatement sous la crete apicale. Dans celle-ci l'arrangement
pseudostratifie disparait et on observe aussi un debut de degenerescence
cellulaire.
2
3,5
6
12
18
24
36
4(50)*
3(40)
6(78)
8(122)
7(96)
8(109)
8(131)
Temps
apres
l'injection
Nombre
(en heures) d'embryons
147,95
151,14
162,68
154,64
148,33
139,82
92,92
Nombre
moyen
total de
cellules
4,58 ±1,59
9,79 ±1,85
13,40 ±1,47
20,92 ±7,14
35,28 ± 6,92
20,90 ±16,19
13,40 ±9,94
Index
mitotique
2,39
3,69
4,98
11,26
17,25
12,31
4,98
35,41
35,89
39,63
37,86
38,54
34,07
32,86
Nombre Nombre
moyen de moyen
cellules
total de
en mitose cellules
6,89 ±2,94
10,22 ±3,66
12,64 ±2,94
28,96 ±6,50
44,64 ±11,01
38,31 ±25,70
15,74 ±9,41
Index
mitotique
Ectoderme banal distal
0,70
1,37
1,59
3,15
3,90
3,50
5,83
26,03
25,30
24,12
21,87
22,54
16,70
19,48
a
f1
ffl
O
2,60 ±1,40
5,03 ±4,78
6,73 ± 3,00
14,38 ±3,53 w
17,46 ±7,95
21,84 ±12,38
29,93 ± 20,03
Index
mitotique
Ectoderme apical
Nombre Nombre
moyen de moyen
cellules en total de
cellules
mitose
Entre parentheses, lc nombre de coupes sur lesquelles les comptages ont ete effectues.
6,85
14,81
21,74
32,53
51,90
29,97
10,86
Nombre
moyen de
cellules
en mitose
Mesoderme distal
Tableau 2. Index mitotique (metaphases) dans les tissus distaux de Vacropode (Fig. 8) apres injection de
vinblastine a 6,5 jours d'incubation
O
to
ON
Vinblastine time-effect on distal foot tissues
621
B. Embryons traites
Les premiers effets histologiques du traitement sont decelables deux heures
apres l'injection sous la forme des premieres mitoses bloquees en metaphase.
Dix-huit heures apres l'injection, le nombre des metaphases bloquees atteint
un maximum dans le mesoderme et dans l'ectoderme banal. Dans l'ectoderme
apical le nombre des metaphases bloquees augmente moins vite en fonction du
temps mais continue a croitre jusqu'a 36 h apres l'injection (Tableau 2; Fig. 19).
(1) 2 et 3,5 h apres Vinjection (Figs. 9 et 11). Dans le mesoderme distal, comme
dans le mesoderme subterminal en-deca du sinus marginal, la proportion des
cellules bloquees en metaphase augmente jusqu'a environ 10% sans que la
structure histologique n'en soit perturbee. Dans l'ectoderme banal, on note une
augmentation parallele de la proportion des mitoses bloquees. La crete apicale
ectodermique conserve sa structure pseudostratifiee. On note la presence de
quelques cellules peridermiques en degenerescence comme chez les temoins
normaux. La proportion de metaphases y reste tres faible, de l'ordre de 5 %.
(2) 6 h apres Vinjection. Dans le mesoderme s'annonce une repartition des
metaphases bloquees qui deviendra plus nette encore 6 h plus tard. Cette
repartition est caracterisee, sur une coupe longitudinale, par une accumulation
maximale dans une zone sous-ectodermique dorsale et ventrale dont l'epaisseur
augmente dans le sens proximo-distal jusqu'au niveau du sinus marginal ou les
deux zones se rejoignent dans le plan frontal. Une petite portion du mesoderme
apical situee entre le sinus marginal et la crete apicale ectodermique se distingue
par la relative rarete des mitoses bloquees. Dans l'ectoderme on ne note aucune
alteration par rapport au stade precedent si ce n'est l'accumulation d'une grande
quantite de metaphases bloquees dans l'ectoderme banal dorsal et ventral dans
une zone subterminale distante de 300 a 500 jam de Pextremite distale de l'acropode. Dans cette zone, qui surmonte dorsalement et ventralement la moitie
proximale de la region mesodermique a forte proliferation, le pourcentage de
mitoses bloquees atteint 33 %.
(3) 12 h apres Vinjection. La proportion de mitoses bloquees depasse 20 %
dans le mesoderme distal, atteint presque 30% dans l'ectoderme distal banal et
15% dans l'ectoderme apical (Tableau 2).
La repartition des metaphases bloquees dans le mesoderme est conforme a
celle qui s'annoncait des 6 h apres l'injection. En effet, dans une coupe longitudinale passant dans l'axe digital (Figs. 20 et 22) ou dans la membrane interdigitale (Figs. 20 et 23), la majorite des metaphases est localisee du cote dorsal
et du cote ventral en deux zones allant en s'epaississant dans le sens proximodistal et delimitant entre elles une region triangulaire large du cote proximal et
devenant etroite en direction distale, ou les metaphases sont rares. Si Ton
examine des coupes longitudinales proches du bord lateral du doigt IV, on
s'apercoit que les metaphases bloquees occupent ici la totalite de l'epaisseur
dorso-ventrale du mesoderme, ce qui montre que dans cette zone bordante, dans
622
MADELEINE K1ENY
laquelle court le sinus marginal, les zones dorsale et ventrale a forte activite
mitotique se rejoignent (Fig. 21). Ainsi, le mesoderme de la palette acropodiale
comporte essentiellement deux parties emboitees l'une dans l'autre: l'une,
peripherique, sous-ectodermique, longue de 400 a 500 fim, a forte activite
mitotique, occupant une proportion d'autant plus grande de l'epaisseur du
Orteil IV
Fig. 20. Repartition des cellules bloquees en metaphase dans une coupe de la zone
digitale {orteil IV) et de la zone interdigitale (espace IH-IV) 12 h apres Pinjection
de vinblastine. Dessin realise d'apres photographies au grossissement x 700. Remarquer la concentration des metaphases dans deux zones sous-ectodermiques,
dorsales et ventrales, en forme d'aileron. La Fig. 13 represente photographiquement
la zone distale d'une coupe voisine de celle du schema de gauche, dont par ailleurs,
la zone subterminale est illustree par la Fig. 22. La zone subterminale du schema
de droite se retrouve sur la photographie de la Fig. 23. d, face dorsale; v, face
ventrale.
tissu qu'elle est plus proche du sinus marginal; l'autre, centrale, a faible activite
mitotique et plus etroite a son apex qu'a sa base. II convient de preciser qu'audela du sinus marginal on trouve d'abord une zone a forte densite de cellules
bloquees, puis en position apicale, immediatement sous la crete apicale ectodermique une zone ou, au contraire, les mitoses sont relativement rares (Fig. 13).
Vinblastine time-effect on distal foot tissues
623
Si Ton partage geometriquement les coupes d'environ 1000 fim de long en deux
moities dorsale et ventrale, on constate que le nombre de mitoses bloquees est
plus eleve du cote ventral que du cote dorsal d'environ 25% (un denombrement
effectue sur 8 coupes prises au hasard chez trois embryons differents a fourni
les moyennes suivantes: 107,5 mitoses du cote dorsal et 132,0 du cote ventral;
cette difference est statistiquement tres significative: t = 8,84; P = 4,79 x 10~5).
Dans l'ectoderme banal, la majorite des metaphases bloquees est situee
au-dessus des zones mesodermiques a forte activite mitotique. En-deca et audela de ces regions dorsales et ventrales la proportion en est plus faible; les
mitoses restent relativement rares, en particulier, dans l'ectoderme banal distal
(29%) ainsi que dans l'ectoderme apical proprement dit (14%) (Fig. \9a).
Celui-ci comporte un nombre de cellules inferieur a celui du stade precedent.
La crete apicale ectodermique montre encore une structure pseudostratifiee,
mais son epaisseur est moindre en raison de la diminution de la hauteur et du
nombre de ses cellules.
Outre l'accumulation des mitoses bloquees que la vinblastine commence a
produire dans l'assise basale de l'ectoderme et surtout dans le periderme, on
observe des alterations morphologiques dues vraisemblablement, en partie, a son
action modificatrice (par destruction du cytosquelette) de la motilite des cellules
(Bhisey & Freed, 1971), et, en partie, au fait que les cellules en metaphase par
manque d'activite pseudopodiale sont incapables de se deplacer le long de la
membrane basale. On constate, en effet, que dans les zones a forte activite
proliferatrice, les cellules basales ectodermiques s'entassent les unes sur les
autres, ce qui conduit a des decollements et occasionnellement des dechirures
du periderme. Ce phenomene est perceptible plus precocement du cote ventral
que du cote dorsal. Dans les zones a moindre activite proliferatrice, qu'elles
soient distales (au-dela du niveau du sinus marginal) ou proximales, l'ectoderme
conserve un aspect bistratifie.
A partir de ce stade, des cellules necrosees et une activite phagocytaire
deviennent decelables dans le mesoderme interdigital. Des cellules en voie de
degenerescence, sans phagocytes, s'observent dans le mesoderme digital paraaxial (non en voie de chondrification) et dans l'ectoderme surtout au niveau du
periderme.
(4) 18 h apres I'injection. La proportion des mitoses bloquees atteint un
maximum dans le mesoderme et dans l'ectoderme distal banal (Tableau 2 et
Fig. 19a); elle a augmente respectivement de 69 et de 54% en 6 h. Dans l'ectoderme apical, elle a augmente moins vite (21 %) par rapport au stade precedent;
de plus, la proportion atteinte a 18 h ne constitue pas un maximum dans cette
zone apicale ectodermique.
La repartition des metaphases bloquees est sensiblement la meme qu'au
stade precedent; cependant la zone mesodermique sous-apicale, oil les metaphases bloquees etaient relativement rares aux stades precedents, est maintenant
occupee, elle aussi, par un grand nombre de noyaux metaphasiques. Dans I'ecto-
624
MADELEINE KIENY
derme banal, les boursouflures et les entassements de cellules en mitose se sont
accentues et se localisent maintenant, de preference, plus pres de l'apex de
l'acropode qu'au stade precedent. Ces alterations ectodermiques sont toujours
plus etendues du cote ventral; elles sont frequemment marquees par raccumulation de grains pycnotiques. Dans le mesoderme distal egalement, une certaine
proportion des metaphases bloquees entre en degenerescence, ce qui est atteste
par l'aspect pycnotique des chromosomes qui finissent par se condenser en une
seule masse osmiophile. De telles masses osmiophiles peuvent aussi se trouver
a Pinterieur de vacuoles lytiques de cellules saines de nature phagocytaire. Par
ailleurs, il n'est pas exclu que certains des granules necrotiques que Ton observe
proviennent aussi de la mort de cellules non bloquees en metaphase; bien qu'a
ce stade, chez les temoins, la necrose morphogene interdigitale n'ait pas encore
atteint cette portion apicale du mesoderme.
La crete apicale ectodermique est desorganisee, aplatie; la disposition des
cellules basales en eventail est souvent perturbee par la presence de noyaux
metaphasiques (Fig. 14). La aussi, certaines cellules peridermiques et basales
sont en degenerescence.
De toute maniere, le nombre de cellules en degenerescence a considerablement
augmente par rapport au stade precedent, d'une part, dans les zones mesodermiques digitale et interdigitale a forte activite mitotique (il s'agit la principalement de raccumulation de granules pycnotiques et de cellules metaphasiques
a cytoplasme vacuolaire), d'autre part, dans les regions mesodermiques interdigitales plus proximales ou la necrose morphogene normale fait son apparition
sous la forme de phagocytes et de granules necrotiques typiques. De sorte que,
dans la membrane interdigitale III-IV, la necrose distale due au traitement
s'ajoutant a la necrose proximale normale, la totalite du mesoderme sousectodermique (a Pexclusion du mesoderme central) est le siege d'une intense
degenerescence cellulaire qui emplit ainsi avant l'heure tout l'espace interdigital. Au niveau de l'orteil IV, seules les zones a forte activite mitotique
FIGURES
21-25
Aspect histologique de la zone subterminale 12 h (Figs. 21—23) et 24 h (Figs. 24 et 25)
apres Finjection de vinblastine. La Figure 21 passe a travers la zone marginale,
lateralement par rapport a 1'axe digital de l'orteil IV; dans cette zone des cellules
mesodermiques sont bloquees en metaphase, dans toute l'epaisseur du tissu. La
Fig. 22, qui est une partie du schema de gauche de la Fig. 20, passe a travers 1'axe
precartilagineux de l'orteil IV. La Fig. 23, qui est une partie du schema de droite
de la Fig. 20, passe a travers la membrane interdigitale de l'espace III-IV. Dans ces
deux dernieres regions les mitoses bloquees sont concentrees essentiellement dans
deux zones sous-ectodermiques dorsale et ventrale plus epaisses du cote apical que
du cote basal de l'acropode.
Les Figs. 24 et 25 illustrent les empilements chaotiques des cellules ectodermiques
dans la zone subterminale.
Sm, sinus marginal.
Vinblastine time-effect on distal foot tissues
625
626
MADELEINE KIENY
presentent une forte proportion de cellules en degenerescence. L'axe cartilagineux quant a lui en est toujours depourvu.
(5) 24 h apres Vinjection. Dans le mesoderme et dans l'ectoderme distal banal,
la proportion de figures metaphasiqu.es bloquees a subi une diminution de
l'ordre de 41 et de 14% respectivement par rapport a celle du stade precedent.
Au contraire, dans l'ectoderme apical, la proportion des mitoses bloquees
continue de croitre et depasse le niveau du stade precedent de 25%. En fait,
si Ton classe les cas individuels fixes 24 h apres l'injection dans l'ordre croissant
de la proportion de mitoses bloquees dans le mesoderme, on s'apercoit qu'ils
se partagent en deux groupes distincts; le premier, comportant trois embryons,
est caracterise par un pourcentage de mitoses bloquees tres faible, particulierement dans le mesoderme, mais aussi dans 1'ectoderme; dans le second, qui
compte cinq embryons, le pourcentage de mitoses est encore tres eleve,
semblable sinon superieur a celui du stade precedent. Comme cette heterogeneite ne fait son apparition que 24 h apres l'injection, elle doit etre interpretee
comme refletant le fait que certains embryons eliminent plus rapidement que
d'autres les cellules bloquees en metaphase et se trouvent ainsi des ce moment-la
en voie de guerison. Comme Faction de la vinblastine est relativement homogene
dans la totalite de la population des embryons traites jusqu'a 18 h apres le
traitement, Pheterogeneite qui apparait a 24 h n'est done pas due au fait que
certains embryons sont insensibles au traitement.
Dans l'ectoderme banal subterminal de ces derniers cas, l'entassement sur
place de mitoses bloquees, de cellules moribondes et de granules necrotiques
aboutit a une configuration extremement chaotique de 1'epithelium (Figs. 24
et 25). Par endroit, il est reduit a une finepelliculecytoplasmique peridermique
(?); ailleurs, jusqu'a cinq ou six couches de cellules ectodermiques se sont
empilees les unes sur les autres. On n'observe pas de phagocytes dans l'ectoderme. L'elimination des cellules mortes et des debris cellulaires s'efTectue
par desquamation. L'ectoderme apical a perdu son organisation caracteristique;
il comprend, d'une part, des petites cellules serrees les unes contre les autres,
d'autre part, de grosses cellules bloquees en metaphase et, enfin, d'autres en
voie de necrose (Fig. 15).
(6) 36 h apres Vinjection. La proportion des mitoses bloquees dans le mesoderme et l'ectoderme distal banal continue a diminuer, mais augmente considerablement (de 37%) dans l'ectoderme apical. Comme dans le cas precedent,
la population des cas examines est heterogene: certains acropodes (trois cas)
(Fig. 17) presentent des tissus ou la proportion des metaphases bloquees est
tombee tres bas, meme dans l'ectoderme apical. Le tissu mesodermique a
alors une apparence tres clairsemee. D'autres acropodes (cinq cas) (Fig. 16)
presentent encore une forte proportion de cellules mesodermiques bloquees en
metaphase. Ce sont ces cas qui possedent un ectoderme apical artificiellement
epaissi par 1'accumulation des mitoses bloquees. Ce gonflement deborde souvent
les limites arbitrages fixees pour la zone ectodermique apicale.
Vinblastine time-effect on distal foot tissues
627
29
Figs. 26-29. Aspect histologique de la zone distale (Figs. 26-28) et de la membrane
interdigitale (Fig. 29), a 8,5 jours, chez les temoins non traites (Figs. 26, 27 et 29)
et 48 h apres l'injection de vinblastine (Fig. 28).
La Fig. 26 passe par l'axe digital II.I-IV; noter la conglomeration sous-ectodermique apicale des cellules mesodermiques, annonciatrice d'une prochaine
activite phagocytaire. Les Fig 27 et 29 passent par l'espace interdigital; noter,
Fig 27, la destruction normale de la crete apicale ectodermique par necrose et vacuolisation des cellules, ainsi que la necrose ponctuelle mesodermique distale; et,
Fig. 29, les figures d'heterophagie dans l'ectoderme.
La Fig. 28 montre l'eclaircissement du mesoderme apical et la disparition de la
crete apicale ectodermique. Noter qu'il subsiste encore, outre desfiguresde phagocytose et de necrose ponctuelle, un certain nombre de noyaux bloques en metaphase.
Dans 1'ectoderme banal distal et subterminal, les alterations morphologiques
(boursouflures, decollement, empilement) s'attenuent et disparaissent avec
l'elimination des cellules bloquees en mitose.
La necrose et l'activite phagocytaire sont done moins denses qu'au stade
precedent. D'une facon generate, les debris cellulaires ont en grande partie
40
EM B 34
628
MADELEINE KIENY
disparu, ce qui confere au tissu son aspect aere. Le denombrement montre que
le mesoderme apical compte environ moitie moins (53 %) de cellules que le
mesoderme normal de meme stade (Tableau 2 et Figs. 17, 18 et 19).
(7) 48 h apres Vinjection. Ce stade est caracterise par Pattenuation progressive
des effets de Palcaloide et par la guerison des tissus. Dans le mesoderme et dans
l'ectoderme banal les figures de mitoses bloquees sont devenues tres rares (les
comptages n'ont pas ete effectues a ce stade). Au niveau de l'ectoderme apical,
on recontre tantot une accumulation de mitoses bloqaees debordant la zone
apicale proprement dite comme au stade precedent, tantot un ectoderme aplati
de type banal a deux assises entierement gueries mais ne presentant aucune
trace de crete apicale ectodermique (Fig. 28).
DISCUSSION
L'administration de vinblastine a Pembryon de poulet de 6,5 jours d'incubation conduit a des malformations de Pacropode qui ont ete decrites precedemment (Kieny et ah 1973; Kieny, Pautou & Sengel, 1975) et qui sont caracterisees
par une hypophalangie des orteils II, III et IV, plus frequente et plus profonde
dans les orteils lateraux que dans les orteils medians. L'orteil I est egalement
affecte, mais a un degre qui est semblable a celui de l'orteil III. On avait conclu
de cette sensibilite differentielle latero-mediane que les ebauches digitales etaient
d'autant plus affectees par l'alcaloide que la part de leur programme morphogenetique restant a accomplir etait plus grande au moment de Pinjection.
L'analyse histologique des effets de la vinblastine montre que Parret de
developpement distal des orteils est du a deux causes principales. La premiere
est l'inhibition mitotique qui atteint dans le mesoderme distal et dans l'ectoderme distal banal une valeur maximale 18 h apres Pinjection et dans l'ectoderme apical 36 h apres Pinjection. Ce blocage mitotique aboutit a une deficience cellulaire grave, de Pordre de 50%. L'autre cause est la destruction
precoce de la crete apicale ectodermique: en effet, sous l'effet de la vinblastine
celle-ci s'involue environ 24 h avant le delai normal. Cette involution est vraisemblablement elle-meme provoquee, d'une part, par le fait que le mesoderme
apical sous-jacent est devenu deficient au point de vue du nombre de cellules
qui le constituent et, d'autre part, par Parret de la migration proximo-distale des
cellules ectodermiques dorsales et ventrales qui alimentent normalement la
crete apicale ectodermique. En effet, les images d'accumulation de cellules
ectodermiques a un niveau subterminal attestent que la vinblastine, outre
qu'elle bloque la proliferation de l'ectoderme, inhibe aussi la motilite des
cellules ectodermiques et arrete ainsi leur deplacement distal.
La vinblastine n'a guere d'effet sur la necrose morphogene interdigitale si ce
n'est qu'elle Paccelere quelque peu, vraisemblablement par son effet toxique
generalise. De ce fait, elle n'a pas d'influence sur la regression normale des
membranes interdigitales si ce n'est, dans certains cas, une legere accentuation
Vinblastine time-effect on distal foot tissues
629
du phenomene (Kieny et al., 1975). II en resulte des orteils hypophalangiques
mais normalement ou quelquefois exagerement liberes.
Si Ton compare la courbe devolution du pourcentage de cellules en mitose
dans les trois tissus considered (ectoderme distal banal, ectoderme apical et
mesoderme distal (Fig. 19a)), on ne peut manquer d'etre frappe par le fait que
seules celles se rapportant a l'ectoderme distal banal et au mesoderme distal
presentent un maximum 18 h apres l'injection de vinblastine. Ce fait signifle
probablement que le cycle cellulaire est plus court dans l'ectoderme distal banal
et dans le mesoderme distal qu'il ne Test dans la crete apicale ectodermique.
La repartition des cellules bloquees en metaphase dans l'ectoderme merite
une mention particuliere, bien qu'un denombrement localise systematique n'ait
pas ete effectue. En effet, les metaphases bloquees ne sont pas reparties uniformement le long de I'axe proximo-distal de l'ectoderme dorsal et ventral: au
contraire, on peut generalement reconnaitre une petite portion ectodermique
ou elles sont plus nombreuses et plus denses qu'ailleurs. Cette portion se deplace
dans le sens proximo-distal en proportion du temps ecoule apres l'injection,
a partir d'une distance d'environ 500 jam de l'extremite apicale. Cette repartition
suggere que la duree du cycle cellulaire est minimale dorsalement et ventralement a la base de la zone subterminale et est d'autant plus longue que Ton se
rapproche de la crete apicale ectodermique, ou elle atteint un maximum. Ce
qui revient a dire que la majorite des cellules qui participeront au revetement
apical ectodermique de l'acropode est engendree dans l'ectoderme subterminal
a environ 500 jum de l'apex de l'acropode. De nombreuses observations suggerent que l'ectoderme dorsal et l'ectoderme ventral du bourgeon de membre
glissent en direction proximodistale, leur convergence contribuant a la formation
et au maintien de l'epaississement ectodermique apical (Amprino & Camosso,
1958; Milaire, 1973). Le blocage experimental de ce glissement provoque,
d'une part un empilement anormal des cellules ectodermiques proximalement
a l'obstacle (Roncali, 1973), d'autre part, un affaissement, voire la disparition
de la crete apicale ectodermique, ce qui engendre des deficiences distales
(Amprino & Ambrosi, 1973). Mais ce glissement proximo-distal de l'ectoderme
est conditionne par la presence sous-jacente de mesoderme de bourgeon de
membre (Searls & Zwilling, 1964). Apres ablation microchirurgicale de l'ectoderme apical sur une largeur de 50 a 100 jitm, une nouvelle crete apicale est
'regeneree', a condition que (1) les bords de l'ectoderme sectionne soient
maintenus reunis; (2) que l'ectoderme soit mis en contact avec du mesoderme
de bourgeon de membre. Le mesoderme somitique est incapable d'assurer la
reconstruction d'une nouvelle crete apicale, comme il est incapable de maintenir
une crete apicale deja formee.
Les changements de la morphologie de la crete apicale dependent plutot de
modifications du rythme du glissement ectodermique que de variations de
1'activite mitotique des cellules de la crete apicale elle-meme. De nombreux
auteurs s'accordent pour attester la rarete des figures mitotiques (poulet,
40-2
630
MADELEINE KIENY
Camosso, Jacobelli & Pappalettera, 1960) ou le faible taux d'incorporation de
thymidine tritiee (canard, Kieny & Sengel (resultats inedits); tortue, Vasse,
1973; lezard, Vasse & Raynaud, 1971; truite, Bouvet (resultats inedits)) dans
la crete apicale ectodermique. Cependant, chez le rat, malgre la migration
massive des cellules peridermiques vers la crete apicale, les figures mitotiques
sont abondantes dans les cellules basales de celle-ci (Milaire, 1973).
D'innombrables donnees experimentales assignent a la crete apicale ectodermique un role stimulant de la croissance du mesoderme et par la de la
poursuite de la progression proximo-distale des differenciations mesodermiques,
en particulier des differenciations squelettiques et tegumentaires. (Les differenciations musculaires ont ete passees sous silence par tous les auteurs) (cf. Zwilling,
1961). Tout au long de son existence l'ectoderme apical conserve qualitativement
le meme pouvoir inducteur (Pautou, 1972; Rubin & Saunders, 1972), n'intervient pas dans la determination specifique de l'acropode (Pautou, 1968, 1972) et
arrete son activite morphogene selon un programme qui lui est inherent
(Pautou, 1972; Rubin & Saunders, 1972). Mais dans le developpement normal,
l'aspect pseudostratifie de la crete apicale est conserve jusqu'a ce que la morphogenese du pied soit achevee. La vinblastine modifie les conditions de la
structuration de la crete comme le fait le vert Janus (Pautou & Kieny, 19716;
Pautou, 1975 b, c). L'une et l'autre substance, certes selon des modalites
differentes, aboutissent, environ 24 h avant le temps normal, a un affaissement
de l'ectoderme de la crete apicale et a sa transformation en un ectoderme banal
bistratifie. La perte de la configuration pseudostratifi.ee de la crete apicale
semble definitive.
Si la configuration pseudostratifiee de la crete apicale a ete jusqu'ici, assez
strictement associee a l'exercice de son activite, il semble que cette structure
physique ne soit plus une condition aussi imperative. Chez Xenopus laevis,
(Tschumi, 1957) l'ectoderme apical exerce une fonction morphogene semblable
a celle generalement admise chez le poulet (voir Zwilling, 1961 pour revue),
bien qu'il ne soit pas differencie en 'crete' typique (Dober & Tschumi, 1969)
mais que son epaississement discret implique uniquement trois couches cellulaires (Tarin & Sturdee, 1971). Apres retournement en doigt de gant du revetement ectodermique, l'ectoderme apical passe transitoirement par une forme
chaotique confuse avant de se reorganiser morphologiquement en crete, sans
que la differenciation proximo-distale ulterieure du membre n'en soit affectee
(Errick & Saunders, 1974).
Les auteurs qui ont etudie la croissance du bourgeon de membre de poulet en
comptant les mitoses (Camosso et al. 1960; Hornbruch & Wolpert, 1970; Kelley
1970) sont d'accord pour dire qu'il existe des differences de taux de proliferation
entre region distale et region proximale du mesoderme du bourgeon de membre.
El les sont faibles et, en tout cas, insufiisantes pour expliquer la croissance
distale rapide, demontree a l'aide des experiences de marquage (Amprino &
Camosso, 1958; Hampe, 1959). De plus, la presence d'une region a activite
Vinblastine time-effect on distal foot tissues
631
mitotique elevee sous la crete apicale a ete supputee (Saunders, 1948; Camosso
et al. 1960; Cairns, 1966; Janners & Searls, 1970) mais non prouvee.
Grace a Pemploi de la vinblastine, la presence d'une telle zone a activite
proliferatrice elevee a pu etre mise en evidence. Sur les coupes, elle se presente
sous la forme de deux ailerons l'un dorsal, l'autre ventral, relies Fun a l'autre de
part et d'autre du sinus marginal, ou elle atteint son epaisseur maximale. En
direction proximale, son epaisseur diminue jusqu'a s'annuler presque completement a environ 400~500 /*m de l'apex de l'acropode. En fait, la reconstitution
tridimensionnelle d'apres les coupes seriees montre qu'il s'agit d'une couche
peripherique sous-ectodermique d'autant plus epaisse qu'on s'approche du
sinus marginal a partir d'un niveau situe a environ 400-500 /*m de l'extremite
distale du pied. II est important de preciser que cette repartition particuliere des
mitoses n'est pas propre a l'axe digital dont les cellules centrales sont de toute
facon en voie de chondrogenese (Fig. 22), mais se retrouve egalement dans la
membrane interdigitale (Fig. 23).
11 reste a montrer que les mecanismes morphogenetiques de proliferation
cellulaire localisee que Femploi de la vinblastine a reveles dans Febauche du
pied a un stade relativement avance de son developpement (7-8 jours d'incubation) interviennent egalement dans le bourgeon de membre aux stades precoces
de sa formation et de sa croissance (3-5 jours d'incubation).
Ce travail a ete effectue avec l'aide de la DGRST (Action complementaire coordonnee:
Biologie de la reproduction et du developpement, conventions n° 71-7-3024 et 73-7-1661).
TRAVAUX CITES
AMPRINO, R. & AMBROSI, G. (1973). Experimental analysis of the chick embryo limb bud
growth. Archs BioL, Paris 84, 35-86.
AMPRINO, R. & CAMOSSO, M. (1958). Analisi sperimentale dello sviluppo dell'ala nel1'embrione di polio. Wilhelm Roux Arch. EntwMech. Org. 150, 509-541.
BHISEY, A. N. & FREED, J. J. (1971). Ameboid movement induced in cultured macrophages
by colchicine or vinblastine. Expl Cell Res. 64, 419-429.
CAIRNS, J. M. (1966). Cell generation times and growth of the chick wing bud. Am. Zool. 6, 328.
CAMOSSO, M., JACOBELLI, V. & PAPPALETTERA, N. (1960). Ricerche descrittive e sperimentali
sull'organogenesi dell'abbozzo dell'ala delPembrione di polio. Riv. BioL 52, 323-357.
DOBER, E. & TSCHUMF, P. A. (1969). Entwickeln sich die Extremitaten von Xenopus laevis
Daud. ohne Epidermisleiste? Revue suisse Zool. 76, 1046-1055.
ERRICK, J. E. & SAUNDERS, J. W. Jr. (1974). Effects of an 'inside-out' limb-bud ectoderm on
development of the avian limb. Devi BioL 41, 338-351.
HAMPE, A. (1959). Contribution a l'etude du developpement et de la regulation des deficiences
et des excedents dans la patte de l'embryon de Poulet. Archs Anat. microsc. Morph. exp. 48,
345-478.
HoRNBRUCH, A. & WOLPERT, L. (1970). Cell division in the early growth and morphogenesis
of the chick limb. Nature, Lond. 226, 764-766.
JANNERS, M. Y. & SEARLS, R. L. (1970). Changes in rate of cellular proliferation during differentiation of cartilage and muscle in the mesenchyme of the embryonic chick wing. Devi
BioL 23, 136-165.
JURAND, A. (1965). Ultrastructural aspects of early development of the forelimb buds in the
chick and the mouse. Proc. R. Soc. B 162, 387-405.
632
MADELEINE KIENY
R. O. (1970). An electron microscopic study of mesenchyme during development of
interdigital spaces in man. Anat. Rec. 168, 43-54.
KIENY, M., PAUTOU, M. P. & MUGNIER, J. (1973) Effets de la vinblastine sur la morphogenese
du pied de Pembryon de poulet. C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci., Paris D277, 1373-1376.
KIENY, M., PAUTOU, M. P. & SENGEL, P. (1975). Limb morphogenesis as studied by Janus
green B- and vinblastine-induced malformations. International Conference 'Test of
teratogenicity in vitro'. Woods Hole (in the Press).
KIENY, M. & SENGEL, P. (1974). La necrose morphogene interdigitale chez l'embryon de
poulet: effet de la cytochalasine B. Annee biol. 13, 57-68.
MILAIRE, J. (1973). Indices d'une participation morphogene de 1'epiblaste au cours du developpement des membres chez les Mammiferes. Archs Biol., Paris 84, 87-114.
PAUTOU, M. P. (1968). Role determinant du mesoderme dans la differentiation specifique de
la patte de l'Oiseau. Archs Anat. microsc. Morph. exp. 57, 311-328.
PAUTOU, M. P. (1972). L'activite inductrice morphogene emanant de l'ectoderme apical du
bourgeon de patte chez les Oiseaux n'a pas de qualification specifique. C. r. hebd. Seanc.
Acad. Sci., Paris D 275, 1071-1074.
PAUTOU, M. P. (1974). Evolution comparee de la necrose morphogene interdigitale dans le
pied de l'embryon de poulet et de canard. C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci., Paris D 278,
2209-2212.
PAUTOU, M. P. (1975o). Morphogenese de 1'autopode chez l'embryon de poulet. /. Embryol.
exp. Morph. 34. 511PAUTOU, M. P. (1975/)). La morphogenese du pied de l'embryon de poulet etudiee a l'aide
de malformations provoquees par le vert Janus (en preparation).
PAUTOU, M. P. (1975 c). Effet du vert Janus sur la morphogenese du pied de l'embryon de
poulet: analyse histologique et cytologique (en preparation).
PAUTOU, M. P. & KIENY, M. (1971 a). Sur les mecanismes histologiques et cytologiques de la
necrose morphogene interdigitale, chez l'embryon de Poulet. C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci.,
Paris D 272, 2025-2028.
PAUTOU, M. P. & KIENY, M. (1971 b). Effet du vert Janus sur la necrose morphogene interdigitale chez le Poulet: analyse histologique et cytologique. C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci.,
Paris D 272, 2378-2381.
RICHARDSON, K. C, JARETT, L. & FINKE, E. H. (1960). Embedding in epoxy resins for ultrathin sectioning in electron microscopy. Stain Technol. 35, 313-323.
RONCALI, L. (1973). Structure and activity of experimentally produced epithelial thickenings
in chick embryo limb buds. Monitore zool. Hal. 7, 1-17.
RUBIN, L. & SAUNDERS, J. W., Jr. (1972). Ectodermal-mesodermal interactions in the growth
of limb buds in the chick embryo: Constancy and temporal limits of the ectodermal
induction. Devi Biol. 28, 94-112.
SAUNDERS, J. W. Jr. (1948). The proximodistal sequence of origin of the parts of the chick
wing and the role of the ectoderm. /. exp. Zool. 108, 363-403.
SEARLS, R. L. & ZWILLING, E. (1964). Regeneration of the apical ectodermal ridge of the
chick limb bud. Devi Biol. 9, 38-55.
TARIN, D. & STURDEE, A. P. (1971). Early limb development of Xenopus laevis. J. Embryol.
exp. Morph. 26, 169-179.
TSCHUMI, P. A. (1957). The growth of the hindlimb bud of Xenopus laevis and its dependence
upon the epidermis. /. Anat. 91, 149-173.
VASSE, J. (1973). Etude autoradiographique des premiers stades du developpement de
l'ebauche du membre anterieur chez deux especes de Cheloniens {Testudo graeca L. et
Emys orbicularis L.). /. Embryol. exp. Morph. 29, 585-600.
VASSE, J. & RAYNAUD, A. (1971). Evolution de l'activite des constituants epiblastique et
mesoblastique de l'ebauche du membre anterieur de jeunes embryons de lezard vert
(Lacerta viridis, Laur.) etudiee au moyen de la thymidine et de l'uridine tritiees. C.r. hebd.
Seanc. Acad. Sci., Paris D 272, 1799-1801.
ZWILLING, E. (1961). Limb morphogenesis. Adv. Morphogen. 1, 301-330.
KELLEY,
(Regu le 12 mars 1975, revise le 11 juin 1975)