/. Embryo!, exp. Morph. Vol. 34, 1, pp. 221-252, 1975
Printed in Great Britain
221
Recherches sur le role de la
temperature dans la realisation du phenotype chez
des embryons de TAmphibien Pleurodeles waltlii
homozygotes pour la mutation
thermosensible ac (ascite caudale)
Par MARIA FERNANDEZ1 et JEAN-CLAUDE BEETSCHEN1
Laboratoire de Biologie generate
(Equipe de Recherche associee au CNRS n° 327),
Universite Paul-Sabatier, Toulouse, France
SUMMARY
1. At the feeding stage (st. 38), a high percentage (79 %) of Pleurodeles homozygous ac/ac
larvae show bent tails after a persistent ascitic blister in the dorsal part of the fin, when
embryonic development occurred at 12°C; about only 25 % of them are affected by abdominal
and pericardic ascites; about 40 % can feed and survive. The larval phenotype is very different
when embryonic development occurred at 23 °C, in which case tail growth appears to be
normal, but 95 % larvae die, due to ascitic fluid collection in the abdominal and heart
regions, marked anaemia and microcephaly.
2. The exchange of posterior neural plates and dorso-lateral epidermis between normal
and mutant neurulae has shown that the localization of the blister in the dorsal fin is not
dependent on autonomous properties of the mutant dorsal tissues, but should be considered
as resulting from general disturbances in the mutant organism.
3. Experiments were performed, involving a temperature shift from 12 to 23°C or 23 to
12°C, occurring at various developmental stages from the end of gastrulation (stage 13) to
the stage of spontaneous embryonic muscle contractions (stage 26). When the temperature
shift was applied after the end of neurulation (stage 21), the caudal phenotype was statistically
similar to that of larvae which had been bred continuously at the first temperature. Thus
temperature-sensitive phases can be characterized between neurula stages 15 and 18 (for a
12-23° shift) or 15 and 21 (for a 23-12° shift). Similarly, abdominal ascites can be induced
when embryos are kept at 23 °C till stage 23 (early tail-bud) only, and occurs much less
frequently when embryos are kept at 12°C till stage 23 and then transferred to 23°C.
4. It could be concluded from these experiments that the caudal mutant phenotype is
already temperature-determined during neurulation, before stage 21.
Nevertheless, double temperature-shift experiments showed that the second shift could
modify the results which would be obtained if the first shift only occurred. Paradoxical results
were obtained, more than 90 % of the tail phenotypes being of the 'warm type' when the
embryos were first kept at 12°C, then shifted up to 23 °C between stages 22 and 26, and
shifted down again to 12°C. Such a treatment markedly lowers the percentage of bent tails
('cold type') from the percentage which would occur if acjac embryos were constantly kept
x
Adresse des auteurs: Laboratoire de Biologie generate, Universite Paul-Sabatier, 118
Route de Narbonne, 31077 Toulouse-Cedex, France.
222
M. FERNANDEZ ET J. C. BEETSCHEN
at 23 °C after stage 21, but this longer warm treatment is of no effect of itself as compared
to the case when the whole development occurs at 12°C (bent tails are predominant in this
latter case).
Thus, whereas the early determination of the position of the caudal blister can be considered as a stable phenomenon under given temperature conditions, it is not irreversible.
5. As compared to cold-bred larvae, thrice as many completely anaemic larvae (66 %)
were obtained from ac/ac embryos kept at 23 °C between stages 21 and 26; this offers an
opportunity for the experimental study of this anaemia.
6. Implications of these results for further analysis of temperature-sensitive mutations in
cold-blooded vertebrates are suggested.
INTRODUCTION
Chez la Drosophile, les mutations thermosensibles constituent une source de
materiel particulierement interessante pour deceler les phases du developpement
au cours desquelles intervient la determination d'une ebauche embryonnaire:
celle-ci n'est plus affectee par le changement de la temperature a partir d'un stade
de developpement donne, caracteristique de l'organe considered L'emplacement
et la duree des phases thermosensibles sont variables (Suzuki, 1970; Foster,
1973).
L'existence de telles mutations thermosensibles chez les Vertebres poikilothermes devrait de meme permettre d'introduire une nouvelle methode
d'approche dans l'analyse experimental de leur developpement embryonnaire.
Mais, bien que le nombre de mutations connues chez les Amphibiens Urodeles,
en particulier chez l'Axolotl, soit deja relativement eleve (Briggs, 1973; Malacinski & Brothers, 1974), la plupart ne paraissent pas manifester une thermosensibilite utilisable pour une telle analyse. L'une d'entre elles a cependant ete
mise en evidence chez Pleurodeles waltlii; la mutation recessive semi-lethale
'ascite caudale' ac (Beetschen & Jaylet, 1965) s'est revelee en effet thermosensible: le phenotype des larves issues d'embryons eleves a 23 °C est beaucoup
plus anormal que celui des larves issues d'embryons eleves a 12 °C, dont 40 %
environ peuvent survivre, et la temperature de 23 °C entraine ainsi la mort de
plus de 95 % des larves mutantes peu apres l'eclosion (Beetschen, 1971). En
outre, la mutation ac induit l'apparition d'un 'effet maternel' dans la descendance des femelles ac/ac (Beetschen, 1970), qu'on peut rapprocher des effets
maternels deceles pour les mutations/, v, o et cl de l'Axolotl (Humphrey, 1960,
1962, 1966; Briggs & Humphrey, 1962; Briggs & Cassens, 1966; Briggs, 1972,
1973; Carroll & Van Deusen, 1973).
A partir de ces donnees, nous avons entrepris une etude approfondie de
diverses modifications phenotypiques des larves mutantes ac/ac, sur la base d'un
seul changement de temperature intervenant a tel ou tel stade du developpement
embryonnaire.
L 'application de deux changements successifs de temperature, qui intercalent
une periode de developpement relativement courte a temperature elevee entre
deux longues periodes a temperature basse (ou reciproquement), nous a
Le role de la temperature
223
ensuite conduits a des constatations qui montreront la complexite des phenomenes de thermosensibilite existant en realite chez un organisme superieur
poikilotherme.
Le present travail expose l'ensemble des resultats auxquels nous sommes
parvenus a l'heure actuelle par ces methodes de changement de temperature au
cours du developpement embryonnaire.
Nous donnerons au prealable une breve analyse experimental concernant
la genese du phenotype 'ascite caudale' au cours du developpement.
MATERIEL ET METHODES
Les souches de Pleurodeles utilisees sont elevees au laboratoire depuis
plusieurs annees, dans des aquariums a eau courante (Gallien, 1952). Les
individus ac/ac utilises pour les experiences de changement de temperature sont
obtenus a l'aide de croisements du type $ + /ac x $ ac/ac ou, a defaut, du
type + /ac x +ac. Les pontes obtenues a partir des $ $ ac/ac donnent une
descendance affectee par l'effet maternel, qui a ete utilisee seulement dans des
experiences de greffes.
Les embryons mutants sont tries des qu'ils deviennent reconnaissables, a
partir du stade 30 de la table chronologique de Gallien & Durocher (1957).
Tous les embryons restent dans leur gangue jusqu'au stade 34 (eclosion), tout
le developpement s'effectuant dans des cristallisoirs ou des cuvettes remplis
d'eau phreatique maintenue a temperature constante (12 ±0,5 ou 23 ±0,5 °C
selon les cas).
L'examen des caracteres phenotypiques choisis a lieu systematiquement sur
le vivant aux stades 37-38, qui correspondent a la prise de nourriture chez les
individus normaux.
Les operations au stade neurula (lere partie) ont ete effectuees dans du liquide
de Holtfreter operatoire sterile additionne d'elcosine Ciba (0,5 g %0), dans des
coupelles operatoires a fond garni de pate a modeler; apres cicatrisation, les
embryons ont ete transported dans du liquide de Holtfreter dilue au 1 /10 et y ont
sejourne pendant 24 a 48 h, avant d'etre places dansde l'eau phreatique sterilisee
par nitration, ou le developpement ulterieur s'est poursuivi jusqu'au stade 38.
Les methodes particulieres utilisees pour l'analyse statistique des resultats et
pour les changements de temperature seront exposees dans le texte correspondant.
RESULTATS
1. Genese du phenotype ascitique
Les individus mutants ac jac sont caracterises aux stades 28-29 par la presence
d'ascite dans la nageoire dorso-caudale (Beetschen & Jaylet, 1965), les individus
+ jac etant phenotypiquement normaux.
L'ascite localisee dans la nageoire a-t-elle pour origine un dereglement de
15
EMB
34
224
M. FERNANDEZ ET J. C. BEETSCHEN
pplpi
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/
2
(
!
/
I
+ /ac ou+/ +
ac/ac
Fig. 1. Echange de la plaque neurale troncale, des bourrelets medullaires et
d'ectoderme dorso-lateral adjacent entre deux jeunes neurulas de Pleurodele aux
stades .14-15, Tune ac/ac, l'autre + / + ou +/ac.
l'activite metabolique des tissus qui donnent naissance a cet organe, ou bien
celui-ci n'est-il qu'un lieu d'accumulation du liquide ?
De nombreux travaux (Raven, 1931; Holtfreter, 1933; Du Shane, 1935;
Twitty & Bodenstein, 1941; Woerdeman, 1946; Horstadius, 1950; Bodenstein,
1952) ont contribue a la comprehension du mecanisme de formation de la
nageoire chez les LJrodeles; celle-ci comporte deux etapes:
(1) Une induction exercee par les cretes neurales sur l'ectoderme dorsal
sus-jacent, certainement peu de temps apres la fermeture du tube nerveux;
(2) L'ectoderme a son tour induit les cretes neurales a former le mesenchyme
qui constitue le soutien de la nageoire.
Ces donnees etant acquises, nous avons entrepris des greffes de l'ensemble
plaque neurale troncale + bourrelets medullaires+ ectoderme adjacent, esperant
repondre ainsi a la question posee.
A. Protocole experimental
Sur de jeunes neurulas de Pleurodele (stades 14-15), deganguees et dechorionnees, on preleve les greffons comme suit: sur la neurula donneuse, on
pratique au moyen d'un fil de platine des incisions interessant uniquement le
feuillet le plus superficiel, autour du fragment que Ton veut extirper.
Le greffon ainsi delimite contient la quasi-totalite de la plaque neurale
troncale, les bourrelets medullaires ainsi que deux lambeaux d'ectoderme dorsolateral. On detache ensuite delicatement le greflfon en prenant soin de ne pas
leser les tissus sous-jacents. Une intervention analogue est realisee sur la neurula
receveuse (Fig. 1). Le greffon transports dans la plaie est maintenu en place
par un petit cavalier de verre. La cicatrisation achevee, les embryons operes
Le role de la temperature
225
sont transportes dans des coupelles contenant une solution de Holtfreter diluee
au 1/10 et y sejournent pendant 24 a 48 h. Us sont ensuite places dans de l'eau
phreatique.
B. Result at s
Deux types d'experiences ont ete effectues selon la provenance des neurulas
donneuses et receveuses.
(1) Les embryons donneurs sont issus d'une ponte provenant d'un croisement
$ + lac x $ ac/ac et les embryons receveurs proviennent soit de la meme
ponte, soit d'une ponte normale ( $ + / + x £+/ + ) .
Dans ces conditions nous avons realise des echanges reciproques qui aboutissent a de meilleurs resultats (Fig. 1).
En effet, dans le cas ou la greffe n'est pas reciproque, tres souvent la neurula
donneuse ne se cicatrise pas a cause de l'ampleur de la blessure, et de ce fait se
cytolyse. II devient des lors impossible de determiner le genotype du greffon
preleve.
(2) Les embryons donneurs sont issus d'une ponte provenant d'un croisement
$ ac/ac x <$ ac/ac. Ces individus presentent les anomalies liees a 1'efFet maternel
(Beetschen, 1970). Les embryons receveurs sont alors choisis dans une ponte
entierement normale. Dans ce cas, seules les combinaisons 'porte-greffe normal
+ greffon mutant' sont realisees. La combinaison inverse ne presente en effet
aucun interet, etant donne que tres rares sont les individus acjac nes de mere
elle-meme ac/ac qui achevent la neurulation, a fortiori lorsqu'ils sont operes.
Au total, 55 individus ont poursuivi normalement leur developpement. Us se
repartissent comme suit:
Phenotype du porte-greffe
^ ~
f Normal ( + / + ou +jac)
Greffon Xyf , /
'
' '
I Mutant
Normal
( +1+ ou +/ac)
16
,,-*
27*
Mutant
7
5
* Parmi lesquels 21 greffons proviennent d'embryons ac\ac nes de mere ac\ac.
1. Associations 'embryon normals greffon normal'
La morphologie generale et la circulation sanguine etaient normales chez tous
les porte-greffes. Cependant il est interessant de noter que l'un d'eux a presente
une cloque d'ascite en position dorsale sub-terminale. La queue s'est courbee
vers le haut reproduisant ainsi, en un point precis, le phenotype caudal d'un
mutant ac/ac eleve a 12 °C (phenocopie).
2. Associations 'embryon mutant+greffon normal"1
Parmi les sept cas observes, cinq d'entre eux ont presente, outre l'ascite
caudale, des cloques d'ascite dans la nageoire dorsale formee a partir de tissus
normaux. Chez les deux autres, bien que les cloques ne fussent pas nettement
15-2
226
M. FERNANDEZ ET J. C. BEETSCHEN
individualists, l'ascite etait presente dans l'epaisseur du repli dorsal. Le
genotype des tissus du greffon n'est done pas responsable de l'apparition et de
la persistance du phenotype mutant au niveau de ces tissus.
3. Associations 'embryon normal+greffon mutant'
Pour 23 porte-greffes sur 27, nous n'avons releve aucune anomalie. Dans
deux autres cas une cloque est apparue dans le repli dorsal. Celle-ci s'est
trouvee reportee vers l'avant et etait presque entierement resorbee aux stades
37-38. Les deux autres individus ont presente une toute petite cloque d'ascite
dans la nageoire ventrale entre les stades 32-34 et 32-36.
4. Associations 'embryon mutant + greffon mutant'
Les cinq individus, tres ascitiques et totalement anemiques, sont morts entre
les stades 34 et 36.
C. Discussion
Les resultats precedents permettent d'affirmer que la presence de l'ascite dans
la nageoire dorsale n'est pas liee au genotype des tissus formateurs de l'organe.
L'apparition de l'ascite dans le repli dorsal doit etre due, chez les mutants, a un
dereglement physiologique intrinseque de Porganisme entier. Les tissus mutants
impliques dans la formation de la nageoire dorsale peuvent manifester ce
dereglement de maniere autonome, mais il n'est alors que temporaire et disparait avant le stade 38 sur un porte-greffe normal.
Un dereglement passager se manifestant de maniere analogue, peut etre
provoque experimentalement de facon accidentelle. Cette hypothese permettrait
d'expliquer la phenocopie obtenue.
II. Consequences des changements de la temperature d'elevage sur le
phenotype des individus mutants
(1) Materiel et methodes
(a) Series temoins
Les pontes obtenues sont synchronisers et les individus sont maintenus a
temperature constante (12, 18 ou 23 °C selon les series) jusqu'au stade de
l'observation (stades 37-38, prise de nourriture).
(b) Changement de la temperature d'elevage
(1). De 12 a 23 °C
Apres synchronisation, aux premiers stades de la segmentation, les embryons
sont eleves a 12 °C jusqu'a un stade donne du developpement. Us sont alors
transferes a l'aide d'une pipette dans une autre cuvette contenant de l'eau a
23 °C. Ainsi les germes ne subissent pas une augmentation progressive de la
temperature, mais sont soumis a un choc thermique, adouci cependant par la
Le role de la temperature
227
presence de la gangue qu'il est preferable de laisser en place pour assurer un
developpement normal.
Aux stades 29-30, les embryons mutants ac/ac, morphologiquement reconnaissables, sont separes de leurs freres ( + / + ou + /ac) qui servent de temoins.
Les deux cuvettes contenant, l'une les mutants, l'autre les temoins ainsi definis,
sont replacees dans l'etuve a 23 °C, temperature a laquelle les germes evoluent
jusqu'au stade de l'observation.
La separation precoce des individus ac/ac et normaux ( + /ac ou + / + ), a pour
but d'eviter une confusion eventuelle entre ces deux types d'individus. En effet,
il s'avere que quelques rares mutants arrivent parfois a resorber, au cours des
stades ulterieurs, la totalite ou la quasi-totalite de l'ascite contenue dans la
nageoire. Ces mutants deviennent des lors tres difficiles a distinguer des embryons
normaux.
Enfin, aux stades 37-38, les jeunes larves ac/ac anesthesiees avec du MS 222
a 1 g/l sont observees sous la loupe binoculaire et comparees avec les larvessceurs temoins ayant subi le meme traitement thermique.
Nous designerons le changement de la temperature d'elevage de 12 a 23 °C
a un stade x, par: 12°—st. x -> 23°.
(2). De 23 a 12 °C
Le protocole experimental est identique a celui que nous venons de decrire
pour les changements de 12 a 23 °C.
(c) Double changement de la temperature (de 12 a 23 °C puis a 12 °C; ou de
23 a 12 °C puis a 23 °C)
Apres synchronisation, les embryons sont d'abord el eves a 12 ou a 23 °C,
selon l'experience, jusqu'a un stade xx (stade 20 par exemple). Us sont alors
transferee dans des cuvettes contenant de l'eau a 23 °C (ou a 12 °C) et y evoluent
jusqu'a un stade x2 (stade 26 par exemple) auquel intervient le deuxieme
changement de temperature. En d'autres termes, une periode de developpement
a temperature elevee est comprise entre deux periodes de developpement a
basse temperature, ou l'inverse.
Les exemples que nous avons donnes seront ainsi notes:
12°—st. 20^23°—st. 26^12°
23°—st. 20->12°—st. 26->23°.
(d) Analyse statistique des resultats
Les resultats obtenus ontete exprimes en pourcentages exprimant la frequence
du nombre de larves acjac presentant un caractere donne, par rapport au
nombre total de larves acjac de la serie considered (chaque serie correspond a
une ponte ou une fraction de ponte). Pour chaque serie, nous avons calcule les
pourcentages de six anomalies differentes.
Pour faciliter l'analyse statistique, toutes les series-temoins ont ete groupees
228
M. FERNANDEZ ET J. C. BEETSCHEN
Tableau 1. Ensemble des experiences faisant intervenir des changements
de temperature
Types d'experiences
Changements de la temperature
d'elevage (°C)
12° ->23°
23° -*12°
12° -»23° ->12°
23° -*12° ^ 2 3 °
Totaux
Temoins eleves (°C)
(23°
a h8°
(.12°
Totaux
Nombre total de larves
ac/ac observees aux
stades 37-38
Nombre
de series
Nombre
de groupes
28
33
5
4
10
12
4
4
70
30
1796
2357
588
191
4932
8
5
3
1
1
1
400
350
230
16
3
980
selon la temperature (23, 18, 12 °C). On a de meme constitue des groupes de
series ayant subi un meme traitement thermique a un meme stade.
La methode d'analyse utilisee (Lazar & Schwartz, 1967; Heller, 1968)
permet de comparer des pourcentages deux a deux: (a) en se basant sur leurs
intervalles de confiance (2c) respectifs; (b) en considerant l'hypothese nulle
(Ho) dans le cas ou les deux intervalles de confiance se chevauchent. La difference
observee entre deux pourcentages considered n'est pas significative quand e < 2,
est significative si e ^ 2 et hautement significative pour e ^ 2,6.
(2) Resultats
Les differents types d'experiences effectuees sont reportes dans le Tableau 1.
L'etude a porte sur les caracteres suivants: 1, microcephalie; 2, absence d'erythrocytes branchiaux; 3, ascite caudale; 4, croissance anormale de la queue;
5, ascite cardiaque; 6, ascite abdominale.
(A) Groupes-temoins de mutants eleves a temperature constante
Les resultats (Tableau 2) confirment ceux de Beetschen (1971) etablis sur un
plus grand nombre d'individus; c'est pourquoi ces series temoins sont considerees comme suffisantes pour les comparaisons etablies ensuite. Le terme de
'temoins' se rapportera par la suite aux mutants ainsi eleves a temperature
constante.
La plupart des larves mutantes elevees a 12 °C presentent aux stades 37-38
une grosse cloque d'ascite dorsale dans la nageoire caudale, ce qui a perturbe
la croissance de cette derniere et lui donne un aspect crochu, la queue etant
recourbee vers le haut. Au contraire, dans la grande majorite des cas, chez les
Nombre de
larves
observees
400
350
230
Temperature
d'elevage
23
18
12
94,6 ±2,3
57,3 ±5,2
15,4 ±4,8
V)
Microcephalie
83,6 ±3,7
54,8 ±5,1
18,2 + 5,1
Absence
d'erythrocytes
branchiaux
(2)
Croissance
anormale de
la queue
(4)
18,4 ±3,9
54,1 ± 5,2
79,3 ±5,3
Ascite caudale
(3)
73,0 ±4,4
79,4 ±4,3
98,3 ±1,7
95,0 ±2,2
37,1 ±5,1
21,5 ±5,4
(•5)
Ascite cardiaque
Moyenne des pourcentages observes pour les differents caracteres ± 2<r
Tableau 2. Etude des groupes-temoins
93,3 ±2,5
59,6 ±5,1
29,5 ± 6,0
Ascite
abdominale
(6)
8"
K)
e la temperature
230
M. FERNANDEZ ET J. C. BEETSCHEN
Fig. 2. (A). Larve ac/ac au stade 36, elevee a 12°C et presentant le phenotype predominant a cette temperature. La morphologie cephalique est normale ou subnormale.
Noter la position dorsale de la cloque d'ascite et la courbure caracteristique de la
queue (G x 8). (B). Larve acjac au stade 36, elevee a 23 °C, presentant le phenotype
predominant a cette temperature. Microcephalie, branchies reduites, ascite abdominale et cardiaque tres importantes, mais queue rectiligne (G x 8).
larves elevees a 23 °C et qui, au stade 30, presentaient le meme phenotype
caracteristique que les embryons eleves a 12 °C, la croissance rectiligne de la
queue n'a pas ete perturbee par la suite, bien que des cloques d'ascite beaucoup
moins importantes se rencontrent encore assez souvent dans la partie dorsale de
la nageoire caudale. Mais, a cette temperature plus elevee, l'ascite n'a pas tendance a se localiser dans la queue au cours du developpement; l'accumulation
de liquide est en revanche beaucoup plus importante dans l'abdomen et la
region cardiaque, s'accentuant au cours des stades tardifs du developpement
(Fig. 2).
(B) Experiences faisant intervenir un seul changement de la temperature
d'elevage
Les resultats peuvent etre consultes dans les Tableaux 3 et 4; le pourcentage
trouve (pour chaque caractere et chaque stade de changement) est accompagne
13
15
16
18
20
21
22
23
24
26
Stade du
Changement*
85,9 ±6,3
77,3 ± 6,7
91,2 ±4,7
66,0 ±5,9
79,0 ±7,3
87,9 ±5,4
61,6 ±7,2
48,3 ± 8,1
38,6 ±5,3
36,5 ± 6,6
Absence
d'erythrocytes
branchiaux
(2)
61,6±8,8
85,2 ±5,7
81,0 ±6,4
93,4 ±3,1
94,2 ± 4,2
98,8 ±1,8
97,3 ±2,4
96,0 ±3,2
98,3 ±1,4
96,3 ± 2,6
Ascite caudale
(i)
19,5 ±7,2
46,4 ±8,0
51,3 ±8,2
80,6 + 5,0
78,1 ± 7,4
84,5 ± 6,0
84,2 ±5,4
79,2 ± 6,6
87,1 ±3,6
79,5 ±5,5
Croissance
anormale de
la queue
(4)
dgee; stades 14-21: neurulation; stades 22-26: bourgeon caudal.
90,5 ± 5,3
96,4 ±3,0
94,6 ±3,7
77,1 ±5,3
91,4 ±5,0
91,1 ±4,7
71,5 ±6,7
65,5 ±7,7
52,9 ±5,4
18,3 ±5,3
Microcephalie
CO
* Stade 13: gastrula
122
156
149
254
124
145
182
153
341
214
Nombre
de larves
observees
86,0 ±6,3
91,2 ±4,5
98,8 ±1,8
85,4 ±4,4
92,1 ±4,9
82,7 ±6,3
84,9 ±5,3
80,9 ± 6,4
53,1 ±5,4
19,4 ±5,4
Ascite
cardiaque
(-5)
Moyenne des pourcentages observes pour les differents caracteres ±2cr
Tableau 3. Resultats des experiences de changement de la temperature d'elevage de 12 a 23 °C
88,0 ±5,9
92,3 ± 4,3
99,2 ±1,5
85,7 ±4,4
96,2 ±3,4
78,6 ±6,8
84,9 ± 5,3
83,8 ±6,0
52,5 ± 5,4
17,5 ±5,2
Ascite
abdominale
(6)
to
Hi
232
M. FERNANDEZ ET J. C. BEETSCHEN
de la valeur ±2cr ce qui nous permet d'obtenir rapidement les limites inferieure
et superieure de son intervalle de confiance au seuil de risque P 0,05.
Rappelons que les pourcentages inscrits dans ces tableaux ont ete compares
aux pourcentages obtenus chez les groupes-temoins. Ces comparaisons nous
ont permis de faire une analyse globale du phenotype de chaque groupe, ainsi
qu'une analyse des differents caracteres.
(1) Changements de 12° a 23 °C
(a) Analyse globale du phenotype
Lorsqu'un changement de ce type est effectue aux stades 13, 15 ou 16 (debut
de la neurulation), le phenotype des larves aux stades 37-38 est identique a
celui des temoins eleves a 23 °C, excepte parfois pour la nageoire caudale
lorsque le choc thermique intervient aux stades 15 ou 16, stades pour lesquels
la frequence des individus a queue recourbee est plus elevee que chez lesdits
temoins.
Au contraire, le phenotype des larves exposees a la temperature de 23 °C a
partir du stade 26, correspond a celui des temoins eleves a 12 °C; seul, le nombre
de larves ne presentant pas d'erythrocytes branchiaux differe significativement:
on remarque en effet que, dans ces conditions, deux fois plus de larves sont
totalement anemiques (36,5 % au lieu de 18, 2 %).
Enfi. n, les embryons soumis au transfert entre les stades 16 et 26, presentent
un phenotype ne pouvant etre assimile globalement, par l'ensemble des caracteres considered, a aucun des groupes-temoins.
(b) Analyse des differents caracteres
(a) Microcephalie (1) et absence d'erythrocytes branchiaux (2). Ces caracteres
evoluent de facon parallele si Ton considere les stades successifs de changement.
Si ce dernier intervient:
- Avant le stade 18:1a quasi-totalite des larves sont fortement microcephales
et les erythrocytes au niveau des branchies sont presque toujours absents,
comme chez les temoins eleves a 23 °C.
- A u stade 18:les pourcentages des anomalies precitees, 1 (77,1%) et 2
(66 %), sont inferieurs a ceux du groupe-temoin eleve a 23 °C.
- Aux stades 20 et 21 (achievement de la neurulation): les frequences redeviennent comparables a celles des temoins eleves a 23 °C.
- Aux stades 22 et 23 (jeune bourgeon caudal): les jeunes larves ne sont
semblables ni a la population des temoins eleves a 23 °C ni a celle des temoins
eleves a 12 °C. Le pourcentage d'animaux presentant les anomalies etudiees est
intermediaire entre ceux des populations citees.
- A u stade 24:1a moitie des individus environ presentent des anomalies
cephaliques, tels des temoins eleves a 18 °C; ces anomalies sont toutefois moins
accentuees que dans les cas precedents. La frequence des larves anemiques
233
Le role de la temperature
100 -
0 15
16
17
18
19
20
Stades de changement
21
22
23
24
26
Fig. 3. Pourcentages (en ordonnees) de queues anormales observes, lors des transferts
de 12 a 23°C (courbe T) et de 23 a 12°C (courbe IT), aux differents stades de changement (en abcisses). # et A, Valeurs obtenues avec leur intervalle de confiance 1;
les limites superieures des differents intervalles de confiance ont ete reliees, de meme
que les limites inferieures. Les limites inferieure et superieure de l'intervalle de confiance de chacun des trois pourcentages des groupes-temoins a 23, 18 et 12°Csont
representees par deux traits continus horizontaux.
(38,6 %) a diminue egalement par rapport aux experiences precedentes: elle est
inferieure a celle de la population des temoins eleves a 18 °C (54,8 %), mais
superieure toutefois a celle du groupe-temoin eleve a 12 °C (18,2 %).
- Au stade 26 (contractions musculaires): la morphologie cephalique est
alors normale dans 82,3 % des cas, comme chez le groupe-temoin eleve a 12 °C.
Par contre, la frequence des individus chez lesquels on n'observe pas d'erythrocytes branchiaux est double de celle observee chez lesdits temoins.
Ainsi, si la duree du sejour a temperature basse a ete suffisante pour empecher
l'aggravation des anomalies cephaliques, il n'en a pas ete de meme pour
l'anemie.
(/?) Ascite caudale (3) et croissance anormale de la queue (4) (Fig. 3). Nous
avons deja mentionne la relation qui existe entre ces deux caracteres lors de la
description des groupes-temoins (Beetschen, 1971). Rappelons brievement que
la (ou les) cloque(s) d'ascite se localise(nt) dans la negeoire caudale, en position
dorsale sub-terminale; la taille de la (ou des) cloque(s) n'a qu'une importance
relative.
Nous allons done analyser revolution de ces deux caracteres de pair, etant
donne que le second est la consequence du premier.
Lorsque le transfert a 23 °C est effectue:
234
0
M. FERNANDEZ ET J. C. BEETSCHEN
J
\
17
I
i
I
I
18
19
20
21
Stades de changement
I
23
l
24
.26
Fig. 4. Pourcentages d'ascite abdominale observes aux differents stades de changement.
Memes conventions que pour la Fig. 3.
- Au stade 13: les individus reagissent comme des temoins eleves a 23 °C en
ce qui concerne la morphologie caudale; 19,5 % d'entre eux seulement ont une
queue recourbee.
- A u x stades 15 ou 16: l'analyse statistique, d'apres le groupage effectue,
identifie les larves a la population des temoins eleves a 18 °C.
En realite, le pourcentage d'individus presentant une queue anormale varie
selon la serie consideree.
Ainsi, pour cinq series etudiees, deux d'entre elles (soit 121 larves) ont reagi
comme le groupe-temoin eleve a 23 °C; deux autres (121 larves egalement)
comme le groupe-temoin eleve a 18 °C et la derniere (63 larves) comme le
groupe-temoin eleve a 12 °C.
Ces resultats s'expliquent par une sensibilite plus ou moins precoce selon les
individus des differentes series et cette difference d'expressivite est caracteristique
d'une phase sensible.
- Au stade 18 ou a un stade ulterieur: la frequence des larves a queue anormale est semblable a celle des temoins eleves a 12 °C.
(y) Ascite cardiaque (5) et ascite abdominale (6) (Fig. 4). Quand le choc
thermique intervient:
- Aux stades 13 ou 15: le pourcentage des larves qui manifestent des troubles
physiologiques responsables des anomalies citees, est comparable a celui des
temoins eleves a 23 °C.
- A u stade 16: la frequence des germes fortement ascitiques dans la region
Le role de la temperature
235
abdominale est meme superieure (98,8 %) a celle trouvee pour les temoins
eleves a 23 °C (Ho rejetee, e = 2,76).
- Au stade 18: la proportion de mutants dont l'abdomen est empli de liquide
est alors inferieure (85,4 %) a celle que Ton observe lorsque le developpement
se deroule constamment a 23 °C (Ho rejetee, e = 3,25).
- Au stade 20: ce pourcentage redevient comparable a celui du groupetemoin eleve a 23 °C, ce qui implique l'existence de fluctuations entre les
stades 15 et 20 de la neurulation, comme pour les caracteres 1 et 2.
- Aux stades 21, 22 ou 23: les larves ne sont semblables ni a la population
des temoins eleves a 18 °C, ni a celle des temoins eleves a 23 °C (voir Fig. 3).
- Au stade 24: les resultats obtenus ne sont pas homogenes; les pourcentages
relatifs a l'ascite cardiaque et a l'ascite abdominale, trouves pour deux series
(soit 104 larves) sont analogues a ceux que Ton observe chez le groupe-temoin
eleve a 12 °C; les deux autres series ont reagi comme des temoins eleves a 18 °C.
Rappelons que sur la Fig. 4, seule la moyenne ponderee correspondant au groupe
etudie (12°—st. 24^23°) a ete reportee.
Nous pensons done que le stade 24 est un stade critique pour la determination
de l'ascite cardiaque et abdominale au meme titre que les stades 15 ou 16 le
sont pour la morphologie caudale.
- Au stade 26: un mutant sur cinq environ manifeste les anomalies 5 et 6, mais
la quantite de liquide est generalement faible.
On note par ailleurs un phenomene curieux: la frequence des larves presentant
de l'ascite dans l'abdomen est significativement plus faible que celle observee
chez les temoins les moins anormaux, ceux eleves constamment a 12 °C (Ho
rejetee, e = 2,98).
Ainsi le passage a 23 °C, temperature qui aggrave normalement le syndrome,
semble retablir chez la plupart des individus une physiologie quasi-normale;
ce phenomene est particulierement surprenant.
(2) Changements de 23 a 12 °C
(a) Analyse globale du phenotype
Lorsque les embryons sont soumis a Faction du froid avant le stade 17 (convergence des bourrelets neuraux), le phenotype des larves au stade 38 est similaire a celui des temoins eleves a 12 °C. II faut noter toutefois que la frequence
des individus presentant l'anomalie caudale est plus faible que chez lesdits
temoins. Nous retrouvons la un phenomene complementaire de celui que Ton
observe dans les experiences faisant intervenir un changement de 12 a 23 °C
aux memes stades. Si nous faisons intervenir le choc thermique a partir du
stade 17, les larves presentent un phenotype ne pouvant etre assimile globalement a celui d'aucune des populations-temoins.
13
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
26
Stade du
Changement
51
63
107
452
195
280
245
288
51
358
254
78
Nombre de
larves
observees
92,0 ± 6,1
90,0 ± 8,4
65,0 ±12,0
95,1 ± 4,2
76,2 ± 4,0
73,9 ± 6,3
73,0 ± 5,3
50,0 ± 6,4
63,5 ± 5,7
65,0 ±13,4
57,0 ± 5,2
17,O± 1,8
36,0 ±10,9
16,0 ±10,3
24,0 ±10,8
30,8 ± 8,9
25,3 ± 4,1
21,2± 5,9
30,0± 5,5
27,8 ± 5,7
25,8 ± 5,2
78,0 ±11,6
36,4 ± 5,1
77,9 ± 4,7
V)
53,0 ±11,3
16,0±10,3
13,0± 8,5
13,9± 6,7
27,7 ± 4,2
38,4 ± 7,0
24,0 ± 5,1
26,8 ± 5,7
33,2 ± 5,5
80,0 ±11,2
42,7 ± 5,2
48,8 ± 6,3
(.3)
(2)
Microcephalie
Ascite caudale
Absence
d'erythrocytes
branch iaux
77,0 ± 9,5
63,0 ±13,5
41,0 ±12,4
58,0 ± 9,5
33,9 ± 4,5
29,5 ± 6,5
33,0 ± 5,6
9,0 ± 3,7
24,8 ± 5,1
2,0 ± 3,9
9,4 ± 3,1
0,9 ± 1,8
Croissance
anormale de
la queue
(4)
17,0+10,5
19,0± 9,9
24,0 ± 8,3
24,5 ± 4,0
28,3 ± 6,5
29,6 ± 5,5
26,5 ± 5,6
32,8 ± 5,5
78,0± 11,6
74,9 ± 4,6
67,9 ± 5,9
4,0 ± 4,4
Ascite
cardiaque
(5)
Moyenne des pourcentages observes pour les differents caracteres ±2<x
Tableau 4. Resultats des experiences de changement de la temperature de 23 a 12 °C
22,0 ± 9,4
25,0 ±12,1
38,0 ±12,2
44,0 ± 9,6
37,9 ± 4,6
39,9 ± 7,0
40,0 ± 5,9
36,6 ± 6,2
37,2 ± 5,7
78,0 ±11,6
80,1 ± 4,2
69,9 ± 5,8
Ascite
abdominale
(6)
2;
W
O
H
in
w
w
m
O
N
tfl
H
d
w
m
to
Le role de la temperature
237
(b) Analyse des differents caracteres
(a) Microcephalie (1). Lorsque le changement a 23 °C intervient:
- Avant le stade 18: la microcephalie se manifeste avec une frequence analogue
a celle des temoins eleves a 12 °C.
- Entre les stades 17 et 26: les pourcentages respectifs de larves microcephales
observes, ne permettent pas d'assimiler les individus de ces divers groupes a l'une
destrois populations-temoins. On remarque (voir Tableaux 2 et 3) que ces
frequences sont intermediaires entre celles des populations-temoins elevees a
18 et a 12 °C (exception faite pour la serie 23°—st. 23 ->12° qui a ete particulierement sensible a l'effet de la chaleur).
- Au stade 26: 48,8 % des larves sont microcephales. Les individus ont done
reagi comme si leur developpement s'etait constamment deroule a 18 °C.
(/?) Absence d'erythrocytes branchiaux (2). Comparee a celle des populationstemoins, revolution de cette anomalie est sensiblement identique a celle de la
microcephalie.
II est interessant de noter que la frequence des larves totalement anemiques
observee pour le groupe 23°—st. 26-^12°, est semblable a celle du groupetemoin eleve a 23 °C. En d'autres termes, tout se passe pour ce caractere comme
si le transfert a basse temperature n'avait pas eu lieu.
(y) Ascite caudale (3) et croissance anormale de la queue (4) (Fig. 3). Si le
choc thermique intervient:
- Au stade 13: la frequence des larves a queue recourbee est identique a celle
des temoins eleves a 12 °C.
- Aux stades 15, 16 ou 17: le phenotype caudal varie selon le stade et la serie
considered. Le pourcentage d'individus a queue anormale est inferieur a celui
que Ton observe lorsque les germes effectuent tout leur developpement a 12 °C.
- Aux stades 18, 19 ou 20: le nombre de larves presentant de l'ascite dans la
nageoire caudale est semblable a celui des temoins eleves a 23 °C.
Cela ne veut pas dire que la position des cloques est forcement la meme;
e'est ce qui explique d'ailleurs que l'anomalie morphologique de la queue soit
dans l'ensemble plus frequente, lorsque les embryons sont transferes a basse
temperature aux stades 18, 19 ou 20, que lorsque les individus se developpent
constamment a 23 °C. Le resultat detaille des experiences va permettre de
mieux preciser ces donnees.
Le changement 23°—st. 18-^12° a concerne six series: deux d'entre elles,
soit 149 larves, ont reagi comme le groupe-temoin eleve a 23 °C (voir Tableau
2), deux autres (151 larves) comme le groupe-temoin eleve a 18 °C; pour les
deux dernieres (152 larves), les frequences obtenues sont intermediaires entre
celles des deux groupes-temoins precites. Si Pexperience a lieu au stade 19 ou
au stade 20, les resultats sont exactement les memes.
238
M. FERNANDEZ ET J. C. BEETSCHEN
Rappelons que lors d'un changement de 12 a 23 °C, aux stades 18, 19 ou 20,
la frequence des larves a queue anormale obtenues etait analogue a celle du
groupe-temoin correspondant a la premiere temperature d'elevage.
lei, le phenomene est plus complexe, et les individus a queue recourbee sont
plus nombreux que dans le groupe-temoin eleve a 23 °C. Le froid peut done
encore agir sur la croissance caudale apres le stade 20, alors que la chaleur
n'avait pas d'effet correcteur sur cette croissance quand le developpement s'etait
poursuivi au froid jusqu'a ce stade.
- Apres le stade 20: la frequence des larves a morphologie caudale anormale
est tres faible et tres inferieure (sauf quand le choc a lieu au stade 22) a celle du
groupe-temoin a 23 °C. Ce fait est particulierement surprenant puisque, en
d'autres termes, le changement de temperature permet d'obtenir une croissance
caudale beaucoup plus normale que si le developpement s'etait deroule constamment
a 23 °C.
II en est de meme pour l'ascite localisee dans la nageoire caudale: la majorite
des larves (83 %) n'en presentent pas.
(8) Ascite cardiaque (5) et ascite abdominale (6) (Fig. 4). Que le developpement
se poursuive a 23° jusqu'aux stades 13, 15 ou 22, la frequence de ces anomalies
est semblable a celle du groupe-temoin eleve a 12 °C, excepte pour le caractere 6
lorsque le choc a lieu au stade 17 (e = 2,61) et pour le caractere 5 quand le choc
a lieu au stade 22 (e = 2,85). Quand les germes evoluent a temperature elevee
jusqu'aux stades 23, 24 ou 26, la valeur d'e nous indique que les larves ne
peuvent etre assimilees ni a la population des temoins eleves a 18 °C ni a celle
des temoins eleves a 23 °C. Certaines d'entre elles subissent done un effet
tardif de la temperature la plus basse, que Ton peut qualifier de curatif.
Notons, ici encore, que pour le groupe 12°—st. 26->23°, nous avions observe
un 'phenotype 12°', la chaleur n'ayant plus d'effet tardif sur les caracteres
considered.
(3) Analyse des re'sultats obtenus avec les ponies d'une femelle donnee (cf.
Tableau 5)
Nous analysons plus particulierement ici les resultats trouves pour les caracteres 4, 5 et 6, l'expression de ces anomalies etant tres differente a 12 et a 23 °C.
Les frequences obtenues dans les experiences faisant intervenir un choc
thermique, sont comparees avec celles observees:
- d'une part, chez les series-temoins de ladite femelle (N3 et LO 2 );
- d'autre part, chez les groupes-temoins (Tableau 2);
-enfin, chez les groupes 12°-^23° (Tableau 3) et 23°->12° (Tableau 4) aux
stades correspondants.
Ces series de pontes d'une meme femelle permettent d'etudier sur un materiel
genetiquement aussi homogene que possible, les variations dues aux diverses
experiences et de montrer leur realite en dehors de tout groupage de series
issues de femelles differentes.
Nombre
de larves
observees
60
131
50
86
79
83
69
78
108
Type
d'experience
Temoins 12 °C
Temoins 23"3C
12°—st. 13 ->23°
12°—st. 16 ->23°
12°—st. 22 ->23°
12°—st. 23 ->23°
12°—st. 24 ->23°
23°—st. 19 -+12°
23°—st. 24 -+12°
Designation
des series Microcephalie
V)
8,0
± 7
N3
LO!
89,7 ± 5
94,0 ± 7
I3-1
N 3 _x
98,0 ± 3
84,0 ± 8
O'8_i
92,0 ± 6
N" 3 _l
O3-1
10,0 ± 7
60,0±ll
I1-3
56,0 ±10
Li-3
Ascite caudale
(3)
98,0 ± 4
77,9 ± 7
64,0 ±14
67,0 ±10
95,0 ± 5
96,0 ± 4
97,0 ± 4
81,0± 9
76,0 ± 8
Absence
d'erythrocytes
branchiaux
(2)
5,0 ± 6
79,4 ± 7
90,0 ± 8
92,0 ± 6
66,0±ll
73,0 ±10
10,0 ± 7
l,0± 2
36,0 ± 9
78,0 ±10,5
19,3 ± 6,8
26,0 ±12,2
20,0 ± 8,5
72,0 ± 9,9
70,0+ 9,9
96,0 ± 4,6
42,0 ±10,9
l,0± 4,1
(4)
Croissance
anormale de
la queue
27,0 ±11
95,0 ± 4
86,0 ±10
98,0 ± 3
94,0 ± 5
96,0 ± 4
25,0 ±10
26,0 ±10
78,0 ± 8
(5)
Ascite
cardiaque
Pourcentages observes pour les differents caracteres ±2<r
Tableau 5. Resultats des diverses experiences faites avec les pontes d'une meme femelle ( $ H-68-9)
36,0 ±12
95,6 ± 4
88,0 ± 9
100,0 ± 0
94,0 ± 5
93,0 ± 6
23,O±1O
31,0+10
78,0 ± 8
(6)
Ascite
abdominale
K)
S"
s-
OS
hi
240
M. FERNANDEZ ET J. C. BEETSCHEN
(a) Changements de 12 a 23 °C
(a) Croissance anormale de la queue (4). La frequence des larves a queue
recourbee obtenues pour la serie \z_x est analogue a celle observee d'une part
pour la serie LOX (temoins eleves a 23 °C), d'autre part pour le groupe-temoin
eleve a 23 °C (Tableau 2) ainsi que pour le groupe 12°—st. 13 ->23° (Tableau 3).
Pour le changement 12°—st. 16->23°, les resultats de la serie N3_! sont semblables a ceux de la serie \^_x. Mais nous avons note qu'une autre serie issue d'une
autre femelle et soumise a un traitement identique a reagi comme le groupetemoin eleve a 12 °C. Nous avons interprets cette difference d'expressivite
comme etant caracteristique d'un stade critique.
Au contraire, si les embryons se developpent au froid jusqu'au stade 22 ou
23, le pourcentage d'individus a morphologie caudale anormale est analogue a
celui de la serie N 3 ainsi qu'a celui du groupe-temoin eleve a 12° (Tableau 2,
voir aussi Tableau 3).
Enfln, si nous considerons le pourcentage de larves a queue recourbee de la
serie O3_l5 nous constatons qu'il est superieur a celui de la serie-temoin N 3
(12 °C). La raeme remarque peut etre faite apres comparaison du groupe complet 12°—st. 24-^23° avec le groupe-temoin eleve a 12 °C, bien que la difference
soit, dans ce cas, moins importante.
(/?) Ascite cardiaque (5) et ascite abdominale (6). Que le developpement a
12 °C se poursuive jusqu'au stade 13, 16, 22 ou 23, la frequence des larves
fortement ascitiques dans les regions cardiaque et abdominale est analogue a
celle de la serie-temoin LOX (23 °C) ainsi qu'a celle du groupe-temoin eleve a
23 °C; elle est cependant quelque peu differente de celle obtenue pour les
groupes 12°—st. 22 ou 23-^23°.
Par contre si les germes evoluent a 12 °C jusqu'au stade 24 (O3_!) les pourcentages des anomalies 5 et 6 sont identiques a ceux de la serie N 3 de meme
qu'a ceux du groupe-temoin eleve a 12 °C.
Nous avons deja signale que le groupe 12°—st. 24->23° est heterogene, et
que deux series sur les quatre analysees ont reagi comme le groupe-temoin
eleve a 12 °C.
(b) Changement de 23 a 12 °C
(a) Croissance anormale de la queue (4). La frequence de cette anomalie dans
la serie Ix_3 est significativement differente de celle des series N 3 (12 °C) et LOX
(23 °C) ainsi que de celle des groupes-temoins eleves a 12 °C et a 23 °C.
Lorsque nous avons analyse les resultats du groupe 23°—st. 19-^12°, nous
avons mentionne que l'anomalie caudale se manifeste avec des frequences
variables selon la serie consideree, et que parmi les trois series analysees, deux
d'entre elles ne peuvent etre assimilees ni a la population des temoins eleves a
12 °C ni a celle des temoins eleves a 23 °C.
Pour la serie L ^ , le nombre de larves ne presentant pas d'anomalie caudale
Le role de la temperature
241
est tres superieur a celui de la serie temoin LOX (23 °C). Une remarque analogue
a ete faite lors de la comparaison du groupe 23°—st. 24->12° avec le groupetemoin a 23 °C.
(/?) Ascite cardiaque (5) et abdominale (6). La serie I ^ a reagi d'une part
comme la serie-temoin N 3 (12 °C), d'autre part, comme le groupe-temoin
eleve a 12 °C, ainsi que comme le groupe 23°—st. 19->12°.
Les resultats de la serie L±_3 concordent avec ceux obtenus pour le groupe
23°—st. 24->12°.
lei encore, au meme titre que le groupe 23°—st. 24-^12° differe des groupestemoins a 12 °C et a 23 °C, la serie Lx_3 differe egalement des series-temoins a
12 °C (N3) et a 23 °C (LOX) provenant de la meme femelle.
(c) Conclusion
Les series realisees a partir des pontes de la $ H-68-9 ont fourni des resultats
comparables a ceux qui se degagent de l'etude faite sur l'ensemble des femelles
(18 $ $ au total). Une analyse semblable a ete entreprise pour chacune de ces
femelles. Elle nous a montre que, si les pourcentages des phenotypes observes
apres un traitement thermique donne, peuvent varier d'une femelle a l'autre
(independamment de la lignee a laquelle elles appartiennent, qu'elle soit consanguine ou non) et d'une ponte a l'autre (meme quand celles-ci sont issues d'une
m6me femelle), les variations observees ne sont cependant pas quelconques:
on obtient toujours, par exemple, une majorite d'individus ayant soit une queue
recourbee apres elevage en eau froide, soit une queue rectiligne apres elevage
en eau plus chaude.
(4) Discussion
Les experiences de changement de la temperature d'elevage a des stades
varies du developpement embryonnaire nous ont ainsi permis de montrer qu'il
existe des stades au cours desquels un changement de temperature entraine des
modifications du phenotype chez les mutants ac/ac, et des stades critiques apres
lesquels ces modifications n'interviennent plus.
Ainsi, lorsque un transfert de 12 a 23 °C intervient au stade 18 ou a un stade
ulterieur, il n'est plus possible de modifier la morphologie ulterieure de la
queue, qui sera courbee vers le haut. Nous avons egalement mis en evidence
une difference d'expressivite de la mutation lorsque le choc thermique a lieu
aux stades 15 et 16.
La determination de la position plus ou moins anterieure des cloques d'ascite,
responsable d'une croissance normale ou anormale de la queue, varie suivant
les individus entre le stade 15 et le stade 18 de la neurulation.
Cependant, dans les experiences complementaires, e'est-a-dire pour les
changements de 23 a 12 °C, la periode thermosensible semble plus allongee et
se situer entre les stades 15 et 21. Insistons sur le fait que Panomalie de la
queue s'exprime dans les conditions naturelles, et que pour ce caractere la
16-2
242
M. FERNANDEZ ET J. C. BEETSCHEN
temperature elevee a un effet curatif. On peut des lors concevoir que la guerison
des germes soit un phenomene plus lent a obtenir.
En ce qui concerne les troubles physiologiques, aboutissant notamment a
l'accumulation de liquide dans la region cardiaque et dans 1'abdomen, nous
avons montre que ces derniers surviennent quand les embryons sont soumis a
la temperature la plus elevee jusqu'aux stades 24 ou 26.
Ainsi, avant meme que l'organogenese ne soit achevee, sont realisees les
conditions determinant des perturbations de la physiologie ulterieure de l'animal,
meme si celui-ci vit desormais a temperature basse.
L'ensemble des resultats obtenus nous permet, en outre, de supposer que la
temperature la plus basse a une action preponderate precoce, non seulement
sur la morphologie de la queue, mais aussi sur la morphologie cephalique. En
effet, si la chaleur parait n'avoir aucune action correctrice sur le futur phenotype
caudal a partir du stade 18 (voir 12°—st. 18 a st. 26-^23°), il semble par contre
que le froid puisse encore modifier le phenotype ulterieur de certains mutants au
stade 20 (voir 23°—st. 20->12°). De meme, si les futures anomalies 1, 5 et 6
(microcephalie, ascite cardiaque et ascite abdominale) ne sont plus accentuees
par la chaleur apres le stade 26 (voir 12°—st. 26-^23°, le pourcentage de larves
presentant ces anomalies est analogue a celui du groupe-temoin a 12°), le froid
semble encore avoir une action benefique apres ce stade: la frequence des larves
manifestant les anomalies citees est inferieure a celle du groupe-temoin maintenu
a 23 °C (voir 23°—st. 26->12°).
Au contraire, la temperature la plus elevee (23 °C) semble avoir un role plus
important que celui de la temperature la plus basse, en ce qui concerne les
anomalies circulatoires. Nous avons vu en effet (23°—st. 26->12°) qu'apres le
stade 26, le froid ne peut plus empecher la future anemie de se manifester; la
chaleur semble, par contre, avoir une action nocive apres ce stade (se referer
au groupe 12°—st. 26->23°, ou la frequence des individus totalement anemiques
est le double de celle observee chez le groupe-temoin eleve a 12 °C).
(C) Experiences de double changement de la temperature d'elevage
(1) Changements de 12 a 23 °C et a 12 °C
Ces resultats sont resumes dans le Tableau 6.
(a) Premiere experience: 12°—st. 20^23°—st. 24-*12°
Les larves observees presentent le plus souvent une morphologie cephalique
normale, leurs branchies ne sont que tres rarement atrophiees (3 %) et sont
meme normales ou subnormales chez 40 % d'entre elles. Generalement l'ascite
ne perturbe pas la morphologie des animaux car, lorsqu'elle est presente dans
la region cardiaque et l'abdomen (15 % des cas), l'accumulation de liquide y
est faible. Quant au phenotype de la queue, il est normal pour la quasi-totalite
12°—st.
12°—st.
12°—St.
12°—st.
20
21
22
23
-> 23°—st.
^23°—st.
^23°—st.
->23°—st.
24
26
26
26
Type d'experience
^12°
^12°
^12°
-> 12°
85
100
342
61
Nombre de
larves
observees
13,0+ 7,3
21,0± 8,1
23,7± 4,6
38,0±12,4
24,0± 9,3,
66,0± 9,5
59,3 ± 5,3
46,0±12,8
19,0± 8,5
81,0± 7,8
66,0± 5,1
75,0±ll,l
Absence
d'erythrocytes
Microcephalie branchiaux
Ascite caudale
(2)
(1)
2,0±3
ll,0±6,3
9,6±3,3
16,0±9,4
Croissance
anormale de
la queue
{4)
J5,0± 7,7
38,0± 9,7
32,2± 5,1
48,0±12,8
Ascite
cardiaque
Moyenne des pourcentages observes pour les differents caracteres ± 2<r
Tableau 6. Resultats des experiences de double changement de temperature de 12 a 23 °C et a 12 °C
15,0± 7,7
44,0± 9,9
48,4± 5,4
46,0±12,8
Ascite
abdominale
(6)
8-
244
M. FERNANDEZ ET J. C. BEETSCHEN
des individus. Precisons enfin que l'ascite se restreint a de toutes petites cloques
cm de simples traces dans la nageoire.
Cette serie s'avere done particulierement interessante: les caracteres specifiques
de la mutation ont disparu, apres Veclosion, dans la majorite des cas et, dans
rensemble, les individus sont moins anormaux que les temoins les moins anormaux
(ceux du groupe eleve a 12 °C).
(b) Deuxieme experience: 12°—st. 21^23°—st. 26-^12°
Les individus ayant subi un tel traitement ne sont assimilables a aucune des
populations-temoins.
En fait, si le pourcentage de larves microcephales n'est pas significativement
different de celui du groupe-temoin eleve a 12 °C (e = 1,24), les larves totalement
anemiques sont beaucoup plus nombreuses (deux-tiers des cas). Par contre la
morphologie caudale est normale chez la majorite des individus, comme chez
le groupe-temoin eleve a 23 °C (e = 1,78). Notons enfin que la frequence des
mutants presentant de l'ascite dans la region ventrale est intermediate entre
celles des deux populations-temoins elevees a 12 et a 23 °C.
(c) Troisieme experience: 12°—st. 22^23°—st. 26->12°
II est interessant de constater que la proportion de larves totalement anemiques, chez lesquelles aucun erythrocyte ne circule dans les branchies, est
semblable a celle relevee pour le groupe 12°—st. 22->23°. Tout se passe done
comme si le retour a 12 °C n'avait pas eu lieu ou, en d'autres termes, comme si
le froid n'exercait aucune action correctrice vis-a-vis de cette anomalie apres le
stade 26. Ceci est tout-a-fait en accord avec ce que nous avons remarque
precedemment pour les experiences ne faisant intervenir qu'un seul choc
thermique.
Les cloques presentes dans la nageoire sont de petite taille et les anomalies
caudales sont moins frequentes que chez les temoins les moins anormaux (9,6 %
contre 18,4 % chez le groupe-temoin eleve a 23 °C).
(d) Quatrieme experience: 12°—st. 23-^23°—st. 26->12°
La frequence des larves anemiques (46 %) est significativement plus faible
que celle de la serie 12°—st. 21-»23°—st. 26^12° (66 %), ou le sejour a 23 °C
commencait plus tot (e = 2,5).
II faut remarquer, ici encore, que la morphologie caudale n'a pas ete affectee
par le sejour initial a 12 °C. C'est pourquoi le resultat obtenu (16 % de larves a
queue anormale) est paradoxal compare a celui du groupe 12°—st. 23->23° ou
79,2 % des individus presentaient l'anomalie.
Le role de la temperature
245
(2) Changements de 23 a 12 °C et a 23 °C
Quatre experiences de ce type ont ete realisees: le transfert de 23 a 12 °C a
ete effectue au stade 19, 20, 21 ou 22 selon la serie, mais le deuxieme choc thermique a toujours eu lieu au stade 26.
Les resultats obtenus sont plus homogenes que ceux des experiences precedentes, bien que le nombre de larves observees dans chaque serie soit peu
eleve. Nous avons constate que, quelle que soit la duree du sejour a 12 °C, les
animaux observes au stade de la prise de nourriture, se presentent globalement
comme s'ils avaient constamment evolue a 18 °C, ce qui exprime Faction temporaire du froid sur un developpement se deroulant dans l'enserable a 23 °C.
Ainsi un sejour a 12 °C entre les stades 19 et 26 suffit pour accroitre considerablement le pourcentage d'anomalies de la croissance caudale par rapport
au groupe-temoin eleve a 23 °C. La frequence des individus a queue recourbee
(50 % des cas environ) est egalement superieure a celles observees chez des
embryons qui subissent uniquement le premier choc thermique (voir les resultats
des groupes 23°—st. 19 a 22-^12°, Tableau 4). Tout se passe done comme si le
ret our a 23 °C au stade 26 renforcait les effets du froid au lieu de les attenuer.
Mentionnons d'autre part que le pourcentage d'animaux presentant les
anomalies 5 et 6 est superieur a celui que Ton obtient quand le deuxieme
changement de la temperature n'intervient pas. L'ascite cardiaque et abdominale
est toutefois moins frequente que chez les germes eleves en permanence a 23 °C.
Le sejour a 12 °C presente done a cet egard une action preventive sur un certain
nombre d'individus.
L'anemie est egalement moins frequente que dans le groupe-temoin eleve a
23 °C, mais elle reste signincativement plus elevee que dans les groupes 23°—st.
19 a 22^12°.
]ci encore, les premiers stades posterieurs a la neurulation semblent done
thermosensibles, ce qui rejoint les observations faites a l'occasion des doubles
changements 12° ^23° ^12°.
(3) Discussion
Lorsque nous avons entrepris les experiences de double changement de la
temperature d'elevage, notre but etait de savoir si chaque choc a des effets
independants (ou non) de celui qui le suit ou qui l'a precede.
Pour essayer d'elucider ce probleme, nous nous sommes bases sur les resultats
des experiences faisant intervenir un seul choc thermique, et avons choisi les
stades de changement en consequence.
Rappelons que la periode thermosensible pour la morphologie caudale se
situe pendant la neurulation, entre les stades 15 et 18 (cf. experiences 12°->23°)
ou 15 et 21 (cf. 23° -^12°) selon le type de traitement; en ce qui concerne le
fonctionnement physiologique global apprecie par la presence d'ascite, la
periode comprise entre les stades 24 et 26 s'avere egalement critique.
246
M. FERNANDEZ ET J. C. BEETSCHEN
Ainsi, le premier choc thermique devait nous permettre de verifier si la position
de la cloque d'ascite etait reellement determined, et le deuxieme, si la determination de l'apparition de l'ascite cardiaque et abdominale etait definitive.
L'interpretation des resultats a ete faite par comparaison avec les groupestemoins et avec les experiences faisant intervenir un seul changement de la
temperature d'elevage a un stade correspondant.
(a) Morphologie caudale. Pour les changements 12°->23O-^12°, le premier
choc a toujours eu lieu a un stade posterieur a la periode sensible precedemment
mise en evidence. Des lors, nous nous attendions a trouver un phenotype caudal
correspondant au premier choc thermique, comme pour les groupes 12°—st.
20 a 23->23°. Les resultats obtenus sont tout-a-fait differents. Dans tous les
cas, le traitement initial a 12 °C ne parait avoir eu aucun effet sur la morphologie
ulterieure. La croissance caudale est en realite beaucoup moins anormale; la
chaleur exerce done un effet curatif.
Ainsi, les mutants de la premiere serie (Tableau 6) reagissent comme ceux du
groupe 23°—st. 24-^12° (second choc thermique), et pour les germes ac/ac des
deuxieme, troisieme et quatrieme series, tout se passe meme comme si leur
developpement s'etait deroule constamment a 23 °C.
Pour les changements 23°-^12°->23°, les phenotypes de la queue correspondent a ceux que Ton observe lorsque les individus evoluent constamment a
18 °C. Ici encore, les resultats semblent contradictoires avec ceux des groupes
23°->12° aux stades correspondants (premier choc thermique), comme nous
l'avons dit precedemment.
Si on effectue un seul changement de temperature, les effets de la deuxieme
temperature paraissent nuls apres un certain stade, que nous pouvons fixer
approximativement autour du stade 20. Mais si on revient a la temperature
initiale vers les stades 24-26, tout se passe comme si ce deuxieme traitement
annulait les effets du premier. On constate alors que, pour des germes se
developpant a 12 °C puis a 23 °C, le retour au froid permet aux effets de la chaleur
de se manifester et meme de se renforcer. Inversement, pour des germes qui se
developpent a 23 °C puis a 12 °C, le retour a 23 °C permet aux effets du froid
de se manifester. Rappelons que les effets respectifs du froid et de la chaleur
sont definis par le phenotype caudal largement dominant soit chez les temoins
maintenus constamment a 12 °C, soit chez ceux eleves en permanence a 23 °C.
Cet ensemble de resultats nous permet seulement de supposer que si la
determination de la position de la cloque d'ascite dans la nageoire est stabilised
a un stade precoce (en fonction de la temperature d'elevage initiale), elle n'est
pas pour autant irreversible, jusqu'a un stade un peu plus avance ou le bourgeon
caudal est deja nettement forme.
Cependant, cette constatation ne nous permet pas de comprendre pourquoi,
lorsque nous effectuons un changement de la temperature d'elevage de 23 a
12 °C au stade 26, stade ou le phenomene est le plus frappant, la frequence des
larves a queue normale (99,1 %) est tres superieure a celle que Ton observe
Le role de la temperature
247
chez les temoins eleves a 23 °C (81,6 %). On retrouve ici un phenomene paradoxal: le passage au froid regularise mieux la croissance caudale que ne peut
le faire la chaleur seule, alors que, agissant plus tot ou exclusivement, le froid
entraine au contraire des effets diametralement opposes. Cette action s'exerce
evidemment en premier lieu sur l'accumulation d'ascite dans l'epiderme caudal,
mais ce phenomene physiologique obeit manifestement a un determinisme
d'allure assez deroutante.
Nous pouvons comparer une telle complexite a celle qui parait presider au
determinisme de la differentiation des gonades chez les Drosophiles triploides
intersexuees, etudiees par Lauge (1969). Des traitements a 30 °C pendant 24 h
provoquent une feminisation des gonades lorsqu'ils sont appliques au moment
de la vie embryonnaire et, pour l'une des deux souches utilisees (la souche
principale) egalement a la fin de la vie pupale. L'auteur n'avance pas d'hypothese
permettant d'interpreter l'augmentation de la frequence des individus a ovaires
au cours de la phase pupale, puisque 'la determination des gonades semble tres
tot definitive (premieres divisions nucleaires)'. Ici aussi une determination
precoce semble sujette a des exceptions.
(b) Ascite caudale. Elle est le caractere le plus specifique de la mutation, et
nous venons de voir que son accumulation obeit a un determinisme tres
complexe.
Nous avons note qu'il n'existe pas de rapport etroit entre l'aspect de la
queue et l'importance quantitative des cloques; c'est la position de ces dernieres
qui semble avoir le role le plus important et qui est modifiee par la temperature.
Nous avons cependant remarque que le caractere est presque inexistant chez
les 19 % de larves qui en sont atteintes dans la serie 12°—st. 20->23°—st.
24-^12°, de meme que chez les 17 % de larves du groupe 23°—st. 26->12°.
La physiologie des mutants semble done pouvoir subir des effets correcteurs
pousses de la part des changements de temperature.
(c) Microcephalie, anemie, ascite cardiaque et ascite abdominale. Ces caracteres
s'averent n'etre que des consequences secondaires de la mutation. On observe
d'ailleurs de tels syndromes chez les mutants r\r et eje d'Axolotl (Humphrey,
1964, 1972).
La frequence des larves totalement anemiques augmente lorsque la duree du
sejour a 23 °C apres la neurulation s'accroit. La difference observee est en effet
significative si Ton compare les resultats des series
12°—st. 23^23°—st. 26^12° (46 %)
et
12°—st. 21 -^23°—st. 26^12° (66 %)
11 en est de meme dans les experiences complementaires:
23°—st. 19^12°—st. 26^23° (45 %)
et
23°—st. 22^12°—st. 26-^23° (62 %).
248
M. FERNANDEZ ET J. C. BEETSCHEN
Ces observations sont egalement valables pour les anomalies cephaliques.
En ce qui concerne l'ascite cardiaque et abdominale, les frequences obtenues
lors des experiences 23° ->12°->-23° sont superieures a celle des groupes 23°—st.
19 a 22->12° et 12°—st. 26^23° mais inferieures a celle des temoins a 23 °C.
Le sejour a temperature basse entre les stades 19 et 26 diminue done la gravite
de l'ascite ulterieure.
Correlativement, les pourcentages de ces anomalies dans les experiences
complementaires 12° -^23° -^12° sont inferieurs a ceux que Ton observe pour
les groupes 12°—st. 20 a 23^23° et 23°—st. 24 ou 26->12°, mais superieurs a
ceux des temoins maintenus constamment a 12 °C, sauf pour la premiere serie.
La chaleur joue done un role entre les stades 20 et 26 en favorisant l'apparition
ulterieure d'ascite.
Ainsi, la conclusion que nous avons tiree apres les experiences 23°->12° et
12° ->23° se trouve done precisee.
II faut souligner que les resultats de la serie 12°—st. 20^23°—st. 24->12°
sont particulierement interessants, car les caracteristiques essentielles de la
mutation ont disparu chez la majorite des larves.
Des lors, l'idee d'une guerison possible des germes par un traitement thermique approprie (par exemple 12°—st. 18->23°—st. 24->12°) n'est pas a
ecarter.
DISCUSSION GENERALE ET CONCLUSION
Le phenotype des mutants ac/ac varie selon le type de traitement thermique
qu'ils ont subi et le stade de developpement auquel il est applique.
Dans un premier temps, nous avons montre qu'il existe des phases thermosensibles entrainant des modifications du phenotype, grace aux experiences
faisant intervenir un seul changement de la temperature d'elevage, de 12 a
23 °C ou de 23 a 12 °C. La periode au cours de laquelle il est possible de determiner la morphologie ulterieure de la queue correspond a une grande partie de
la neurulation (stades 1 5 a l 8 o u l 5 a 2 1 selon la temperature appliquee).
Quand les germes sont soumis au changement de temperature apres la neurulation, ils presentent aux stades 37-38 un phenotype caudal correspondant a celui
qu'on observerait si on avait maintenu les embryons a la premiere temperature
d'elevage pendant toute la duree de leur developpement. La frequence des
larves a queue rectiligne dans le groupe transfere de 23 a 12 °C au stade 26, est
meme tres superieure a celle qu'on trouve pour les mutants temoins eleves
constamment a 23 °C: ce phenomene apparait comme assez paradoxal, la
temperature la plus basse ayant un effet inverse lorsqu'elle agit seule pendant
tout le developpement.
La localisation ou l'absence finales de la cloque d'ascite dans la nageoire
caudale, responsables de la morphologie observee, semblent done definitivement
determinees pendant la phase terminale de la neurulation. L'accumulation ou
l'absence d'accumulation de liquide ascitique dans la cavite pericardique et
Le role de la temperature
249
l'abdomen paraissent de meme etre soumises a un determinisme precoce, bien
que plus tardif que le precedent, et ne pas dependre de la temperature a laquelle
vit 1'embryon aux stades ou le fonctionnement des appareils circulatoire et
excreteur est pleinement assure.
Mais, dans un deuxieme temps, les resultats des experiences de double
changement de temperature, qui avaient pour but d'eprouver l'independance
des effets des deux chocs thermiques, ont dementi en partie ces conclusions.
Nous sommes des lors amenes a penser que, si la determination precoce de la
position de la cloque d'ascite est stable dans des conditions de temperature
donnees, elle n'est pas pour autant irreversible. On observe ici des effets qu'on
peut qualifier de paradoxaux, en attendant de leur trouver une explication
satisfaisante.
Si la methode des chocs thermiques appliques a des mutants thermosensibles
'permet de provoquer ou d'enrayer a volonte les effets de genes lethaux et de
dresser eventuellement la chronologie de leurs periodes d'action et de leurs
consequences sur le developpement', chez les microorganismes et la Drosophile
(Fraser, 1970), les problemes poses semblent done moins faciles a resoudre
quand on considere une mutation thermosensible semi-lethale chez un Vertebre.
La determination embryonnaire, quand elle implique des processus d'ordre
essentiellement physiologique, apparait comme tres complexe. II reste en tout
cas acquis que l'expression de diverses anomalies physiologiques chez les
mutants acjac, a un stade avance du developpement, se trouve sous la dependance de phenomenes qui se deroulent beaucoup plus tot chez 1'embryon et
qu'on peut influencer de maniere durable en modifiant la temperature a laquelle
se developpe celui-ci pendant une phase donnee.
Les effets anemiants d'une temperature elevee agissant aux premiers stades
qui suivent la neurulation, e'est-a-dire lors de la formation de l'ilot sanguin,
pourront en particulier faciliter l'etude experimental des manifestations de ce
caractere. Des recherches anterieures ont deja montre que cette anemie est
transmissible par parabiose a des embryons normaux, soit de la meme espece,
soit d'Axolotl, et qu'un facteur diffusible anti-erythrocytaire existe probablement chez les embryons mutants (Jaylet, Beetschen & Deparis, 1970;
Fernandez & Beetschen, 1973).
RESUME
1. Chez le Pleurodele, un fort pourcentage (79 %) de larves homozygotes acjac presenters
au stade 38 (prise de nourriture) une queue recourbee par suite de la presence d'une cloque
d'ascite dans la region dorsale de la nageoire, quand le developpement embryonnaire s'est
deroule a 12°C; 25% environ d'entre elles sont affectees par de l'ascite abdominale et
pericardique et environ 40 % peuvent se nourrir et survivre. Le phenotype larvaire est tres
different quand le developpement s'est effectue a 23 °C; dans ce cas, la croissance de la queue
est normale, mais 95 % des larves sont lethales, en raison de l'accumulation de liquide
ascitique dans la cavite abdominale et la region cardiaque, d'une forte anemie et de microcephalie.
2. L'echange de la plaque neurale posterieure et de l'epiderme dorso-lateral entre des
250
M. FERNANDEZ ET J. C. BEETSCHEN
neurulas normales et mutantes a montre que la localisation de la cloque dans la nageoire
dorsale n'est pas la consequence de proprietes intrinseques des tissus mutants dorsaux,
mais doit etre considered comme le resultat de troubles physiologiques generaux affectant
l'organisme des mutants.
3. On a effectue des experiences impliquant l'intervention d'un changement de temperature,
de 12 a 23 °C ou de 23 a 12 °C, a divers stades du developpement, de la fin de la gastrulation
(st. 13) a l'apparition des contractions musculaires spontanees (st. 26). Quand le changement
intervient apres la fin de la neurulation (st. 21), le phenotype caudal est statistiquement
semblable a celui de larves qui avaient ete elevees en permanence a la premiere temperature
utilisee. On a pu ainsi caracteriser des phases thermosensibles, entre les stades 15 et 18 de la
neurula (pour un passage de 12 a 23 °C) ou entre les stades 15 et 21 (pour un passage de
23 a 12°C). De meme, on peut induire l'apparition d'ascite abdominale quand on maintient
les embryons a 23°C jusqu'au stade 23 seulement (jeune bourgeon caudal); cette ascite survient au contraire beaucoup moins frequemment quand on maintient les embryons a 12°C
jusqu'au stade 23 avant de les transferer a 23 °C.
4. On a pu conclure de ces experiences que le phenotype caudal des mutants est deja
determine par la temperature pendant la neurulation, avant le stade 21. Neanmoins, des
experiences de double changement de la temperature d'elevage ont demontre que le deuxieme
changement modifie les resultats que Ton devrait obtenir si le premier changement seulement
avait ete effectue. On a ainsi obtenu des resultats paradoxaux, plus de 90 % des phenotypes
caudaux etant du type 'chaud' quand les embryons avaient d'abord ete maintenus a 12°C,
puis a 23 °C entre les stades 22 et 26, puis de nouveau a 12°C. Un tel traitement abaisse
fortement le pourcentage de queues recourbees ('type froid') qui devrait etre obtenu si les
embryons acjac etaient maintenus en permanence a 23 °C apres le stade 21, ce traitement
plus long par la chaleur restant lui-meme sans effet par comparaison avec les resultats obtenus
quand le developpement se deroule entierement a 12°C (queues recourbees predominates
dans ce dernier cas).
Done, si on peut considerer que la determination precoce de la position de la cloque
caudale est un phenomene stable dans des conditions donnees de temperature, elle n'est
pas pour autant irreversible.
5. Par comparaison avec les larves elevees au froid, on a obtenu trois fois plus de larves
ac/ac completement anemiques (66 %) a partir d'embryons maintenus a 23 °C entre les stades
21 et 26, ce qui offre un moyen d'etude experimentale de cette anemie.
6. On suggere diverses implications de ces resultats pour l'analyse ulterieure de mutations
thermosensibles chez les Vertebres poiikilothermes.
Nous remercions vivement M. Le Professeur L. Bonnet, du Laboratoire de Biologie
quantitative de l'Universite Paul Sabatier, pour les conseils qu'il nous a aimablement fournis
dans le choix des methodes statistiques utilisees.
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{Received 4 February 1975, revised 13 March 1975)