/. Embryo/, exp. Morph. Vol. 33, 4, pp. 1051-1066, 1975
1051
Printed in Great Britain
Effets biologiques de solutions de
proteines chromatiniennes non histoniques sur un
systeme embryonnaire en differentiation in vitro
Par C. MATHIEU, 1 A.M. DUPRAT, 2 M. H. DUPUY, 1
P.FERRER, 1 J. P. ZALTA 1 ET J. C. BEETSCHEN 2
Institut de Biochimie et de Genetique cellulaires du C.N.R.S. et
Laboratoire de Biologie generate, Universite Paul-Sabatier, Toulouse, France
SUMMARY
Biological effects of solutions of non-histone chromatin-associated proteins
on cell differentiation in vitro
Nuclear non-histone (NNH) proteins, both chromatin-associated and otherwise, have been
prepared in defined conditions, either from nuclei or from washed chromatin. When these NNH
proteins are homospecific, they produce inhibitory effects on morphological differentiation
of embryonic Urodelan Amphibian cells cultivated in vitro. When they are heterospecific,
on the contrary, they have no action on the differentiation of those cells. It is concluded
that the effects of the non-histone proteins on cell differentiation depend upon the
relationship between the animal species which is used to provide the proteins and that used
to provide the reactive material.
INTRODUCTION
L'etude de proteines chromatiniennes non histoniques (PCNH) presente
actuellement un grand interet du fait du role important, encore mal connu,
qu'elles jouent dans la regulation de l'expression genique chez les Eucaryotes
(McClure & Hnilica, 1972; Stein, Spelsberg & Kleinsmith, 1974). Par des
techniques de reconstitution de chromatine et d'hybridation moleculaire, Paul
& Gilmour (1968), Axel, Cedar & Felsenfeld (1973) ont montre l'existence d'une
specificite tissulaire de Faction des proteines chromatiniennes non histoniques
(PCNH) sur la transcription. Kostraba & Wang (1970), Teng, Teng & Allfrey
(1971), Spelsberg, Hnilica & Ansevin (1971), Kamiyama & Wang (1971) ont
mis en evidence une stimulation des syntheses de RNA par les proteines non
histoniques dans des systemes chromatiniens isoles. De plus, on sait d'apres les
travaux de Teng et al. (1970), Kleinsmith, Heidema & Carrol (1970), que certaines
de ces proteines se lient plus fortement au DNA et que leur synthese varie au
cours du cycle cellulaire (Stein & Baserga, 1970; Stein & Borun, 1972).
1
Adresse des auteurs: Institut de Biochimie et de Genetique du C.N.R.S., Universite Paul118, route de Narbonne, 31077 Toulouse Cedex, France.
Sabatier,
2
Adresse des auteurs: Laboratoire de Biologie generate, Universite Paul-Sabatier, 118,
route de Narbonne, 31077 Toulouse Cedex, France.
1052
C. MATHIEU AND OTHERS
Toutefois s'il semble maintenant que Ton puisse attribuer a certaines proteines
non histoniques un role de controle dans l'expression genique, elles representent
un systeme complexe dont l'analyse et l'etude des mecanismes d'action restent
a faire. Les travaux precedemment cites realises sur des systemes chromatiniens
montrent le role des differentes proteines restructures au sein de la chromatine.
Une des rares etudes in vivo de ces proteines est celle effectuee par Tuan, Smith,
Folkman & Merler (1973) montrant qu'une fraction de proteines nucleaires non
histoniques isolee d'un carcinome de rat provoque une activite mitotique
importante des cellules endotheliales de la cornee de lapin.
Pour notre part, etant donne qu'au cours d'une precedente experimentation
nous avons mis en evidence un effet inhibiteur des PCNH issues d'un tissu
heterologue sur la differenciation d'un systeme embryonnaire (Mathieu, Duprat,
Zalta & Beetschen, 1972) il devenait interessant d'etudier les effets biologiques
de PCNH homospecifiques et heterospecifiques sur la differenciation de ces
cellules.
MATERIEL ET METHODES
Le foie nous a paru etre un materiel convenable pour extraire les proteines
chromatiniennes non histoniques (PCNH) d'un tissu differencie. Nous les avons
done isolees de cellules hepatiques d'Amphibien adulte (pleurodele, axolotl,
grenouille), de Mammifere (rat), et de cellules de l'hepatome ascitique de
Zajdela.
Les noyaux sont obtenus selon une technique mise au point au laboratoire
(Zalta, Zalta & Simard, 1971). Les PCNH sont isolees a partir de chromatine non
lavee, d'apres la methode de Wang (1967) modifiee par Kruh, Tichonicky &
Wajcman (1969). Nous avons aussi procede a une extraction des PCNH a partir
de chromatine lavee dans une solution tampon tris-HCl 0,05 M (pH 7,4).
Ces proteines constituent un groupe heterogene designe dans le texte par:
PCNH totales. Leur dosage est effectue par la methode de Lowry, Rosebrough,
Farr & Randall (1951), en utilisant la serumalbumine comme standard. Un
premier fractionnement par precipitations successives a differents pH selon la
technique de Wang (1967), a permis de separer les 4 fractions: f, RNP; f, PH:6;
f, PH:5; et f, SO4(NH4)2 (Wang, 1967).
Les PCNH totales et leurs fractions ont ete analysees par electrophorese selon
la methode de Davis (1964) en gels d'acrylamide a 8,4%, 0,1 % de sodiumdodecyl-sulfate et 4 M uree. La solution-tampon d'electrophorese est composee
de Tris 0,025 M et glycocolle 0,2 M a pH 8,3.
Le marquage des PCNH est realise suivant la technique de David (1972)
modifiee pour l'adapter a notre materiel. Les PCNH sont iodees par l'lode 125
a l'aide de lactoperoxydase fixee sur Sepharose 4B active par du bromure de
cyanogene (Cuatrecasas, 1970). La reaction s'effectue sous agitation a 18 °C
pendant 8 a 10 minutes; en fin de reaction on elimine l'enzyme fixee, par centrifugation et Fiode non fixe aux proteines, par chromatographie sur Sephadex G15.
Effets de proteines chromatiniennes non histoniques
1053
Les cellules embryonnaires provenant de la plaque neurale et du chordomesoderme sous-jacent d'embryons de Pleurodeles waltlii, stade 14, de la table
chronologique de Gallien & Durocher (1957), et d'Ambystoma mexicanum au
stade correspondant, sont cultivees isolees selon une technique precedemment
decrite (Duprat, Zalta & Beetschen, 1966). Les cellules determinees mais non
encore morphologiquement differenciees appartiennent a differentes categories:
il s'agit essentiellement de cellules nerveuses, musculaires, epitheliales et pigmentaires qui se differencient simultanement dans la meme chambre de culture.
Apres fixation par les liquides de Zenker, Helly, Champy ou les vapeurs
osmiees, des colorations cytologiques et cytochimiques appropriees nous ont
permis de mettre en evidence divers constituants cellulaires: colorations au
violet cristal de Benda, a la fuchsine d'Altmann (chondriome), au vert solide
d'Alfert et Geschwind a pH: 8,2 (proteines basiques) et a pH: 2,4 (proteines
acides), au vert de methyle-pyronine de Unna (RNA, DNA), au Feulgen (DNA),
au Noir Soudan et Rouge Soudan III (lipides) et Bleu de Nil (lipides acides)
(Gabe, 1968).
Pour l'etude ultrastructurale, le materiel cellulaire est fixe in situ au formol
neutre a 5 % dans une solution-tampon-phosphate de Sorensen (pH: 7,4), postfixe au tetroxyde d'osmium a 1 % dans la meme solution-tampon. Apres inclusion dans l'Epon, des coupes sont effectuees a l'aide d'un microtome Reichert,
colorees selon la technique de Reynolds (1963) et observees au microscope
Hitachi HU 11 sous 100 kV.
Techniques autoradiographiques
(1) Les experiences d'incorporation sont realisees en procedant a une incubation des cellules pendant 1 h en presence des precurseurs radioactifs (CEA,
Saclay): uridine tritiee (activ. specif.: 21 Ci/mM) pour le RNA; leucine tritiee
(activ. specif.: 18 Ci/mM) pour les proteines, avec une activite finale pour chacun
des precurseurs de 5 /*Ci/ml de milieu de culture.
Les lamelles de culture sont alors detachees de la chambre, le milieu radioactif
elimine, les cellules fixees par le melange de Carnoy, puis lavees dans un milieu
froid. Les lamelles sechees sont montees sur lames gelatinees.
(2) Pour l'etude de la penetration des PCNH dans les cellules, celles-ci sont
incubees pendant des durees variant de 3 h 30 a 16 h en presence des PCNH
iodees. Apres plusieurs lavages, elles sont fixees par une solution de formol
neutre a 5 % dans le tampon phosphate de Sorensen (pH: 7,4), puis lavees dans
plusieurs bains de solution-tampon pendant 48 h et post-fixees par le tetroxyde
d'osmium. Apres des deshydratations dans l'ethanol, les cellules sont incluses
dans l'Epon. Des coupes de 1500 A sont montees sur lames gelatinees.
L'emulsion Ilford L 4 est coulee directement sur les preparations en une
couche de 30 /mi d'epaisseur apres sechage, exposee a l'abri de la lumiere a 4 °C
et en atmosphere deshydratee pendant un temps approprie.
L'observation des autoradiographies est effectuee en microscopie photonique.
1054
C. MATHIEU AND OTHERS
RESULTATS
Etude des effets des PCNH
Nous avons effectue trois types d'experiences:
(1) Combinaisons homospecifiques: les cellules de pleurodele sont traitees
par des PCNH de pleurodele, de meme que les cellules d'axolotl sont traitees par
des PCNH d'axolotl.
(2) Combinaisons heterospecifiques: les cellules de pleurodele et d'axolotl
sont traitees par des PCNH de rat et de grenouille.
(3) Combinaisons heterospecifiques croisees entre deux especes proches: les
cellules de pleurodele sont traitees par des PCNH d'axolotl et les cellules d'axolotl
sont traitees par des PCNH de pleurodele.
Les concentrations utilisees sont comprises entre 30 /.ig et 100 ^g/ml de milieu
de culture. Des concentrations inferieures a 30 /tg/ml sont sans action apparente
sur le comportement et revolution des cellules traitees; par contre, des concentrations superieures a 100 /*g/ml entrainent une degenerescence rapide de tous
les types de, cellules traitees qui traduit une cytotoxicite non specifique.
Ainsi done, nous avons retenu pour nos experiences ulterieures une concentration moyenne de 50 /*g/ml qui permet une survie normale des cellules.
Plusieurs modes de traitement des cellules par la solution de PCNH ont ete
utilises. Quand le traitement par des PCNH homospecifiques ou heterospecifiques debute lors de leur mise en culture, le pourcentage de cellules qui s'etalent
sur le fond de la chambre par rapport au nombre total de cellules mises en
culture est tres faible. Pour ces raisons nous avons adopte un deuxieme mode de
traitement, qui consiste a trailer les cellules immediatement apres leur etalement,
soit avant que la differentiation morphologique n'apparaisse, soit apres que
celle-ci a debute. La duree du traitement varie de quelques heures (1,3, 6, 8,16 h)
a plusieurs jours (traitement continu). Ce travail a necessite 50 series experimentales comportant environ 1000 cultures traitees et autant de cultures temoins.
Chaque culture est constitute de plusieurs centaines de cellules parmi lesquelles
10 % approximativement sont des neurones (Duprat, 1910 a, b). Ces derniers
ne sont reconnaissables qu'apres differenciation morphologique.
I. Effets des proteines homospecifiques sur des cellules embryonnaires de pleurodele
(a) Lorsque des cellules morphologiquement indifferenciees de pleurodele sont
traitees par des PCNH totales de pleurodele la differenciation des cellules
attachees est fortement perturbee ou totalement inhibee. Le traitement empeche
toute differenciation de neuroblastes alors qu'il ne fait que retarder de deux a
trois jours celle des myoblastes (Fig. 3). D'autre part, si le traitement debute
lorsque les cellules ont deja amorce leur differenciation morphologique, les
prolongements axoniques des neurones degenerent rapidement (Figs. 4, 5), le
retard a la differenciation myofibrillaire etant dans ce cas pratiquement inexistant.
Excepte pour une duree de traitement de 1 h qui n'affecte pas revolution des
Effets de proteines chromatiniennes non histoniques
1055
Photographies effectuees sur le vivant en contraste de phase.
Fig. 1. Cellule musculaire temoin de Pleurodele, differenciee en culture in vitro.
Fig. 2. Myoblaste de Pleurodele traite avant sa differenciation morphologique par
des proteines acides d'hepatome ascitique de Rat (50 /ig/ml).
Fig. 3. Myoblaste de Pleurodele, traite avant l'apparition de sa differenciation
morphologique par des proteines acides de foie de Pleurodele (50/tg/ml); la striation
myoftbrillaire est apparue.
Fig. 4. Neurone temoin de Pleurodele presentant un axone en cours de formation.
Fig. 5. Terminaison axonique d'un neurone de Pleurodele, traite par des proteines
acides de foie de Pleurodele (50 /Wg/ml). Le traitement qui a debute alors que la
differenciation morphologique du neurone etait deja amorcee, entraine la degenerescence de la cellule.
ax, axone; cc, corps cellulaire; my, myofibrilles striees; N, noyau; v, vacuoles.
1056
C. MATHIEU AND OTHERS
diverses categories cellulaires, les resultats obtenus sont comparables quelle que
soit la duree du traitement (3 h, 6 h, 8 h, 16 h ou plusieurs jours).
(b) De nombreux auteurs (cf. Stein et al. 1974) ont montre que les PCNH sont
tres heterogenes et presentent une specificite tissulaire et une specificite liee
a l'espece.
Le grand nombre et la quantite de proteines de faibles poids moleculaires
observes sur les electrophoregrammes de PCNH issues de foie d'axolotl et de
pleurodele rendent difficile la comparaison entre ces deux especes. Les electrophoregrammes ne paraissant pas presenter de differences fondamentales, il est
possible que la specificite des effets observes soit liee a des fractions mineures qui
ne peuvent etre clairement mises en evidence par la technique electrophoretique
utilisee.
Des differences apparaissent plus nettement quand on compare les electrophoregrammes de PCNH de foie d'Urodeles et ceux de foie de Rat. Des essais
preliminaires de fractionnement chimique (cf. Materiel et techniques) et l'etude
des quatre fractions obtenues montrent que l'effet sur la differentiation morphologique est lie a une seule fraction: f. SO4(NH4)2. Comme les electrophoreses en
gels de polyacrylamide permettent de le constater, cette fraction est encore tres
heterogene, la plus grande partie des bandes observees sur les electrophoregrammes des PCNH totales s'y retrouvent.
(c) Controles. Pour s'assurer qu'il s'agit d'une action par les proteines ellesmemes, nous avons verifie que, utilisee seule, la solution-tampon Tris HC10,05 M
a pH: 8,5 dans laquelle les proteines sont solubilisees est inactive sur le materiel
biologique. Un dosage du DNA dans la solution des PCNH totales par la
technique de Giles & Myers (1965) par reaction avec la diphenylamine permet de
conclure, dans les limites de la sensibilite de la technique, a la non-contamination
par le DNA. Un dosage du RNA a l'orcinol de cette meme solution a montre
une contamination variable de RNA (12 a 14 %).
Cependant ce RNA peut etre elimine par hydrolyse. La solution de PCNH
a alors ete incubee pendant 1 h a 37 °C en presence de RNase (RNase A
(Worthington) + RNase T (Sigma))fixeesur sepharose (Cuatrecasas, 1970). Dans
ces conditions les PCNH ainsi debarrassees du RNA (et sans contamination
par la RNase), produisent les memes effets biologiques, ce qui laisse penser que
le RNA qui la contamine n'est probablement pas en cause.
La fraction active f: SO4(NH4)2 provoque les memes effets que les PCNH
totales. 11 etait important de controler si cette fraction n'etait pas contaminee
par des histones. Or cette fraction precipitee a un pH de 1,2 s'est revelee etre
toujours biologiquement active. II semble done peu probable que le precipite
actif soit constitue d'histones. Par ailleurs des experiences de combinaisons entre
les PCNH et des histones sont en cours. Les premiers resultats obtenus dans des
conditions de concentrations ou les histones seules n'agissent pas, laissent
penser que les effets observes ne sont pas ceux de complexes PCNH-histones,
bien que cette eventualite ne puisse etre totalement exclue.
Effets de proteines chromatiniennes
non histoniques
1057
II. Effets des proteines heterospecifiques sur des
cellules embryonnaires de pleurodele
Lorsque des cellules de pleurodele sont cultivees (selon les modalites experimentales decrites) dans un milieu contenant des PCNH totales extraites
d'hepatome ascitique ou de foie de rat, espece zoologiquement tres eloignee,
ou meme de foie de grenouille, espece plus proche, nous constatons que leur
differenciation morphologique se deroule normalement sans aucun retard par
rapport aux cellules temoins (Fig. 2). Des resultats semblables sont encore
obtenus si les cellules de pleurodele sont traitees par les PCNH de foie d'axolotl,
espece beaucoup plus voisine du pleurodele que les precedentes, mais appartenant cependant a une famille differente.
III. Extension de Vetude de Vaction des proteines heterospecifiques
et homospecifiques a des cellules embryonnaires d'axolotl
Afi.n de savoir si l'effet perturbateur sur la differenciation etait lie a des
proprietes particulieres des PCNH de pleurodele, nous avons etudie Faction de
ces proteines sur des cellules embryonnaires d'axolotl. Dans ce cas, ces cellules
se sont differenciees normalement. D'autre part, traitees dans des conditions
identiques par les PCNH de foie de rat ou de grenouille, ces cellules d'axolotl
se differencient comme le font les cellules de pleurodele en presence de proteines
heterospecifiques et les observations precedentes peuvent leur etre appliquees
(schema 1). Au contraire les cellules embryonnaires d'axolotl traitees par les
PCNH de foie d'axolotl presentent les memes perturbations de leur differenciation que les cellules de pleurodele traitees par les PCNH de pleurodele.
Ainsi done, seules les PCNH extraites defoie de pleurodele perturbent profondement la differenciation des cellules de pleurodele et seules les PCNH extraites
de foie d'axolotl perturbent la differenciation des cellules d'axolotl.
Par consequent, il semble que l'effet inhibiteur des PCNH sur la differenciation morphologique des cellules embryonnaires d'Amphibiens soit bien lie
a l'espece utilisee a la fois comme source de proteines et comme materiel
reactif (schema 1).
PCNH de foie de:
Neuroblastes de:
_ - -»- Pas d'effet
Pleurodele
r
*- Pleurodele
\?
Axolotl
s'
*•
""V
i»-
Axolotl
•<^"""""""
^ > Inhibition de la croissance
^*^^
des axones
«<rC.
Pas d'effet
Effets des proteines homospecifiques
Effets des proteines heterospecifiques
Schema 1. Experiences sur deux especes d'amphibiens.
1058
C. MATHIEU AND OTHERS
IV. Effets cytologiques
Sous l'action du traitement, quel que soit le type de proteines utilisees,
homospecifiques ou heterospecifiques, des alterations morphologiques identiques
se manifestent. Elles sont de deux sortes; les unes peuvent etre aussi bien observees sous l'action de divers autres traitements: telles sont les modifications de
la morphologie mitochondriale (Fig. 7) l'heterogeneite nucleaire ou l'alteration
nucleolaire (Fig. 8); les autres semblent particulieres aux PCNH, telle l'apparition d'inclusions cytoplasmiques fortement contrastees, dans les myoblastes
principalement (Fig. 9).
Une etude ultrastructurale nous a permis de detecter un effet sur les mitochondries qui pour certaines, presentent une disparition presque totale des cretes
mitochondriales (Fig. 12); de meme le reticulum endoplasmique des cellules
traitees est fortement dilate et plus particulierement dans la zone perinucleaire
(Figs. 10, 11).
Dans le cas des PCNH homospecifiques, les effets cytologiques apparus sous
l'action de la fraction active seule sont moins marques que ceux provoques par
les PCNH totales. De plus, que les PCNH soient directement extraites selon la
methode de Wang ou a partir de chromatine isolee de noyaux ouverts dans la
solution tris-HCl, ces deux types d'effets biologiques sont les memes.
V. Effets sur les syntheses de RNA et de proteines
Afin de savoir si le traitement par les PCNH homospecifiques entraine des
perturbations des syntheses globales des RNA et des proteines cellulaires,
nous avons fait des incorporations d'uridine et de leucine tritiees. Avant que
n'apparaisse la differentiation morphologique, les cellules sont traitees pendant
24 a 48 h par les PCNH homospecifiques a la concentration active ou par les PCNH
heterospecifiques a la meme concentration, puis incubees pendant 1 h en presence
d'uridine tritiee et de PCNH homospecifiques ou heterospecifiques. Les cellules
temoins sont incubees en meme temps en presence d'uridine tritiee seulement.
Une analyse statistique du marquage, portant pour chacune des series traitee et
temoin sur 200 noyaux repartis en quatre cultures, est effectuee. L'utilisation du
test de Mann-Whitney nous a permis de montrer qu'il n'y a pas de difference
significative entre les taux d'incorporation dans les cellules traitees et dans les
cellules temoins. De meme, on ne decele pas de difference significative entre le
marquage des cellules traitees par les PCNH homospecifiques et celui des cellules
traitees par les PCNH heterospecifiques (Tableau 1).
II n'y a pas non plus de difference significative dans le marquage des cellules
traitees et temoins incubees en presence de leucine tritiee.
VI. Etude de la penetration des PCNH
Dans le but de mieux analyser les effets observes, il est fondamental de savoir
si les PCNH penetrent dans la cellule. Les autoradiogrammes de cellules traitees
Effets de proteines chromatiniennes non histoniques
1059
Photographies effectuees sur Je vivant en contraste de phase.
Fig. 6. Cellule temoin de Pleurodele presentant un noyau d'aspect homogene et un
chondriome constitue de filaments courts et flexueux.
Fig. 7. Cellule de Pleurodele traitee par des PCNH de foie de Pleurodele (50 /tg/ml),
chondriome constitue de filaments longs et anastomoses.
Fig. 8. Noyau de cellule de Pleurodele traitee par des PCNH de foie de Pleurodele
(60/<g/ml); chromatine en amas tres contrasted, morphologie nucleolaire alteree,
epaississements importants de la membrane nucleaire.
Fig. 9. Inclusions cytoplasmiques apparues dans une cellule de Pleurodele traitee par
des PCNH de foie de Pleurodele (50 /^g/ml). Chondriome enfilamentstres allonges.
ch, chondriome; chr, chromatine; /, inclusions cytoplasmiques; mn, membrane
nucleaire; N, noyau; n, nucleole; pv, plaquettes vitellines.
66
EMB 33
1060
C. MATHIEU AND OTHERS
Fig. 10. Cellule de Pleurodele traitee par une solution de PCNH heterospecifiques
(les solutions de PCNH homospecifiques ou heterospecifiques produisent les memes
effets). Reticulum endoplasmique tres dilate.
Fig. 11. Cellule de Pleurodele traitee par une solution de PCNH. Reticulum endoplasmique granulaire tres dilate.
Fig. 12. Mitochondries d'une cellule de Pleurodele traitee. Disparition d'une partie
des cretes mitochondriales.
Fig. 13. Mitochondries d'une cellule de Pleurodele non traitee. Reticulum endoplasmique normal.
RE, reticulum endoplasmique; m, mitochondrie; TV, noyau.
Effets de proteines
chromatiniennes
non histoniques
1061
Tableau 1. Incorporation de [3H]uridine par des cellules traitees et temoins
Cultures temoins
Moyenne des observations
effectuees par noyau sur
chaque culture temoin (xlti)
Nombre d'observations
36,48
36,74
43,86
35,10
50
50
50
50
38,00
35,52
50
50
32,16
34,32
50
50
Cultures traitees PCNH homospecifiques
33,42
34,04
Moyennes des observations
effectuees par noyau sur
chaque culture traitee (x2>i)
50
Nombre d'observations
50
Cultures traitees PCNH heterospecifiques
Moyennes des observations
36,18
35,58
effectuees par noyau sur
chaque culture tiaitee (x3i)
Nombre d'observations
50
50
L'utilisation du test de Mann-Whitney nous permet de constater que, pour un seuil
efficace de 5 %, les limites etant ta = 10 et t'a = 26, nous avons:
Comparaison temoin-pleurodele
tx = 14; t2 = 22; ta < tx < t2 < t'a (10 < 14 < 22 < 26).
La difference entre tx et /2 n'est pas suflfisamment grande pour qu'il faille raisonnablement
l'imputer a une difference entre les fonctions de repartition de Xx et X2 (Duprat & Mathieu,
1969).
II semble done que Je traitement n'a pas eu d'effet sur les cellules.
Comparaison temoin-ascite
tx = 12; t2 = 24; tot < tx < t2 < t'a (10 < 12 < 24 < 26).
Dans ce cas encore, la difference entre tx et t2 n'est pas suffisante pour etre imputee a une
difference entre les fonctions de repartition de Xx et X3. Le traitement ne semble pas avoir
d'effet sur les cellules.
Comparaison ascite-pleurodele
t1 = tt = 18; ta < tu h < t'a.
10 < 18 < 26.
Le traitement ne semble pas avoir d'effet sur les cellules.
pendant des durees de 3 h 30, 4 h, 5 h, 16 h par les PCNH iodees homospecifiques ou heterospecifiques ont revele un marquage significatif essentiellement
localise dans le cytoplasme (Mathieu et ah, en preparation).
DISCUSSION
Le present travail permet de mettre en evidence deux types d'effets:
(1) Des effets non specifiques, tel celui sur l'attachement des cellules et ceux
se traduisant par les diverses anomalies cytologiques.
66-2
1062
C. MATHIEU AND OTHERS
En effet si le traitement des cellules par des PCNH homospecifiques et
heterospecinques commence lors de la mise en culture, lagrande majorite d'entre
elles ne s'attachent pas, contrairement a ce qui se passe dans les cultures temoins.
Lorsque le traitement debute apres etalement des cellules sur leur support, une
partie (50 %) s'en detache dans les 24 h qui suivent. Ces observations suggerent
done un effet des PCNH sur le processus d'attachement des cellules. De raeme
les anomalies cytologiques sont communes aux deux types de proteines, heterospecifiques et homospecifiques.
11 importe d'insister sur le fait que lorsque les cellules se differencient, le
traitement n'altere pas de facon profonde leur dififerenciation (myoblastes par
exemple), les efifets non specifiques n'empechant pas la differenciation morphologique normale des cellules. L'effet specifique nous parait alors interessant
a discuter.
(2) Cet effet specifique sur la differenciation se manifeste apres l'attachement
des cellules. Les PCNH homospecifiques perturbent profondement l'apparition
et le deroulement de la differenciation morphologique des cellules alors que les
PCNH heterospecifiques sont sans effet. La differenciation des neuroblastes est
totalement inhibee; dans les myoblastes, la differenciation myofibrillaire
apparait generalement, mais avec du retard par rapport a celle des myoblastes
temoins. Comme cela a ete montre par immunofluorescence et apres action
combinee de divers inhibiteurs des syntheses de RNA et de proteines (Duprat,
19706; Duprat, Romanovsky, Hurichova & Macha, \915a,b), ce dernier type
cellulaire possede des m-RNA de longue duree qui dirigeraient la synthese
des proteines de structure du systeme contractile. Par contre il semble qu'une
synthese continue de RNA soit indispensable pour assurer la differenciation des
cellules nerveuses. Nous insistons done sur le fait que, chez les Amphibiens
tout au moins, l'inhibition de la differenciation morphologique des neuroblastes
en culture, par des PCNH extraites de cellules hepatiques, est liee a l'espece
utilisee a la fois comme source de ces proteines et comme materiel reactif.
Lorsque les PCNH sont issues d'un systeme biologique zoologiquement eloigne
(Mammifere) ou plus proche (Anoure), ou meme relativement voisin du
systeme reactif (autre Urodele), Faction inhibitrice ne se manifeste pas, bien
que les effets cytologiques observes dans tous ces cas soient identiques a ceux
notes sous Faction des PCNH homospecifiques.
Une analyse electrophoretique des solutions de PCNH etudiees, montre
que, pour un meme tissu, elles different d'une espece a l'autre. Toutefois ces
differences sont moins marquees entre especes tres voisines, comme le pleurodele
et l'axolotl, qu'entre classes zoologiques differentes comme celle des Amphibiens
et des Mammiferes.
En outre, les divers controles effectues ont tous ete negatifs, ce qui permet de
supposer que le facteur biologiquement actif est lie aux proteines non histoniques
et non a des histones; en particulier ces dernieres ne presentent pas de specificite
(Duprat & Mathieu, 1975). De plus Faction d'un complexe PCNH-histone ne
Effets de proteines chromatiniennes non histoniques
1063
peut etre exclue, compte-tenu des resultats concernant les effets des histones
sur le systeme cellulaire utilise (Duprat & Mathieu, 1975).
II importait de savoir s'il etait possible de mettre en evidence une alteration
de la biosynthese des acides nucleiques et des proteines sur ce systeme biologique,
par les PCNH. Le fait que la striation myofibrillaire apparaisse dans les myoblastes qui, par ailleurs, presentent de profondes alterations cytologiques dues
au traitement, laisse penser que, tout au moins dans ce type cellulaire, la traduction n'est pas inhibee. Les RNA messagers deja synthetises dans ces cellules
sont apparemment traduits normalement puisque Ton voit se former et s'organiser les filaments d'actine et de myosine. Une etude autoradiographique de
l'incorporation de leucine tritiee par des cellules traitees et temoins nous
a egalement permis de constater une intensite de marquage identique dans les
deux cas. II semble done que les PCNH ne perturbent pas le processus de
traduction lui-meme.
Comme nous n'avons pas constate de difference significative dans le taux
d'incorporation d'uridine tritiee par des cellules traitees et temoins, il semble
done que le traitement par des PCNH homospecifiques et heterospecifiques
n'entraine pas de perturbations dans les syntheses globales des RNA.
Cependant, ces recherches ne represented qu'une approche dans l'etude de la
biosynthese des RNA et celle des proteines car, si Faction des PCNH homospecifiques se traduit par une perturbation dans la synthese d'unnombre discret
d'especes de RNA ou de proteines, il n'est pas possible de la mettre en evidence
par la technique utilisee. De meme les resultats concernant l'etude de la penetration mettent en evidence une localisation du marquage au niveau cytoplasmique. Mais on ne peut affirmer, malgre la localisation essentiellement
cytoplasmique de ces PCNH, qu'une fraction non decelable par autoradiographie ne penetre neanmoins dans le noyau et soit suffisante pour entrainer les
perturbations que nous constatons. D'autre part, etant donne que les PCNH
iodees provoquent les memes effets que les PCNH non iodees, on peut en
conclure que l'iodation dans les conditions pratiquees n'est pas denaturante,
tout au moins quant aux effets observes.
La plupart des travaux effectues sur les PCNH montrent qu'une partie de
celles-ci jouent un role de controle positif dans la modulation de l'expression
genique. De plus l'addition de PCNH a un systeme acellulaire chromatinien de
synthese de RNA in vitro, conduit a une stimulation de celle-ci et la composition
en nucleotides de ce RNA differe selon que les PCNH appartiennent ou non
a la meme espece que le DNA entrant dans le systeme de synthese considere
(Wang, 1968; Kostraba & Wang, 1972, 1973; cf. Stein et al. 1974).
Selon les travaux de Kruh et al. (1969) il existerait dans les cellules differenciees des proteines nucleaires acides qui empecheraient, de maniere specifique,
la traduction de messagers en se combinant a eux avant que la traduction ne
debute.
En conclusion, l'effet specifique que nous constatons ne peut etre actuellement
66-2
1064
C. MATHIEU AND OTHERS
explique avec ce systeme biologique mais nous pouvons emettre plusieurs hypotheses quant au niveau cellulaire ou cet effet s'exercerait.
(1) Soit au niveau de l'expression des genes. Si les proteines penetrent dans
le noyau il suffit peut-etre d'une tres faible quantite de PCNH pour modifier la
transcription des genes. Dans ce cas, ces PCNH exerceraient un controle
negatif.
(2) Soit au niveau de la traduction. Etant donne les resultats de la penetration,
cette derniere hypothese semble plus probable. Dans ce cas il est interessant de
souligner l'existence d'un effet inhibiteur sur la differenciation des cellules
a messagers a vie courte (neuroblastes) alors que celui-ci ne se manifeste pas
dans le cas de cellules a messagers a vie longue (myoblastes); ceci suggere une
action des PCNH au niveau du 'processing' des m-RNP qui ne pourraient alors
s'exprimer. D'autre part, la technique d'extraction des PCNH utilisee ne
garantit pas que les proteines qui agissent ne se situent pas au niveau des
m-RNP.
Par ce travail, nous avons done pu mettre en evidence le fait remarquable
qu'un tissu adulte tel que le tissu hepatique produit des PCNH inhibant la
differenciation d'autres types cellulaires dans la meme espece animale, alors que
ces PCNH stimulent la differenciation du tissu hepatique embryonnaire (Duprat,
Houssaint, Suignard & Zalta, 1975).
Ce travail a ete realise dans le cadre de contrats du C.N.R.S. (A.T.P. 4310 sur la differenciation cellulaire et E.R.A. n° 327) et de 1'INSERM (n° 711019). C. Mathieu est Chargee
de Recherches INSERM.
TRAVAUX CITES
AXEL, R., CEDAR, H. & FELSENFELD, G. (1973). Synthesis of globin ribonucleic acid from duck
reticulocyte chromatin in vitro. Proc. natn. Acad. Sci. U.S.A. 70, 2092-2032.
CUATRECASAS, P. (1970). Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of
agarose and polyacrylamide beads. /. biol. Chem. 245, 3059-3065.
DAVID, G. S. (1972). Solid state lactoperoxidase: a highly stable enzyme for simple, gentle
iodination of proteins. Biochem. biophys. Res. Commun. 48, 464-471.
DAVIS, B. J. (1964). Disc electrophoresis. Method and application to human serum proteins.
Ann. N.Y. Acad. Sci. 121, 404-427.
DUPRAT, A. M. (1970#). Recherches sur la differenciation de cellules embryonnaires d'Urodeles en culture in vitro. Annls Embryol. Morph. 3, 411-423.
DUPRAT, A. M. (19706). Action de la puromycine et d'une substance analogue sur la differenciation de cellules embryonnaires d'Amphibiens cultivees /// vitro. J. Embryol. exp. Morph.
24, .119-138.
DUPRAT, A. M., HOUSSAINT, E., SUIGNARD, G. & ZALTA, J. P. (1975). Specificite tissulaire
des effets de proteines chromatiniennes non histoniques sur la differenciation d'organes
embryonnaires en culture in vitro. C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci., Paris D 280, 1143-1146.
DUPRAT, A. M. & MATHIEU, J. R. (1969). Analyse statistique de l'etude autoradiographique
des effets de faibles concentrations de puromycine sur 1'incorporation d'acides amines dans
des cellules embryonnaires d'Amphibiens cultivees in vitro. C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci.,
Paris D 268, 823-825.
DUPRAT, A. M. & MATHIEU, C. (1975). Etude comparative des effets morphologiques
d'histones et de proteines chromatiniennes non histoniques sur des cellules embryonnaires en differenciation in vitro. C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci., Paris D 280, 483-486.
Effets de proteines chromatiniennes non histoniques
1065
DUPRAT, A. M., ROMANOVSKY, A., HURICHOVA, D. & MACHA, J. (1975a). Immuno-
flourescence studies on the appearance of myosin and actin during in vitro differentiation of amphibian myoblasts. Experientia (sous presse.)
DUPRAT, A. M., ROMANOVSKY, A., HURICHOVA, D. & MACHA, J. (19756). Immuno-
flourescence studies on amphibian myoblasts differentiation. /. Embryol. exp. Morph.
(sous presse.)
DUPRAT, A. M., ZALTA, J. P. & BEETSCHEN, J. C. (1966). Action de l'actinomycine D sur la
differenciation de cellules embryonnaires de l'Amphibien Pleurodeles waltlii;en culture in
vitro. Expl Cell Res. 43, 358-366.
GABE, M. (1968). Techniques histologiques. Paris: Masson.
GALLIEN, L. & DUROCHER, M. (1957). Table chronologique du developpement chez Pleurodeles waltlii Michah. Bull. biol. Fr. Belg. 91, 97-114.
GILES, K. W. & MYERS, A. (1965). An improved diphenylamine method for the estimation
of deoxyribonucleic acid. Nature, Lond. 206, 93.
KAMIYAMA, M. & WANG, T. Y. (1971). Activated transcription from rat liver chromatin by
non-histone proteins. Biochim. biophys. Acta 228, 563-576.
KLEINSMITH, L. J., HEIDEMA, J. & CARROL, A. (1970). Specific binding of rat liver nuclear
proteins to DNA. Nature, Lond. 226, 1025-1026.
KOSTRABA, N. C. & WANG, T. Y. (1970). Tissue variation of acidic nuclear proteins and their
biosynthesis during liver regeneration. Int. J. Biochem. 1, 327-334.
KOSTRABA, N. C. & WANG, T. Y. (1972). Differential activation of transcription of chromatin
by non-histone fractions. Biochim. biophys. Acta 262, 169-180.
KOSTRABA, N. C. & WANG, T. Y. (1973). Non-histone proteins and gene activation in regenerating rat liver. Expl Cell Res. 80, 291-296.
KRUH, J., TICHONICKY, L. & WAJCMAN, H. (1969). Action des proteines acides du noyau sur
la synthese acellulaire de Phemoglobine et sur les RNA. Biochim. biophys. Acta 195, 549562.
LOWRY, O. M., ROSEBROUGH, N. J., FARR, A. L. & RANDALL, R. J. (195.1). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. biol. Chem. 193, 265-275.
MATHIEU, C, DUPRAT, A. M., ZALTA, J. P. & BEETSCHEN, J. C. (1972). Effets de proteines
nucleaires non histoniques sur des cellules embryonnaires d'Amphibiens cultivees in vitro.
C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci., Paris 21A, 292-294.
MCCLURE, M. E. & HNILICA, L. S. (1972). Nuclear proteins in genetic restriction. III. The
cell cycle. SubCell Biochemistry 1, 311-332.
PAUL, J. & GILMOUR, R. S. (1968). Organ-specific restriction or transcription in mammalian
chromatin. /. molec. Biol. 34, 305-316.
REYNOLDS, E. S. (1963). The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in
electron microscopy. /. Cell Biol. 17, 208-213.
SPELSBERG, T. C , HNILICA, L. S. & ANSEVIN, A. T. (1971). Proteins of chromatin in template
restriction. III. The macromolecules in specific restriction of the chromatin DNA. Biochim.
biophys. Acta 228, 550-562.
STEIN, G. & BASERGA, R. (1970). Continued synthesis of non-histone chromosomal proteins
during mitosis. Biochem. biophys. Res. Commun. 41, 715-722.
STEIN, G. S. & BORUN, K. W. (1972). The synthesis of acidic chromosomal proteins during
the cell cycle of Hela S-3 cells. / . Cell Biol. 52, 292-307.
STEIN, G. S., SPELSBERG, T. C. & KLEINSMITH, L. J. (1974). Non histone chromosomal proteins
and gene regulation. Science, NY. 183, 817-824.
TENG, C. T., TENG, C. S. & ALLFREY, V. G. (1970). Species-specific interactions between
nuclear phosphoproteins and DNA. Biochem. biophys. Res. Commun. 41, 690-696.
TENG, C. S., TENG, C. T. & ALLFREY, V. G. (1971). Studies of nuclear acidic proteins. Evidence
for their phosphorylation, tissue specificity, selective binding to deoxyribonucleic acid and
stimulatory effects on transcription. /. biol. Chem. 246, 3597-3609.
TUAN, D., SMITH, S., FOLKMAN, J. & MERLER, E. (1973). Isolation of the non histone proteins
of rat Walker carcinoma. Their association with tumor angiogenesis. Biochemistry, N. Y.
12, 3159-3165.
66-3
1066
C. M A T H I E U A N D
OTHERS
WANG, T. Y. (1967). The isolation properties and possible functions of chromatin acidic
proteins. / . biol. Chem. 242, 1220-1226
WANG, T. Y. (1968). Restoration of histone-inhibited DNA-dependent RNA synthesis by
acidic chromatin proteins. Expl Cell Res. 53, 288-291.
ZALTA, J., ZALTA, J. P. & SIMARD, R. (1971). Isolation of nucleoli. / . Cell Biol. 51, 563-568
(Recu le 11 decembre 1974, revise le 23 Janvier 1975)