/ . Embryol. exp. Morph. Vol. 33, 3, pp. 665-683, 1975
Printed in Great Britain
665
Recherches sur Torigine des
differentes lignees de cellules sanguines chez
FAmphibien Urodele Pleurodeles waltlii
Par PIERRE DEPARIS1 ET ANDRE JAYLET1
Laboratoire de Biologie generate, Equipe de recherche associee au
C.N.R.S. n° 327, Universite Paul-Sabatier
SUMMARY
Studies on the origin of various blood cell lines in the salamander
Pleurodeles waltlii
1. Grafting of haemopoietic organs was performed at several developmental stages
between diploid and autotetraploid individuals of Pleurodeles waltlii. The difference in size
between diploid and tetraploid cells is so obvious that their identification is possible by direct
microscopic examination. To avoid immunological rejection, the giafts have been made with
inbred animals.
2. After grafting the spleen, the host cells are observed to colonize it. This phenomenon is
more important with spleens from donors at early stages of development. When the spleen
from a late larval stage or a metamorphosed animal is transplanted into another larva, the
blood of the latter contains 66 or 72 % erythrocytes originating from the graft.
3. Embryonic liver grafting is followed by a colonization of all haemopoietic organs by
cells originating from the granulopoietic tissue of the graft. The proportion of grafted blood
cells is then very high. A liver graft performed at a larval stage gives qualitatively similar
results but the numbers of cells originating from the graft are lower.
A survey of intra-cardiac erythropoiesis in these animals shows that it develops from
stream blood cells and not from cardiac endothelial cells.
4. After thymus graft, the lymphoid part of the organ is replaced by the host cells.
5. From these results, it is suggested that the granulopoietic liver tissue contains one or
several kinds of stem cells which could differentiate into all types of blood cells.
INTRODUCTION
Les organes hematopoietiques des Urodeles ont ete etudies depms longtemps
et Ton sait que, a quelques variantes pres selon les groupes considered, le foie et
le mesonephros sont granulopoietiques, tandis que la rate est le siege de
Ferythropoiiese, de la thrombocytopoiese et de la lymphopoiese (Jordan &
Speidel, 1924, 1928; Barrett, 1936; Ouji, 1950; Deparis, 1968a). Les Proteidae
presenters cependant une difference par rapport a ce tableau, le mesonephros
y etant l'organe granulopoietique principal (Drzewina, 1903; Dawson, 1932;
1
Adresse des auteurs: Laboratoire de Biologie generate, Universite Paul-Sabatier, 118,
route de Narbonne, 31077 Toulouse Cedex, France.
666
P. DEPARIS ET A. JAYLET
Jordan, 1932). Enfin le cceur est souvent un organe erythropoietique (Wituschinski, 1928; Jordan & Speidel, 1930#; Jolly & Lieure, 1931; Ouji, 1950;
Deparis & Flavin, 1973). D'autre part les Urodeles possedent un thymus qui
differe morphologiquement de celui des Vertebres superieurs car il n'est pas
subdivise en cortex et medulla (Dustin, 1911; Maximow, 1912; Webster, 1934;
James, 1939; Klug, 1967; Hightower & St Pierre, 1971) mais son role physiologique au niveau des phenomenes immunitaires est comparable a celui du
thymus des Mammiferes (Charlemagne & Houillon, 1968; Cohen, 1969). La
morphologie des organes hematopoietiques des Urodeles est done assez bien
connue mais on ignore pratiquement tout des relations qui peuvent exister entre
eux. Chez les Anoures, Hollyfield (1966) a montre que Pilot sanguin ne donnait
qu'une population erythrocytaire transitoire, relayee par la suite par des cellules
issues du mesonephros. L'un de nous (Deparis, 1968Z?) a egalement montre,
chez le Pleurodele, Pindependance de la rate vis-a-vis des cellules de Pilot
sanguin.
Nous avons essaye de preciser les relations qui peuvent exister entre les
differents organes hematopoietiques des Urodeles, e'est-a-dire la rate, le foie, le
mesonephros, le thymus et le cceur. La methode a consiste a greffer sur un
individu autotetraploide (Jaylet, 1972), un des organes hematopoietiques suscite, preleve sur un individu diploiide. La difference de taille entre les cellules
diploides et les cellules tetraploides est telle qu'elle permet leur identification a
l'examen microscopique direct (Fig. 1A-F). Les cellules du greffon sont done
ainsi facilement decelables dansle porte-greffe. Afin d'eviter les reactions de rejet
des greffons lorsque ceux-ci sont implantes aux stades larvaires, nous avons
utilise une lignee etroitement consanguine oil la tolerance, testee par des hornogreffes cutanees, est de 100 % apres 14 mois.
Nous avons ainsi pratique des greffes de rate, de foie et de thymus.
MATERIEL ET METHODES
Des pontes d'individus consanguins (sixieme generation consanguine) sont
separees en deux lots. L'un est soumis a un choc thermique selon la methode de
Jaylet (1972) et fournit les individus autotetraploides, Pautre est conserve pour
donner des individus diploides.
Au moment des greffes, la determination des stades des individus a ete faite
selon la table chronologique du developpement de Gallien & Durocher (1957).
Pour la greffe de rate, nous avons utilise des boites de Petri dont le fond est
garni de coton hydrophile imbibe d'eau. Les individus donneur et receveur sont
anesthesies au M.S. 222 Sandoz, couches sur le flanc droit, puis recouverts d'un
voile de coton hydrophile qui capte immediatement Peau de la couche inferieure.
Les individus sont ainsi proteges de la dessiccation, seul le champ operatoire est
degage. Le flanc gauche du receveur est incise longitudinalement, juste en arriere
du membre anterieur, avec un microscalpel constitue d'un eclat de lame de
rasoir monte sur un mandrin. La rate qui se trouve juste sous Pincision est
L'origine des cellules sanguines chez Pleurodeles
667
10 ftm
Fig. 1. Difference de taille entre les cellules diploides et les cellules tetraploides
(marquees d'une fleche). (A) Polynucleaires neutrophiles. (B) Polynucleaires
eosinophiles. (C) Polynucleaires basophiles. Cas ou la difference de taille est
particulierement nette. (D) Petits lymphocytes. (E) Thrombocytes. (F) Erythrocytes.
excisee avec des pincettes. II faut ensuite separer la peau du flanc de la couche
musculaire sous-jacente, au niveau du bord posterieur de l'incision, de maniere
a constituer une poche ou la rate du donneur sera inseree. L'incision est refermee
avec du fil de platine de 0,04 mm de diametre. Le greffon sera vascularise 6 a 8
jours plus tard et aura un developpement normal.
42
E M B 33
668
P. DEPARIS ET A. JAYLET
Nous avons adopte cette technique de greffe car Jolly & Lieure (1928) ont
montre, chez le Triton crete, que la rate greffee ne se developpe bien que fixee
aux tissus de l'hote.
La greffe de foie a ete realisee chez l'embryon et chez la larve. En ce qui
concerne la greffe au stade du bourgeon caudal (stade 24) nous avons utilise les
techniques classiques de l'embryologie experimentale. Le milieu operatoire est
constitue par du liquide de Holtfreter sterile renfermant 0,5 % d'elcosine Ciba.
L'ebauche hepatique d'un embryon tetraploide a ete excisee et remplacee par
celle d'un embryon diploide. Les greffons sont decoupes a l'aide de fines pincettes, ce qui permet d'avoir des bords francs et une forme reguliere, facteurs
importants quant a la cicatrisation et a la nature des tissus preleves.
Nous avons egalement effectue des greffes de foie diploide, que nous avons
implante sous la peau du flanc d'individus tetraploides avec une technique
analogue a celle employee pour les greffes de rate.
La greffe de thymus a ete pratiquee au stade 55 a. L'individu porte-greffe est
thymectomise a la pincette. Au niveau de Pincision ainsi realisee, la peau est
decollee de la couche musculaire sous-jacente de maniere a former une poche
dont le fond se trouve juste en arriere de l'oeil. Le greffon est place au fond de
cette poche et, dans la plupart des cas, il n'est meme pas necessaire de refermer
l'incision. De par sa position, le greffon peut etre localise avec precision et on
peut suivre son developpement, chez la larve, a travers les teguments.
Les frottis sanguins a partir desquels nous avons etabli les proportions des
differentes categories de cellules sanguines ont ete colores au May-Griinwald
Giemsa. Cette coloration a egalement ete employee pour les coupes d'organes
hematopoietiques, prealablement fixes au liquide de Helly.
L'etablissement des proportions des differentes categories de cellules sanguines In (diploide) et 4/2 (tetraploide) a ete fait comme suit: pour les erythrocytes nous avons compte un minimum de 300 cellules dans des champs
microscopiques repartis en differents points du frottis. Pour les leucocytes
et les thrombocytes nous avons compte 200 cellules.
RESULTATS
A. Greffes de rate
Nous avons procede a des greffes isochroniques et heterochroniques chez
differents stades larvaires afin d'etudier l'origine des cellules-souches erythrocytaires, thrombocytaires et lymphocytaires qui se trouvent dans cet organe.
Dans les differentes combinaisons que nous avons etudiees, le greffon est
vascularise environ 6 a 8 jours apres son implantation sous la peau du flanc du
porte-greffe. Cette vascularisation est facile a constater car la peau des larves est
tres fine et Ton peut voir les vaisseaux qui arrivent au greffon et en partent.
Dans certains cas favorables on peut meme voir le sang circuler a l'interieur du
greffon. Quelques jours apres la pose du greffon, les porte-greffe sont a nouveau
Stade du
donneur
43
50
55
56
Stade du
receveur
47
48
55
53
12
13
8
9
Nombre
d'individus
1800 ±700
12900 ±4000
72 400 ±3000
64100 ±4 500
66600±6000
65 700 ±6000
108 800 ±8000
883O0±850O
2,7 ±0,2
19,6 ±1
66,5 +1
72,5 ± 1
In
In
/o
d'erythrocytes
Nombre
d'erythrocytes
Nombre
d'erythrocytes
par mm3
4,7 ± 0,3
6,4 ±0,1
7,8 ±0,3
5,3 ± 0,5
Taux d'Hb.
(g/100 ml
de sang)
21 ±0,2
25 ±0,1
30 ±0,1
22 ±0,1
Taux
d'hematocrite
Tableau 1. Differents parametres relatifs a la lignee rouge chez des individus 4n porteurs d'un greffon de rate
2n ± intervalle de confiance de la moyenne
o
S
I
670
P. DEPARIS ET A. JAYLET
operes et les regenerats sont excises lorsqu'il y en a. Trois semaines apres cette
deuxieme operation, les porte-greffe sont encore examines et dans ce cas nous
n'avons jamais trouve de regenerats.
(1) Etude du sang circulant
Trois semaines a un mois apres la metamorphose, les porte-greffe des differentes series ont ete ponctionnes et nous avons examine les differents parametres de
la serie rouge. Les resultats obtenus sont consignes dans le Tableau 1.
Les pourcentages d'erythrocytes In mentionnes dans le Tableau 1 doivent etre
stables pendant toute la vie de l'animal puisqu'on les retrouve encore 2 ans
apres la greffe dans les trois premieres series. Nous ne pouvons pas faire cette
affirmation pour la derniere serie (greffe de rate 2n d'individu metamorphose
sur un individu 4/2 au stade 53) qui a rapidement succombe a une infection
fongique.
L'observation de frottis sanguins des individus porte-greffe montre la presence, dans toutes les series de greffes, de cellules dont la ploidie correspond a
celle du greffon. C'est ainsi que Ton retrouve non seulement des erythrocytes
comme nous l'avons vu, mais aussi toutes les categories de cellules sanguines, y
compris des granulocytes neutrophiles et des granulocytes eosinophiles. Les
proportions des differents types cellulaires sont en relation directe avec celle des
erythrocytes pour un individu donne.
(2) Examens histologiques
L'examen histologique, effectue plusieurs mois apres la greffe, montre une
colonisation du greffon par les cellules de l'hote. Celle-ci est d'autant plus
importante que la rate a ete prelevee chez une larve plus jeune. La colonisation
interesse surtout les lignees erythrocytaire et lymphocytaire. Pour la premiere,
on retrouve tous les stades de maturation, depuis le proerythroblaste jusqu'a
l'erythrocyte mur. Les lymphocytes An sont egalement nombreux dans le greffon
et lorsque le stade du donneur etait jeune (stades 43 et 50) les plages lymphocytaires de la rate sont constitutes presque exclusivement de lymphocytes
tetraploides. Dans certains greffons la pulpe blanche est moins abondante que
dans une rate temoin, on y retrouve cependant toutes les categories cellulaires
que Ton rencontre dans une rate normale. La rate greffee est done devenue une
mosaique Anjln.
Le thymus des individus porte-greffe est egalement mixte; cependant toutes
les mitoses que nous avons pu rattacher avec certitude a une ploidie donnee
etaient celles de cellules tetraploides. Quelques mitoses semblaient appartenir a
des cellules diploides, mais il est difficile de faire une identification precise sur
coupes histologiques. Nous ne savons done pas si les lymphocytes 2« qui se
trouvent dans le thymus des individus porte-greffe proviennent de la circulation
sanguine ou de cellules-souches ayant emigre dans le thymus de l'hote.
Vorigine des cellules sanguines chez Pleurodeles
671
B. Grejfes defoie
Contrairement a ce qui se passe pour la rate dont l'ebauche ne peut etre
localisee dans l'embryon, le territoire presomptif du foie est bien delimite des le
stade bu bourgeon caudal. La greffe de foie au stade embryonnaire est done
possible mais on sait que le greffon est capable de donner d'autres tissus que le
foie (Chibon, 1969). Neanmoins cette technique appliquee entre individus
tetraploides et diploides permet l'excision de la plus grande partie du foie du
receveur et son remplacement par celui du donneur. Pour assurer la cicatrisation
(Chibon, 1969) le greffon doit comprendre les trois feuillets, epiderme, mesoderme et endoderme, le mesoderme etant celui qui nous interesse dans ce cas
particulier puisqu'il est, en principe, a l'origine du tissu granulopoiietique
comme 1'a montre Copenhaver (1943). 11 existe cependant d'autres sites granulopoietiques chez la larve (Deparis, 1968 a) et la greffe de foie au stade embryonnaire permet d'etudier leurs interactions.
Malgre les precautions prises au moment de la grefife (greffon decoupe
nettement en retrait par rapport a l'ebauche cardiaque et prelevement de la zone
superficielle de l'endoderme) nous n'etions pas surs qu'une partie du mesoderme
greffe ne pouvait pas donner naissance a la rate. Nous avons done decide de
pratiquer en outre des greffes de foie au stade larvaire en implantant sous la peau
du flanc d'un individu autotetraploide au stade 41, le foie d'une larve diploide
au stade 39. Le choix de ces deux stades differents se justifie pour les raisons
suivantes.
Le greffon preleve au stade 39 ne peut apporter de cellules d'origine splenique
qui se trouveraient dans la circulation sanguine, puisque la rate n'apparaitra que
plusieurs jours plus tard. II ne contient done, en plus des cellules hepatiques
proprement dites, que la couche granulopoietique et des cellules issues de Pilot
sanguin. Nous n'avons pas pu pratiquer ce genre de greffe sur un stade anterieur
au stade 41 en raison de la petite taille de la larve, mais cela est suffisant car le
receveur ne se trouve qu'au stade 43 au moment ou le greffon est vascularise,
e'est-a-dire a un moment ou sa rate vient juste de se former. La situation est
done favorable pour etudier les interactions entre les deux organes.
L'inconvenient de la greffe au stade larvaire est que le greffon constitue un
organe surnumeraire, car il est impossible d'hepatectomiser l'hote. Le greffon
n'aura done qu'un developpement reduit et sa taille representera, chez l'individu
metamorphose, le quart ou le cinquieme de celle du foie du porte-greffe.
La determination de la ploidie des cellules du sang circulant a ete faite sur
frottis sanguins pour toutes les series examinees. Pour les globules rouges, on
peut faire cette determination directement a la cellule hematimetrique mais le
resultat est moins precis car certains erythrocytes 4n donnent naissance a des
erythroplastides et ont aussi la taille d'erythrocytes 2n mais avec un noyau 4«.
11 arrive egalement que les globules rouges 4n se divisent par amitose, les deux
cellules qui en resultent sont rondes avec un noyau egalement rond qui se
672
P. DEPARIS ET A. JAYLET
Tableau 2. Greffe defoie d'un individu 2n sur un individu 4n au stade 24
(bourgeon caudal)
Pourcentages des cellules diploides etablis sur frottis sanguins apres la
metamorphose du receveur.
Numero des
individus
Erythrocytes
1
2
3
4
5
83
83
81
80
6
35
9,5
7
Polynucleaires
neutrophiles
73,5
48
50
30
29
20
Polynucleaires
eosinophiles
10
15
63
21
28
8
6
0,5
0,5
Thrombocytes
80
90
95
68
88
65
77
distingue facilement du noyau d'un erythrocyte diploide. En ce qui concerne la
lignee blanche, la determination de la ploidie se fait obligatoirement sur frottis.
(1) Premiere se'rie d1 experiences
On a effectue une greffe orthotopique du foie d'un individu diploide sur un
individu autotetraploide au stade du bourgeon caudal. Les porte-greffe ont
evolue ensuite jusqu'a la metamorphose apres laquelle on a confectionne des
frottis sanguins. Sur ceux-ci nous avons determine le pourcentage de cellules
appartenant a la ploidie du greffon. Nous n'avons pas etabli les pourcentages
des lymphocytes et des polynucleaires basophiles. Dans ces deux dernieres
categories cellulaires, les variations de taille a Pinterieur d'une meme ploidie
sont trop importantes pour pouvoir rattacher avec certitude les elements de
taille moyenne a l'une ou l'autre ploidie; ces types cellulaires sont presents de
facon indiscutable chez tous les individus examines mais nous ne voulons pas
donner une evaluation quantitative de leur presence qui serait erronee. Les
resultats concernant cette serie sont consignes dans le Tableau 2.
La greffe de foie au stade embryonnaire entraine done la presence d'une forte
proportion de toutes les categories cellulaires sanguines du donneur dans le
sang du receveur, y compris de celles qui se differencient dans la rate. II reste a
prouver que ces cellules viennent bien de la couche granulopoietique du foie et
qu'une partie du mesoderme greffe n'a pas donne naissance a une partie de la
rate.
(2) Deuxieme serie d'experiences
Compte tenu de ce qui precede, elle a consiste a greffer le foie d'une larve
diploide du stade 39 sur un receveur autotetraploide du stade 41. L'examen
sanguin a eu lieu apres la metamorphose et les resultats sont regroupes dans le
Tableau 3.
Vorigine des cellules sanguines chez Pleurodeles
673
Tableau 3. Greffe defoie d'individu. diploide au stade 39 sur un individu
autote'traplo'ide du stade 41
Pourcentages des cellules diploides dans le sang du receveur.
Numero des
individus
1
2
3
4
5
6
7
8
Erythrocytes
32
12
11,5
9
7
4,5
4,5
2,5
Polynucleaires
neutrophiles
Polynucleaires
eosinophiles
Thrombocytes
15
4
6
4
6
2
7
4
20
8
5
10
8
2
19
2
50
2
18
20
34
20
20
12
Comme dans les greffes aux stades embryonnaires, on constate qu'une
proportion non negligeable de cellules sanguines est issue du greffon. La encore
on trouve des erythrocytes, des thrombocytes, des lymphocytes et des polynucleaires basophiles dont la ploidie correspond a celle du greffon. Le donneur
se trouvant a un stade anterieur a celui ou la rate se forme, il est evident que les
cellules-souches de ces categories cellulaires ne sont pas d'origine splenique.
(3) Troisieme serie d'experiences
On a effectue une greffe de l'ebauche hepatique diploide, au stade 24 (bourgeon caudal), sur un individu autotetraploide. Les porte-greffe ont ensuite ete
splenectomises au stade 43. Cette experience a eu un double but:
(1) Verifier que la splenectomie n'affecte pas le developpement des cellules
sanguines issues du greffon.
(2) Obtenir des individus tetraploides a fort pourcentage d'eryt hrccytes
diploides dont l'hematopoiese intra-cardiaque soit importante, afin de determiner l'origine de cette hematopoiese.
Le Tableau 4 regroupe les resultats obtenus dans cette serie.
L'absence de rate ne modifie pas les resultats par rapport a la premiere
experience (greffe d'ebauche hepatique sans splenectomie). Ce resultat, ajoute a
celui des greffes de foie au stade larvaire, prouve que le mesoderme greffe ne
prend pas part a la formation du tissu splenique du porte-greffe et done que les
cellules diploides trouvees sont issues de la couche granulopoietique du foie.
Les dosages d'hemoglobine et la determination du taux de l'hematocrite
confirment que la regulation de l'erythropoiese se situe en dehors des organes
hematopoietiques. Les individus n° 6, 7 et 8 sont particulierement demonstratifs
a cet egard, le nombre d'erythrocytes y est relativement tres eleve en raison de la
forte proportion de cellules diploides mais les taux d'hemoglobine et de
Phematocrite sont typiquement ceux d'individus autotetraploides.
Nombre
total
d'erythrocytes
57 600
65600
67200
68800
59200
96000
118400
112000
Numero
des
individus
1
2
3
4
5
6
7
8
2,5
2,2
54
50
5
48
94
84
d'erythrocytes
In
5,8
6,7
5,6
5,6
5,3
6,7
6,7
6,4
Taux
d'hemoglobine
21
25
20
20
20
19
23
22
Taux
d'hematocrite
2/7
8
5
56
56
3
36
92
76
0,5
1
50
24
0,5
30
69
18
1
1
40
38
1
34
66
32
de thrombocytes
d'eosinophiles
de neutrophiles
In
Splenectomie du porte-greffe au stade 43. Examens sanguins pratiques 6 mois apres la metamorphose.
Tableau 4. Greffe de foie d' individu 2n sur un individu autotetraplo'ide au stade 24
H
r
w
>
w
H
as
Uorigine des cellules sanguines chez Pleurodeles
675
Tableau 5. Analyse de Vhematopo'iese intra-cardiaque chez des individus autotetraploides qui ont recu une greffe de foie diploi'de au stade 24, puis ont ete
splenectomises au stade 43
P.E., proerythroblastes; E.B., erythroblastes basophiles; E.P., erythroblastes
polychromatophiles; G.R., globules rouges.
% de cellules
tetraploides
\ de cellules
°/<
diploides
Numero
des
individus
E.B.
E.P.
r
P.E.
E.B.
E.P.
% de cellules
2/7 dans le cceur
% de G.R. In
P.E.
3
4
6
7
8
17
12,5
9
7,5
15,5
23
19
9
7,5
14,5
12
20,5
30
8
1,5
7,5
10
10,5
10,5
12
16
12,5
13
21
32
24,5
25,5
28,5
45,5
25
48
48
52
77
69
54
50
48
94
84
A
A
dans le sang
Deux individus ne presentaient plus de cellules issues du greffon et leur
absence est alors generate. II est vraisemblable que dans ces deux cas une grande
partie du greffon, ou du mesoderme, a ete eliminee au moment de la cicatrisation. Ces deux individus presentaient des taux d'hemoglobine de 5,5 et 6,8
g/100 ml de sang et des taux d'hematocrite de 18 et 22 %.
(4) He'matopo'iese intra-cardiaque
Nous avons etudie l'hematopoiese intra-cardiaque chez les individus 3, 4, 6,
7 et 8 du Tableau 4 en raison de leur fort pourcentage d'erythrocytes diploides.
Rappelons que l'hematopo'iese intra-cardiaque peut avoir deux origines: oubien
les cellules de l'endocarde donnent naissance a des erythroblastes, ou bien des
cellules se trouvant dans la circulation sanguine se differencient en erythroblastes au niveau du coeur. Pour analyser plus facilement les populations
cellulaires de la lignee erythrocytaire qui se trouvent en majorite au niveau de
Tatrium, nous avons preleve une partie de celui-ci que nous avons dilaceree dans
une goutte de serum sanguin de Pleurodele pour confectionner un frottis. Le
reste du coeur a ete fixe au liquide de Helly en vue de l'etude histologique. Nous
avons etabli les proportions des differents types cellulaires pour chacune des
ploidies sur les frottis, les resultats se trouvent dans le Tableau 5.
Nous voyons que l'erythropoiese intra-cardiaque est largement partagee entre
les deux ploidies et que la quantite des erythroblastes diploides est proportionnelle a celle d'erythrocytes diploides dans le sang. Compte tenu des precautions
prises au moment de la greffe, nous sommes absolument surs que du tissu
cardiaque n'a pas ete greffe. La taille des noyaux des cellules cardiaques endotheliales et musculaires prouve que ces cellules sont tetraploides. D'autre part,
dans d'autres experiences, nous avions echange le tube cardiaque, au moment
de sa formation, entre des individus In et 3«. Deux individus survecurent a
676
P. DEPARTS ET A. JAYLET
P operation, ils furent splenectomises au cours de la vie larvaire et le sang
examine au stade adulte. Aucun erythrocyte ne correspondait a la ploidie du
greffon.
L'hematopoiese intra-cardiaque est done le fait de cellules du sang circulant
en provenance du tissu granulopoietique du foie.
(5) Etude histologique des organes hematopo'ietiques des porte-greffe
L'etude histologique des greffons de foie au stade 24 montre que les regions
hepatiques de Fhote et du greffon ont parfaitement fusionne. Le tissu granulopoietique est mixte, les cellules diploides et les cellules tetraploides sont reparties
uniformement sans que Ton puisse delimiter la zone de greffe sur ce tissu. II
n'en va pas de raeme avec le parenchyme hepatique ou la limite entre les
hepatocytes diploides et les hepatocytes tetraploides est toujours nette. Ceci
traduit la difference entre les deux tissus: l'un est constitue de cellules mobiles,
Pautre de cellules fixes. Nous avons pu ainsi delimiter le greffon avec assez de
precision grace a la difference de taille entre les hepatocytes In et An. Comme
nous l'avons deja fait remarquer a propos de l'hematopoiese intra-cardiaque, la
partie anterieure du parenchyme hepatique est entierement tetraploide, ainsi que
les limites droite et gauche de l'organe. Les parties centrales et posterieures sont
diploides. L'importance relative des parties In et 4« varie avec chaque greffon.
Lorsque \SL greffe de foie a lieu sur de jeunes larves (donneur au stade 39,
receveur au stade 41) on constate que les couches granulopoietiques des deux
organes sont mixtes egalement. II y a done entre elles un echange de cellulessouches qui se fait par Pintermediaire de la circulation sanguine, ce qui implique
que ces cellules-souches ne sont pas fixes et que le sang des larves en transporte
une partie.
Le mesonephros des porte-greffe contient egalement des granuloblastes
diploides dont les cellules-souches sont apportees par la circulation sanguine.
II se passe a son niveau ce que nous avons constate entre les foies diploides et
tetraploides. Nous ne savons done pas si la granulopoiese mesonephretique est
autonome ou sous la dependance de celle du foie.
La rate des individus tetraploides porte-greffe reflete exactement la situation
de la circulation sanguine. Chez les individus greffes au stade 24 et a forte
proportion de cellules diploides, la rate est presque entierement constitute de
cellules sanguines diploides. On retrouve done la une similitude avec les greffes
de rate; dans les deux cas la trame splenique est colonisee par des cellules qui
lui sont etrangeres et dont nous pouvons dire maintenant qu'elles sont d'origine
perihepatique. Chez les individus greffes au stade larvaire, les phenomenes sont
quantitativement differents mais qualitativement identiques.
Le thymus n'echappe pas a la regie generale et est constitue, pour sa partie
lymphoide, de deux populations de lymphocytes, Pune diploide et Pautre
tetraploide, que Pon distingue aisement Pune de Pautre grace a la difference de
taille des noyaux (Fig. 2).
Uorigine des cellules sanguines chez Pleurodeles
677
Fig. 2. Coupe histologique dans le thymus d'un individu An ayant recu un greffon
de foie 2« au stade 24. •<.: thymocytes 4/7. 4 - : thymocytes In.
GrefTe de foie au
stade embryonnaire
Greffe de foie au stade
larvaire
St.41
Colonisation de tous
les sites hematopoietiques par les cellules
du greffon
M6mes resultats qu'en 1 mais
quantitativement inferieurs
Greffe de foie au stade'
embryonnaire et
splenectomie du receveur au stade 43
2/i
An
Memes resultats qu'eia 1
mais developpement d'une
hematopoiese intracardiaque importante
comportant de nombreuses cellules issues du
greffon
Fig. 3. Les differentes combinaisons de greffes de foie et leurs resultats.
Les sites de lymphopoiiese diffuse (cavite buccale, intestin) sont egalement
mixtes.
C. Greffe du thymus
La greffe de thymus a ete effectuee de longue date puisque Jolly & Lieure
(1932) et Gregoire (1935) la pratiquaient deja. Ces auteurs apportaient des
678
P. DEPARIS ET A. JAYLET
arguments en faveur d'une origine exogene du tissu lymphoide du thymus. Cet
organe serait constitue d'un epithelium issu des fentes branchiales et d'un tissu
lymphoide prenant naissance a partir de cellules apportees par la circulation
sanguine. Les progres accomplis dans la connaissance du role du thymus dans
les phenomenes immunitaires, dans la selection de lignees pures de Souris et
dans l'analyse chromosomique, ont permis de reprendre les recherches avec des
moyens d'investigation beaucoup plus precis (Miller, 1963; Harris, Ford, Barnes
& Evans, 1964; Moore & Owen, 1967; Owen & Ritter, 1969) et de montrer que
la population lymphoide du thymus a bien une origine exogene. Recemment,
Le Douarin & Jotereau (1973) ont montre, chez le Poulet, que les lymphocytes
du thymus proviennent de cellules sanguines.
En greffant du thymus entre des larves diploides et des larves tetraploides,
notre but etait de verifier si la colonisation du thymus par des cellules lymphoides
exogenes avait egalement lieu chez le Pleurodele. Nous n'avons pas cherche a
mettre en evidence, au niveau des organes lymphoides, de la rate en particulier,
des zones thymo-dependantes comme il en existe chez les Mammiferes (Miller,
1962; Parrott, de Sousa & East, 1966; Weissman, 1967). Les greffons provenant
de larves tetraploides du stade 55 ont ete places sur des larves diploides du meme
age thymectomisees au moment de la greffe. Dix individus porte-greffe ont ete
examines dix-huit mois plus tard.
Les greffons ont une croissance legerement inferieure a la normale. Neanmoins, on les distingue tres bien sous la peau, en arriere de l'ceil, ou ils forment
une legere protuberance. A l'examen histologique, la structure du thymus est
parfaitement normale mais le tissu lymphoide est entierement diploide. On
retrouve done chez le Pleurodele les phenomenes de colonisation par des
cellules etrangeres a l'organe.
Les rates des individus porte-greffe ne presentent pas de lymphocytes An, ce
qui n'est pas etonnant etant donne le temps ecoule entre la greffe et l'examen
histologique.
Les individus porte-greffe ont des reactions immunitaires normales puisqu'ils
rejettent des greffons de peau trois semaines apres la pose de ceux-ci (de 19 a 25
jours) (Tournefier, Charlemagne & Houillon, 1969). Les lymphocytes impliques
dans le rejet sont diploides, done correspondent a la ploidie de l'hote. Nous
avons cependant decele de rares lymphocytes dont la taille correspond a celle
d'un lymphocyte tetraploide.
DISCUSSION
Les resultats precedemment exposes nous montrent que la rate est vraisemblablement sous la dependance d'un autre site hematopoietique. En effet,
elle est largement colonisee par les cellules de l'hote, quel que soit Page du
donneur, mais cette colonisation est d'autant plus importante que le greffon
provient d'un individu plus jeune. Ceci indique que des cellules sanguines qui se
differencient dans la rate ne proviennent pas des cellules spleniques comme on
Uorigine des cellules sanguines chez Pleurodeles
679
le pense generalement, mais que le tissu splenique au sens strict constitue ici un
site de differentiation pour des cellules-souches venues d'ailleurs. II faut
cependant remarquer que la circulation sanguine des porte-greffe peut contenir
des cellules-souches d'origine effectivement splenique, lesquelles coloniseraient
le greffon, ce qui reviendrait a un phenomene de 'homing'.
De meme, le greffon contient des cellules-souches des series granulocytaires,
puisque Ton trouve de nombreux granulocytes diploiides, neutrophiles et
eosinophiles, chez les porte-greffe tetraploides. La encore on peut supposer, soit
que le greffon apporte avec lui des cellules-souches de ces leucocytes venues du
foie ou du mesonephros par Pintermediaire de la circulation sanguine, soit qu'il
contient des cellules-souches totipotentes capables de donner tous les types
cellulaires en des lieux de differentiation distincts.
11 faut rapprocher les experiences de greffe de rate et eel les de splenectomie.
Nous savons que la splenectomie precoce du Pleurodele ne perturbe en rien les
caracteristiques de la lignee rouge, entrainant seulement un changement de site
erythropoietique (Deparis & Flavin, 1973). Dans ces conditions on voit mal
pour quelle raison le phenomene de 'homing' serait seul responsable de la
colonisation du greffon, alors qu'en l'absence de rate l'erythropoiese s'effectue
normalement.
La reponse a ces questions est apportee par la greffe de foie. Celui-ci est le
seul organe hematopoietique qui, greffe a un stade precoce, donne naissance a
une grande quantite de cellules sanguines. Cet organe amene done avec lui les
cellules-souches necessaires au developpement des lignees granulocytaires, mais
aussi erythrocytaires, lymphocytaires et thrombocytaires. Ceci explique les
resultats que nous avons obtenus avec les greffes de rate. Lorsque la rate greffee
est jeune, elle se trouve rapidement colonisee par les cellules de l'hote issues du
tissu granulopoietique hepatique. II est probable que la rate des Urodeles est
constituee de deux tissus, l'un provenant du mesogastre dorsal qui donne la
trame et les cellules spleniques, l'autre provenant de cellules issues du tissu
granulopoietique, apportees par la circulation sanguine et qui constitue la partie
hematopoietique de l'organe.
L'erythropoiese intra-cardiaque est egalement sous la dependance du tissu
granulopoietique hepatique et il semble que Ton puisse maintenant exclure la
participation de l'endothelium cardiaque a l'erythropoiese. L'hypothese de
Jolly & Lieure (1931) se trouve ainsi verifiee. Des recherches recentes de Boyd
(1970c, b, 1971), chez le Chien et la Tortue, montrent cependant que Ton peut
obtenir la transformation de cellules endotheliales en erythroblastes, apres injection de lobe intermediaire de l'hypophyse de Bovides. Dans les conditions
normales et apres splenectomie, cette transformation n'intervient pas chez le
Pleurodele. De meme Dawson (1933) ne constate aucune formation d'hemoblastes a partir de cellules reticuloendotheliales chez Necturus.
II reste a expliquer pourquoi le tissu granulopoietique du foie qui contient,
soit la cellule-souche pluripotentielle, soit les differentes cellules-souches des
680
P. DEPARIS ET A. JAYLET
Thymus
Mesoderme
troncal
anterieur
Tissu
*- granulopoietique ^
hepatique
1
Mesonephros
Fig. 4. Relations entre les differents organes hematopoietiques.
: migration de
cellules souches etablie de facon sure. - - : migration de cellules souches non etablie
de fa?on sure ou non examinee.
differentes lignees cellulaires sanguines, ne montre jamais autre chose que de la
granulopoiese neutrophile et eosinophile. La splenectomie ne modifie pas son
aspect, et des conditions beaucoup plus severes, telle que l'anemie totale
provoquee par l'injection de phenylhydrazine, ne changent apparemment rien
dans son evolution (Grasso, 1973 a, b). D'apres Jordan & Speidel (1924, 19306)
il y aurait, chez les Amphibiens et les Cyclostomes, une cellule-souche pluripotentielle qui, dans les conditions extra-vasculaires, se differeneierait dans la
voie granulocytaire et, dans les conditions intra-vasculaires, se differeneierait
dans la voie erythrocytaire. Cette hypothese n'a pu etre verifiee jusqu'a present,
mais elle n'est pas en contradiction avec les faits observes. Le passage de
cellules-souches du compartiment extra-vasculaire (en l'occurrence le tissu
granulopoietique) dans le compartiment vasculaire ou elles se diviseraient,
expliquerait l'absence de reaction apparente de ce tissu granulopoietique a la
splenectomie ou a l'anemie consecutive a l'injection de phenylhydrazine.
En ce qui concerne la greffe de thymus, il apparait que celui-ci n'est pas
physiologiquement different de celui des Vertebres superieurs. Chez ceux-ci la
partie epitheliale de l'organe se developpe en symbiose avec le tissu lymphoide
dont il semble prouve que les cellules proviennent de la moelle osseuse (Ford
et al. 1966; Micklem, Ford, Evans & Gray, 1966; Nowell & Cole, 1967). Chez
le Pleurodele, les lymphocytes qui se developpent dans le thymus proviennent
du tissu granulopoietique du foie. En effet, lorsqu'on greffe la region hepatique
au stade embryonnaire, une grande partie des thymocytes sont de la meme
ploidie que le greffon. II est done logique de penser que les lymphocytes qui
colonisent le thymus lorsque celui-ci est greffe proviennent du foie de l'hote.
Ces resultats sont en contradiction avec ceux de Turpen, Volpe & Cohen (1973)
obtenus chez Ranapipiens. Ces auteurs ont montre par des greffes embryonnaires
que, chez cette espece, les lymphocytes thymiques sont issus de l'ebauche
thymique elle-meme. Dans les deux groupes d'Amphibiens, Anoures et Urodeles, les thymocytes auraient done une origine differente. Nos individus portegreffe sont capables de rejeter des greffes de peau provenant d'un individu qui
n'est pas le donneur du thymus. Ceci est en accord avec les travaux de Miller
(1962).
Uorigine des cellules sanguines chez Pleurodeles
681
II apparait que le tissu granulopoietique hepatique des Urodeles, meme
greffe au stade embryonnaire, se montre capable de donner naissance a tous les
types cellulaires sanguins. Nous pouvons done l'assimiler a la moelle osseuse des
Mammiferes adultes, non pas parce qu'il est le siege de la granulopoiese comme
on l'a fait jusqu'a maintenant, mais parce que, comme la moelle osseuse, il
contient les cellules capables de peupler n'importe quel organe hematopoietique.
Les relations entre ce tissu granulopoietique et les autres organes hematopoietiques peuvent etre schematisees comme suit (Fig. 4).
RESUME
1. Des greffes d'organes hematopoietiques ont ete realisees a divers stades du developpement entre des individus diploides et autotetraploides de Pleurodeles waltlii. La difference de
taille entre les cellules diploides et les cellules tetraploides est telle qu'elle permet leur
identification a l'examen microscopique direct. Afin d'eviter les phenomenes immunitaires de
rejet, les greffes ont ete pratiquees entre des individus etroitement consanguins.
2. La greffe de rate se traduit par une colonisation du greffon par les cellules de l'hote,
qui est d'autant plus importante que le greffon est plus jeune. Lorsque celui-ci est preleve sur
une larve agee ou un individu metamorphose, le sang du porte-greffe contient de 66 a 72 %
d'erythrocytes provenant du greffon.
3. La greffe de foie realisee au stade embryonnaire est suivie d'une colonisation des
organes hematopoietiques de l'hote par des cellules issues du tissu granulopoietique du
greffon. La proportion de cellules sanguines greffees est alors tres elevee. La greffe de foie
realisee au stade larvaire donne des resultats qualitativement identiques mais quantitativement inferieurs. L'analyse de Phematopoiese intra-cardiaque des porte-greffe montre que
cette hematopoiese provient de cellules du sang circulant et non des cellules de Pendothelium
cardiaque.
4. La greffe de thymus est suivie d'un remplacement de la partie lymphoide du greffon par
des cellules de l'hote.
5. A la lumiere des resultats precedents, il apparait que le tissu granulopoietique hepatique
est a Porigine de cellules-souches capables de se differencier pour fournir toutes les categories
de cellules sanguines.
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