/. Embryol. exp. Morph. Vol. 35, 2, pp. 403-424, 1976
Printed in Great Britain
403
Activite genetique au cours de
Fembryogenese de FOligochete Eisenia fcetida
(autoradiographie a Furacile-3H et
traitement a Factinomycine D)
Par J. DEVRIES 1
Institut de Biologie Animate, Universite de Bordeaux I
SUMMARY
Gene activity during embryogenesis of the earthworm Eisenia foetida
([zH]uracil autoradiography and actinomycin D treatment)
Embryos of Eisenia fcetida (Spiralia) have been cultivated with [3H]uracil precursor of RNA
at different stages of development from egg to gastrula. The results show that ribonucleic
acid synthesis detected by autoradiography begins precociously. During segmentation
messenger RNAs are produced by interphase nuclei and liberated in cytoplasm cyclically at
mitosis. After the blastula stage rRNAs (nucleoli), which can migrate through the nuclear
membranes, predominate. The blastomeres, which contain polar plasm and also mesoderm,
already known for its controlling part in embryogenesis after gastrulation, are the seats of
the increasingly important ribonucleic acid synthesis.
These genetic transcriptions, which are inhibited by actinomycin D, are implicated in the
determination of the blastomeres and postblastular differentiation. Only the messages
required for the segmentation divisions pre-exist in the undivided egg.
INTRODUCTION
Les ceufs 'en mosaique' apparaissent, a l'oppose des germes a regulation,
tres precocement determines. Us renfermeraient des determinants specifiques
repartis dans des territoires cytoplasmiques precis que decouperaient par la
suite les clivages successifs de la segmentation. Ainsi fut interprets le developpement normogenetique (non regulatif) des blastomeres qui ont ete isoles experimentalement a partir de jeunes embryons chez les Spiralia et les Prochordes.
En fait, aujourd'hui, cette facon d'envisager le probleme du determinisme
embryonnaire devient de plus en plus difficile a soutenir. Bien que les resultats
de certaines experiences de centrifugation, de microdissection et de compression
sur des ceufs en mosaique (Lehmann, 1956; Raven, 1958; Reverberi & Ortolani,
1962; Styron, 1967; Clement, 1968; Farina, 1969; Farinella-Ferruzza &
1
Adresse de Vauteur: Universite de Bordeaux I, Laboratoire de Zoologie A, Institut de
Biologie Animale, avenue des Facultes, 33405 - Talence (France).
26-2
404
J. DEVRIES
Reverberi, 1969; Cather, 1971) conduisent, selon l'optique preformiste, a
admettre que seul le cortex ovulaire intervient dans la determination des
ebauches, celui-ci apparait neanmoins dote d'une certaine 'malleabilite': les
determinants specifiques n'y seraient plus prelocalises mais seulement preexistants! (Raven, 1958).
Avec les donnees recentes de la Biologie moleculaire on se rend nettement
mieux compte du caractere 'epigenetique' du determinisme embryonnaire.
Chez un germe a regulation, comme celui des Echinides (Czihak, 1968;
Brachet, 1969; Hogan & Gross, 1972; Lovtrup-Rein, 1972; Sconzo, Bono,
Albanese & Giudice, 1972; Brahmachary, 1973; Giudice, 1973; Mizuno,
Whiteley & Whiteley, 1973; Mizuno, Lee, Whiteley & Whiteley, 1974), le
developpement apparait controle par des vagues successives de transcriptions
genetiques: des RNAs deja transcrits avant la fecondation conditionnent le
deroulement ulterieur des clivages de segmentation; au cours de cette meme
periode (blastule) des informations specifiques nouvelles prennent naissance et
interviennent dans le processus de la gastrulation; a ce stade d'autres encore,
plus nombreuses et differentes, determinent les premieres differentiations
organogenetiques de la larve.
Le pattern des transcriptions genetiques de l'embryon en mosaique semblerait
different. S'il est admis, comme dans le cas des germes regulatifs, que l'oeuf
indivis renferme les informations necessaires a la segmentation et que la differentiation de la larve agee est soumise au controle de derepressions genetiques
tardives, une ambiguite persiste dans les interpretations au sujet de la determination des stades de gastrule et de jeune larve. Plus particulierement chez les
Gastropodes et les Tuniciers on est incite a penser, a la suite des resultats des
traitements a l'actinomycine D (Librera, 1964; Collier, 1965a; Feigenbaum &
Goldberg, 1965; Markert & Cowden, 1965; Brahmachary & Banerjee, 1967;
Geilenkirchen, 1967; Brahmachary, 1968; Brahmachary, Banerjee & Basu,
1968; Brahmachary & Palchoudhury, 1971; Karp & Whiteley, 1973) et des
experiences d'hybridation moleculaire (Karp & Whiteley, 1973; Lambert, 1971),
que la formation de ces stades (gastrule, trochophore ou jeune 'tetard') se
trouve egalement conditionnee par des messages (RNAs ou proteines qui en
derivent) deja produits dans l'oeuf avant la segmentation, prelocalises comme le
voudraient les supporters de la these de la Preformation.
A notre avis, ces interpretations auraient ete acceptables si les tests a 1'actinomycine precites (dans le cas ou les auteurs indiquent le protocole experimental)
avaient ete appliques de maniere continue depuis l'oeuf jusqu'aux stades qui ont
ete envisages precedemment et avec des traitements a l'antibiotique plus
efficaces. D'ailleurs, lorsque ces deux conditions sont respectees, le resultat
obtenu est tout autre: ainsi chez les Ascidies, Brahmachary (1966), Smith (1967)
et Reverberi (1971) ont montre que le developpement s'arrete avant la gastrulation, l'obtention d'un jeune 'tetard' est impossible. Par ailleurs les donnees
des experiences d'hybridation moleculaire DNA-RNA doivent egalement etre
Activite genetique au cours de Vembryogenese chez Eisenia
405
interpretees avec prudence (Britten & Kohne, 1968; Denis, 1974): celles-ci ne
font intervenir que les sequences repetitives du genome et seules peuvent done
etre prises en consideration les differences bien marquees existant entre les
courbes d'hybridation que Ton compare.
En definitive, il n'est pas impossible que les syntheses ribonucleiques qui ont
ete identifiers au cours de la periode pregastrulaire de ces embryons en mosaique
(Dauwalder, 1963; Neyfakh, 1964; Collier, 19656; Smith, 1967; Brahmachary,
Banerjee & Basu, 1968; Davidson, 1968; Collier & Yuyama, 1969; Firtel &
Monroy, 1970; Brahmachary & Palchoudhury, 1971; Brahmachary, Tapaswi &
Ghosal, 1971; Van den Biggelaar, 1971; Kidder, 1972a, b; Brahmachary, 1973;
McLean & Whiteley, 1974) aient un effet determinant sur la differentiation de
la gastrule et celle de la jeune larve. L'oocyte serait done charge de moins
d'informations qu'on avait estime.
C'est sous cet angle que nous avons aborde le probleme de la determination
embryonnaire chez une Annelide Oligochete, le Lombricien Eisenia fatida.
L'embryond' Eisenia f., comme tout germe en mosaique, presente une determination precoce de son developpement (Devries, 1973 c). Mais il revele une etonnante possibility de regulation lorsqu'on le soumet a diverses compressions
mecaniques peu avant le premier clivage (Devries, 1973 a). L'oeuf apparait
totipotent; les deux plasmes polaires animal et vegetatif qu'il renferme n'ont
pas de valeur determinante specifique. Cette particularite du developpement
offre un interet dans la mesure ou le determinisme embryonnaire sous son
aspect genetique est connu. Dans ce but nous avons soumis des embryons
d'Eisenia /., d'une part a des tests autoradiographiques utilisant l'uracile
marque, precurseur du RNA, ceci afin de connaitre l'etendue des syntheses
ribonucleiques au cours du developpement, et d'autre part a des tests a l'actinomycine D, inhibiteurs de ces memes syntheses (Desveaux-Chabrol, 1965),
permettant ainsi de nous renseigner sur leur degre d'influence dans la determination embryonnaire.
MATERIEL ET METHODES
Culture normale. Les ceufs fecondes et les embryons sont preleves directement
dans les cocons que Ton ouvre dans une solution glucosee a 2 %. Us sont ensuite
transportes a la pipette dans un milieu de culture constitue essentiellement par
du vitellus archenterique d'embryons ages. Pour plus de details sur cette
technique et sur le developpement embryonnaire normal, le lecteur pourra
consulter les travaux anterieurs (Andre, 1963; Devries, 1968, 1973 b).
Micromilieux de culture a Vuracile-^H et a Vactinomycine D. Dans le fond
d'une 'saliere' on depose sous une couche d'huile de paraffine, au moyen d'une
micropipette graduee a 1 trait, 2 ou 3 volumes egaux (chacun 1,5 mm3 environ)
de liquide vitellin auxquels on incorpore ensuite 1 volume de la solution-test:
uracile tritie ou actinomycine D. On melange l'ensemble a l'aide d'une microbaguette de verre. Les embryons mis au prealable en attente dans du jus
406
J. DEVRIES
embryonnaire normal sont implantes dans ces micromilieux a raison en general
de 2 a 5 embryons par 'saliere', celle-ci etant placee ensuite a l'obscurite et a la
temperature de 22 °C. Les concentrations finales des micromilieux en uracile-3H
(activite specifique 1 Ci/mM) sont de 25, 30 ou 33 /^Ci/ml; le traitement dure,
selon les cas 2 h 45 a 3 h 15. L'actinomycine D (Merck Sharp et Dohme Research Lab.) a ete appliquee a differentes doses, 6, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 96 /igf
ml, de maniere continue ou pendant des temps variables qui seront precises plus
loin dans le texte. Apres le traitement les embryons subissent 1 ou 2 ringages
dans une solution glucosee a 2 % puis, suivant les experiences, sont fixes
aussitot ou bien remis en culture dans du liquide embryonnaire normal en vue
d'une fixation ulterieure.
Fixation, autoradiographie et coloration des coupes. Les embryons sont fixes
au Bouin-Hollande, inclus dans la gelose-parafrine et coupes a 6-7/*m. Les
preparations histologiques destinees a l'autoradiographie subissent apres l'hydratation un traitement au CO3Li2 et a l'uracile non marque. Une fois sechees
elles sont recouvertes d'une emulsion photographique Ilford K2 et revelees au
bout d'un mois d'exposition au Kodak Dektol (technique de Rogers, 1969);
une coloration de fond au bleu de toluidine est utilisee. Les coupes d'embryons
issus des traitements a l'actinomycine sont colorees a l'hematoxyline ferrique.
RESULTATS ET INTERPRETATIONS
I. Etude autoradiographique
Des ceufs et embryons (324 provenant de 89 cocons) ont ete cultives en
presence d'uracile tritie a differents stades du developpement depuis remission
du ler globule polaire jusqu'a la gastrule.
(1) Jeunes stades en segmentation
Chaque traitement (3 h) dure approximativement le temps d'un cycle cellulaire au cours de la segmentation. Dans le cas des plus jeunes embryons
(stades 2 a 11) dont le deroulement des divisions est relativement plus facile a
suivre in vivo au microscope, on peut appliquer le traitement de sorte qu'il se
termine a un moment prevu au cours du cycle, et proceder alors a la fixation.
La periode de maturation de l'ceuf apres la fecondation n'est accompagnee
apparemment d'aucune synthese de RNA. Dans un petit nombre de cas seulement nous avons detecte un marquage radioactif, extremement tenu, au niveau
des pronuclei male et femelle avant l'amphimixie.
Le marquage des noyaux a lieu au stade 2 (Fig. 1) mais il demeure encore
assez aleatoire jusqu'au stade 4 (question de permeabilite cellulaire?). II faut
attendre le stade 5 pour observer un marquage nucleaire effectif que Ton
retrouve alors aux etapes suivantes de la segmentation.
L'incorporation de l'uracile tritie a lieu a l'interphase apres la fusion des
caryomeres telophasiques et devient plus importante au debut de la prophase de
Activite genetique au cours de Vembryogenese
chez Eisenia
407
Tableau 1. Evaluation du marquage radioactif nucleaire {nombre de grains d'Ag
sur les noyaux en inter phase ou debut de prophase) chez des embryons of'Eisenia f.
fixes a differents stades pregastrulaires des la fin du traitement a Vuracile tritie
Stades 5
1
2
3
4
Autres
blastomeres (4)
—> Stades 7 2D* ou 2d*
ID*
40
56
18 \deb.
14/ int.
5 10 div
2 11 div
3 16 19
13 9 2
9
5
5
6
Stades
9 3D* ou2dl*
9
10
11
12
37
50
78
43
51
65
96
74
5
6
7
8
54
67
10
8
,
9
30
54*
40*
16
13
12
15
59
2 1 7 2 14
43
7 5 21 5 13
4\deb. 13 3 6 0 0
5/ int. 3 div 4 4 4
18
13
16
16
27
35
40
30
55
23
75
52
46
16
17
18
24
35
20
37
28
div
Mesoteloblastes (2)
Placules
19
10
17
12
4
30
14
8
10
15
6
8
10
4
9
13
7
6
7
6
10
0
Derniers meso- Autres celsomitoblastes lules mesoemis (4)
dermiques
A
r
36
31
3
1
10
9
11
5
2
4
6
3
13,3±4,3f
6
30
38
5
5
15 13
21
5
7
4
7,4 + 4,lt
7,9 ±3,9
7,8 ±4,5
5
Cellules
Entero- isctodermiWastes
ques (55
environ)
0
1
6,6±3,lf
77 1 7
20
?
8
12
11
Autres cellules a
destinee ecto- ou
endodermique (40 a 50)
N
10
6
4
,
A
Cellules mesoblastiques
emises (4 a 7)
Mesotelo-
Blastules blastes (2)
A
45 h t
10
8
29
22
7
22
13
13
t
28
54
56
~\
Autres blastomeres (8 a 9)
Stades
12 13 4d,* 4D,* 2dll*ou2dl2' 1
13
14
15
<
Autres blastomeres (5)
*
3dou2d2
17
30
20
11
Autres
blastomeres (5)
77 4 4
7
6
13,8±4,2
2
3
2
5
18,6±6,2
8
7
7,4 ±4,6
n 46
7*42
77 50
Cellules
endodermiques (40
environ)
9,5±5,4f
77 3 2
6,5 ±5,2
77 3 4
21
22
39
24
41
31
5
0
8
0
9,9 ±5,3
7*18
77 37
11,1 ±4,1
4,5 ±2,9
0
0
77 1 8
* Presence de plasmes dans ces blastomeres.
t Moyenne et ecart-type.
77: nombre de cellules testees.
div: blastomere en division,
deb. int.: debut d'interphase.
77 3 7
11,7 ±5,9
77 2 7
6,8 ±3,9
77 3 6
408
J. DEVRIES
Activite genetique au cours de Vembryogenese chez Eisenia
409
la mitose qui suit. Les grains d'Ag sont distribues au dessus du ou des nucleoles,
et largement dans l'espace nucleoplasmique ou se trouvent les chromosomes
(Tableau 1: embryons n° 1 a 15; Fig 2).
Chez Eisenia f. on sait ^importance que revet la presence des jMasmes
polaires de l'ceuf dans le deroulement de la segmentation (Devries, 1973 #). Les
blastomeres qui en heritent se trouvent alors dotes d'une aptitude plus prononcee a la division. La concentration puis la segregation des plasmes dans le
quadrant D ont fait de celui-ci le foyer constructif de l'embryon d'ou prennent
naissance en particulier les initiales ectodermiques et mesodermiques (2dlll et
4d). Or, fait interessant, Fincorporation de l'uracile est plus intense dans le
secteur D au niveau des blastomeres pourvus de granulations plasmiques,
c'est-a-dire successivement: ID (stade 5), 2D et 2d (stade 7), 3D et 2dl (stade
9), 4D, 4d, 2dll et 2dl2 (stades 11-13) (voir Tableau 1: embryons n° 1 a 15). Si
des granulations s'introduisent incidemment lors de la formation du stade 9
dans les micromeres 2d2 et 3d (Devries, 1968), ceux-ci presenteront une synthese
accrue de RNA comparable a celle des initiales dont ils sont issus (Tableau 1:
embryons n° 11 et 12). Les plasmes, a cote de leur pouvoir mitogenetique,
activeraient done les syntheses ribonucleiques nucleaires des blastomeres qui les
recoivent.
Les produits de ces syntheses sont liberes dans le cytoplasme lors de la disparition de la membrane nucleaire a la fin de chaque prophase. On peut observer
ce phenomene sur les coupes histologiques lorsque la fixation de l'embryon a
FIGURES 1 a 6
bg, bandelettes germinatives laterales; bl, blastopore; end, endoderme; mt, mesoteloblastes; pi, plasmes. Echelle, 20 /tm. Les cliches sont mis au point sur les grains
d'Ag.
Fig. 1. Stade 2 issu d'un ceuf (2 globules polaires et plasmes en place a chaque pole)
traite a l'uracile tritie 33 /tCi/ml pendant 3 h 15. Marquage du noyau interphasique
de AB et de celui de CD en fin de prophase.
Fig. 2. Stade 9 (race bicolor) issu d'un jeune stade 7 traite a l'uracile tritie 33 /iCi/ml
pendant 3 h 10. Coupe passant par les blastomeres 3D et 2dl; marquage de leur
noyau en interphase.
Fig. 3. Toute jeune blastule de 17 blastomeres issue d'un stade 9 age (3D + 2dl)
traite a l'uracile tritie 33 /tCi/ml pendant 3 h puis, apres rincage, cultive sur un milieu
normal pendant 5 h. Marquage nucleaire essentiellement.
Fig. 4. Stade 5 avec ID en division, issu d'un stade 4 en fin d'interphase traite a
l'uracile tritie 33 /tCi/ml pendant 3 h. Marquage cytoplasmique (fleche).
Fig. 5. Placule moyenne traitee a l'uracile tritie 30 /tCi/ml pendant 2 h 30. Coupe
transversale passant par les 2 mesoteloblastes; marquage nucleolaire visible sur
l'un des deux mesoteloblastes (fleche).
Fig. 6. Coupe transversale d'une toute jeune gastrule issue d'une placule agee, au
debut de la gastrulation, traitee a l'uracile tritie 25 ywCi/ml pendant 2 h 30 puis, apres
rincage, cultivee sur un milieu normal pendant 4 h 30. Marquage cytoplasmique
surtout; au niveau de l'endoderme, seules les travees cytoplasmiques intervitellines
sont marquees (fleches).
410
J. DEVRIES
lieu a ce moment-la et egalement lors de la metaphase (Fig. 4). A la telophase
on ne retrouve plus de grains d'Ag sur le cytoplasme, ce qui laisse supposer une
utilisation assez rapide des molecules de RNA immediatement apres leur
liberation. Si apres le traitement a l'uracile-3H les jeunes embryons sont maintenus en culture sur un milieu normal (3 a 6 h) jusqu'aux interphases suivantes,
on constate que les noyaux sont a nouveau nettement marques (Fig. 3); il
semblerait done que les molecules d'uracile tritie provenant de la degradation
precedente des RNAs dans le cytoplasme (et egalement celles qui n'ont pu etre
eliminees au cours du rincage intermediate) soient reincorporees par les
noyaux.
Au niveau des blastomeres A, B et C dont les divisions sont plus tardives le
marquage reste localise sur les noyaux.
(2) Blastules
A partir du stade de jeune blastule tous les noyaux sont nettement marques.
Les nucleoles apparaissent plus denses a la coloration au Bleu de Toluidine et
les grains d'Ag s'y localisent de preference. Cette activite nucleaire correspond
comme on le pense habituellement a une synthese de RNA ribosomial. Mais une
incorporation a lieu egalement dans le nucleoplasme (mRNA?). Les deux
mesoteloblastes, qui ont recu des granulations plasmiques a la suite du lignage
cellulaire de 2D, representent dans la blastule le lieu ou Ton decele toujours le
plus de molecules marquees. Les premiers elements mesoblastiques internes
qu'ils emettent incorporent le precurseur a un degre sensiblement le meme que
celui des autres blastomeres (Tableau 1: embryons n° 16 a 18).
Du fait de la dispersion des plasmes mitogenetiques au cours des clivages la
frequence des mitoses diminue dans la blastule, et en consequence la liberation
dans le cytoplasme des RNAs nucleaires a lieu moins souvent. Toutefois
certains de ces RNAs peuvent traverser la membrane des noyaux interphasiques;
on s'en rend compte sur des blastules qui a la suite du traitement a l'uracile sont
remises pendant 6 h en culture normale sans precurseur. Ce processus de
migration des produits nucleaires qui s'amorce ici prendra plus d'ampleur dans
la suite du developpement.
(3) Placules et gastrules
Les deux mesoteloblastes de l'embryon demeurent toujours le site le plus
actif dans l'incorporation de l'uracile tritie et les deux bandelettes mesodermiques qui en derivent sont a present le siege de syntheses ribonucleiques plus
importantes que celles observees dans l'ectoderme et Pendoderme (Tableau 1:
embryons n° 19 a 22; Fig. 5). Seules les deux premieres cellules internes emises
par les mesoteloblastes au stade de blastule, e'est-a-dire les 'enteroblastes',
conservent un marquage radioactif tres bas. Ce caractere du metabolisme
nucleaire est a mettre en relation avec la reduction de taille des nucleoles et la
Activite genetique au cours de V embryogenese chez Eisenia
411
diminution de la colorabilite nucleocytoplasmique de ces cellules, signes precurseurs de leur disparition ulterieure apres la gastrulation (Devries, 1971).
Dans tous les cas, quelle que soit l'origine des cellules, le marquage est surtout
nucleolaire, mais aussi nucleoplasmique au niveau des mesoteloblastes.
Au bout de 3 h de traitement on peut deja constater que la migration de
molecules marquees du noyau vers le cytoplasme a commence. Si les embryons
traites sont cultives sans precurseur avant la fixation pendant quelque temps
(3 a 6 h) la radioactivite detectee sur les coupes histologiques apparait alors
entierement cytoplasmique; au niveau des cellules endodermiques, seuls les
espaces intervitellins sont marques (Fig. 6).
L'entree en mitose des mesoteloblastes permet egalement, comme nous
l'avions vu precedemment chez les jeunes stades, la liberation des molecules
ribonucleiques nucleaires dans leur cytoplasme.
(4) Interpretation
Les resultats de ces experiences d'incorporation a l'uracile tritie montrent
que les syntheses nucleaires de RNA chez l'embryon d'Eisenia / . debutent tres
precocement, qu'elles se manifestent progressivement et cycliquement (jeunes
stades) au cours du developpement. Des observations similaires ont deja ete
decrites chez certains germes en mosaique (Neyfakh, 1964; Brahmachary,
Ghosal & Tapaswi, 1971; Brahmachary, Mallik & Tapaswi, 1972).
II faut noter de plus le role important que jouent les plasmes de l'ceuf dans
l'activation de ces syntheses. Le quadrant D en devient le foyer initial et de ce
point de vue il peut etre compare aux micromeres vegetatifs de l'embryon
d'Oursin (Czihak, 1968).
Le test autoradiographique applique ici ne permet pas de nous renseigner sur
la nature des RNAs synthetises au cours de l'embryogenese. Mais, en considerant les relations qui existent entre la localisation des grains d'Ag sur les
noyaux (nucleole ou nucleoplasme), l'aspect histologique des nucleoles et les
modalites de la migration des molecules marquees du noyau vers le cytoplasme, on peut distinguer deux periodes successives de syntheses ribonucleiques.
A la premiere periode qui s'etend jusqu'au stade de blastule correspondraient
principalement des syntheses de RNA non ribosomial, du type messager comme
le suggere le marquage radioactif important du nucleoplasme des noyaux. Ces
RNAs messagers ne sont liberes, semble-t-il, dans le cytoplasme qu'au moment
de la mitose et sont utilises aussitot. Un fait analogue a deja ete observe chez
plusieurs types de cellules (Prescott, 1964; Neyfakh & Kostomarova, 1971;
Abramova & Neyfakh, 1973). A titre d'hypothese, on peut penser que ces
RNAs sont de haut poids moleculaire (hnRNA?) et pour cette raison ne
traversent pas la membrane nucleaire des noyaux interphasiques. Selon Brachet,
O'Dell, Steinert & Tencer (1972) les nucleoles des blastomeres en clivage
(embryon d'Oursin) seraient plutot le siege d'une accumulation de proteines que
de RNA. Par ailleurs l'existence de syntheses de RNAs de transfert n'est pas
412
J. DEVRIES
Tableau 2. Traitements confirms a Vactinomycine (20 figjml)
Nombre
d'embryons
Debut du
traitement
Duree du
traitement
(jours)
12
Stades 2
11
Stades 4-5
4
Stades 7-9
(bicolor)
Stades 15-16
3
8
14
11
8
13
3a5
j
a
j 2
3
Jeunes blastules
(27 a 30 h)
Blastules de 40 h
3a4
Blastules moyennes
2a3
(50 h)
5
17
10
8
7
12
Blastules au debut
de 1'aplatissement
dorso-ventral (60 h)
Placules jeunes et
moyennes
Placules agees
Placules en debut de
gastrulation
Jeunes gastrules
Gastrules spheriques
de 0,2 mm
2a3
Stades maximaux atteints
Blastules spheriques (2 mesoteloblastes + 2 x 0 a 3 cellules
mesoblastiques)
Blastules spheriques (2 mt. + 2 x 1 a 3
cell, mes.)
Blastules spheriques (2 mt. + 2 x 1 a 3
cell, mes.)
Blastules spheriques (2 mt. + 2xO a 2
cell, mes.)
Blastules plus ou moins aplaties
(2 mt. + 2 x 5 a 8 cell, mes.)
2 blastules plus ou moins aplaties
(2 mt. + 2 courtes bandelettes
mesodermiques)
6 embryons aplatis (2 mt. + 2
courtes band, mesod.)
12 embryons aplatis (2 mt. + 2 courtes
band, mesod.) 1 embryon tres
anormal
Placules -+ *
2
Placules -> *
2
7 placules ->• * 3 en debut de
gastrulation
En gastrulation -> *
2
1
2a3
-> *
A peine plus grosses (arret du
developpement)
exclue, mais dans le cas present celles-ci ont ete effacees par les traitements
histologiques qui precedent Fautoradiographie.
A partir de la blastule, stade de transition, debute la seconde periode de
syntheses ribonucleiques jusqu'a la placule et la gastrule. Les noyaux des
cellules s'engagent surtout dans la production de RNAs ribosomiaux nucleolaires, ceux-ci pouvant franchir la membrane nucleaire et venir peupler ainsi
le cytoplasme environnant. Au cours de cette raerae periode il existe tres
probablement des transcriptions de RNA messagers. Le mesoderme qui
represente le feuillet directeur de l'embryogenese (Devries, 1974a, b, c) est le
siege d'une synthese ribonucleique toujours plus importante.
Activite genetique au cours de V embryogenese chez Eisenia
413
II. Traitements a Vactinomycine D
(A) Choix de la dose. Efficacite des traitements
La reaction des germes d'Eisenia f. a l'actinomycine varie etroitement avec la
concentration de celle-ci dans le milieu de culture, la duree et le moment
d'application du traitement au cours du developpement. Ainsi les embryons
ages, placules et gastrules, sont particulierement sensibles a l'actinomycine,
meme aux concentrations les plus basses (6 a 10 figjvaX). Les jeunes embryons
par contre supportent des doses plus fortes (80 et 96/*g/ml). Comme chez
Paracentrotus (Lallier, 1963) et les Amphibiens (Brachet, Denis & de Yitry,
1964) le developpement des embryons d'Eisenia f. progresse de moins en moins
avec des doses croissantes en antibiotique. Nous indiquerons ici les resultats
obtenus avec les concentrations en antibiotique que nous avons le plus frequemment utilisees: 20, 40 et 80/*g/ml.
L'efficacite de Faction inhibitrice de la drogue sur la synthese des RNAs dans
le noyau a ete verifiee. Une trentaine d'embryons d'ages differents (stades 2, 3,
5 et 7, blastules et placules) ont ete soumis a un traitement prealable de 5 h a
l'actinomycine a 40 /tg/ml, puis ont ete cultives pendant 3 h dans un milieu
mixte renfermant 40/^g/ml d'antibiotique et 30/tCi/ml d'uracile tritie. A
l'examen des coupes histologiques autoradiographiques le marquage radioactif
des embryons apparait nul dans la quasitotalite des cas.
(B) Traitements continus a 20 fig\ml (Tableau 2; observations portant sur 136
embryons issus de 35 cocons)
(1) Jeunes stades en segmentation. Lorsque le traitement commence aux
stades, 2, 4-5, 7-9 et 15-16, les embryons se segmentent normalement en une
jeune blastule (16 a 20 cellules, 30 h, 2 mesoteloblastes) mais ne depassent
pas le stade de blastule moyenne, meme si la culture est poursuivie pendant
4 jours, temps au bout duquel le stade de gastrule est normalement atteint
(Fig. 7).
L'antibiotique provoque chez ces embryons des modifications structurales qui
rappellent beaucoup celles deja observees par Sanchez (1966, 1968) sur les
ovocytes d'Oursin. Les noyaux spheriques ou ovoides a contour plus ou moins
regulier presentent une membrane plus colorable. Frequemment contre celle-ci
sont plaques les nucleoles qui sont de taille reduite en general (parfois absents).
Le cytoplasme parait plus granuleux et prend difficilement la coloration a
Fhematoxyline. Nous y avons remarque dans plusieurs cas l'existence de
curieux corpuscules spherulaires ressemblant a des grains vitellins noiratres ou
a de grosses vesicules vides de leur contenu (Figs. 8, 9); la signification de ces
structures aberrantes est inconnnue.
Chez plus du tiers des blastules bloquees par l'actinomycine certains blastomeres (2 ou 3), places a cote de blastomeres ectodermiques indifferencies,
commencent a presenter, fait inhabituel a ce stade, des caracteres de cellules
414
10
J. DEVRIES
I
I
13
16
Activite genetique au cours de V embryogenese chez Eisenia 415
endodermiques comme en temoigne la presence de nombreux globules vitellins
dans leur cytoplasme (Fig. 7).
(2) Blastules. Tout traitement debutant au stade de jeune blastule (30 h) ou de
blastule moyenne (40 et 50 h) inhibe encore tres vite le developpement. Les
embryons subissent, d'une maniere plus ou moins nette, l'aplatissement dorsoventral caracteristique sans toutefois acquerir une forme et une symetrie
normales. Ces pseudoplacules bloquees par l'actinomycine (Fig. 10) presentent
toujours une accumulation de vitellus tres active au niveau des cellules endodermiques ventrales. L'ectoderme dorsal est parfois reduit et ne differencie des
cellules ciliees que dans peu de cas. Le mesoderme est difficilement colorable;
son developpement peut atteindre celui de la placule moyenne. D'une maniere
generate les nucleoles dans toutes les cellules ont une taille reduite.
Des placules typiques ne sont produites que si l'antibiotique est applique a
partir du stade de 60 h. Mais le developpement ne progresse pas plus loin: tres
FIGURES 7 a 16
blend, blastomere endodermique avec grains de vitellus; bm, bandelette mesodermique; cil, cellules ciliees; cm, cellules mesoblastiques; est, cellules stomodeennes;
ect, ectoderme; end, endoderme; mes, mesoderme; mt, mesoteloblaste. Echelle,
20 /tm.
Fig. 7. Embryon bloque au stade de blastule, issu d'un stade 2 traite a l'actinomycine 20 /tg/ml pendant 5 jours.
Fig. 8. Embryon bloque au stade de blastule, issu d'un stade 2 traite a l'actinomycine
20/tg/ml pendant 4 jours. Fleche: corpuscules spheriques intracytoplasmiques.
Fig. 9. Embryon bloque au stade de blastule, issu d'un stade de 15 blastomeres
traite a l'actinomycine 20 /<g/ml pendant 3 jours et 6 h. Fleche: corpuscules spheriques intracytoplasmiques.
Fig. 10. Embryon bloque a un stade qui s'apparente a la placule, issu d'une blastule
spherique de 40 h traitee a l'actinomycine 20/tg/ml pendant 4 jours. Fleche:
nucleole de taille reduite dans l'un des deux mesoteloblastes, ceux-ci ont emis au
total dans cet embryon 2 x 8 cellules mesoblastiques.
Figs. 11 et 12. Embryons anormaux issus d'un lot d'oeufs (ler globule polaire)
traites a l'actinomycine 20 /tg/ml pendant 27 h et cultives ensuite sans antibiotique
pendant 4 jours. L'embryon de la Fig. 12 est depourvu de mesoderme.
Fig. 13. Embryon en forme de blastule plus ou moins spherique, issu d'un stade 4
traite a l'actinomycine 40 /tg/ml pendant 8 h, puis cultive normalement pendant
4£ jours. Les 2 mesoteloblastes ont emis seulement 4 petites cellules mesoblastiques
internes; les cellules ectodermiques sont peu nombreuses (fleche).
Fig. 14. Embryon placuloide anormal issu d'un stade 4 traite pendant 8 h a l'actinomycine 40/tg/ml, puis cultive sans antibiotique pendant 4£ jours. Endoderme
vitellin a peine invagine; pas de cellules ciliees, ni de cellules stomodeennes.
Fig. 15. Embryon placuloide anormal issu d'un stade 4 traite a 1'actinomycine
80/ig/ml pendant 10 h et cultive ensuite normalement pendant 4^ jours. Sur cette
coupe l'endoderme est peu abondant.
Fig. 16. Embryon placuloide anormal issu d'un stade 2 traite a l'actinomycine
80 /tg/ml pendant 6 h, puis cultive sans antibiotique pendant 5 jours. Pas de mesoderme, ni de cellules stomodeennes.
416
J. DEVRIES
sensibles a la drogue, les embryons degenerent sans avoir subi la moindre
invagination gastrulaire.
(3) Placules et gastrules. Mises en presence d'actinomycine, les placules
voient d'emblee leur evolution bloquee et meurent tres tot. Seules les placules
agees au tout debut de l'invagination endodermique s'averent capables de
franchir l'etape de la gastrulation. Mais a partir de ce stade l'actinomycine
exerce une inhibition de plus en plus forte et le developpement des embryons
s'arrete.
(4) Interpretation. II parait logique d'admettre a la suite de ces resultats que le
developpement de l'ceuf d'Eiseniaf. peut s'effectuer jusqu'au stade de blastule
(jeune blastule a blastule moyenne) en l'absence de toute information genetique
nouvelle. On peut objecter cependant que la dose utilisee de 20 /*g/ml ne suffit
pas a bloquer toute l'activite genetique; en fait l'application de doses plus fortes
de 30 et 40/tg/ml dans les memes conditions ou de 80/^g/ml en traitements
discontinus (voir plus loin) ne change en rien ces resultats.
II est done possible de considerer compte tenu des donnees acquises chez les
Echinodermes et les Amphibiens (Gross & Cousineau, 1963; Barros, Hand &
Monroy, 1966; Brachet, 1967, 1969; Davidson, 1968) que les RNAs controlant
les syntheses proteiques necessaires au deroulement de la segmentation ont ete
produits avant le ler clivage.
II semble que les transcriptions genetiques responsables du developpement
postblastulaire ne commencent qu'a la fin de la segmentation puisque les
traitements appliques a des stades 15-16 bloquent encore le developpement au
stade de blastule. Ces transcriptions, comme nous l'avons indique au cours de
l'etude autoradiographique, concernent surtout le RNA ribosomial (nucleoles)
et aussi le mRNA. En traitant, comme nous l'avons fait, des blastules de
differents ages (30, 40, 50 et 60 h) on permet aux premieres nouvelles syntheses
ribonucleiques de s'effectuer. Le blocage du developpement se trouve reporte au
plus tard au stade de placule. La formation de la placule apparait ainsi determinee par des transcriptions genetiques anterieures survenues au stade de
blastule. De la meme facon nous avons montre que la phase critique de la
gastrulation necessite la derepression de certains genes juste avant sa realisation
(placule agee).
Cependant, les traitements continus a l'actinomycine ne permettent pas de
savoir si des syntheses de RNA se trouvent impliquees (ou non) au cours de la
segmentation dans la determination du developpement postblastulaire. Seules
des expositions a l'antibiotique de duree limitee appliquees a de jeunes stades
doivent pouvoir nous renseigner a ce sujet.
(C) Traitements discontinus
(1) Traitements a 20 /igjml (Tableau 3; observations portant sur 82 embryons
issus de 18 cocons). Des embryons mis en presence d'actinomycine 20/tg/ml,
des les stades a ler, 2eme globule polaire, ou a 2 blastomeres, et maintenus dans
Activite genetique au cows de Vembryogenese chez Eisenia 417
Tableau 3. Traitements discontinus a Vactinomycine {20 ftgl
Nombre
d'em- Debut du
bryons traitement
Duree de
Duree du
la culture
traitement Stades a la fin sans Act. D
(h)
du traitement
(jours)
4
5
2eme GP
Stades 2
10
4
2eme GP
18
7
Stades 2
4
6
lerGP
Stades 2
24
7
lerGP
27
4
lerGP
30
5
ler GP
35
4
Stades 2
43
9
Stades 7
18
3
Stades 11
18
5
Jeunes
blastules
de30h
Blastules
de40h
Blastules
de 48h
Blastules
de50h
18
4
7
4
18
10
18
Stades 5
Stades 7-9
(bicolor)
Stades 9-11
(bicolor)
Stades 12-14
Stades atteints
4
Gastrules
3
Placules en invagination,
sauf une
2 placules, 1 gastrule,
2 anormaux, 2 blastules
4
Stades 12-14
Jeunes blastules
Jeunes blastules
Jeunes blastules
3
4
Placules
2 gastrules, 4 anormaux
4
Blastules
spheriques
Blastules
spheriques
Jeunes blastules
Blastules
spheriques
Blastules
spheriques
2
5
4 gastrules dont 1 anormale, 3 anormaux
Blastules spheriques
(2 mesoteloblastes +
2x3 cellules mesoblastiques)
Blastules spheriques
(2 mt.+ 2 x 4 cell, mes.)
Blastules spheriques
(2 mt. + 2 cell, mes.)
Gastrules agees
5
Gastrules agees
3
Gastrules
3
3
Placules completes
informes
Placules peu developpees
2
Placules 'epaisses' -» *
Blastules
aplaties
Blastules
aplaties
Placules
circulaires
2
2
ces conditions au-dela du stade de jeune blastule (traitements de 30 a 43 h)
voient leur developpement bloque definitivement a l'etat de blastule spherique
moyenne. Si les traitements sont interrompus plus tot (traitement de 10 a 27 h),
les germes evoluent dans la plupart des cas normalement en placule et gastrule,
mais un petit nombre d'entre eux deviennent anormaux et n'effectuent pas
toujours la gastrulation (Figs. 11, 12).
27
BIB
35
418
J. DEVRIES
Tableau 4. Traitements de courtes durees a Vactinomycine {80 jug/ml)
Stades atteints
A
Duree
la
du
Debut
du
traitement
traitement
(h)
Stades 2
Stades 3-4
6.9
6.10
Stades 5-7
(bicolor)
Stades 9-11
(bicolor)
Stades 24 h
10
Jeunes
blastules
(30-34 h)
Blastules
de40h
Blastules
moyennes
(51 h)
Blastules
un peu
aplaties
8.9
6
9
8
8
8
Stades a la
fin du
traitement
culture
sans
Act. D
(jours)
,
A
^
Placules
Em-
en
bryons Inva- invagina- GasBlastules aplatis gines
tion
trules
6
* 6
* 4
9
3
—
—
—
—
3
8
—
—
—
3
*
3
—
2
2
7
*
1
3
2
7
—
7
—
3
6
4
—
2
—
2->*
3
—
—
—
12->*
—
3
—
—
—
4 -> +
—
Stades 5-7
4a5
Stades 7-11 4 £ a 5
(bicolor)
4
Tres jeunes
blastules
4
Tres jeunes
blastules
5
Jeunes
blastules
Blastules
4a5
spheriques
Blastules
moyennes
Blastules
un peu
aplaties
Jeunes
placules
Normaux
Anormaux
Duree de
5
Par contre les traitements (18 h) qui debutent aux stades 7, 11 et de jeune
blastule de 30 h ne s'accompagnent d'aucun trouble de la gastrulation, les
embryons obtenus sont tous normaux.
Traitees de la meme maniere pendant 18 h ou 10 h seulement des blastules
moyennes de 40 h et de 48 h peuvent evoluer en jeunes placules circulaires mais
leur developpement finit par se bloquer; la gastrulation est inhibee.
L'ensemble de ces resultats s'accorde parfaitement avec Interpretation
donnee precedemment selon laquelle une activite genetique se met en train des
la fin de la segmentation. Par ailleurs on entrevoit l'existence de transcriptions,
limitees apparemment aux premiers stades de la segmentation, qui seraient
indispensables au deroulement normal du developpement postblastulaire, mais
dont l'inhibition par l'antibiotique est mal controlee dans nos experiences a
cause vraisemblablement de la faible dose utilisee. Avec une concentration de
40/£g/ml l'effet de l'actinomycine est d'ailleurs plus prononce: des stades de 2
a 4 blastomeres traites pendant seulement 8 h conduisent a un pourcentage plus
eleve d'embryons anormaux, les uns bloques au stade de blastule plus ou moins
spherique, d'autres difformes plus evolues (Figs. 13, 14). Comme nous allons
Activite genetique au cours de V embryogenese chez Eisenia
419
le voir ces resultats sont mis en evidence de facon plus nette par des traitements
a plus forte dose.
(2) Traitements de courtes durees (6 a 10 h) a 80 fijml [Tableau 4; observations
portant sur 110 embryons (71 survivants) issus de 33 cocons]. Les stades 2 a 7
cultives dans ces conditions se developpent toujours anormalement. Certains
evoluent seulement en blastules plus ou moins spheriques oil Ton peut reconnaitre, a cote de blastomeres indifferencies, des cellules endodermiques vitellines
bien developpees et les deux mesoteloblastes qui a ce stade ont emis au plus
deux ou trois cellules mesoblastiques. Les nucleoles, malgre cette interruption
apparente du developpement temoignent dans Pensemble d'une activite reelle
que le retour a des conditions normales de culture a certainement favorisee.
Les individus les plus avances subissent l'aplatissement dorso-ventral a des
degres divers, mais ne parviennent jamais a former de placules typiques. Les
trois composantes habituelles, ectoderme, endoderme et mesoderme, qui sont
en general representees, se repartissent un peu irregulierement entre elles, ce qui
donne aux embryons Failure de 'placules ratees' (Figs. 15, 16). L'endoderme
vitellin plus ou moins palissadique est toujours present. Les cellules ectodermiques de recouvrement, en quantite variable, sont accompagnees ou non de
cellules ciliees. II faut noter en general un developpement modere du feuillet
mesodermique (parfois absent). Dans tous les cas la gastrulation est inhibee.
Si les traitements debutent entre le stade 9 (bicolor) et la jeune blastule, les
chances d'obtenir une evolution normale du developpement sont nettement
ameliorees. Chez les individus anormaux des cellules ciliees et stomodeennes se
differencient et la gastrulation dans certains cas n'est plus inhibee.
Apres le stade de jeune blastule on entre dans la periode de transcription tres
importante qui marque le developpement postblastulaire. De breves expositions
a l'actinomycine aux fortes doses suffisent alors a bloquer les embryons au
stade de placule et entrainer leur mort.
En resume, ces dernieres experiences confirment une fois de plus les resultats
des cultures continues. De plus, il ressort que la segmentation de l'embryon
n'est pas une periode vide d'activite genetique: des informations elaborees plus
particulierement lors des premiers stades (avant le stade 9) ont une action
determinante sur la differenciation ulterieure de la blastule.
DISCUSSION, CONCLUSION
En confrontant les donnees obtenues a la suite de ces deux tests a l'uracyle-3H
et a l'actinomycine D, il est possible de tracer une premiere esquisse de ce que
doit representer, sous son aspect genetique, le determinisme du developpement
embryonnaire, de l'ceuf a la gastrule, chez Eisenia f.
L'oeuf indivis renferme tous les elements permettant le deroulement de la
segmentation jusqu'au stade de blastule. Les plasmes polaires apparus peu
avant le ler clivage jouent a cet egard un role de premier plan par suite de leurs
proprietes mitogenetiques (Devries, 1973a). Celles-ci sont certainement a
27-2
420
J. DEVRIES
mettre en relation avec la structure particuliere de ces formations plasmiques qui,
en microscopie electronique, apparaissent formees d'une ebauche de reticulum
endoplasmique enserrant de tres nombreuses mitochondries et des particules de
glycogene (Devries, etude en cours).
Les syntheses ribonucleiques nucleaires debutent tres precocement (stade 2)
et se poursuivent sans interruption (en dehors des mitoses) dans tous les blastomeres au fur et a mesure que progresse l'embryogenese. Deux periodes peuvent
etre distinguees: la premiere correspondant a la segmentation et la suivante au
developpement postblastulaire jusqu'au stade de gastrule.
Au cours de la premiere periode, des RNAs, du type messager principalement,
seraient produits. On pourrait penser que ces RNAs servent a l'elaboration des
proteines necessaires aux clivages de segmentation, comme le suggererait le fait
que les plasmes polaires ont une action a la fois sur le rythme mitotique et sur
les syntheses ribonucleiques. En realite, les traitements a l'actinomycine
demontrent que les RNAs emis au cours de la segmentation ne sont pas indispensables au deroulement propre de cette periode du developpement, mais
qu'ils interviennent de facon determinante sur la differenciation ulterieure
apres le stade de blastule. A notre avis la determination precoce des blastomeres
(Devries, 1973 c), celle des blastomeres ectodermique et endomesodermique 2d
et 2D notamment, est liee a cette premiere vague d'activation genetique. La
production cyclique des RNAs aux interphases et leur liberation hors du noyau
a chaque division appartiennent peut-etre au mecanisme de la determination
embryonnaire dont nous avions deja soupc.onne les rapports avec le rythme
mitotique chez les jeunes stades (Devries, 1913a). Selon Gurdon & Woodland
(1968), c'est a la telophase que s'effectuerait la regulation des genes.
La seconde periode du developpement a partir du stade de blastule est le
siege d'une synthese importante de molecules de RNA ou le type ribosomial
semble dominer sur le type messager. Ces RNAs qui peuvent migrer vers
l'exterieur du noyau a travers la membrane nucleaire semblent etre utilises au
fur et a mesure de leur production pour la differenciation immediate de l'embryon, en particulier celle de la placule et de la gastrule.
Le 'pattern' genetique des determinations embryonnaires chez Eisenia f. se
rapproche en definitive beaucoup plus de celui d'un germe a regulation, aux
seules differences que, les Echinides etant pris comme reference, l'entree en
activite des genes est plus precoce et les transcriptions genetiques determinantes
ne sont pas limitees a une periode restreinte de l'ontogenese (Olsson, 1967;
Giudice, 1973). Dans les deux cas il existe dans l'embryon un foyer plus actif de
syntheses ribonucleiques: les micromeres vegetatifs de l'embryon d'Oursin au
4eme clivage (Czihak, 1968), le quadrant D chez Eisenia f.
Le fait que les syntheses ribonucleiques atteingnent un degre plus eleve au
niveau du mesoderme chez l'embryon d'Eisenia f. est vraisemblablement en
rapport avec le role directeur joue par ce feuillet au cours de l'embryogenese
(Devries, 1974<ar, b, c).
Activite genetique au cours de Vembryogenese chez Eisenia
421
Les informations necessaires au developpement postblastulaire (placule,
gastrulation) ne sont pas pretranscrites dans l'oeuf indivis, contrairement aux
interpretations donnees cHez certains Spiralia et Prochordes (voir introduction).
Plusieurs auteurs l'ont deja souligne, la distinction entre les deux categories de
germes, en mosaique et a regulation, est de plus en plus difficile a justifier
actuellement. L'embryogenese du Lombricien Eisenia f. est un bon exemple
pouvant argumenter cette these.
RESUME
Des embryons d'Eisenia foetida (Spiralia) ont ete cultives a differents stades du developpement, de l'oeuf a la gastrule, en presence d'uracile-3H, precurseur des RNAs. Les resultats
obtenus indiquent que les syntheses ribonucleiques, detectees par autoradiographie, debutent
precocement. Au cours de la segmentation des RNAs du type messager sont produits par les
noyaux en interphase et liberes cycliquement a chaque mitose dans le cytoplasme. A partir
du stade de blastule on observe une predominance de RNAs ribosomiaux (nucleoles) qui
peuvent migrer directement a travers les membranes nucleaires. Les blastomeres porteurs de
plasmes polaires et le mesoderme deja connu pour son role directeur de 1'embryogenese apres
la gastrulation sont le siege de syntheses ribonucleiques to ujours plus importantes.
Ces transcriptions genetiques qui peuvent etre inhibees par l'actinomycine D sont impliquees dans la determination des blastomeres des jeunes embryons et la differenciation postblastulaire. Seuls les messages necessaires aux divisions de segmentation preexistent dans
l'oeuf indivis.
Extrait en partie d'une these (1972) enregistree aux Archives Originales du C.N.R.S. sous
le n° 7715 (France).
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