/. Embryol. exp. Morph. Vol. 32, l,pp. 133-145, 1974
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Printed in Great Britain
Mise en evidence du role, dans la
regeneration des Amphibiens, dune glycoproteine
secretee par la cape apicale: etude cytochimique
et autoradiographique en microscopie electronique
Par CLAUDE CHAPRON 1
Laboratoire de Zoologie 'A', Universite de Bordeaux
SUMMARY
Evidence for the role of an apical cap glycoprotein in
amphibian regeneration: cytochemical and autoradiographic
electron-microscopic studies
Early during limb regeneration in the newt, an ectodermal apical cap covering a mesodermal blastema is formed. High-resolution autoradiography of these tissues has been
carried out after incorporation of [3H]fucose, which is a precursor of glycoproteins. Autoradiography shows that silver particles are located at first on epithelial cells, then on
mesenchymatous cells. This observation is consistent with a hypothesis in which the apical
cap would elaborate a glycoprotein acting on the blastema. Substructural autoradiography
and cytochemistry also show the importance of cellular surfaces for both cells producing
glycoprotein and those which are target cells.
INTRODUCTION
On sait que les Urodeles regenerent bien leurs membres. Apres amputation,
la plaie est fermee par un epithelium cicatriciel qui, au bout d'une dizaine de
jours, s'epaissit pour former une cape ou coiffe apicale. Celle-ci parait jouer
un role important dans la mise en place et la multiplication des cellules de
regeneration (Thornton, 1957, 1960). Dans une etude experimental recente
nous avons montre qu'elle intervenait probablement par l'intermediaire d'une
secretion glycoproteique (Chapron, 1973). Nous apportons ici de nouveaux
arguments en faveur de cette hypothese.
Differentes methodes, adaptees a la microscopie electronique, ont ete
utilisees: coloration des glycoproteines du cytoplasme et de la surface cellulaire
et surtout technique autoradiographique avec l'emploi du fucose-3H. Le fucose
1
Adresse de Vauteur: Laboratoire de Zoologie 'A', Universite de Bordeaux I, Avenue
des Facultes 33405 Talence, France.
134
C. CHAPRON
est en effet un constituant de la plupart des glycoproteines; de plus c'est un
sucre qui ne se transforme pratiquement pas en glucose et en acides amines
(Coffrey, Miller & Sellinger, 1964; Bennett & Leblond, 1970) et qui par
consequent participe peu a la synthese du glycogene et des proteines; on peut
le considerer comme un precurseur specifique des glycoproteines (Bekesi &
Winzler, 1967).
MATERIEL ET METHODES
Cent Tritons adultes de l'espece Triturus cristatus sont amputes d'une main
et d'une portion d'avant bras. Douze jours plus tard on selectionne les individus
(30) qui ont des regenerats sensiblement au meme stade de developpement. Ces
regenerats comprennent alors une cape apicale en contact etroit avec un
blasteme mesodermique forme par les cellules de regeneration. Us sont
preleves et fixes dans le glutaraldehyde dilue dans du tampon phosphate
0,1 M de ph 7,25 pendant 1 h. Les pieces sont ensuite rincees dans le meme
tampon phosphate et post-fixees par le tetroxyde d'osmium pendant 30 min.
Toutes les manipulations sont effectuees a la temperature du laboratoire.
L'inclusion est faite dans l'Epon et les coupes minces (gris-argent) sont obtenues
avec le microtome Porter-Blum MT1.
Les particularites de chaque technique utilisee peuvent etre resumees ainsi.
Technique de coloration des glycoproteines cytoplasmiques (Thiery, 1967)
Les coupes fines sont prelevees sur des grilles en or et oxydees par l'acide
periodique. Celui-ci fait apparaitre, a partir des polysaccharides, des groupements aldehydiques qui sont alors visualises par un traitement au Thiocarbohydrazide (TCH) - proteinate d'argent. Alors qu'un temps de contact,
avec le TCH, d'une heure suffit pour mettre en evidence le glycogene, il faut
plus de 48 h pour reveler les polysaccharides lies aux proteines, c'est a dire
les glycoproteines.
Technique de coloration des glycoproteines de surface (Luft, 1964)
On melange du rouge de ruthenium aux solutions de glutaraldehyde et de
tetroxyde d'osmium (concentration: 0,3%).
Technique autoradiographique (Larra & Droz, 1970)
Cinq minutes, 1 h ou 4 h avant la fixation, les animaux rec.oivent, au niveau
des regenerats, une injection de 0,5 mCi de L-fucose-3H (activite specifique:
1,4 Ci/mmole). Les coupes fines sont recueillies sur des lames de verre portant
une couche de celloidine. Elles sont alors colorees a I'acetate d'uranyle pendant
20 min et au citrate de plomb pendant 2 min et recouvertes d'un film de
carbone avant d'etre trempees dans l'emulsion L4 de Ilford. Apres une duree
Glycoproteine dans la regeneration des amphibiens
135
d'exposition de 10 semaines les autoradiographies sont revelees par le Microdol
et fixees par le thiosulfate de sodium.
Ces differentes techniques ont ete appliquees aux 30 regenerats selectionnes
et repartis en 6 series de 5 regenerats chacune:
Serie I: Traitement, selon la technique de Thiery, au TCH pendant 1 h.
Serie II: Traitement au TCH pendant 72 h.
Serie III: Traitement au rouge de ruthenium.
Serie IV: Autoradiographie apres 5 min d'incorporation de fucose-3H.
Serie V: Autoradiographie apres 1 h d'incorporation.
Serie VI: Autoradiographie apres 4 h d'incorporation.
Une serie supplemental (Serie VII) concerne deux regenerats ages de
20 jours et fixes 1 h apres l'injection de fucose-3H. Ces regenerats different
histologiquement des regenerats plus jeunes par la presence d'une membrane
basale qui separe l'epithelium superficiel du mesoderme sous jascent.
OBSERVATIONS
La cape apicale (epithelium ectodermique a 10 ou 12 couches), la membrane
basale et le blasteme (ensemble de cellules eparses de type mesenchymateux)
ont deja ete decrits en microscopie electronique par Salpeter & Singer (1960o,
b), Norman & Schmidt (1967), Bryant, Fyfe & Singer (1971). Ces etudes
serviront de base a nos observations cytochimiques et autoradiographiques.
Observations cytochimiques (Series I a III)
L'observation de coupes traitees selon la technique de Thiery et restees en
contact avec le TCH pendant 1 h (Serie I) montre tres nettement la presence
de glycogene dans les cellules de la cape apicale (Fig. 1). Si on prolonge le
temps de contact pendant 72 h (Serie II) on retrouve les memes particules de
glycogene mais on n'observe aucun autre type de granule. La technique de
Thiery ne permet done pas de mettre en evidence des glycoproteines dans les
cellules epitheliales du regenerat. La meme technique appliquee aux cellules
blastematiques (Fig. 2) donne egalement des resultats negatifs.
En revanche, l'emploi du rouge de ruthenium (Serie III) revele bien la
presence de glycoproteines mais a la surface des cellules, dans le coat ou
glycocalyx. Au niveau des cellules epitheliales le coat est continu et d'une
epaisseur importante, de l'ordre de 100 nm (Fig. 3). Parfois il parait detache
de la membrane plasmique formant ainsi des granules glycoproteiques intercellulaires (Fig. 4). En ce qui concerne les cellules blastematiques, les glycoproteines de surface sont reparties inegalement, plus abondantes a certains
endroits qu'a d'autres (Fig. 5).
136
C. CHAPRON
Glycoproteine dans la regeneration des amphibiens
137
Observations autoradiographiques (Series IV a VII)
Dans le cas des regenerats ages de 12 jours nous avons determine pour
chaque temps d'incorporation (5 min, 1 h et 4 h) 1'intensite de la reaction
autoradiographique (IRA) dans le cytoplasme et le coat des cellules epitheliales
et blastematiques. Les modalites de ce calcul sont les suivantes. On selectionne
dans chacun des cinq regenerats d'une serie experimentale donnee (Serie IV
a VI) Tune des coupes les plus sagittales. On compte le nombre de grains
d'argent presents sur ces cinq coupes au niveau du cytoplasme et du coat
pour l'ensemble des cellules epitheliales et blastematiques. Precisons que nous
avons considere comme appartenant au coat tout grain qui presente au moins
un point de contact avec la face externe ou la face interne de la surface cellulaire.
On etablit ensuite le nombre moyen de grains d'argent par coupe et on a ainsi
1'intensite de la reaction autoradiographique pour chaque compartiment cellulaire et pour chaque type cellulaire. Les chiffres obtenus sont rapportes dans
le Tableau 1 et sur la Fig. 6. Us peuvent etre considered comme significatifs
dans la mesure ou nous avons fait intervenir dans leur determination un grand
nombre de cellules.
En ce qui concerne les regenerats ages de 20 jours (Serie VII) nous avons
fait seulement des observations qualitatives.
Cas des regenerats de 12 jours fixes 5 min apres
Vinjection de L-fucose-zH (Serie IV)
La radioactivite est localisee au cytoplasme des cellules de la cape apicale
(Fig. 7). Elle y est tres intense (IRA = 3270). La plupart des grains d'argent
sont concentres sur les dictyosomes ou a leur voisinage.
FIGURES
1-5
Etude cytochimique des cellules de la cape apicale et du
blasteme (regenerats de 12 jours)
Fig. 1. Cellule epitheliale traitee selon la technique de Thiery. Temps de contact
avec le TCH: 72 h. Les seuls granules visibles sont des grains de glycogene. gl,
glycogene; mf, microfilaments; n, noyau.
Fig. 2. Cellule blastematique traitee selon la technique de Thiery. Temps de contact
avec le TCH: 72 h. Aucun granule de glycogene ou de glycoproteine n'est reperable.
g, appareil de Golgi; m, mitochondria; n, noyau; r, reticulum.
Fig. 3. Cellule epitheliale coloree par le rouge de ruthenium. Le coat est epais.
c, coat; mf, microfilaments.
Fig. 4. Cellule epitheliale coloree par le rouge de ruthenium. Des portions de coat
sont detachees de la surface cellulaire. c, coat; mf, microfilaments.
Fig. 5. Cellule blastematique coloree par le rouge de ruthenium. Des granules
glycoproteiques (gg) sont fixes sur la membrane plasmique (mp).
138
C. CHAPRON
Tableau 1.
Radioactivite d'une coupe sagittate de regenerat
en nombre de grains d'argent
Duree de
l'incorporation
(min)
Cape apicale
Blasteme
Cytoplasme
Coat
Cytoplasme
Coat
3270
0
312
0
88
330
0
280
5
60
240
864
180
1150
1032
2700 -
1800
900
_CB
240
60
Temps d'incorporation
Fig. 6. Courbes traduissant revolution, en fonction du temps d'incorporation, de la
radioactivite dans le cytoplasme et le coat des cellules epitheliales et blastematiques
(regenerats ages de 12 jours). •
• , radioactivite dans le cytoplasme (CE) et
le coat (GE) des cellules epitheliales. O
O, radioactivite dans le cytoplasme
(CB) et le coat (GB) des cellules blastematiques.
Cas des regenerats de 12 jours fixes 1 h apres
V injection de L-fucose-3H (Serie V)
Dans ces regenerats la radioactivite est reperable a la fois dans les cellules
de la cape apicale et dans celles du blasteme. Au niveau de la cape apicale le
cytoplasme est marque (IRA = 864) mais le coat (IRA = 312) et les espaces
intercellulaires le sont egalement (Fig. 8). Dans le cytoplasme les grains d'argent
sont le plus souvent sur l'appareil de Golgi mais parfois aussi en dehors et
Glycoproteine dans la regeneration des amphibiens
139
a proximite de la membrane plasmique. Au niveau des cellules blastematiques
(Fig. 9) le cytoplasme montre une legere reaction autoradiographique (IRA =
88); celle-ci est trois fois plus importante dans le coat (IRA = 280).
Cas des regenerats de 12 jours fixes 4 h apres
V inject ion de L-fucose-3H (Serie VI)
Par rapport au cas precedent la radioactivite (Fig. 10) diminue dans le
cytoplasme des cellules epitheliales (IRA = 180) alors qu'elle augmente dans
le coat (IRA = 1150). La somme des radioactivites de chaque compartiment
est comparable dans les deux cas. En ce qui concerne les cellules blastematiques
(Fig. 11) 1'evolution est bien differente. En effet la radioactivite croit dans le
cytoplasme (IRA = 330) comme dans le coat (IRA = 1032). 11 est a remarquer
que dans le cytoplasme les grains d'argent recouvrent rarement les dictyosomes
ou le reticulum: ils sont le plus souvent en relation avec des vacuoles de type
lytique (Fig. 12).
Cas des regene'rats de 20 jours fixes 1 h apres
V injection de L-fucose-3H (Serie VII)
Les cellules epitheliales et la membrane basale montrent une radioactivite
peu importante mais decelable (Fig. 13). En revanche dans les deux regenerats
examines nous n'avons pas observe de radioactivite au niveau des cellules
blastematiques indifferenciees.
INTERPRETATION ET CONCLUSION
Nos observations autoradiographiques des regenerats ages de 12 jours
montrent que la radioactivite due au fucose-3H s'observe avec une grande
intensite dans le cytoplasme des cellules epitheliales au tout debut de l'incorporation, mais qu'elle diminue considerablement dans l'heure qui suit. Une
petite partie seulement de cette radioactivite perdue par le cytoplasme se
retrouve dans le coat, une autre partie dans les espaces intercellulaires. Trois
heures plus tard la radioactivite cytoplasmique a encore subi une baisse mais
celle-ci correspond sensiblement a l'augmentation de la radioactivite reperable
au niveau du coat. II ressort de ces observations qu'aux temps initiaux de
l'incorporation du fucose-3H une glycoproteine d'origine cytoplasmique migre
dans le coat mais n'y demeure pas et doit done etre liberee. II apparait ainsi
que les cellules de la cape apicale du membre d'Amphibien en regeneration,
comme celles de l'epithelium germinatif de l'embryon de poulet (Dubois &
Cuminge, 1970, 1971), puissent elaborer une glycoproteine exportable. Les
molecules nouvellement formees de cette substance sont certainement libres
dans le hyaloplasme car le marquage n'est jamais en rapport avec des vesicules,
des grains ou des granules. On explique ainsi que la glycoproteine ne soit pas
visualisable par la technique de Thiery. Nous emettons l'hypothese qu'elle
140
C. CHAPRON
Glycoproteine dans la regeneration des amphibiens
141
est condensee au niveau du coat cellulaire intensement colorable par le rouge
de ruthenium.
Pour ce qui est des cellules blastematiques nous avons constate qu'elles
montrent, 4 h apres l'injection de fucose-3H, une radioactivite nette aussi bien
dans le coat que dans le cytoplasme. Nous pensons que la glycoproteine mise
ainsi en evidence n'est pas synthetisee par les cellules blastematiques ellesmemes mais qu'elle provient des cellules epitheliales. Quatre arguments plaident
en faveur de cette hypothese:
(1) On sait que l'accrochage du fucose a l'extremite des chaines glucidiques
s'efTectue au niveau des dictyosomes (Bennett & Leblond, 1970; Rambourg,
Bennett, Kopriwa & Leblond, 1971) ou du reticulum (Cuminge & Dubois,
1972). Or dans les cellules blastematiques le marquage est surtout manifeste
au niveau de vesicules en voie de lyse.
(2) La radioactivite n'apparait dans les cellules blastematiques qu'apres une
heure d'incorporation, c'est a dire au moment de la liberation, par les cellules
epitheliales, de leur glycoproteine.
(3) La radioactivite des cellules blastematiques est souvent decelable dans
le coat avant de l'etre dans le cytoplasme et elle est toujours plus intense dans
le coat que dans le cytoplasme.
(4) Dans le coat des cellules blastematiques il existe des structures semblables
aux granules glycoproteiques colorables par le rouge de ruthenium et liberes
a la surface des cellules epitheliales.
En resume, nos etudes cytochimiques et autoradiographiques semblent bien
montrer qu'une glycoproteine provenant de la cape apicale peut se fixer a la
surface des cellules blastematiques. Un tel transfert n'est possible que dans
les jeunes regenerats (12 jours) ou il n'existe pas encore de membrane basale
entre Fepithelium et le mesenchyme. En effet dans les regenerats plus ages
(20 jours) nous avons constate qu'apres incorporation du fucose-3H la radioactivite restait localisee a l'epithelium qui est alors pourvu d'une membrane
basale. Ainsi le transfert d'une glycoproteine epitheliale au mesenchyme parait
caracteriser les phases precoces de la regeneration. De plus si ce transfert est
rendu impossible par la mise en place trop rapide d'une membrane basale,
FIGURES
7-9
Etude autoradiographique des cellules epitheliales et blastematiques apres 5 min
et 1 heure d'incorporation de fucose-3H (regenerats de 12 jours).
Fig. 7. Cellule epitheliale apres 5 min d'incorporation. Le marquage est tres
abondant dans le cytoplasme. g, appareil de Golgi; r, reticulum.
Fig. 8. Cellule epitheliale apres 1 h d'incorporation. Le marquage est abondant
dans le cytoplasme et dans le coat, g, appareil de Golgi; mp, membrane plasmique.
Fig. 9. Cellule blastematique apres 1 h d'incorporation. Le marquage est present
surtout dans le coat, mp, membrane plasmique; r, reticulum.
142
12
C. CHAPRON
Glycoproteine dans la regeneration des amphibiens
143
y
•V,
Fig. 13. Cellule epitheliale et membrane basale dans un regenerat age de 20 jours.
Etude autoradiographique apres 1 h d'incorporation de fucose-3H. mb, membrane
basale.
comme c'est le cas a la suite d'une denervation (Bryant et al. 1971), alors la
regeneration n'a pas lieu (Singer, 1952).
En conclusion, il ressort de ces recherches que la cape apicale intervient
bien au cours de la regeneration des Tritons par l'intermediaire d'une glycoproteine. Chez les Vers de terre nous avons deja montre qu'une glycoproteine
FIGURES
10-12
Etude autoradiographique des cellules epitheliales et blastematiques
apres 4 h d'incorporation de fucose-3H (regenerats de 12 jours).
Fig. 10. Cellule epitheliale. Le marquage est devenu plus important dans le coat
que dans le cytoplasme. mf, microfilaments; mp, membrane plasmique.
Fig. 11. Cellule blastematique. Le marquage a augmente dans le coat et dans le
cytoplasme. mp, membrane plasmique.
Fig. 12. Cellule blastematique. Le marquage cytoplasmique existe souvent au
niveau de vesicules en voie de lyse. ly, lysosome; m, mitochondries; n, noyau;
r, reticulum.
144
C. CHAPRON
agissait egalement sur la mise en place et la multiplication des cellules de
regeneration (Chapron, 1972a, b). Nous cherchons actuellement, chez les
Yers et chez les Tritons, a isoler ces glycoproteines et a etudier leur mode
d'action.
RESUME
Au cours de la regeneration du membre chez les Tritons il se forme assez precocement
une cape apicale ectodermique recouvrant un blasteme mesodermique. L'autoradiographie
a haute resolution de ces tissus, apres incorporation de fucose-3H, precurseur specifique
des glycoproteines, a ete effectuee. Elle montre que les grains d'argent se localisent d'abord
sur les cellules epitheliales puis sur les cellules mesenchymateuses. Cette observation conflrme
l'hypothese selon laquelle la cape apicale elaborerait une glycoproteine active sur le blasteme.
L'autoradiographie et la cytochimie infrastructurales revelent en outre l'importance des
surfaces cellulaires aussi bien au niveau des cellules productrices de la glycoproteine que
des cellules receptrices.
Je remercie Madame Chapron pour son aide efficace dans la realisation des autoradiographies.
TRAVAUX CITES
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