/. Embryol. exp. Morph. Vol. 31, 2, pp. 453-477, 1974
Printed in Great Britain
453
Role des cellules mesectodermiques
issues des crates neurales cephaliques dans la
formation des arcs branchiaux et
du squelette visceral
Par C. LE LIEVRE 1
Laboratoire d'Embryologie (Professeur N. Le Douarin),
Universite de Nantes
SUMMARY
The participation of neural crest cells in the formation of the branchial arches and especially
of the hypobranchial skeleton has been studied with heterospecific grafts of quail neural tube
into the chick embryo. According to the labelling technique devised by Le Douarin, the
differences between quail and chick interphase nuclei make it possible to use quail cells as
cellular markers in this system.
The excision of the mesencephalo-rhombencephalic primordium of 4- to 12-somite chick
embryos results in the atrophy of the branchial arches, and in important deficiencies of the
hypobranchial skeleton. Nevertheless, the nearly complete absence of the branchial mesenchyme does not prevent the visceral pouches and clefts from forming.
The isotopic and isochronic graft of quail neural primordium into the chick shows that the
mesenchymal component of the branchial arches is of neurectodermal origin, except for the
muscle plates and the endothelium of the aortic arches, which derive from the mesoderm.
The mesencephalic neural crests give rise to the totality of the mesenchyme of the first
branchial arch and partially to that of the second one, while the rhombencephalon contributes to the formation of the second, third and fourth arches.
The stability of the marker system produced by quail cells implanted into the chick makes it
possible to follow the migrating cells until they have reached their definitive localization in the
various structures of the hypobranchial skeleton, which thus appears to be entirely of neurectodermal origin. The cells arising from the mesencephalic neural primordium constitute the
lower jaw skeleton (Meckel's cartilage and bones) and are all still in the process of migration
at the 6-somite stage. Cells originating from the rhombencephalon have left the neural axis at
the 9- to 10-somite stage for the anterior part (in front of the first somite) and at the 11- to
12-somite stage for the posterior rhombencephalon.
Differentiation of mesectodermal cells into chondrocytes and osteocytes has been observed
during the morphogenesis of the visceral skeleton.
INTRODUCTION
Les cretes neurales correspondent au territoire ectodermique situe a la
limite de l'ectoderme dorso-lateral et du tube nerveux. Apres la decouverte
par His (1868) des capacites de migration des cellules des cretes neurales,
1
Adresse de Vauteur: Laboratoire d'Embryologie, Universite de Nantes, B.P. 1044,
44037 Cedex, Nantes, France.
454
C. LE LIEVRE
de nombreux travaux ont mis en evidence les potentialites multiples de ces
cellules.
Depuis les premieres observations de Goronowitsch (1892, 1893), sur
l'embryon de poulet, et de Platt (1893, 1897), sur celui de Necturus, on sait que
les cretes neurales et certaines placodes ectodermiques donnent naissance a une
partie du mesenchyme de la tete et des arcs branchiaux qui a ete designee pour
cette raison par Platt sous le terme de mesectoderme. Bien que ce point de vue
ait ete longtemps conteste par les tenants de la theorie des feuillets embryonnaires de Von Baer (1828), des travaux experimentaux ulterieurs realises
essentiellement chez les Amphibiens ont confirme les conclusions que Goronowitsch et Platt avaient tirees d'une observation histologique fine. Des techniques
de marquage par les colorants vitaux (Vogt, 1925, 1929; Stone, 1932; Detwiler,
1937; Horstadius, 1950) ou par la thymidine tritiee (Chibon, 1962, 1966) et
d'excision de tron<;ons de crete neurale aux stades precoces du developpement
(Stone, 1926, 1929; Horstadius & Sellman, 1946; Horstadius, 1950; Newth,
1956) ont en effet montre l'intervention des cellules d'origine neurectodermique
dans la formation d'une partie du mesenchyme pharyngien et cephalique dont
derivent diverses structures, nerveuses et paraganglionnaires, pigmentaires et
squelettiques.
En ce qui concerne les Vertebres Superieurs, les techniques d'extirpation
precoce des cretes neurales (Van Campenhout, 1930, 1937; Jones, 1937, 1942;
Yntema, 1944; Hammond & Yntema, 1964) ont permis d'etendre aux Oiseaux
la plupart des donnees acquises chez les Vertebres Inferieurs. Ainsi, Van
Campenhout, d'une part, Hammond & Yntema, d'autre part, ont-ils demontre
que l'excision des cretes neurales cephaliques provoque des deficiences du
squelette visceral et cranien. D'autre part l'utilisation par Johnston (1966) du
marquage isotopique nucleaire (selon Weston, 1963) a mis en evidence l'importance de la participation des cretes neurales cephaliques a la constitution du
mesenchyme de la tete et de la region branchiale chez l'embryon de poulet.
Nous avons repris l'etude de la participation des cretes neurales a la genese
des arcs visceraux en utilisant la technique de marquage biologique mise au
point par Le Douarin (1969, 1971, 1973). Cette methode a, sur l'utilisation des
isotopes, l'avantage de fournir un marquage durable qui permet de suivre la
destinee des cellules des cretes neurales jusqu'a ce qu'elles aient atteint un etat
de complete differentiation. Elle est basee sur des differences de la structure
nucleaire chez deux especes d'Oiseaux, la caille {Coturnix cotumix japonica) et
le poulet (Gallus gallus). Chez le poulet comme dans la plupart des especes
animales, la chromatine est dispersee d'une maniere homogene dans l'ensemble
du noyau constituant un reseau qui presente quelques chromocentres de petite
taille. Chez la caille, au contraire, une partie importante de l'ADN est associee
au nucleole sous la forme d'une volumineuse masse heterochromatique. II en
resulte que l'application de la reaction nucleate de Feulgen & Rossenbeck (1924)
permet de reconnaitre sans ambiguite les cellules de caille des cellules de poulet.
Role des cellules mesectodermiques
455
Le principe de la technique utilisee dans le present travail consiste a realiser des
greffes isotopiques et isochroniques d'ebauche neurale de caille chez l'embryon
de poulet, dans la region du mesencephale et du rhombencephale presomptifs,
puis a suivre la migration des cellules issues du greffon dans la region branchiale
de l'embryon-hote.
MATERIEL ET METHODE
Les experiences ont porte sur des embryons de poulet {Gallus gallus) de la race
Leghorn blanche et sur des embryons de caille japonaise {Coturnix coturnix
japonic a).
1. Techniques ope'ratoires
Excision de Vebauche neurale chez Vembryon de poulet
Les excisions bilaterales de troncons d'ebauche neurale cephalique sont
pratiquees au cours du 2eme jour de 1'incubation. A l'aide de microscalpels, des
incisions sont faites de part et d'autre de l'ebauche neurale, ceci permet de
separer le troncon du tube nerveux et les cretes neurales qui lui sont associees
de l'ectoderme dorsal et du mesoderme somitique ou cephalique. Le tube neural
est ensuite detache de la corde sous-jacente et le fragment d'ebauche neurale
ainsi isole est elimine.
Trois types d'operations sont realises selon l'age des embryons. La migration
des cellules des cretes neurales s'etablissant progressivement de l'avant vers
l'arriere au cours de la formation du tube nerveux, l'operation doit etre effectuee
a des stades d'autant plus precoces que le territoire excise est plus anterieur.
Au stade de 5 et 6 somites. L'etendue de l'ablation indiquee sur la Fig. 1A
correspond au territoire presomptif du mesencephale et de la partie anterieure
du rhombencephale. La limite posterieure de l'operation est situee au niveau du
ler somite.
Au stade de 7 a 9 somites. L'excision est realisee depuis la constriction mesencephalorhombencephalique jusqu'au niveau de la 6eme paire de somites
(Fig. IB).
Au stade de 9 a 12 somites. Sur ces embryons seule la partie posterieure de
l'ebauche rhombencephalique entre les niveaux des lere et 6eme paires de somites
est excisee (Fig. 1C).
A l'interieur de ces limites d'autres types d'excisions ont ete pratiques
occasionnellement. Leur niveau exact sera precise par la suite au cours de
l'expose des resultats (Tableaux 1 et 4).
Greffe isotopique et isochronique de Vebauche nerveuse de caille sur Vembryon de
poulet
Dans cette serie experimentale l'ablation d'un fragment de l'ebauche neurale,
realisee sur des embryons de poulet de 5 a 12 paires de somites a ete suivie de la
greffe du territoire neural homologue provenant d'un embryon de caille de
2g
EMB 31
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C. LE LIEVRE
V
B
Fig. 1. Niveaux et stades auxquels sont le plus generalement pratiquees les operations
d'excision ou de greffe de l'ebauche neurale, H. (A) Avant le stade de 7 somites,
ebauche mesencephalique et partie anterieure de l'ebauche rhombencephalique.
(B) Avant le stade de 9-10 somites: partie anterieure de l'ebauche rhombencephalique. (C) Avant le stade de 11-12 somites: partie posterieure de l'ebauche
rhombencephalique.
meme stade (Fig. 2). L'ebauche neurale de caille est isolee des tissus avoisinants
par action d'une solution de trypsine a 5%0 dans du liquide de Tyrode sans
calcium ni magnesium (Moscona & Moscona, 1952). Le territoire neural greffe
est rapidement incorpore aux structures axiales de l'hote et se trouve recouvert
par l'ectoderme cicatriciel du poulet. Les cellules issues du greffon migrent dans
l'embryon note ou elles peuvent etre reconnues grace a leurs caracteres nucleaires.
2. Observation des resultats
Exarnen de la morphologie externe des embryons qui ont subi Vexcision d'un
fragment d'ebauche neurale cephalique
Ces embryons sont preleves apres une duree totale d'incubation de 2 a 19
jours. Aux stades 10 a 35 de Hamburger & Hamilton (H. et H.), 1951 (2 a 9
jours d'incubation), les embryons qui ont subi l'ablation de troncons de tube
nerveux et de cretes neurales sont dessines a la chambre claire ou photographies,
leur morphologie cranienne et cervicale est comparee a celle d'embryons
temoins de meme stade. Chez les embryons preleves aux stades de 10 a 19 jours
d'incubation, le squelette branchial est disseque.
Role des cellules mesectodermiques
457
Fig. 2. Greffe orthotopique isochronique d'ebauche neurale de caille sur l'embryon
de poulet. (a) vue dorsale, (b) coupe transversale au niveau du 3° somite. (A) Embryon de poulet de 9 somites apres excision de l'ebauche neurale rhombencephalique,
§3. (B) Embryon de poulet apres remplacement de l'ebauche excisee par une ebauche
neurectodermique homologue (C) prelevee sur un embryon de caille de meme stade
(D) et isolee apres action de la trypsine, HE).
Techniques histologiques
Les embryons qui ont subi l'excision d'une partie de l'ebauche neurale
cephalique sont fixes in toto par le liquide de Bouin aux stades 10 a 35 de H. et H.
Les embryons porte-greffe sont fixes in toto par le liquide de Zenker entre le
2eme et le 8eme jour de l'incubation. Au-dela de ce stade on preleve seulement
la region de la tete et du cou. La coloration appliquee est la reaction nucleale de
Feulgen & Rossenbeck (1924) qui permet de reconnaitre les cellules de Caille
(Fig. 3). Cette reaction est suivie d'une legere coloration de fond au picroindigocarmin.
29-2
458
C. LE LIEVRE
Tableau 1. Recapitulation des cas observes aux divers stades en
fonction du niveau auquel a ete pratiquee Vexcision
Niv :au de l'excision
Rhombencephale
Stade au moment de la fixation
Mesencephale
En avant du
ler somite
Du ler au
6e somite
Nombre
de cas
Stade 10 a 18 de H. et H.
1
1
Stade 19 a 25 de H. et H.
8.
4
4
Stade26a35deH. et H.
4
RESULTATS
A. MORPHOGENESE DES ARCS BRANCHIAUX
1. Consequences de Vexcision de Vebauche neurale mesencephalique sur la
constitution des arcs brcnchiaux
Sur 170 embryons operes, 31 embryons survivants seulement ont pu etre
observes (Tableau 1). La mortalite survient essentiellement dans les jours qui
suivent l'intervention, elle peut etre attribute dans une large mesure aux
perturbations de la morphogenese cardiocirculatoire resultant de I'ablation
precoce de l'ebauche neurale dans la region cephalocervicale.
(a) Observation des embryons fixes aux stades 10 a 18 de H. et H. La cicatrisation de l'ectoderme au niveau de I'ablation qui a lieu au cours de cette periode
est generalement realisee avant le stade 15 de H. et H. II n'apparait pas qu'il y
ait de reconstitution des cretes neurales dans les conditions de nos experiences.
Ventralement, l'aspect de l'embryon opere differe peu de celui d'un embryon
temoin de meme stade; au stade 15 de H. et H., la 3eme poche branchiale se
forme, les trois premiers arcs branchiaux sont peu developpes, ils contiennent
quelques couches de cellules mesodermiques entourant les arcs aortiques
dont la paroi propre n'est alors constitute que d'une couche de cellules
endotheliales.
Role des cellules mesectodermiques
459
(b) Observation des embryonsfixes aux stades 18 a 25 de H. et H. Au stade 19,
les cinq poches branchiales sont formees. L'excision d'un fragment d'ebauche
neurale cephalique provoque la reduction d'un ou plusieurs arcs selon le niveau
auquel a ete pratiquee l'operation. Si l'ablation est realisee au niveau du mesencephale et de la partie anterieure du rhombencephale, on constate une atrophie
des premiers et seconds arcs branchiaux qui restent etroits et aplatis. Les
processus mandibulaires du ler arc ne se developpent pas et le 2eme arc ne
recouvre pas les arcs posterieurs, comme c'est le cas chez les embryons normaux; il en resulte que les 3eme et 4eme arcs demeurent apparents.
Si l'ablation est pratiquee au niveau du rhombencephale, les 2eme, 3eme, et
4eme arcs branchiaux sont reduits. L'atrophie des arcs branchiaux posterieurs
n'est visible qu'a partir des stades 20 a 22 de H. et H.
A l'observation histologique des embryons operes, les poches branchiales, qui
se forment selon une sequence normale, ainsi que la cavite pharyngienne,
apparaissent parfois anormalement dilatees. Au niveau des arcs branchiaux on
observe a ces stades une reduction de la quantite de mesenchyme entourant les
arcs aortiques. Des masses mesenchymateuses relativement denses, situees en
position posterolaterale par rapport aux arcs aortiques sont cependant toujours
presentes (Fig. 3C, D).
(c) Observation des embryons fixes aux stades 26 a 35 de H. et H. A ce stade
les arcs branchiaux perdent leur individualite et l'epithelium des poches
branchiales fournit diverses ebauches glandulaires.
L'ablation des cretes neurales mesencephaliques se traduit par l'absence de
machoire inferieure (Fig. 3E). Celle des cretes neurales rhombencephaliques a
pour resultat un raccourcissement general du cou du fait de la carence mesenchymateuse produite au niveau des 3eme et 4eme arcs branchiaux (Fig. 3F).
La colonne vertebrale qui se developpe normalement a tendance a se courber
en S.
2. Observation des embryons de poulet porteurs d'une ebauche neurale de caille
(a) Localisation des cellules de caille dans les arcs branchiaux de Vhote.
134 embryons de poulet de 5 a 12 somites ont subi la greffe orthotopique d'un
fragment d'ebauche neurale preleve sur un embryon de caille de meme stade.
26 embryons survivants ont ete observes (Tableau 2).
Nous decrirons, dans un premier temps, les differentes phases de l'invasion du
2eme arc branchial par les cellules d'origine neurale.
Les cellules issues du greffon effectuent une migration dorsoventrale le long
du tube nerveux et de l'ectoderme laterodorsal en direction des racines aortiques
dorsales, puis s'insinuent entre l'endoderme pharyngien et l'ectoderme lateroventral. Au stade 15-16 de H. et H. (Fig. 4A, B) Fare branchial est limite par
les epitheliums branchiaux endodermiques et ectodermiques qui, comme l'endothelium du 2eme arc aortique, sont constitues de cellules de poulet. Le mesenchyme est forme de cellules de caille et d'un amas allonge de cellules de poulet,
460
C. LE LIEVRE
461
Role des cellules mesectodermiques
Tableau 2. Recapitulation des embryons observes aux
divers stades en fonction du niveau de Voperation
Niveau de la grefTe
Rhombencephale
Stude au moment de la fixation Mesencephale
En avant du
ler somite
Du 1 er au
6eme somite
N ombre
de cas
?
Stadc 15 a 18 de H. et H.
->
~>
5
3
Stade 19 a 27 de H. et H.
6
6
la plaque musculaire destinee a entrer dans la constitution de la musculature
hypoglosse.
Au cours des stades suivants, les cellules mesenchymateuses se multiplient
activement. L'arc branchial est principalement constitue de cellules issues du
greffon qui entourent le pharynx et l'ebauche thyroidienne et qui atteignent
dorsalement le niveau des ratines aortiques et des veines cardinales anterieures
(Fig. 4C, D).
Les plaques musculaires qui ont subi une croissance notable sont essentiellement formees de cellules de poulet; toutefois quelques cellules d'origine
Fig. 3. (A, B) Principe du marquage. Illustration des differences d'aspect des cellules
mesenchymateuses d'arcs branchiaux d'embryons de 4 jours chez les deux especes.
Reaction nucleate de Feulgen. G. x 1250. (A) Poulet, chromatine dispersee dans
1'ensemble du noyau. (B) Caille, masse heterochromatique intensement coloree
dans un nucleoplasme clair.
(C, D) Coupes transversales au niveau du 3° arc branchial (A3) d'embryons de
poulet au stade 20 de H. et H. G. x 40. (C) Embryon temoin. (D) Apres ablation,
au stade de 6 somites, de l'ebauche neurale rhombencephalique, reduction de la
masse mesenchymateuse (->) de l'arc branchial.
Ao, arc aortique; Co, coeur; Pb3, 3° poche branchiale; Ph, cavite pharyngienne.
(E-G) Consequences de l'excision de troncons d'ebauche neurale sur la morphogenese des regions cephalique et cervicale. G. x 2,5. (E) Embryon de 8£ jours apres
excision au niveau du mesencephale et du rhombencephale en avant du 1° somite.
Absence de machoire inferieure. (F) Embryon de 9 j apres ablation de l'ebauche
rhombencephalique. Raccourcissement ventral du cou. (G) Embryon temoin de
9 jours.
462
C. LE LIEVRE
•'
c
vv
Fig. 4. Localisation au sein du 2° arc branchial des cellules issues de l'ebauche
neurale mesencephalorhombencephalique de caille greffee sur l'embryon de poulet
au stade de 6 somites. Feulgen. (A) Embryon fixe au stade 15 de H. et H. G. x 125.
(B) Detail de la precedente, presence de cellules de caille (-*) de part et d'autre de
l'arc aortique (Ao2). L'endoderme pharyngien (En) et l'ectoderme (Ec) sont constitues de cellules du poulet-hote. G. x 460. (C) Embryon fixe au stade 20-21 deH.
et H. Coupe transversale au niveau de l'ebauche thyroidienne (T). Les limites de la
localisation des cellules issues du greffon au sein de Tare 2 sont indiquees en traits
interrompus (
). G. x 170. Ad, racine aortique dorsale; Ao2, 2° arc aortique;
V, veine cardinale anterieure; Ph, cavite pharyngienne. (D) Detail de la precedente.
G. x 430. En, endoderme de poulet; C, mesectoderme de caille.
Role des cellules mesectodermiques
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Fig. 5. Localisation des cellules mesectodermiques dans les arcs branchiaux
d'embryons porte-greffe. Le mesenchyme est d'origine neurectodermique et ses cellules presentent les caracteres des cellules de caille (C) a l'exclusion de la plus grande
partie des plaques musculaires (M) et de l'endothelium vasculaire des arcs aortiques
(£V). En, endoderme pharyngien; Ec, ectoderme. Feulgen. (A) Coupe transversale
au niveau du 2° arc d'un embryon de poulet porteur d'un greffon d'ebauche mesencephalorhombencephalique de caille. Stade 21-22 de H. et H. G. x 120. (B) Detail
de la precedente. G. x 360. (C) Coupe transversale au niveau du 4° arc d'un embryon de poulet porteur d'un greffon d'ebauche rhombencephalique de caille.
Stade 23 de H. et H. G. x 90. (D) Detail de la precedente. La plaque musculaire
est reduite a un amas de quelques cellules de poulet auxquelles sont melees des
cellules de caille. G. x 480.
464
C. LE LIEVRE
Tableau 3
1 er arc
Mesencephale
2eme arc
Rhombencephale anterieur
(en avant du ler somite)
3eme arc
4eme arc
Rhombencephale postericur
(du ler au 6eme somite)
En arriere de la 4eme poche
Fig. 6. Schema recapitulatif de la migration des cellules mesectodermiques issues de
divers niveaux (a, b, c) du nevraxe au sein des arcs branchiaux d'un embryon au stade
23 de H. et H. (a) H , Mesencephale^ 1° et 2° arcs (,Alt A2). (b) ®, Partie
anterieure du rhombencephale ->• 2° et 3° arcs (A2, A3). (c) HE), Partie posterieure
du rhombencephale-> 3° et 4° arcs (A3, A4).
Role des cellules mesectodermiques
465
mesectodermique se sont infiltrees a l'interieur de ces masses mesodermiques
et sont localisees principalement a leur peripherie (Fig. 5 A, B).
La colonisation des arcs mandibulaires et des 3eme et 4eme arcs branchiaux
par les cellules issues de l'ebauche neurale greffee se fait de la meme fac.on que
pour les 2emes arcs. L'essentiel du mesenchyme est constitue de cellules mesectodermiques a Pexclusion de Pendothelium des arcs aortiques et des plaques
musculaires, celles-ci sont reduites dans le 4eme arc branchial a un petit amas de
cellules d'origine mixte (Fig. 5C, D). Dans la region posterieure a la 4eme poche
branchiale, les cellules issues de l'ebauche neurale de caille entourent les
ebauches ultimobranchiales (Le Douarin & Le Lievre, 1970). En arriere de ce
niveau, le pharynx est entoure d'un melange de cellules de caille et de poulet
jusqu'a la bifurcation de l'oesophage et de la trachee.
Les diverses greffes pratiquees permettent de determiner le niveau d'origine
des cellules qui migrent dans chaque arc branchial (Tableau 3, Fig. 6).
B. PARTICIPATION DES CRETES NEURALES CEPHALIQUES A
LA FORMATION DU SQUELETTE VISCERAL
1. Excision de fragments de Vebauche neurale cephalique
160 embryons ont ete operes afin d'etudier les repercussions de l'excision de
l'ebauche neurale cephalique sur la formation du squelette visceral, 33 embryons
ont survecu au dela du stade de 8 jours d'incubation et ont pu etre observes
(Tableau 4).
L'ablation de l'ebauche neurale avant le stade de 12 somites a pour resultat la
reduction ou la disparition de diverses pieces squelettiques (Fig. 7) a condition
qu'elle ait ete pratiquee sur une longueur suffisamment importante. D'autre part,
comme l'ont montre Hammond & Yntema (1964), nous avons observe que si les
embryons sont operes apres le stade de 12 somites, quel que soit le niveau de
l'operation, la morphogenese du squelette visceral n'est pas affectee par l'intervention.
Lorsqu'on excise l'ebauche neurale mesencephalique, avant le stade de
7 somites, les malformations du squelette visceral sont localisees dans la
machoire inferieure; elles consistent en la reduction du cartilage de Meckel ou
meme dans la disparition complete de la machoire inferieure (Fig. 1b) lorsque
le trongon d'ebauche neurale elimine correspond au mesencephale et a la partie
anterieure du rhombencephale. D'autre part l'entoglosse peut etre absent et le
basihyal, ou copula I, reduit a une petite masse cartilagineuse soudee en avant
des cornes de Phyoiide (Fig. 1b).
Lorsque l'excision pratiquee avant le stade de 10 somites porte sur l'ebauche
neurale rhombencephalique, les ceratobranchiaux et les epibranchiaux, ainsi que
le basibranchial, ou copula II, sont absents (Fig. 7 c), le squelette hypoglosse se
compose alors uniquement des cartilages de l'entoglosse et d'un basihyal reduit
et souvent malforme. Dans 2 cas sur 6 une masse cartilagineuse independante
466
C. LE LIEVRE
Fig. 7. Malformations du squelette hypobranchial (schematisees en II) obtenues
apres excisions de divers fragment d'ebauche neurale (schematisees en I), (a) Temoin. (b) I. Excision de l'ebauche neurale mesencephalique et de la partie anterieure
du rhombencephale ( H i ) . II. Absence du squelette de la machoire inferieure, de
l'entoglosse et de la plus grande partie du basihyal. (c) I. Excision de l'ebauche
rhombencephalique ( i l l ) . II. Disparition des cornes de l'hyoide, du basibranchial
et d'une partie du basihyal. (d) I. Excision unilateral de l'ebauche rhombencephalique (HH). II. Une come de l'hyoide et la moitie de l'entoglosse ont disparu
du cote opere.
467
Role des cellules mesectodermiques
Tableau 4. Recapitulation des observations faites sur le squelette visceral
des embryons operes enfonction du niveau auquel a ete pratiquee Vexcision
Niveau de 1'excision et stade au
moment de ['operation
Rhombencephale
Pieces squelettiques
reduites ou absentes
Mesencephale,
avant le st 7 s
En avant du
ler somite
st: 4 a 10 s
Du ler au
6eme somite
st: 6 a 12 s
Nombre
de cas
3
Cartilage de Meckel
(MSchoire inferieure)
3
Entoglosse et basihyal
3
3
Basihyal seul
3
6
Ceiatobranchiaux
et Epibranchiaux
*
L nilaterale
3
5
nilaterale
4
5
Basibranchial
5
i
du reste du squelette a ete retrouvee ventralement, en position caudale par
rapport a l'entoglosse et pourrait correspondre au basibranchial.
L'excision unilateral d'un troncon de l'ebauche neurale au niveau du
mesencephale et du rhombencephale est sans effet sur la formation des pieces
impaires (basihyal et basibranchial) mais elle se traduit par une reduction de
l'entoglosse et generalement une disparition de la corne de Phyoide correspondant au cote opere (Fig. Id).
468
C. LE LIEVRE
Role des cellules mesectodermiques
469
2. Greffe isotopique et isochronique d'une ebauche neurale de caille et participation
des cellules issues du greffon a la formation du squelette visceral de Vhote
Sur 285 embryons operes, 48 ont pu etre etudies entre 7 et 19 jours d'incubation.
Participation des cellules aborigine neurectodermique a la formation du squelette
de la machoire inferieure. Dans le mesectoderme de la premiere paire d'arcs
branchiaux, des ebauches prochondrales apparaissent au cours du 6e jour de
l'incubation (Fig. 8 A, B). A partir du stade de 7 jours, s'y differencient des
baguettes cartilagineuses paires dont les extremites anterieures fusionnent
entre 9 et 11 jours d'incubation pour former le cartilage de Meckel; ainsi que
la plus grande partie du mesenchyme du ler arc dont il provient, celui-ci est
constitue de cellules de caille lorsque l'ebauche neurale mesencephalique de
l'embryon de poulet a ete remplacee par l'ebauche homologue de caille (Fig. 8C,
D). Toutefois dans la region de l'articulation avec le carre, on note la presence
de cellules de caille lorsque la greffe a ete pratiquee au niveau du rhombencephale.
De plus, des le stade de 7-8 jours d'incubation, on observe, de part et d'autre,
dans la region latero-dorsale de l'ebauche mandibulaire, la formation de deux
condensations mesectodermiques qui correspondent aux angulaires et aux supraangulaires (Fig. 8E). Au stade de 9 jours viennent s'ajouter deux nouvelles
ebauches paires a partir desquelles se differencieront les operculaires en position
interne et les dentaires en position externe. A 10 jours les ebauches des os de
membrane de la machoire inferieure ainsi apparues sont le siege d'une differentiation osseuse, les osteoblastes presentent les caracteres nucleaires des
cellules de caille et proviennent, comme les chondrocytes du cartilage de Meckel,
de l'ebauche mesencephalique greffee (Tableau 5).
Participation des cellules d'origine neurectodermique a la formation de Vhyo'ide.
A la fin du 6e jour de l'incubation, les premieres ebauches prochondrales de
Phyoiide se forment dans les territoires mesenchymateux correspondant aux 2e,
3e et 4e arcs branchiaux, elles sont constitutes de cellules mesectodermiques
Fig. 8. (A-D) Differentiation du cartilage de Meckel (CM) a partir de cellules
mesectodermiques (C) issues du greffon. Feulgen. (A) Embryon de 6 jours, apparition de l'ebauche prochondrale (Pr) dans le mesectoderme du 1° arc branchial.
G. x 45. (B) Detail de la precedente. En, endoderme du poulet-hote. G. x 500. (C)
Embryon de 8 jours; vue d'ensemble d'une coupe transversale au niveau de la
machoire inferieure. Hy, hyoi'de; O, os de membrane (supra-angulaire). G. x 10.
(D) Detail de la precedente, cartilage de Meckel constitue de cellules mesectodermiques de caille (C), des cellules de poulet-hote (P) constituent le mesenchyme
avoisinant. G. x 600.
(E, F) Differentiation de cellules mesectodermiques en cellules osseuses chez
l'embryon de poulet porteur d'une ebauche neurale cephalique de caille. (E) Os de
membrane: angulaire d'un embryon de poulet opere de 8 jours. O, osteocyte de
caille. G. x 620. (F) Os endochondral: ceratobranchial d'un embryon de poulet
opere de 14 jours. O, osteocyte du manchon osseux; He, chondrocyte hypertrophie; Po, perioste. G. x 620.
470
C. LE LIEVRE
Tableau 5. Repartition des diverses pieces squelettiques de la mdchoire inferieure
constituee de cellules issues du greffon enfonction du niveau auquel le remplacement
a ete pratique
Niveau dc la greffe <f ebauche neuralc de caillc
Rhombencephale
Ebauchcs squelettiques formecs
de cellules issues du greffon
Mescncephale
En avant du
ler somite
Du ler au
6emc somite
Nombre
de cas
2'T
5/5
Cartilage de Mcckcl
^-. ,
2'4
2.'4
Articulation du cartilage de
Meckel seule
2/2
^-
_____
1/14
1/14
2/2
Angulaire, supra-angulaire
dentaire, operculaire
5/5
2/4
issues des cretes neurales cephaliques, elles sont le siege d'une chondrogenese a
partir des stades de 7 et 8 jours d'incubation. Lorsque l'ebauche neurale
mesencephalique et rhombencephalique de l'embryon de poulet a ete remplacee
par une ebauche homologue de caille, les chondrocytes et les cellules perichondrales differencies presentent les caracteristiques nucleaires des cellules de
caille.
Le squelette de l'hyoide est alors constitue de quatre pieces principales: deux
pieces impaires, medianes, ventrales par rapport au pharynx et situees dans le
prolongement l'une de l'autre, le basihyal (ou copula I) anterieur et le basibranchial (ou copula II) posterieur; au niveau de la suture de ces deux cartilages
viennent fusionner les extremites medianes des cornes de l'hyoide composees
chacune d'un ceratobranchial et d'un epibranchial etires en direction laterodorsale.
Le basibranchial se constitue a partir de cellules mesectodermiques du 4e arc
branchial, issues des cretes neurales correspondant aux niveaux posterieurs du
All
Role des cellules mesectodermiques
Tableau 6. Participation des cellules issues de Vebauche neurale de caille greffee
a divers niveaux a la formation de chacun des cartilages de Vhyo'ide
Niveau de la greffe
Rhombenccphale
Pieces de l'hyo'ide
constitutes de cellules .
issues du greffon
Mesence'phale
Anterieur,
en avant du
ler somite
Posterieur,
du ler au
6eme somite
N ombre
de cas
1/1
Entoglosse
4/4
2/4
4/4
5/5
Basihyal
2/2 +
8/14±
2/8 ±
4/4 +
5/5
Ceratobranchiaux et
epibranchiaux
2/2 ±
14/14
14/14
4/6 ±
5/5
10/12
Basibranchial
9/11
6/6
rhombencephale; les ceratobranchiaux et epibranchiaux se forment a partir du
mesenchyme du 3e arc branchial derivant des cretes neurales rhombencephaliques
moyennes, alors que le basihyal est constitue de cellules mesectodermiques du 2e
arc branchial qui sont issues des cretes neurales du mesencephale et de la partie
anterieure du rhombencephale (Tableau 6, Fig. 9).
Aux stades de 9 a 11 jours d'incubation, les cartilages de l'hyoi'de poursuivent leur differentiation, ils s'allongent et s'epaississent, de plus, les ebauches
paires de l'entoglosse apparaissent dans la pointe de la langue, leurs parties
30
E M B 31
472
C. LE LIEVRE
\
A
B
Fig. 9. Schema recapitulatif de la participation des cellules mesectodermiques
issues de divers niveaux du nevraxe (A) a la constitution des pieces du squelette
hypobranchial (B). Machoire inferieure: cartilage de Meckel (CM), os de membrane: angulaire (Ag), supra-angulaire (sA), dentaire (d), operculaire (op). Hyoiide:
entoglosse (Eg), basihyal (Bh), ceratobranchial (Cb), epibranchial (Eb), basibranchial (Bb). (a) |»], Mesencephale. (b) ^ , Partie anterieure du rhombencephale.
(c) H, Partie posterieure du rhombencephale.
medianes viennent fusionner sur l'extremite anterieure du basihyal. Les cellules
qui constituent ces ebauches presentent les caracteres nucleaires de la caille
lorsque le remplacement heterospecifique de l'ebauche neurale a ete pratique au
niveau du mesencephale (Tableau 6, Fig. 9).
C'est a la fin de la premiere moitie de l'incubation que commence l'ossincation
des ceratobranchiaux, le manchon osseux forme en premier lieu dans la region
moyenne de ces cartilages s'etend et s'epaissit progressivement, les osteoblastes
qui le constituent presentent les caracteres nucleaires des cellules de caille chez
les embryons porte-greffe (Fig. 8F). Les ceratobranchiaux sont les seules pieces
de Phyo'ide qui soient ossifiees pendant la vie embryonnaire.
Role des cellules mesectoderrniques
473
CONCLUSIONS ET DISCUSSION
Les experiences rapportees ci-dessus montrent la participation importante des
cellules mesectodermiques issues des cretes neurales a la formation des arcs
branchiaux. L'utilisation de la technique de marquage biologique par les cellules
de Caille (Le Douarin, 1969, 1971, 1973) met en evidence l'origine ectodermique
de Fensemble du mesoderme branchial a l'exception des plaques musculaires et
de Pendothelium vasculaire des arcs aortiques. La stabilite du marqueur cellulaire naturel constitue par les cellules de caille implantees chez le poulet, a
permis de suivre revolution du mesectoderme neural au cours de l'ontogenese.
II a ete ainsi possible d'etudier la localisation definitive et le type de differenciation des cellules mesenchymateuses qui colonisent precocement les arcs branchiaux. Dans le present travail nous nous sommes interessee particulierement a la
formation des pieces squelettiques branchiales, l'etude des autres formations
conjonctives derivees du mesectoderme fera l'objet d'un prochain article.
Nous avons pu montrer que les pieces de la machoire inferieure ainsi que
l'hyoide dans sa totalite derivent des cretes neurales. Certains auteurs (Hammond
& Yntema, 1964) se basant sur les resultats d'experiences d'excision des cretes
neurales a des stades precoces du developpement embryonnaire ont considere
que le basibranchial pouvait avoir une origine mesodermique, differente de celle
des autres pieces de l'hyoide. Nous n'avons pas retrouve ce resultat. Dans nos
experiences en effet, lorsque la greffe de tube neural de caille a ete realisee au
stade et au niveau convenables le basibranchial est, comme le basihyal, l'entoglosse, les ceratobranchiaux et les epibranchiaux, forme de cellules issues du
greffon. Les conclusions de Hammond & Yntema s'expliquent vraisemblablement par le fait que l'excision de fragments de territoires embryonnaires aux
jeunes stades du developpement entraine des processus de regulation qui peuvent
introduire des causes d'erreurs quant a la localisation precise des territoires
presomptifs considered.
Les niveaux d'origine des differentes pieces du squelette hypobranchial ont
pu etre determines avec une assez grande precision. Nous avons toutefois
remarque qu'il n'existe pas de limite tranchee au niveau du nevraxe entre les
territoires qui colonisent les arcs branchiaux successifs. II existe le long de la
crete neurale une succession de zones dont les cellules migrent preferentiellement
dans les differents arcs, ces zones etant separees par des territoires marginaux
dont les cellules colonisent indifferemment deux arcs voisins (Fig. 8, Tableau 3).
II ressort de nos experiences que les pieces de la machoire inferieure ainsi
que l'entoglosse de l'hyoide derivent de l'ebauche mesencephalique alors que
les autres parties de l'hyoide sont constitutes de cellules issues des regions
anterieures et posterieures (basihyal, ceratobranchiaux, epibranchiaux et basibranchial) de l'ebauche rhombencephalique (Fig. 9).
La possibility de suivre revolution des cellules de caille implantees chez le
poulet pendant toute la duree de l'incubation de l'embryon hote nous a amenee a
30-2
474
C. LE LIEVRE
observer la differentiation des cellules mesectodermiques en osteoblastes. Ceci
a pu etre etudie dans les os de membrane (angulaires, supra-angulaires, dentaires
et operculaires) de la machoire inferieure et aussi dans les processus d'ossincation
endochondrale des ceratobranchiaux. Dans les deux cas, nous avons pu observer
la formation de tissu osseux dont les osteoblastes sont des cellules de caille.
Des experiences d'excision de l'ebauche neurale mesencephalorhombencephalique comparables a celles de Hammond & Yntema (1964) on ete faites chez
l'embryon de poulet aux stades de 4 a 12 somites. Elles nous ontpermis d'observer
les repercussions de la deficience en mesectoderme branchial sur la morphogenese de la region cervicale de l'embryon. L'absence presque totale de mesenchyme branchial consecutive a l'excision de l'ebauche neurale n'empeche pas la
constitution normale des poches endodermiques et des fentes branchiales. La
consequence marquante de l'intervention consiste dans un deficit important du
developpement de la region ventrale du cou par rapport a la face dorsale qui
s'accroit normalement.
Les differentes experiences realisees faisant intervenir soit les excisions de
l'ebauche neurale soit la greffe de tube neural de caille sur l'embryon de poulet
ont permis de montrer que les cellules mesectodermiques presomptives quittent
l'ebauche neurale a un stade precoce du developpement qui se situe avant le stade
de 7 somites en ce qui concerne la region mesencephalique, avant celui de 9 a
10 somites pour la region anterieure du rhombencephale et avant celui de 11 a
12 somites pour le rhombencephale posterieur.
Remarquons que nos experiences qui ont implique l'excision ou la greffe du
tube neural et des bourrelets medullaires ne nous permettent pas d'affirmer que
les cellules migrantes derivent exclusivement des cretes neurales. Toutefois,
compte tenu des experiences de differents autres auteurs (Hammond & Yntema,
1953; Johnston, 1966; Chibon, 1966) qui ont operepreferentiellementleterritoire
des cretes neurales, nous pouvons considerer que l'essentiel sinon la totalite des
cellules qui participent a la genese des structures branchiales sont en fait
originaires des cretes neurales.
11 convient de remarquer que le territoire des cretes neurales rhombencephaliques est particulierement riche de potentialites evolutives. Dans des
travaux anterieurs, il a en effet ete montre qu'elles sont aussi a l'origine des
cellules a calcitonine du corps ultimobranchial (Le Douarin & Le Lievre, 1970,
1971 a, b) des cellules du corps carotidien (Le Douarin, Le Lievre & Fontaine,
1972; Pearse et ah 1973) et des cellules ganglionnaires intramurales du tractus
digestif (Le Douarin & Teillet, 1971, 1973). II ressort de nos experiences que les
territoires capables de fournir les cellules mesectodermiques qui collaborent a
la formation du mesenchyme cephalique et branchial est strictement limite aux
cretes neurales anterieures au 7eme somite.
Role des cellules mesectodermiques
475
RESUME
La participation des cellules issues des cretes neurales mesencephalorhombencephaliques a
la genese des arcs branchiaux et particulierement du squelette hypobranchial a ete mise en
evidence par des experiences de greffes heterospecifiques d'ebauches neurales de caille chez
l'embryon de poulet. Les cellules de caille qui peuvent etre distinguees des cellules de poulet
par la structure de leur noyau (Le Douarin, 1969, 1973) jouent dans ces experiences le role
de 'marqueurs'.
L'excision de l'ebauche neurale mesencephalorhombencephalique chez des embryons de
poulet de 4 a 12 somites, non suivie de la greflfe d'un territoire homologue d'un embryon de
caille de meme stade, a pour consequence une atrophie des arcs branchiaux et des deficiences
importantes du squelette hypobranchial.
La greffe isotopique et isochronique d'ebauche neurale de caille chez le poulet a permis de
constater que le mesenchyme des arcs branchiaux est forme de cellules issues de l'ebauche
mesencephalique (1° et 2° arcs) et rhombencephalique (2°, 3° et 4° arcs). Toutefois les plaques
musculaires et l'endothelium vasculaire des arcs aortiques sont d'origine mesodermique.
La stabilite du marquage realise par les cellules de caille permet d'etudier la localisation
definitive des cellules mesectodermiques dans les structures squelettiques de la region branchiale et de montrer que toutes les pieces de la machoire inferieure et de 1'hyoide ont une origine
mesectodermique.
Les experiences de greffes heterospecifiques combinees aux experiences d'ablation permettent
de preciser le niveau d'origine des differentes pieces du squelette hypobranchial ainsi que le
stade auquel les cellules migrantes correspondantes quittent le nevraxe. La migration des
cellules neurales mesencephaliques, qui vont constituer le squelette de la machoire inferieure,
I'entoglosse et la partie anterieure du basihyal, commence avant le stade de 6 somites.
Les cellules mesectodermiques rhombencephaliques quittent le nevraxe avant le stade de
9 somites dans la region anterieure au niveau du 1° somite et avant le stade de 11-12 somites
dans la partie posterieure, elles vont constituer successivement une partie du basihyal, les
ceratobranchiaux et epibranchiaux ainsi que le basibranchial de 1'hyoide.
La differentiation des cellules mesectodermiques en chondrocytes et en osteocytes a ete
suivie au cours de la morphogenese du squelette hypobranchial. Cette observation met en
evidence l'origine mesectodermique des cellules qui constituent les os de membrane de la
machoire inferieure et l'os endochondral des ceratobranchiaux.
Je tiens a exprimer ma gratitude a Madame le Professeur N. Le Douarin pour l'aide et les
conseils qu'elle m'a prodigues au cours de la realisation de ce travail et de la redaction de
ce manuscrit.
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