/. Embryol. exp. Morph. Vol. 31, 2, pp. 263-286, 1974
263
Printed in Great Britain
Analyse morphologique des
chimeres obtenues par greffes embryonnaires chez
les Amphibiens Urodeles
Par JACQUES CHARLEMAGNE1 ET CHARLES HOUILLON1
Laboratoire de Biologie animate 2, Universite Paris 6, Paris
SUMMARY
Allogenic and heterospecific chimaeras have been made between four species of Amphibian Urodeles: Pleurodeles waltlii Michah., Triturus alpestris Laur., Triturus helveticus
Raz. and Ambystoma mexicanum Shaw. These chimaeras are complementary (groups A, B, C)
or not (groups D and E) and possess different morphologic types.
Allogenic chimaeras develop normally, are able to breed and easy to achieve. Their principal
interest, especially for E group, is that each one possesses two pairs of gonads.
A number of certain types of heterogenic chimaeras have been obtained and have reached
metamorphosis: 158 chimaeras between Pleurodeles waltlii and Triturus alpestris and 134
chimaeras between Pleurodeles waltlii and Triturus helveticus. Some live several years and raise
interesting problems: immune reactions, growth regulation and sexual differentiation.
INTRODUCTION
La microchirurgie embryonnaire appliquee aux germes d'Amphibiens,
permet de realiser des animaux chimeres constitues par l'association de deux
hemi-parties d'embryons sectionnes a des niveaux differents.
Des 1894, Born reussissait a obtenir de telles chimeres en associant des
bourgeons caudaux de Triturus taeniatus et Rana esculenta; la survie n'excedait
pas quelques jours. Le meme auteur (1897) a par la suite montre qu'il etait
possible de souder des germes de manieres tres diverses aussi bien entre embryons
d'une meme espece {Rana esculenta) qu'entre embryons de genres differents
{Rana esculenta-Bombinator igneus). Certaines chimeres realisees par Harrison
(1898) entre Anoures {Rana sylvatica-Rana palustris) ont depasse le stade de la
metamorphose. Ces resultats furent confirmes par Stone (1934) entre les memes
especes ainsi qu'entre Ambystoma tigrinum et Ambystoma punctatum, puis par
Church (1953, 1955), Hamilton (1963) et Davison (1966).
Depuis plusieurs annees, de nombreuses chimeres ont ete realisees dans
notre Laboratoire a partir des Amphibiens Urodeles. II s'agit aussi bien d'associations entre especes differentes, ou chimeres heterospecifiques (Houillon,
1
Adresse des auteurs: Universite Paris 6, Laboratoire de Biologie animale 2, 12, rue
Cuvier, 75230 Paris Cedex 05, France.
17
EMB 31
264
J. CHARLEMAGNE ET C. HOUILLON
1964a, b, c, 1965), que d'associations a l'interieur d'une meme espece, ouchimeres
allogeniques (Houillon & Charlemagne, 1971). Le developpement harmonieux
de tels animaux et leur longevite souvent comparable a celle des animaux
temoins, posent un certain nombre de problemes biologiques mais seuls
seront plus particulierement envisages dans le present travail, les problemes
morphologiques.
MATERIEL ET METHODES
1. Especes utilisees
Les greffes en chimere sont realisees entre les quatre especes suivantes
d'Amphibiens Urodeles:
famille des Salamandridae: Pleurodeles waltlii Michah. (Pleurodele); Triturus
alpestris Laur. (Triton alpestre); Triturus helveticus Raz. (Triton palme);
famille des Ambystomatidae: Ambystoma mexicanum Shaw (Axolotl).
Le Pleurodele est eleve au laboratoire selon la technique mise au point par
Gallien (1952). Les pontes s'obtiennent pratiquement en toutes saisons. Le
Triton alpestre pond en captivite de septembre a Juin. Les pontes de Triton
palme sont obtenues au printemps a partir d'animaux fraichement captures.
L'Axolotl se reproduit toute l'annee en captivite.
2. Techniques operatoires et d'elevage
Toutes les operations sont realisees au stade embryonnaire du bourgeon
caudal, determine d'apres la morphologie des embryons et defini par les tables
chronologiques du developpement:
- stades 22 a 25 du Pleurodele selon la table du developpement de Gallien &
Durocher (1957);
- stades 23 a 27 du Triton palme selon Gallien & Bidaud (1957) et stades
equivalents pour le Triton alpestre;
- stades 25 a 29 de 1'Axolotl selon Harrison (1960).
Les embryons sont operes dans le liquide operatoire sterile de Holtfreter.
La greffe en chimere consiste a sectionner transversalement deux embryons
FIGURES 1 A 8
Chimeres au stade du bourgeon caudal. Fig. 1, 2, 5, 6, 7 et 8: 24 heures apres
L'operation. Fig. 3 et 4: 3 heures apres l'operation.
Fig. 1 et 2. Chimeres Pl-alp et alp-Pl du groupe B
Fig. 3 et 4. Chimeres Pl-palm et palm-Pi du groupe B.
Fig. 5. Chimere alp-palm du groupe B.
Fig. 6. Chimere palm-alp du groupe C.
Fig. 7. Chimere palm-Ax du groupe C.
Fig. 8. Chimere Ax-palm du groupe B.
Les traits blancs indiquent l'emplacement des soudures.
Chimeres obtenues par grejfes embryonnaires
265
17-2
266
Embryon 1
J. CHARLEMAGNE ET C. HOUILLON
Embryon 2
FIGURE 9
Chimeres complementaires. Les embryons 1 (en blanc) et 2 (en gris), sont sectionnes selon les niveaux I, II et III. Les parties sectionnees homologues sont ensuite
echangees pour constituer des embryons chimeres qui peuvent etre de trois groupes:
groupe A, section au niveau I; groupe B, section au niveau II; groupe C, section
au niveau III.
Chimeres obtenues par greffes embryonnaires
267
puis a associer deux parties differentes arm d'obtenir un germe composite. La
section est obtenue a l'aide d'une lame de rasoir sterile. Chaque element de la
chimere est ensuite place dans une logette de pate a modeler prealablement
calibree, de facon a disposer les deux parties dans le prolongement exact l'une
de l'autre. Une legere pression des bords de la logette permet de maintenir le
nouveau germe pendant la cicatrisation. La vitesse de cicatrisation depend du
pH de la solution operatoire: elle est rapide (10 a 20 min) a pH 7 et beaucoup
plus lente a pH 8-8,2. Apres soudure, les chimeres sont sorties des logettes et
placees dans des coupelles de verre steriles contenant du liquide operatoire de
Holtfreter (Figs. 1-8). Deux a 4 jours plus tard, les embryons peuvent etre
places dans l'eau ordinaire quotidiennement renouvelee. La nourriture des
larves chimeres comporte en premier des Artemies {Artemia salind) ou des
Daphnies vivantes, puis des Tubifex finement haches et ensuite des Tubifex
entiers et des larves de Chironomes. Les elevages sont maintenus a la temperature du laboratoire (18-22 °C) jusqu'a la metamorphose. Par la suite, les
animaux eleves individuellement, sont places dans une salle climatisee
(20 ±1 °C).
3. Rendement operatoire
La mortalite des animaux operes est surtout importante au debut du
developpement, d'une part dans les 3 a 4 jours qui suivent l'operation et d'autre
part au moment de la prise de nourriture, soit 15 jours apres l'intervention.
Chaque serie operatoire est en fait un cas particulier ou intervient surtout le type
d'intervention realise entre les embryons disponibles.
Dans les associations allogeniques, environ la moitie des chimeres realisees
atteint la metamorphose; par la suite la mortalite n'est pas plus elevee que celle
des animaux temoins. Dans les associations heterospecifiques, les resultats sont
tres variables, le rendement operatoire pouvant varier largement pour un meme
type d'intervention. Statistiquement, il est exceptionnel que plus de 10 % des
chimeres realisees survivent un an apres l'operation. Les causes de la mortalite
seront envisagees a propos de chaque association.
4. Groupes de combinaisons operatoires
Disposant de deux embryons de la meme espece ou d'especes differentes, il
est possible de realiser un certain nombre de combinaisons operatoires en fonction de la section transversale au moment de l'intervention.
(a) Chimeres complementaires {Fig. 9)
Les combinaisons A, B et C montrent les differents types de chimeres
appelees complementaires: des parties homologues sont echangees entre les
deux embryons, chaque animal composite est la reciproque de l'autre.
Groupe A: les embryons sont sectionnes au niveau anterieur de la region
branchiale entre la vesicule optique et le bourgeon du balancier (niveau I).
268
J. CHARLEMAGNE ET C. HOUILLON
Embryon 1
Embryon 2
D
Embryon 1
Embryon 2
Fig. 10. Chimeres non complementaires (chimeres longues).
Groupe D. L'embryon 1 est sectionne posterieurement et l'embryon 2 est sectionne
immediatement en avant du pronephros. La chimere obtenue possede 3 paires de
membres: 2 paires anterieures et 1 paire posterieure.
Groupe E. L'embryon 1 est sectionne posterieurement et l'embryon 2 est sectionne
un peu en arriere du pronephros. La chimere obtenue possede un corps tres allonge,
sans ceinture intermediaire.
Chimeres obtenues par greffes embryonnaires
269
A Tetat adulte, le niveau de la soudure se situera immediatement en arriere de
la region oculaire.
Groupe B: la section des embryons passe entre le dernier bourgeon branchial
et la legere protuberance qui marque l'ebauche pronephretique (niveau II).
Chez Tadulte, la soudure sera situee dorsalement en arriere du crane et ventralement au niveau du pli gulaire.
Groupe C: les embryons sont sectionnes juste en arriere du bourgeon
pronephretique ou plus posterieurement (niveau III). Dans le premier cas, la
ceinture pectorale de l'animal pourra etre mixte avec une duplication plus ou
moins complete des membres anterieurs. Dans le second cas, la ceinture pectorale provient exclusivement de la partie anterieure.
(b) Chimeres non complementaires {Fig. 10)
Les chimeres non complementaires sont obtenues en soudant deux parties
d'embryons qui n'ont pas ete sectionnes au meme niveau.
Groupe D: l'embryon anterieur est sectionne posterieurement, la partie
posterieure du tronc et l'ebauche caudale sont eliminees. L'embryon posterieur
est sectionne immediatement en avant de l'ebauche pronephretique. L'animal
adulte possede un tronc anormalement long, interrompu dans sa partie moyenne
par la ceinture pectorale appartenant a l'individu posterieur.
Groupe E: l'embryon anterieur est sectionne tres posterieurement, la region
anale et l'ebauche caudale sont seules eliminees; l'embryon posterieur est
sectionne legerement en arriere de la zone pronephretique, la partie anterieure
eliminee correspond a la tete et a la ceinture pectorale. On obtient des chimeres
adultes qui possedent pratiquement deux parties troncales completes dans le
prolongement exact l'une de l'autre (chimeres a corps double).
Toutes les chimeres des differents groupes precedents peuvent etre realisees
entre embryons d'une meme espece (chimeres allogeniques) ou entre embryons
d'especes differentes (chimeres heterospecifiques). L'ebauche de l'appareil
urogenital etant situee assez posterieurement chez les embryons d'Urodeles,
les previsions statistiques permettent de prevoir pour toutes les chimeres du
groupe E et parfois egalement pour celles du groupe C, quatre combinaisons
sexuelles differentes: $-$, $-$, $-# et J - $ .
RESULTATS
A partir des quatre especes d'Amphibiens Urodeles indiquees, il est possible
de realiser 16 associations dont 4 allogeniques et 12 heterospecifiques. Le
tableau 1 rend compte, pour chaque association, du nombre de chimeres qui ont
atteint la metamorphose ou qui, pour les chimeres avec une partie anterieure
Axolotl, ont atteint l'age de 3 mois.
Le type d'association dans une chimere est designe par la succession des
270
J. CHARLEMAGNE ET C. HOUILLON
Tableau 1. Nombre de chimeres allogeniques et heterospecifiques ay ant atteint
ou depasse Page de la metamorphose ou ayant, pour les chimeres de partie
anterieure Axolotl, atteint Page de trois mois. Les chiffres entre parentheses
indiquent en pourcentage le rendement operatoire approximatif pour chaque
combinaison
partie anterieure
partie
posterieure
Pleurodele
Triton alpestre
Triton palme
Axolotl
Pleurodele
152
(50%)
97
(25 %)
79
(25 %)
0
Triton alpestre
Triton palme
61
(15%)
38
(50%)
17
(25%)
40
(15%)
55
(25%)
7
(25 %)
0
13
(5%)
Axolotl
4
(2%)
8
(2 %)
0
3
(50%)
abreviations1 correspondant aux especes en presence, l'espece qui constitue
la partie anterieure etant citee en premier. Par exemple, une chimere alp-Ax est
une chimere heterospecifique partie anterieure Triton alpestre et partie posterieure Axolotl, une chimere Pl-Pl est une chimere allogenique entre Pleurodeles.
Certaines associations, suivies d'un pourcentage appreciable de reussite ont
ete realisees en grand nombre. L'association Pl-Ax, bien que toujours precocement letale a fait l'objet de nombreuses tentatives. De meme, les quelques
chimeres du type inverse (Ax-Pl) n'ont pu etre obtenues qu'en multipliant les
interventions. L'absence de chimeres allogeniques entre Tritons palmes provient
non pas d'une difficulty operatoire particuliere, mais de la grande difficulty a
elever ces Tritons qui refusent de s'alimenter apres la metamorphose.
L'analyse morphologique qui suit se rapporte a l'ensemble des chimeres
considerees dans le tableau 1.
I. Chimeres allogeniques
1. Chimeres Pl-Pl
152 chimeres allogeniques entre Pleurodeles appartenant aux groupes A, B, C,
D et E ont depasse l'age de la metamorphose.
(a) Groupe A (10 animaux). Les chimeres allogeniques du groupe A atteignent
normalement l'age adulte et rien ne les distingue des Pleurodeles temoins.
(b) Groupe B (20 animaux). Ces chimeres sont d'une realisation facile. Aucun
1
Abreviations: PI: Pleurodele; Ax: Axolotl; alp: Triton alpestre; palm: Triton palme.
Chimeres obtenues par greffes embryonnaires
271
signe d'intolerance ne se manifeste et leur developpement est tout a fait
comparable a celui des animaux temoins.
(c) Groupe C (31 animaux). Les chimeres du groupe C ont souvent un tronc
legerement plus court que celui des animaux temoins. Apres la metamorphose
la croissance est nettement ralentie chez quelques individus devenus cachectiques.
Le niveau de la section lors de la realisation de la chimere peut affecter la future
region des glandes genitales: si dans 29 cas le phenotype sexuel est normal, par
contre, 2 animaux ages de 3 ans, presentent un aspect particulier. Us ont des
callosites aux membres anterieurs, un cloaque plus ou moins turgescent mais un
abdomen renfle dans la region pelvienne comme chez les Pleurodeles femelles.
Une biopsie sommaire a permis d'observer un testicule bien developpe situe au
voisinage anterieur d'un ovaire renfermant des ovocytes murs.
Toutes les interventions dans les groupes A, B et C peuvent theoriquement
faire l'objet d'un echange reciproque entre deux embryons, les germes composites
obtenus seront alors complementaires Pun de l'autre. La parfaite viabilite de
ces animaux implique la reconnaissance pour chaque chimere de la constitution
antigenique de son partenaire. Les consequences quant a l'immunite de transplantation dans un couple de chimeres allogeniques reciproques sont actuellement en cours d'etude.
(d) Groupe D (41 animaux). Le developpement de ces chimeres est rapide, les
larves sont tres voraces et atteignent la metamorphose vers Page de 3 mois,
parfois raeme avant les individus temoins issus des memes pontes. Les males
manifestent tous les caracteres de la maturite sexuelle vers Page d'un an et les
femelles 2 a 3 mois plus tard.
Les chimeres du groupe D possedent deux paires de membres anterieurs (Fig.
12) dont Pune appartient a lamoitie anterieure et l'autre a la partie posterieure.
On observe lors de la marche une remarquable coordination de leurs mouvements qui sont paralleles pour un meme cote de Panimal. La paire de membres
posterieurs est normalement coordonnee pour une marche en diagonale avec
les deux paires de membres anterieurs. La section trarusversale de Pembryon
posterieur se situant au niveau du champ morphogenetique des membres
anterieurs, il arrive que ce dernier soit plus ou moins fragmente. Les membres
qui se developpent a partir de ce territoire embryonnaire peuvent alors presenter
des duplications plus ou moins completes.
Parvenues a maturite sexuelle, ces chimeres se reproduisent normalement mais
les annees qui suivent sont marquees par un amaigrissement progressif de la
plupart des animaux. Six chimeres sont cependant en parfaite condition
8 annees apres Poperation.
L'anatomie interne des chimeres du groupe D est complexe. II existe generalement deux systemes digestifs complets se faisant suite: 2 foies, 2 estomacs,
2 pancreas. L'intestin moyen de la partie anterieure est directement relie
a Pestomac de la partie posterieure. Les aliments sont ainsi digeres deux fois.
L'assimilation est telle que les matieres fecales deviennent tres concentrees et
272
J. CHARLEMAGNE ET C. H O U I L L O N
13
11
FIGURES 11 A 13
Fig. 11 et 13. Chimeres Pl-Pl du groupe E, male a gauche et femelle a droite, agees
de 4 ans. Respectivement 220 et 200 mm.
Fig. 12. Chimeres Pl-Pl du groupe D, de sexe male, agee de 4 ans. 200 mm.
Chimeres obtenues par greffes embryonnaires
273
ne sont que difficilement eliminees, elles s'accumulent dans l'intestin de la partie
posterieure pour former une masse compacte parfois de grande taille qui finit
par obstruer completement le tube digestif. Une occlusion intestinale est intervenue dans 17 cas sur 41 chimeres analysees, particulierement chez les animaux
dont le systeme digestif posterieur est bien developpe.
Seule rhemi-partie posterieure a un tractus urogenital normal. L'hemipartie anterieure est depourvue de reins et de glandes genitales, cependant les
canaux de Wolff et de Muller sont presents mais s'interrompent au niveau de la
soudure entre les deux hemi-parties. Ceci est particulierement evident pour les
chimeres femelles dont les oviductes anterieurs ne se raccordent pas a ceux de
la partie posterieure. La ceinture pectorale surnumeraire constitue un obstacle
mecanique qui entraine un blocage des canaux de Muller (Houillon, 1959).
(e) Groupe E (50 animaux). Sur un nombre total de 150 operations, 50
chimeres sont parvenues a l'age de la maturite sexuelle. Leur developpement est
tout a fait comparable a celui des animaux temoins. Ces chimeres possedent un
corps dont la longueur est pratiquement le double de celle d'un animal normal.
A Page de trois ans, elles mesurent 180 a 210 mm (Figs. 11 et 13).
L'anatomie du systeme digestif est simple, il est seulement plus long au
niveau de l'intestin moyen. Ces chimeres possedent par contre un double systeme de glandes genitales (Houillon & Charlemagne, 1971). Dans les combinaisons entre embryons du meme sexe, les deux gonades anterieures et les deux
gonades posterieures peuvent etre soit des ovaires ou soit des testicules. Des
chimeres a corps double possedant quatre ovaires sont capables de pondre au
meme titre que les femelles temoins. Contrairement aux femelles du groupe D,
les canaux de Muller de la partie anterieure se raccordent a ceux de la partie
posterieure, les oviductes sont alors continus de chaque cote de l'animal. Dans
la combinaison SS, les chimeres possedent aux mieux trois testicules normaux. En general un testicule, parfois deux, demeurent a l'etat vestigial. II ne
s'agit alors que d'une deficience quantitative, ces gonades presentent une
differentiation testiculaire normale sans cependant atteindre la maturite sexuelle. Les canaux de Wolff des chimeres homosexuees males sont en parfaite
continuite entre les parties anterieure et posterieure.
Dans les combinaisons heterosexuees, 1'evolution male s'efFectue le plus
souvent de maniere normale, les deux testicules parviennent a maturite sexuelle.
Les ovaires sont par contre profondement inhibes et reduits a de minces tractus
sans ovocytes macroscopiquement discernables. II s'agit la d'un phenomene
classique relevant de l'inhibition du developpement ovarien en presence de
testicules. Cependant, quelques individus possedent des ovaires mieux differencies avec plus ou moins d'ovocytes ay ant effectue leur vitellogenese malgre
la presence de testicules normaux. Ces cas sont a rapprocher des deux chimeres
particulieres signalees a propos du groupe C. Le developpment des conduits
genitaux se trouve alors perturbe et merite une etude ulterieure.
274
J. CHARLEMAGNE ET C. HOUILLON
Groupe B
Groupe C
18
Groupe D
Groupe E
FIGURES 14 A 21
Chimeres heterospecifiques entre Pleurodeles et Tritons alpestres. Dans chaque
groupe, la chimere Pl-alp est a gauche et la chimere alp-PI est a droite.
Groupe B. Fig. 14: 36 mois, 70 mm; Fig. 15: 60 mois, 120 mm.
Groupe C. Fig. 16: 10 mois, 50 mm; Fig. 17: 10 mois, 65 mm.
Groupe D. Fig. 18: 10 mois, 65 mm; Fig. 19: 10 mois, 65 mm.
Groupe E. Fig. 20: 10 mois, 63 mm; Fig. 21: 10 mois, 67 mm.
Chimeres obtenues par greffes embryonnaires
275
Tableau 2. Detail numerique des chimeres heterospecifiques Pl-alp et alp-Pl
obtenues dans chaque groupe d'association
Groupe
A
B
C
D
E
Total
Chimeres Pl-alp
Chimeres alp-Pl
5
3
61
37
21
12
3
2
7
7
97
61
2. Chimeres alp-alp (38 animaux)
Les chimeres allogeniques entre embryons de Tritons alpestres, tout comrae
les chimeres allogeniques entre Pleurodeles, sont realisables avec un pourcentage
eleve de reussite. Les interventions se rapportent uniquement aux chimeres
des groupes D et E pour lesquels 27 animaux ont depasse l'age d'un an. Cet age
correspond a la maturite sexuelle du Triton alpestre eleve au Laboratoire,
atteinte egalement dans les memes delais pour les chimeres. L'etude actuellement en cours, revele pour les combinaisons homosexuees et pour les combinaisons heterosexuees, un aspect du tractus urogenital comparable a celui des
Pleurodeles a corps double.
3. Chimeres Ax-Ax (3 animaux)
A titre preliminaire, un nombre restreint d'interventions entre embryons
d'Axolotl a ete realise. Seules 3 chimeres appartenant au groupe D atteignent
maintenant l'age de 4 ans. Le developpement de ces chimeres est comparable a
celui des animaux temoins.
II. Chimeres heterospecifiques
1. Chimeres entre Pleurodeles et Tritons alpestres
Des chimeres des groupes A, B, C, D et E peuvent etre realisees entre
ces deux especes (Figs. 14 a 21). Le tableau 2 indique le detail des chimeres
heterospecifiques Pl-alp et alp-Pl obtenues. Seuls sont pris en consideration
les animaux ayant au moins atteint le stade de la metamorphose.
(a) Chimeres Pl-alp (97 animaux). Au cours de la vie larvaire, chaque partie
de la chimere s'accroit au meme rythme que celle d'un Pleurodele ou d'un
Triton alpestre temoin. Les larves sont vigoureuses et s'alimentent normalement. La metamorphose intervient vers l'age de 4 mois. Cette derniere est
determinee dans les groupes, B, C, D et E par Pactivite du complexe hypothalamus-hypophyse-thyroiide de la partie anterieure Pleurodele. La metamorphose
de la partie posterieure Triton alpestre se deroule plus rapidement que celle
de la partie anterieure. Ceci provient vraisemblablement du fait que, pour une
meme quantite d'hormone thyroidienne, les tissus de Triton alpestre sont plus
sensibles que ceux de Pleurodele.
Les chimeres des groupes B et C ont souvent un abdomen dilate par la
276
J. CHARLEMAGNE ET C. HOUILLON
/
150
/
140
/
/
130
/
120
110
/
/
100
V
/
/
A
90
E
= 80
SJ
/
/
!
!
-
•jjj 7 0
-''
+- - —
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•
•
•
60 50
40
/
/ • *
•
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i
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•
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•
•
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•
•
1/
30
V.
10 -
20
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
2 4 6 8 10 72 14 16 18 20 22 24
30
36
42
48
Mois
Fig. 22. Taille des chimeres Pl-alp complementaires en fonction de leur age.
Chaque point ( # ) figure la taille d'une chimere au moment de sa mort. #
•,
chimeres Pl-alp; A
A, Pleurodeles temoins; H
h, Tritons alpestres
temoins.
presence de poumons tres longs, libres dans la cavite generale et gonfles d'air.
Les poumons prenant naissance juste en arriere du dernier arc branchial, sont
d'origine Pleurodele; leur grand developpement est en rapport avec l'espece
Pleurodele mais ils vont occuper une place importante dans la cavite generale
de la petite espece Triton alpestre qui constitue la partie posterieure de la
chimere.
Apres la metamorphose, la croissance de la partie Pleurodele se trouve
ralentie ou arretee. Dans le cas des chimeres du groupe B, la tete Pleurodele ne
depasse pas la taille de celle d'un Pleurodele age de 9 a 10 mois dans les meilleurs cas, 4 a 5 mois en general. La croissance du corps Triton alpestre est
proche de celle des Tritons temoins. Apres un an la taille des chimeres varie
entre 50 et 78 mm, la taille des Tritons temoins entre 70 et 100 mm. Un Triton
alpestre femelle temoin adulte mesure au plus 110 mm (Fig. 22).
Chimeres obtenues par greffes embryonnaires
277
150
140
130
120
110
100
90
|
80
1 70
60
50
40
30
20
10
2
6
4
10 14 18
8 12 16
24
J
30
L
36
i
42
'
i
I
I
L
54
60
66
72
78
Mois
Fig. 23. Taille des chimeres alp-Pl complementaires en fonction de leur age.
Chaque point ( # ) figure la taille d'une chimere au moment de sa mort. •
•,
chimeres alp-Pl; A
A, Pleurodeles temoins; H
1-, Tritons alpestres
temoins.
Parmi les 92 chimeres des groupes B a E, 72 ont atteint l'age de 6 mois, 37
l'age d'un an, 19 l'age de 2 ans, 7 l'age de 3 ans et 2 l'age de 4 ans. La mortalite
se situe d'abord entre 3 et 6 mois, age correspondant a la metamorphose des
animaux. Les remaniements anatomiques consecutifs a la metamorphose
surtout au niveau de la region pharyngienne, sont le plus souvent responsables
de cette breve survie. Pres de 40 animaux sont par la suite decedes entre l'age
de 8 a 17 mois. Une telle mortalite apres un developpement jusque la harmonieux, devient plus delicate a interpreter car elle ne releve pas d'anomalies
anatomiques. Dans la majorite des cas, la partie posterieure Triton alpestre
presente des plaies necrotiques au niveau de l'epiderme dorsal et de l'extremite des membres. Plusieurs observations, dont il sera fait mention ulterieurement, suggerent que les animaux perissent par suite d'un conflit d'ordre
immunitaire plus ou moins tardif. Ainsi, les chimeres qui sont parvenues a
subsister plus de trois ans ont peri au cours d'une crise de necrose.
278
J. CHARLEMAGNE ET C. HOUILLON
Sur 78 chimeres Pl-alp appartenant aux groupes B et C dont l'etat general
a permis l'observation des glandes genitales, il y avait 42 males et 36 femelles.
La differentiation sexuelle s'effectue nonnalement au cours de la vie larvaire,
mais par suite du retard general de la croissance apres la metamorphose la
maturite sexuelle est atteinte tardivement. Seules 8 chimeres males et 6 chimeres
femelles agees de 25 a 30 mois, ont atteint la maturite sexuelle. Une chimere
Pl-alp du groupe B, a pondu spontanement quelques ceufs de Triton alpestre a
l'age de 24 mois.
(b) Chimeres alp-Pl (61 animaux). Le developpement larvaire s'effectue
nonnalement et la metamorphose des chimeres alp-Pl intervient vers l'age de
12 semaines. A ce moment, la partie posterieure Pleurodele n'est encore qu'au
stade morphologique 55 a, anterieur de quelques semaines a celui de la metamorphose normale. Neanmoins, les deux parties de la chimere se metamorphosent d'une maniere synchrone.
Par la suite, la croissance generate des chimeres est sous la dependance du
developpement de la partie anterieure. La figure 23 montre un parallelisme
assez net entre le developpement de ces chimeres et celui des Tritons alpestres
temoins: 6 chimeres agees de 2 a 6 ans ont atteint ou depasse legerement la
taille de 100 mm correspondant a celle des Tritons temoins adultes et a la taille
de Pleurodeles temoins ages d'environ 6 mois.
Parmi les 58 chimeres des groupes B a E, 23 d'entre elles seulement ont
atteint ou depasse l'age d'un an, cette mortalite n'etant pas particulierement
liee au phenomene de la metamorphose. Le plus souvent, refusant de s'alimenter,
les animaux meurent d'inanition. La necrose n'intervient que rarement.
Les glandes genitales situees uniquement dans la partie posterieure du type
Pleurodele pour les chimeres alp-Pl des groupes B, C et D, demeurent a l'etat
juvenile. La cause principale reside dans le retard du developpement de cette
partie posterieure dont l'aspect morphologique atteint rarement celui d'un
Pleurodele temoin age de 10 mois. Les testicules des chimeres males presentent
un developpement comparable a celui des Pleurodeles dont le corps aurait une
longueur equivalente et meme tres souvent, le developpement testiculaire
semble inhibe. La maturite sexuelle n'ajamais ete atteinte, quel que soit l'age,
par les 5 chimeres males du type alp-Pl ayant vecu plus d'un an.
Le developpement des ovaires, moins ralenti que pour les testicules correspond a celui des Pleurodeles femelles de longueur equivalente. Aucun cas de
vitellogenese n'a ete observe au niveau des ovaires chez les 13 femelles du type
alp-Pl ayant depasse l'age d'un an et meme chez deux d'entre elles a l'age de 4
ans.
2. Chimeres entre Pleurodeles et Tritons palmes
Les combinaisons Pl-palm et palm-Pi ont ete realisees selon les groupes
B, C, D et E. Le tableau 3 indique le nombre d'animaux de chaque groupe
ayant au moins atteint le stade de la metamorphose.
Chimeres obtenues par greffes embryonnaires
279
Tableau 3. Detail numerique des chimeres heterospecifiques palm-Pi et Pl-palm
obtenues dans chaque groupe d''association
Groupe
...
Chimeres palm-Pi
Chimeres Pl-palm
A
B
C
D
E
Total
1
0
26
46
26
19
0
7
2
7
55
79
(a) Chimeres palm-Pi (55 animaux). La metamorphose de ces chimeres,
placee sous le controle endocrinien de la partie anterieure Triton palme, debute
en general vers l'age de 10 semaines alors que les animaux mesurent environ
45 mm; elle est done nettement anticipee pour la partie posterieure Pleurodele.
Deux chimeres seulement de ce type ont atteint respectivement l'age de 26 et 40
mois; leur longueur correspond a celle d'un Triton palme adulte (Fig. 24).
Les jeunes Tritons palmes temoins, eleves au Laboratoire, refusent de
s'alimenter apres la metamorphose; les chimeres constituees d'une partie
anterieure Triton palme ayant le merae comportement, meurent d'inanition en
general 1 a 3 mois apres la metamorphose. Les quelques chimeres agees de plus
d'un an meurent pour la plupart d'une maladie cachectisante a evolution lente.
L'oedeme et la necrose sont rares.
Les chimeres palm-Pi gardent des gonades d'aspect juvenile qui ne parviennent jamais a maturite sexuelle, sauf pour l'animal ayant suvecu 40 mois et qui
presentait les caracteres de la maturite sexuelle male.
(b) Chimeres Pl-palm (79 animaux). Le developpement presente les memes
caracteristiques que pour les chimeres Pl-alp. La petite taille du Triton palme
accentue encore la disproportion entre la partie anterieure et la partie posterieure (Fig. 25). Apres la metamorphose, la croissance de la partie anterieure
Pleurodele est tres ralentie. Pour les chimeres des groupes C et surtout D et E,
la partie anterieure Pleurodele peut atteindre dans quelques cas les proportions
d'un Pleurodele temoin age d'un an. La disproportion entre les deux parties
de la chimere est alors importante. La taille des chimeres des groupes B et C
ne depasse pas 90 mm, taille approximative d'un Triton palme adulte.
Sur 79 animaux, 36 seulement atteignent l'age de 6 mois; cependant,
3 chimeres Pl-palm ont survecu plus de 5 ans. La mortalite est due dans la
majorite des cas a la necrose de la partie posterieure Triton palme. Les chimeres
agees de plus d'un an meurent pour les memes raisons, au cours d'un phenomene de rejet, particulierement violent pour les groupes C, D et E.
Sur les 67 chimeres Pl-palm analysees, 32 etaient males et 35 femelles. Parmi
les 22 chimeres qui ont atteint ou depasse l'age d'une annee, 6 males et
8 femelles sont parvenus a maturite sexuelle.
l8
EMB
31
280
J. CHARLEMAGNE ET C. H O U I L L O N
27
FIGURES 24 A 27
Fig. 24. Chimere palm-Pl du groupe C (20 mois, 97 mm).
Fig. 25. Chimere Pl-palm du groupe E (32 mois, 89 mm).
Fig. 26. Chimere palm-alp du groupe C (24 mois, 80 mm).
Fig. 27. Chimere alp-palm du groupe B (24 mois, 100 mm).
Chimeres obtenues par greffes embryonnaires
281
3. Chimeres entre Tritons
Le nombre de chimeres obtenues entre les Tritons alpestre et palme est assez
restreint bien que la reussite operatoire soit souvent superieure a celle rencontree dans les associations heterospecifiques precedentes, du moins jusqu'a
Fepoque de la metamorphose.
(a) Chimeres palm-alp (7 animaux). Connaissant les difficultes deja signalees a propos de Felevage des Tritons palmes, tres peu de chimeres palm-alp
ont ete realisees. Malgre tout, ce type d'association heterospecifique presente
la plus remarquable longevite: deux chimeres palm-alp ont survecu pres de
8 annees. II s'agissait d'individus males qui manifestaient deja les caracteres de la
maturite sexuelle a l'age de deux ans. La taille de ces chimeres correspondait a
celle des Tritons palmes adultes (Fig. 26).
(b) Chimeres alp-palm (17 animaux). Les associations alp-palm ont ete plus
particulierement realisees dans le groupe D (10 animaux). La mortalite est
intervenue au cours des mois suivant la metamorphose. Cependant, 3 chimeres
du groupe B ont atteint la maturite sexuelle et ont survecu davantage: 30 mois
pour une chimere male et respectivement 33 mois et plus de 6 ans pour deux
chimeres femelles (Fig. 27).
4. Chimeres entre Pleurodeles et Axolotls
L'embryon de l'Axolotl est plus volumineux que celui du Pleurodele. Des
chimeres de tous les groupes peuvent pourtant etre realisees, les soudures sont
en general rapides, bien que parfois imparfaites au niveau de Fendoderme
ventral.
(a) Chimeres Pl-Ax. Malgre le grand nombre d'interventions realisees
(plusieurs centaines), aucune chimere n'a ete elevee plus de trois semaines apres
Foperation. Les quelques chimeres qui atteignent la stade de la prise de nourriture sont incapables de s'alimenter et le plus souvent sujettes a de Fascite
cardiaque qui entraine une microcephalie et une paralysie de la bouche.
(b) Chimeres Ax-Pl (4 animaux). L'association est rapidement letale dans les
groupes B et C. Une chimere du groupe D a vecu 4 mois \ (longueur: 78 mm);
trois chimeres du groupe E ont vecu respectivement 4 mois \ (40 mm), 7 mois
(110 mm) et 16 mois (120 mm). Un grand nombre d'operations a ete necessaire
pour obtenir ces chimeres qui sont mortes lors du rejet immunologique de la
partie posterieure Pleurodele par la partie anterieure Axolotl. Les chimeres
Ax-Pl ne se metamorphosent pas, Fetat larvaire permanent etant sous la
dependance du complexe endocrinien de l'Axolotl (Fig. 32).
5. Chimeres entre Tritons et Axolotls
(a) Chimeres alp-Ax (40 animaux) et palm-Ax (13 animaux). Alors que
les associations Pl-Ax ne sont pas viables, les chimeres alp-Ax et palm-Ax
qui pourtant se pratiquent aussi entre families differentes, peuvent survivre
18-2
282
J. CHARLEMAGNE ET C. HOUILLON
28
1
29
31
Chimeres obtenues par greffes embryonnaires
283
plusieurs mois. Le rendement operatoire est du meme ordre que celui obtenu
dans les associations heterospecifiques entre les trois especes de Salamandridae,
du moins jusqu'a la metamorphose.
La soudure de la partie anterieure Triton et de la partie posterieure Axolotl
s'effectue parfaitement malgre la disproportion entre les hemi-parties associees, surtout lorsqu'il s'agit du Triton palme. La croissance larvaire de la
partie Triton est semblable a celle des temoins, par contre, la partie Axolotl se
developpe en general moins rapidement que dans les conditions naturelles. La
metamorphose intervient vers l'age de 3 a 5 mois, les chimeres mesurent au
plus 45 mm et leurs deux parties se transforment d'une maniere rigoureusement synchrone. Les Axolotls temoins a cet age peuvent atteindre 80 mm,
neanmoins dans l'association en chimere, la partie posterieure Axolotl encore
tres juvenile, est capable de subir les processus de la metamorphose grace a
1'activite endocrinienne de la partie anterieure.
Les chimeres palm-Ax meurent pour la plupart d'inanition apres la metamorphose. Les chimeres alp-Ax ont surtout ete obtenues dans les groupes C et
E; 35 ont atteint l'age de 6 mois et 4 l'age de 20 mois. Une seule chimere a
vecu 26 mois et mesurait 100 mm. La necrose se manifeste rarement, les chimeres alp-Ax meurent le plus souvent d'oedeme, suivi de paralysie (Figs. 28, 30
et 31).
{b) Chimeres Ax-alp (8 animaux). L'association Ax-alp est aussi delicate a
obtenir que l'association Ax-Pl, les animaux depassent rarement la prise de
nourriture. Pourtant, 8 chimeres Ax-Pl ont ete elevees plus de 3 mois (3 du
groupe B et 5 du groupe E). Le maximum de longevite a ete de 10 mois pour 3
chimeres du groupe E. Le developpement de la partie anterieure Axolotl se
trouve tres ralenti. Ces chimeres, comme les chimeres Ax-Pl, ne se metamorphosent pas. Elles meurent toutes par necrose de la partie Triton alpestre
consecutive a l'activite immunologique de la partie anterieure Axolotl (Fig. 29).
FIGURES 28 A 32
Fig. 28. Chimere alp-Ax du groupe C (20 mois, 95 mm).
Fig. 29. Chimere Ax-alp du groupe C (7 mois, 93 mm).
Fig. 30. Chimere de la figure 28 photographiee en vue ventrale. Observer la zone
intermediaire pigmentee noire et blanche sitee au niveau de la soudure.
Fig. 3.1. Chimere alp-Ax du groupe C (9 mois, 50 mm). L'Axolotl est ici de la race
pigmentee. Comparer l'aspect de la pigmentation a l'aspect de la zone intermediaire
de la chimere precedente.
Fig. 32. Chimere Ax-Pl du groupe C (9 mois, 100 mm).
284
J. CHARLEMAGNE ET C. HOUILLON
CONCLUSION
1. Chimeres allogeniques
La technique de greffe embryonnaire en chimere offre de nombreux interets
biologiques. Dans le domaine de la morphogenese il serait possible d'analyser
le developpement des associations entre animaux normaux et aneuploides ou
affectes de mutations letales. Mais surtout le domaine immunologique merite
une attention plus particuliere. La tolerance activement acquise est evidente
puisque les chimeres allogeniques de Pleurodeles sont encore parfaitement viables
a l'age de 8 ans, de meme que les chimeres allogeniques de Tritons alpestres
et d'Axolotls atteignent maintenant 4 annees. II vient d'etre demontre dans notre
Laboratoire que chaque hemi-partie d'une chimere allogenique conservait son
antigenicite particuliere (inedit): les greffons preleves sur la partie anterieure
ont une evolution qui peut etre differente des greffons preleves sur la partie
posterieure lorsqu'ils sont greffes sur un meme hote temoin.
L'interet principal des chimeres du groupe E reside dans les interactions
sexuelles que Ton observe chez ces animaux a corps double. II se developpe en
effet toujours un double systeme de glandes genitales. Si pour la majorite des
animaux la prevalence male est respectee dans les associations heterosexuees,
dans quelques cas testicules et ovaires a maturite sexuelle coexistent au voisinage
immediat les uns des autres. De telles associations, realisees entre animaux
histocompatibles, devraient permettre d'eliminer 1'influence eventuelle de
facteurs d'ordre immunologiques au cours de la differenciation sexuelle d'une
combinaison heterosexuee (Houillon, Charlemagne & Goujon, 1973).
2. Chimeres heterospecifiques
Un nombre appreciable dissociations a pu etre obtenu dans certaines combinaisons: 97 chimeres Pl-alp; 61 alp-Pl; 79 Pl-palm; 55 palm-Pi; 40 alp-Ax.
Les chimeres heterospecifiques qui survivent plusieurs annees, posent de
nombreux problemes. Les analyses serologiques ont permis de mettre en
evidence un chimerisme des proteines seriques dans les chimeres du groupe B
(Charlemagne & Houillon, 1969, 1971). L'etude immunologique (Charlemagne,
1972) a montre que suivant les combinaisons, trois etats peuvent se realiser:
- Certaines chimeres pdssedent des organes hematopoietiques normaux ou
aplasiques, non stimules. L'association est alors stable, la tolerance excellente
entraine une remarquable longevite.
- Le systeme hematopoietique peut etre stimule en permanence, la lymphocytopoiese importante au niveau splenique, le sang riche en polynucleaires et en
cellules mononucleees activees. Pour les chimeres allogeniques, cette stimulation
est la regie, mais elle n'evolue pas au-dela d'un certain stade et le phenomene de
rejet n'intervient pas. Pour certains types de chimeres heterospecifiques,
l'expression de l'activite des organes hematopoietiques peut rester sans effet
Chimeres obtenues par greffes embryonnaires
285
pendant plusieurs annees; toutefois, Pequilibre tolerance-rejet peut se rompre
dans le sens du rejet.
- Enfin, dans d'autres associations, une partie de la chimere rejette invariablement l'autre au moment de l'acquisition de sa competence immunologique.
L'etude de la croissance de ces chimeres montre que l'espece dont la taille est
la plus petite assure la regulation de la taille definitive. Ce n'est pas, comme
Faffirmait Stone (1934), la partie anterieure de la chimere qui regularise la
croissance de l'ensemble. Les facteurs qui interviennent dans cette harmonisation de croissance sont d'une analyse delicate; ils contribuent a la constitution
d'individus equilibres, done viables.
L'etude des glandes genitales des chimeres heterospecifiques a corps double
est en cours. Dans les chimeres homosexuees, l'animal peut avoir deux ovaires,
ou deux testicules, appartenant a une espece et deux ovaires, ou deux testicules,
appartenant a une autre espece. Dans les chimeres heterospecifiques heterosexuees se realise le maximum de complexite puisque l'animal peut posseder
deux gonades d'un sexe appartenant a une espece donnee et deux gonades du
sexe oppose appartenant a une autre espece. En plus des interactions entre
glandes genitales de sexe differents, s'ajoute eventuellement un conflit immunologique du a Pincompatibilite entre les deux hemi-parties heterogenes. Un autre
facteur dont il conviendra de tenir compte, est le decalage d'ordre chronologique
lors de la differentiation sexuelle des deux especes en presence.
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