/ . Embryo!, exp. Morph. Vol. 31,1, pp. 27-35,1974
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Printed in Great Britain
A propos (Tun effet paradoxal de la cycloheximide
sur Foeuf d'Anemia salina
Par J. FAUTREZ1 ET N. FAUTREZ-FIRLEFYN1
Universite de Gand - Laboratoire d'Anatomie de la Faculte de Medecine
SUMMARY
Cycloheximide, an inhibitor of protein synthesis at the 'translation' level, has a very strong
antimitotic activity upon the egg of Artemia salina, during segmentation. At extremely low
concentrations, on the contrary, it enables eggs, extracted from the uterus just after fertilization, to enter into segmentation, while the controls remain undivided. From these results it
is argued that synthesis of a protein in the immature egg could have an inhibitory influence
upon too early cell division. The synthesis of this factor could be extremely sensitive to cycloheximide action.
INTRODUCTION
La cycloheximide inhibe la synthese des proteines au niveau des ribosomes.
Elle empecherait la liaison initiate de m-RNA aux ribosomes en une structure
du type polysome, et le glissement du messager contre les ribosomes (Colombo,
Felicetti & Baglioni, 1965). Sur Pceuf & Artemia salina, en segmentation, elle se
revele etre un antimitotique puissant, agissant jusqu'a de tres fortes dilutions
(1 x 10~6 M a % x 10~6 M). NOUS reviendrons ailleurs sur les particularity de cette
action, mais voudrions tirer l'attention, ici, sur une activite apparemment
paradoxale observee fortuitement. II s'est revele en effet que des concentrations
plus faibles encore (1 x 10~7 M a £ x 10~6 M) peuvent induire la division cellulaire de jeunes ceufs indivis, fraichement fecondes, dans des lots, ou les temoins
ne se divisent pas in vitro.
MATERIEL ET TECHNIQUE
Les ceufs d'Artemia salina sont preleves dans l'ovisac et recueillis dans des
salieres contenant soit un liquide salin (temoins) (Fautrez-Firlefyn & Van Dyck,
1961), soit ce merae liquide auquel de la cycloheximide fut ajoutee (oeufs
experimentes).
Dans le present travail nous ne nous interessons qu'a certains lots d'ceufs
indivis, preleves rapidement apres leur descente dans l'uterus et leur fecondation
(Fig. 1), toujours avant le soulevement de la membrane vitelline. Ces oeufs se
reconnaissent aisement, sous la loupe binoculaire, des oeufs ayant souleve leur
1
Adresse des auteurs: Laboratoire d'Anatomie de la Faculte de Medecine, Universite de
Gand, B-9000 Gent, Ledeganckstraat 35, Belgium.
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membrane. Les premiers sont en effet legerement aplatis et mats; les seconds
sont spheriques et brillants.
Alors que dans nos conditions de culture, les oeufs indivis ou aux premiers stades
de la segmentation se developpent jusqu'au debut de la gastrulation, il arrive
cependant que des lots d'oeufs indivis 'mats' ne se divisent pas. Ayant fortuitement constate que dans ces cas, la cycloheximide a de faibles concentrations
pouvait permettre a la segmentation de se realiser, nous avons repris 10 fois
cette experience, en utilisant differentes concentrations allant de 1 x 10~7 M a
1 x 10-6 M.
Les germes sont examines vivants, et apres 6 a 7 heures il sont fixes pour
examen microscopique. Le fixateur utilise est l'alcool-formol-acetique. La
coloration des oeufs coupes en serie se fait au bleu de toluidine ou a la reaction
de Feulgen.
RESULTATS PERSONNELS
(a) Les temoins
La plupart des oeufs soulevent leur membrane de fecondation, environ quatre
heures apres leur descente dans l'uterus. Us ne presentent aucun signe, visible a
la loupe, de division cellulaire. Quelques rares germes cependant restent mats et
collent plus ou moins fortement au fond du recipient. Ces derniers presentent
plusieurs ondes de division. Dans ces oeufs aplatis, les blastomeres sont anormalement disposes, pratiquement tous dans un seul plan.
A l'examen microscopique des temoins, qui sont restes indivis et qui ont
souleve leur membrane vitelline, on observe des figures pluricentriques, qui
occupent le centre de l'oeuf. Les centres sont des spheres peu colorees, reliees
par des images fibrillaires, constituant des fuseaux anarchiques dans lesquels
des chromosomes se retrouvent deci-dela en plaques equatoriales ou en amas
FIGURES 1 A 6
(Eufs temoins, cultives dans un liquide physiologique. Toutes les coupes sont
colorees au bleu de toluidine. L'echelle au bas de la page se rapporte a toutes les
figures.
Fig. 1. Coupe d'un ceuf, au debut de l'experience. II est preleve de l'ovisac apres
fecondation, au moment ou l'axe de la metaphase de la premiere division de maturation (en haut) est encore parallele a la surface du germe.
Fig. 2 et 3. Deux exemples typiques d'oeufs jeunes cultives dans le liquide physiologique: figures polycentriques a centres clairs. Les chromosomes sont disperses
dans les fuseaux polycentriques.
Fig. 4. Cas plus exceptionnel: on trouve un seul noyau interphasique pres d'un des
asters pluricentriques.
Fig. 5 et 6. (Eufs n'ayant pas souleve leur membrane vitelline. Division en VIII
blastomeres, dont les rapports sont atypiques: etales dans un seul plan. Pour le reste
les images mitotiques semblent normales et remarquablement synchrones. Fig. 5.
Tous les noyaux sont en prophase. Fig. 6. Tous les noyaux sont en metaphase.
Cycloheximide sur /Vw/VArtemia
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Cycloheximide sur V'ceuf d'Artemia
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plus irreguliers (Fig. 2, 3). Plus rarement on trouve un seul noyau en intercinese, pres d'un des poles de la figure pluricentrique (Fig. 4). Dans 6 series de
temoins, nous ne trouvons pratiquement que des oeufs presentant cet aspect
particulier. Dans les 4 autres series, de rares germes ont atteint le stade des deux
pronuclei, apparemment normal, auquel ils sont figes.
Sporadiquement on observe des oeufs, qui ne soulevent pas leur membrane
vitelline; ils restent flasques et se divisent. A l'examen microscopique, on trouve
des blastomeres etales en un plan. II est remarquable que, meme dans ces
conditions, les cycles cellulaires restent absolument synchrones. La Fig. 5
montre un de ces oeufs, ou tous les noyaux sont en prophase; dans l'oeuf
represents sur la Fig. 6, ils sont tous en metaphase.
(b) CEufs soumis a faction de la cycloheximide
1. La solution \ x 10~7 M n'a aucune action decelable sur les germes, qui ont
le meme aspect que les temoins.
2. La solution \ x 10~7 M est a la limite de l'activite. Sur 7 lots d'oeufs, un
seul presente des germes, qui sont tous semblables aux temoins. Dans les autres
lots on obtient un melange. De tres nombreux oeufs sont arrives, au moment de
la fixation, aux stades a II (Fig. 7) ou IV blastomeres. Dans un lot de nombreux germes avaient atteint le stade VIII (Fig. 8). Tres souvent, au stade a
II blastomeres, la cloison separant les deux cellules ne se developpe que d'un
seul cote (Fig. 9,10). Dans la plupart des lots, on rencontre en outre des germes
bloques au stade des 2 pronuclei (Fig. 11), ou a diverses phases de la premiere
division de segmentation. Mais a l'exception des germes a cloisonnement
incomplet, tous ces elements ne sont pas differenciables, morphologiquement de
germes normaux, fixes a des moments correspondants du developpement. Dans
la moitie des echantillons environ, on rencontre une faible quantite d'oeufs
semblables aux temoins. Exceptionnellement, on peut trouver un germe indivis
a plusieurs noyaux intercinetiques dans un complex pluricentrique (Fig. 12).
3. La solution 1 x 10~7 M a une action plus prononcee que la precedents
Jamais plus nous y avons rencontre des germes semblables aux temoins. Sur
FIGURES 7 A 12
CEufs cultives dans une solution de cycloheximide \ x 10~7 M dans le liquide
physiologique. Toutes les coupes sont colorees au bleu de toluidine. L'echelle au
bas de la page se rapporte a toutes les figures.
Fig. 7. OEuf divise en II blastomeres.
Fig. 8. GEuf divise en VIII blastomeres.
Fig. 9. OEuf au stade II avec cytodierese incomplete.
Fig. 10. Le sillon entre les II blastomeres ne s'esquisse que d'un cote (vers la droite:
fleche).
Fig. 11. CEuf fige au stade des 2 pronuclei.
Fig. 12. Les noyaux se sont divises au centre d'une figure polycentrique. Absence de
toute cytodierese.
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7 lots examines, 1 seul etait compose essentiellement de germes au stade a IV
blastomeres. Dans 5 autres nous avons trouve le plus grand nombre d'oeufs a
II blastomeres. Dans 1 seul, les elements etaient figes au stade des 2 pronuclei.
Dans quatre des cinq lots ou les oeufs au stade II predominaient, on decouvrit
quelques germes presentant encore les 2 pronuclei, et d'autres arretes au cours
de la premiere mitose de segmentation.
4. La solution a \ x 70~6 M ne fut utilisee que pour deux lots. Dans un des
lots, certains oeufs avaient atteint le stade a II blastomeres; d'autres restaient
figes a celui des 2 pronuclei. Dans l'autre lot, on observe divers stades, d'aspect
normal, de la premiere division de segmentation.
5. La solution a 1 x 10~6 M bloque tous les oeufs au stade des 2 pronuclei
situes au centre du germe, soit encore a sa peripherie. II s'agit du blocage de la
segmentation au meme moment ou la cycloheximide arrete, aussi a des concentrations plus elevees des oeufs immerges au stade indivis jeune, aussi dans des
experiences dans lesquelles les temoins se divisent anormalement.
DISCUSSION
L'effet de la cycloheximide permettant du moins l'initiation d'une segmentation apparemment normale d'ceufs indivis, venant de descendre dans l'ovisac,
alors que les temoins restent indivis, se manifeste dans des limites de concentration tres etroites. D'une part la concentration | x 10~7 M n'a aucune action
visible. D'autre part la concentration 1 x 10~6 M bloque les oeufs au stade des
deux pronuclei, c'est-a-dire au stade ou des oeufs mats, dont les temoins sont
capables de se segmenter, sont arretes par Faction antimitotique du produit,
utilise a cette meme concentration ou a des concentrations plus elevees. Entre
ces deux extremes on voit que la concentration a -| x 10~7 M presente l'effet
favorisant, mais que toutefois un certain nombre d'oeufs reste encore semblable
aux temoins. Par contre, les solutions a 1 x 10~7 M et a | x 10~6 M permettent la
division cellulaire, mais on constate deja, pour un certain nombre de germes, le
blocage au stade des pronuclei.
II n'est pas simple de s'imaginer le mecanisme de cette influence, qui regularise et favorise la division cellulaire. Si Ton se souvient que la cycloheximide
est connue comme un inhibiteur de la synthese des proteines, l'hypothese la
plus vraisemblable nous semble etre l'inhibition par l'antibiotique d'une
proteine inhibitrice de la division cellulaire. La synthese de cette proteine
inhibitrice serait particulierement sensible a la cycloheximide, et le serait encore
a des doses ou la synthese des proteines necessaires a la division n'est plus
influencee.
Insistons sur le fait qu'il ne peut s'agir ici, que d'une simple hypothese,
basee sur des deductions indirectes. La synthese de proteines, pas plus que
l'inhibition de celle de certaines parmi elles sous l'effet de la cycloheximide,
n'a pu etre mise en evidence jusqu'ici sur notre materiel par des tests et des
Cycloheximide sur I'oeuf d'Artemia
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mesures directs, faute de technique appropriee. Ce n'est que par analogie avec ce
que Ton sait sur l'action du produit utilise sur d'autres materiaux (Wettstein,
Noll & Penman, 1964; Colombo et al. 1965), que nous estimons pareille
assertion plausible, tout en nous rendant compte que Interpretation de l'effet
d'un inhibiteur reste toujours delicate et qu'il pourrait sans doute agir sur le
metabolisme cellulaire par des mecanismes differents.
La cycloheximide, a des doses plus fortes que celle que nous avons utilisees
ici, se revele sur l'oeuf & Artemia en segmentation comme un antimitotique
puissant (resultats inedits). Son eflfet antimitotique est en grandes lignes semblable a celui de la puromycine (resultats inedits), agent qui s'est egalement
revele etre un inhibiteur de la synthese proteique au niveau de la traduction
(Colombo et al. 1965), et a celui de l'actinomycine D (Fautrez-Firlefyn &
Fautrez, 1966) et de la proflavine (Fautrez & Fautrez-Firlefyn, sous presse)
dont l'action sur la transcription est generalement admise (Hurwitz, Furth,
Malamy & Alexander, 1962). II nous semble done assez logique d'admettre que
les 4 agents, reputes comme des inhibiteurs de la synthese des proteines, produisant un effet antimitotique semblable sur notre materiel, le feraient par le
mecanisme qui leur est commun.
II nous semble en outre indispensable de rapprocher ces observations des
resultats anterieurs (Fautrez & Fautrez-Firlefyn, 1961), ou nous avons montre
que des ceufs vierges etaient actives, et pouvaient presenter des divisions
abortives, a condition de quitter l'oviducte. Cette reaction pouvait etre obtenue
de deux manieres differentes. Les oeufs peuvent etre extraits de l'oviducte et
recueillis dans un milieu physiologique. On pouvait encore les laisser descendre
dans l'ovisac chez des femelles separees de males: ils n'y etaient done pas fecondes comme normalement. Dans ces conditions, nous avons cru pouvoir conclure a la presence, dans l'oviducte, d'un facteur empechant des divisions
cellulaires d'eeufs immatures.
Nos presentes experiences permettent, nous semble-t-il, de faire un pas de
plus. Le facteur frenateur de l'oviducte agit par l'intermediaire de metabolites
synthetises par le germe lui-meme, puisque la cycloheximide agissant sur les
oeufs recueillis in vitro, leve l'inhibition en frenant cette synthese.
Mais il y a plus: les oeufs dont-il s'agit dans ces nouvelles experiences sont
fecondes. En effet, la fecondation a lieu des la descente dans l'ovisac de la
femelle, non separee des males, qui est un veritable receptacle de spermatozoides.
De plus quelques rares oeufs-temoins, et d'assez nombreux germes traites a
la cycloheximide sont arretes au stade des deux pronuclei. D'autres oeufs
soumis a la cycloheximide parcourent les premiers stades d'une segmentation
normale. Tous ces phenomenes sont le fait d'oeufs fecondes.
Si les oeufs descendus dans l'ovisac avaient ete laisses en place, ils auraient
connu un developpement normal. Dans des centaines de ces femelles, observees
au cours de 25 ans de recherches, nous n'avons jamais trouve un arret du
developpement semblable a celui de nos germes-temoins.
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EMB
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L'interpretation la plus plausible de nos resultats nous semble done etre
qu'apres un court sejour dans l'ovisac, l'ceuf, qui vient d'etre feconde est capable
d'entrer en segmentation, parce qu'un facteur, contenu dans le sue de l'ovisac,
inhibe la synthese d'inhibiteurs de la division. II faut un certain temps d'action
de ce facteur de l'ovisac pour permettre la segmentation normale. Si l'ceuf lui
est soustrait trop tot, on obtient le resultat qu'illustrent nos temoins. Mais
l'action de la cycloheximide, a tres faible dose, peut mimer Peffet desinhibiteur
du facteur present dans le sue de l'ovisac.
Cette hypothese peut rendre compte de tous les effets observes. Les oeufs
extraits de l'ovisac apres un sejour suffisant vont se developper in vitro, jusqu'au
debut de la gastrulation. Extraits rapidement apres la fecondation, encore en
metaphase de la 1° division de maturation, ils sont encore sous l'effet des
proteines inhibitrices de la division. Celles-ci permettent dans les oeufs extraits
deja la division des centres, mais pas encore celle des noyaux, ni surtout la
cytodierese, et Ton obtient l'image habituelle, observee dans nos temoins. Si
pour une raison, qui nous echappe encore, la membrane vitelline n'est pas
soulevee, on peut supposer, que par une plus grande permeabilite la proteine
inhibitrice se perd dans le milieu; les mitoses de segmentation sont normales et
meme remarquablement synchrones, comme dans la segmentation normale.
Seuls les rapports entre les blastomeres sont anormaux dans les germes flasques
et aplatis. Apres soulevement de la membrane vitelline les proteines inhibitrices
quittent moins le germe ou restent concentrees dans le liquide perivitellin.
La cycloheximide, inhibitrice des syntheses proteiques, pourrait, a tres
faible dose mimer Faction d'un facteur contenu dans le liquide de l'ovisac,
apres extraction precoce. Elle va rendre possible la division nucleaire et enfin
la cytodierese, qui souvent reste encore troublee et partielle. Elle inhibe les
facteurs proteiques, qui empechent la division d'oeufs encore immatures. Dans
les meilleurs cas on arrive, dans les delais de l'experience a des stades VIII,
apparemment normaux. Si la dose frole l'effet antimitotique de l'antibiotique,
on arrive a un arret au stade des deux pronuclei, qui est typique pour Faction
de la cycloheximide a des concentrations plus elevees, dans des experiences ou
des temoins sont deja capables de se segmenter.
Ces experiences semblent done montrer l'existence d'un equilibre delicat
entre des facteurs, peut-etre de nature proteique, qui rendent possible la
segmentation normale d'un oeuf feconde, et ceux qui inhibent des divisions
inadequates d'un germe encore immature. L'intervention d'un facteur secrete
par l'oviducte serait responsable de l'arret a la metaphase de la premiere
division de maturation. II agirait par l'intermediaire de proteines synthetisees
par le germe lui-meme. Cette synthese serait moins importante dans les germes
eleves in vitro, et rapidement inhibee par un facteur present dans le sue de
l'ovisac.
Cycloheximide sur Vosuf d'Aittmia,
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RESUME
A de tres faibles concentrations, la cycloheximide permet l'entree en segmentation d'oeufs
d'Artemia, qui viennent d'etre fecondes, alors que les temoins restent indivis.
L'hypothese est emise qu'a des doses minimes, la cycloheximide pourrait inhiber dans les
oeufs la synthese de proteines, activee par un facteur present dans l'oviducte, et tendant a
empecher des divisions d'oeufs immatures. Elle pourrait mimer Faction d'un facteur contenu
dans le sue de l'ovisac et rendant possible la segmentation normale d'un oeuf feconde.
TRAVAUX CITES
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