/. Embryol. exp. Morph. Vol. 31, 1, pp. 183-198, 1974
Printed in Great Britain
\ 83
Evolution enzymatique des
tissus foetaux et placentaires de Rat en carence
teratogene de riboflavine
Par G. POTIER DE COURCY, S. DESMETTRE-MIGUET,
M. R. MACQUART-MOULIN ET T. TERROINE
Centre de Recherches sur la Nutrition du C.N.R.S. 9,
rue Emile, 92-Bellevue-Meudon, France
SUMMARY
Enzymic changes of foetal and placental tissues of the rat
in teratogenic riboflavin deficiency
The electrophoretic pattern of alkaline phosphatase was studied in teratogenic riboflavin
deficiency in the whole foetus, chorioallantoic placenta and visceral yolk-sac of the rat in
order to follow the course of their differentiation from day 13 to day 20 of gestation. Lacticdehydrogenase (LDH) isozymes were chosen in the case of foetal organs (heart, intestine and
kidneys) as a more sensitive test. A fluorometric analysis of alkaline phosphatase was also
performed to evaluate more precisely quantitative modifications brought on by maternal
riboflavin deficiency in the placenta and the whole foetus.
The importance of alkaline phosphatase in rat yolk-sac was indicated in the last period of
gestation by the presence of a specific rapid isozyme band from the 16th to the 21st day,
simultaneously with a greater complexity of the electrophoretic picture of this membrane.
Placenta and foetus, on the other hand, were shown to possess two common bands but those
concerned with the foetus appeared later and were related to the onset and increase of
ossification. In the foetal organs, differentiation of LDH isozymes appeared specific for each
organ studied; while the heart tissue showed five bands on the 16th day, kidney arrived at
this stage only on the 21st day, indicating a slower maturation of this tissue.
At the end of gestation riboflavin deficiency delayed the appearance of rapid isoenzymes
of alkaline phosphatase in the whole foetus and of LDH in the foetal kidneys, suggesting a
similar delay in the course of metabolic differentiation of the skeleton and kidney tissues.
Deficiency had no effect upon placental isoenzyme development but in this organ it greatly
reduced the biochemical alkaline phosphatase activity, especially on day 13. This result
suggests the participation of the enzyme in the general hypotrophy of the foetus by a decrease
in nutrients carried by the placenta. On the other hand, the decline in the alkaline phosphatase
activity of the whole foetus is related to the delayed appearance of mineralization.
INTRODUCTION
Les effets morphologiques de la carence en riboflavine avec Galactoflavine
concernent principalement le systeme osseux (Warkany & Nelson, 1942) et la
croissance ponderale des foetus. Une deviation du metabolisme foeto-maternel
peut done se produire au niveau du transfert placentaire en abaissant le niveau
de ce transfert (Sullivan, 1970) et/ou au niveau meme des sites de calcification.
184
G. POTIER DE COURCY ET COLL.
Pour tester ces deux possibilites, nous avons utilise comme critere de l'integrite metabolique du complexe foeto-placentaire la phosphatase alcaline, enzyme
qui semble liee a la fois aux processus de l'ossification (Jibril, 1967), notamment
au stade embryonnaire (Teller, Merker & Gunther, 1971) et au transfert des
nutriments par le placenta (Padykula, 1958; Hempel & Geyer, 1969).
L'etude des isoenzymes apporte l'avantage sur celle de l'enzyme totale de
permettre d'apprecier l'etat de differenciation (Markert & Moller, 1959) et de
maturation des tissus et par consequent de leur controle genetique (Moss, 1970).
Elle parait done tout specialement indiquee comme instrument d'analyse dans
le foetus pour deceler d'eventuelles anomalies de differenciation, notamment au
cours d'avitaminoses teratogenes.
II n'est pas encore certain que la phosphatase alcaline possede dans chaque
organe plusieurs isoenzymes (Moss, 1970). De plus, son apparition dans l'embryon se fait assez tardivement et sa presence dans les organes foetaux de Rat
est presque inexistante en deca du 18eme jour de gestation. Nous avons done
utilise comme critere de differenciation des organes les isoenzymes de la lacticodeshydrogenase (LDH) beaucoup plus connues sur le plan biochimique et
genetique (Fine, Kaplan & Kuftinec, 1963).
MATERIEL ET METHODES
Les rattes Wistar C.F. sont elevees en pieces conditionnees. Elles sont mises
au male entre 180 et 250 g et le jour 0 ou premier jour de la gestation est
determine par la presence de spermatozoides dans le vagin.
Les rattes gestantes temoins regoivent un regime semi-synthetique complet
comportant pour 100 g: 25 g de caseine devitaminee (supplemented par la
L-cystine), 57 g de saccharose, 2,5 g de cellulose, 10 g de lipides, 4 g de melange
salin H.M.W. et 1 g de melange vitaminique NBC. Les meres carencees recoivent
du jour de l'accouplement au sacrifice le meme regime mais prive de riboflavine
avec adjonction de Galactoflavine a raison de 1,5 mg pour 100 g de regime. La
chute d'appetit de 25 % due a la carence n'etant pas teratogene (Berg, 1965) et
ne provoquant que de minimes alterations biochimiques (Potier de Courcy,
1968), l'usage de 'temoins restreints' a ete ecarte.
Les sacrifices ont lieu par decapitation. Seuls sont conserves pour les determinations les foetus presentant en fin de gestation des malformations manifestes.
Avant le 18eme jour, on elimine les embryons dont le poids presente moins de
30 % de difference avec les temoins, estimant sur la base des determinations
ulterieures que leurs chances d'etre malformes sont minimes. Les tissus, apres
pesee, sont homogeneises dans la glace et a vitesse controlee. Les etapes suivantes
de preparation des tissus sont resumees dans le tableau 1.
La purification partielle realisee sur les extraits destines a l'etude de la
phosphatase alcaline est derivee de la methode initiate de Morton (1954)
modifiee par Saini & Posen (1969).
Evolution enzymatique
185
Tableau. 1. Differentes etapes de preparation des extraits enzymatiques
Homogeneisation
Tris 0,01 M pH 7,4
P
Dilution: 1/2 a 1/3 —
Centrifugation
20min4°C-14500£
Purification
1-Butanol 2 vol/1 poids de tissu frais
Agitation: 30min25°C
Surnageant
Centrifugation
20 min 4 °C 14500 g
Electrophorese LDH
Surnageant
Dialyse
Tris 0,01 M pH 7,4 18 H 4 °C
Dosage fluorometrique PA*
Electrophorese PA*
* PA, Phosphatase alcaline.
Le dispositif d'electrophorese utilise est de type cylindrique vertical avec pour
support un gel unique de polyacrylamide a 5,5 % (Szylit, 1968) en tampon Tris
(0,03 M) - acide borique (0,0125 M) a pH 8,5. Les bains d'electrophorese sont
constitues d'un tampon Tris-borique (0,1 M) pH 8,3.10 /A d'extrait enzymatique,
additionnes de 40 /A de saccharose a 40 % sont deposes au sommet du gel et
soumis a un courant continu a tension constante (200 V) avec une intensite
initiate de 2,5 mA/tube. L'electrophorese dure 30 a 40 min avec le bleu de
bromophenol comme indicateur.
Les isoenzymes de la LDH sont reveles par precipitation du paranitrobleu de
tetrazolium sous forme de formazan en presence de NAD, avec le lactate
d'NH 4 comme substrat. Les bandes de la phosphatase alcaline sont concretisees
en presence d'une quantite egale (10 mg/100 ml) de /?-naphtyl phosphate acide
de Na et de Fast-Blue BB dans un tampon Tris 0,1 M a pH 9,8 contenant du
MgCl2 comme activateur. La revelation se fait a 37 °C pendant 45 min.
Le dosage fluorimetrique de la phosphatase alcaline suit la methode mise au
point par Moss, Campbell, Anagnostou-Kakaras & King (1961), permettant
d'utiliser le meme substrat que pour la revelation electrophoretique, le naphtyl
phosphate. La reaction enzymatique se deroule a 37 °C pendant 5 min, et
commence par additions de 5 jul d'extrait enzymatique, dilues de 1/5° a 1/100°
186
G. POTIER DE COURCY ET COLL.
1 cm
1 cm
B
Fig. 1. Effets de la carence en riboflavine sur le niveau d'ossification des foetus
(clarification a Palizarine). A g. temoins, a dr. carences. (A), 17e jour: absence totale
des premiers points d'ossification (cotes, clavicule, mandibule). (B), 22e jour: retard du
developpement osseux (raccourcissement de la machoire inferieure, absence des
cubitus et radius gauches, des tibias, et perones, torsion des cotes et de la colonne
vertebrate).
Evolution enzymatique
SM
187
FOE
Fig. 2. Evolution des isoenzymes de la phosphatase alcaline des annexes et du foetus.
Effets de la carence en riboflavine sur le foetus. SM, serum maternel; PL, placenta;
VO, vesicule ombilicale; FOE, foetus. Serie temoin: A, 14e, B, 16e, C, 18e, D, 21e
jour de gestation. Foetus carences: C, 18e, D', 21e jour de gestation. 1, 2, X, 3:
numerotation arbitraire des bandes. O: bande restee a I'origine. Sens de la migration:
vers l'anode ( + ).
188
G. POTIER DE COURCY ET COLL.
21'
Fig. 3. Evolution des isoenzymes de la LDH des organes foetaux en fin de gestation.
Effets de la carence en riboflavine. C, coeur; /, intestin; RT, reins temoins; RC, reins
carences. Sous chaque gel est indique le jour de la gestation. Les isoenzymes sont
numerotees de 1 (vers l'anode +) a 5.
selon le stade de la gestation et le tissu. La lecture se fait dans un fluorimetre
Farrand.
Les proteines sont dosees sur homogenat frais par la methode de Lowry,
Rosenbrough, Farr & Randall (1951).
RESULTATS
1. Etat des meres et de la portee
Les rattes carencees n'ont pris en fin de gestation que 10 % de leur poids de
depart et leur taux de resorption est de 2,4 contre 1 chez les temoins. Le poids
des foetus carences est inferieur de 43 % a celui des temoins en fin de gestation
alors que celui des annexes ne baisse que de 25 %. Les malformations apparentes,
de type classique, affectent surtout les membres et la machoire inferieure tandis
que les anomalies touchant les tissus mous restent inferieures a 3 %. La clarification a l'alizarine (Fig. 1) montre l'absence des points d'ossification chez le
foetus carence en riboflavine au 17eme jour et plusieurs anomalies du squelette
au 22eme jour.
Evolution enzymatique
9,5
10
10,5
11
pH du milieu d'incubation
189
11,5
Fig. 4. pH optimum de l'activite de la phosphatase alcaline placentaire en fonction
delaquantitede substrat du milieu d'incubation (MgCl2:0,05 M, 37 °C). • , O.lOmivi;
D, 0,25 niM; A, 0,50 HIM; O, 1 ITIM; • , 2 IHM de /?-naphtyl phosphate. On observe
que le pH optimum augmente avec la quantite de substrat et le pouvoir d'hydrolyse.
2. Analyse electrophoretique
A. Phosphatase alcaline
Des le 14eme jour, il existe deux bandes bien marquees dans le placenta
(Fig. 2 A), la plus rapide (2) migrant a la hauteur de celle du serum maternel.
Alors que les deux isoenzymes de la phosphatase alcaline placentaire ne
subissent pas de modification d'intensite au cours de la gestation (Fig. 2 A, B, C),
le facies de la vesicule ombilicale evolue en se diversiflant jusqu'au 18eme jour.
Au 16eme jour deja (Fig. 2C), elle possede les bandes placentaires et embryonnaires 3 et 2 mais egalement deux 'isoenzymes' supplementaires specifiques, une
tres rapide et large que nous appelons bande 1, et une legere et fine, la bande X
qui apparait dans les echantillons les plus nettement reveles. Au 18eme jour, ces
2 bandes apparaissent dans certains echantillons de placenta et de serum
maternel (Fig. 2C).
Dans l'embryon, les bandes 3 et 2 n'apparaissent qu'a partir du 16eme jour,
d'abord faiblement puis en augmentant jusqu'a la fin de la gestation (Fig
2B, C, D).
La carence en riboflavine n'a de repercussion que sur les 'isoenzymes' du
foetus: elle provoque un retard d'apparition de la bande 2 et une attenuation
des 2 bandes en fin de gestation (Fig. 2C, D).
Temoins (5)
Carences (5)
Temoins (5-6)
Carences (5)
Temoins (6-7)
Carences (5-6)
Temoins (5-7)
Carences (6-14)
Temoins (4-6)
Carences (3-7)
Temoins (5-6)
Carences (4-7)
Temoins (4-5)
Carences (4)
Temoins (5-7)
Carences (5-8)
mg
mg/
A*(%) placenta
Poids du placenta
A(%)
mg/g
frais
/*M naphtol/
H/placenta A(%)
} -
IM naphtol/
H/g frais A(%)
Phosphatase alcaline
M naphtol/
H/mg
proteine A(%)
43 ±3
56 ±1
125±4
767 ± 50
7,1 ± 0,4 1
-13§
- 5 1 t 494 ± 33
21 ±2
43 ±5 } -24J 4,6 ±0,4/ - 3 5 | 109 ±8
4 0 ±0,8'
816±35
1J8 + 5 I _40t 114,0
92 ±6
6,76 ± 0,29 \
' ±0'8l
-45+ 122+3
-6§
-44f
4UT
43T
7J ±5 J
6,54 ±0,34/
8,
115±4
52
±6
742
± 53
8,0 ±0,5/
127±7
173±1O
22 ±
1017 ±67 \
174 ± 11
7,72 ± 0,43
16e
-16§
}+6
-40t
_9
1J3 ±9 } -35t 12+ 1 } -43f 108 ±7
8,17 ±0,84
928 ±79 /
104 ±7
32 ±1
241 ±11
139±8
358 ±25
1481 ±71 \
9,93 ± 0,46 \
~12§
- 4 7 f 123±4
177 ± 16
141 ±8 } -41t 17 ±1
1238±44 /
9,91 ±0,74/ 0
420 ±32
1496 ±22 \
135±6
292±19 \
40 ±4 I _
11,5 ±0,5
18 e
34| 132±5
-io§
- 3 5 f 1480 ±65 / - 1
197 + 8 / - 3 3 f
26 ±1
272 ± 11
10,3 ±0,4
e
303 ±12 \
48 ±4
148 ±10
436 ±30
1443 ±54
8,88 ±0,52 \
19
-21§
344 ±39
29 ±3 } -40t 135±8
1618±79
11,2 ±0,2 / + 26f
215 ±11 J - 2 9 t
€
363 ±12 |
53 ±6
146 ±13 \
576 ±25
157O±28 \
10,7 ±1,0 \
20
-44t
+3
-43$ 144±9 / - 1
208 ±20 / - 4 3 f
325 ±33
30±4
1561 ±51 /
11,0+1,0 /
381 ±8
±8 \
148 ±7
620 ±8
56 ±3
±45 \
1l,2±l,0 \ _
- 3 3 t 1625 ±45
-26t
+4
415±27
/ - 2 8 t 42 ±3
274 ±8
±
154±6
1487±±73
9,31 ±0,64/ 1 / s
73/
* A = Differences (%) entre carences et temoins. La signification statistique a ete etablie d'apres le test / et les valeurs de P classees comme suit: f P < 0,01;
%P < 0,05; §0,1 < P < 0,2. Les moyennes sont suivies de leur ecart-type.
14 e
Jour de la
gestation
Lot experimental
(nombre
d'animaux)
Proteines
Tableau 2. Evolution de Vactivite de la phosphatase alcaline placentaire en fonction du poids et des proteines
effet de la carence en riboflavine
n
o
H
m
o
o
o
0
w
m
H
O
O
Evolution enzymatique
191
100 -
14°
1 5 C 1 6 e 1 7 e 18 C 1 9 e 2 0 c 2 1 C
J o u r d e gestation
Fig. 5. Evolution de l'activite de la phosphatase alcaline du placenta total: # — #
temoins, O
O carences. Les lignes verticales represented l'ecart-type de la
moyenne.
B. LDH
Des le 16eme jour de gestation, les 5 isoenzymes de la LDH du cceur sont
presentes dans nos echantillons avec une predominance des bandes 2 et 3;
quant a Tintestin, il n'a jamais plus de 3 bandes. Le rein par contre, possede 5
isoenzymes comme le cceur mais ne les acquiert que progressivement (Fig. 3 C,
I, RT).
Seule Telectrophorese du rein est modifi.ee par la carence (Fig. 3RC). Au
21 erne jour, les isoenzymes 1 et 2, les plus rapides, n'ont pas apparu. II se
produit precedemment un retard d'apparition de la bande 3 (17eme jour) et a
tous les stades une diminution d'intensite des isoenzymes presentes.
3. Etude quantitative de la phosphatase alcaline
La phosphatase alcaline a une activite qui croit en meme temps que son pH
optimum lorsque la quantite de substrat present augmente (Motzok & Branion,
1959). La figure 4 donne Failure des courbes obtenues pour le placenta et confirme dans le cas du Rat cette propriete. Pour la concentration de 0,5 mM de
naphtyl phosphate choisie pour nos mesures, le pH optimum est de 9,5 pour le
placenta alors qu'il est de 9,25 pour l'embryon et la vesicule ombilicale.
Le Km determine d'apres la methode de Lineweaver & Burk (1934) et en
tenant compte des observations de Motzok & Branion (1959) est constant au
cours de la gestation, mais il est different selon le tissu (Fig. 5). De 0,38 mM de
naphtol pour le placenta. II passe a 0,27 pour l'embryon et a 0,19 pour la
vesicule ombilicale. Ces valeurs sont plus elevees que celles donnees par Moss
e
e
Temoins (5-6)
Carences (5-6)
Temoins (5-6)
Carences (4-5)
Temoins (5-7)
Carences (5-7)
Temoins (4-5)
Carences (3-4)
Temoins (6-7)
Carences (5-7)
Temoins (4-8)
Carences (4-6)
Temoins (4-6)
Carences (3-5)
Temoins (5-7)
Carences (5-6)
Lot experimental
(nombre
d'animaux)
mg
65 ±2
45 ±2
147 ±4
110±6
244 ±10
191 ±9
338 ±7
258 ±10
605 ± 24
411 ±23
1O18±31
668 ± 48
1584±71
860 ±130
2621± 44
1622 ±54
-38t
-46f
-34f
-32f
-24f
-22f
-25t
- 3 1 t1
l
-42t
'
_-,.
24±2
16±2 }
42 ±3
31 ±2 }
79 ±6
51+6 }
360+13 |
75 ± 1 6 /
237 ±21 |
143 ±9 /
'
4US
_
_
-35f
-28J
-31§
} "
+2
75±7
-2
74 ±8
97 ±7
} -18§
79 + 3
91 ±9
3
88 ±8
71 ±2
72 ±3
} -
} -
\
-10
/
\
J -62f
\
J -52f
125 ±9
61 ±6
214 ±24
114±15
465 ± 61
124 ±32
709 ±71
352 ± 24
1
J
\
J
\
j
\
/
-50f
-73t
-47t
-51t
41 + 3 \
-45J
23±4 J
0,7 ±0,1
0,6 ± 0,03
3.0 ±0,4
1.1 ±0,1
8,9 ±0,9
4,3 ±0,3
—19§
-54f
} -
-29|
•29§
} 124±9 \
88± 16 /
208 ±15
148 + 13
216±19
161 ±14
295 ±27 \
137± 17 /
270 ±28 \
218 + 14 J
38 ±4
23 ±2
14 ±1
20±3
10±l
0,36 ± 0,06 \
0,20 ±0,02/
0,55 ± 0,10 \
0,41 ± 0,05 /
l,87±0,15 \
-32J
1,26 ±0,05/
2,72 ± 0,10 \
2,10 + 0,16/
3,05 ± 0,44 \
2,16 ±0,30/ - 2 9 §
2,93 ±0,33
l,85±O,17
3,22 ±0,51 \ _
22
2,52 ±0,14 /
0,19 ±0,01
/*M naphtol/
H/mg
proteine A(%)
+ 32J 0,28 ± 0,01
/*M naphtol/
/*M naphtol/
H/g frais A(%)
A(%)
H/foetus A(%)
\ -11§
JS
50±3 /
58 + 2
55 ±2
69 ±4
56 ±2 } -19§
70 + 5
69 ±7
5 6 ± 1
A(%) mg/g frais
Proteines
} -m
'
'H
2,2±0,2/
8,3
,3 + 0,2\
0,2
6,4
,4 ±0,5/
17±1
3 8±O
A*(%) mg/foetus
Poids du foetus
* A(%) = Differences (%) entre carences et temoins. Leur signification statistique a ete etablie par le test t et les valeurs de P classees comme suit:
P < 0,01; %P < 0,05; §0,1 < P < 0,2. Les moyennes sont suivies de leur ecart-type.
21
20
e
19
e
18e
17
16
e
15e
14e
Jour de la
gestation
Phosphatase alcaline
Tableau 3. Evolution de Vactivite de la phosphatase alcaline feet ale en fonction du poids et des proteines:
effets de la carence en riboflavine
o
O
H
w
d
o
a
o
d
a
o
P
to
193
Evolution enzymatique
=
400 -
200 -
14° I5C
I6
C
1 7 e 18C 19
20 21
14L 15
Jour de gestation
16C
17C 18e
19e 20e 2 1 '
Fig. 6. Evolution de l'activite de la phosphatase alcaline foetale en fonction du stade
de la gestation. A: activite totale (M de naphtol/H). B: activite specifique (M de
naphtol/H/mg de proteines). • • Foetus temoins, O A foetus carences(avec l'ecarttype de la moyenne).
et coll. (1961) pour les autres organes de mammiferes, situees entre 0,100 et 0,167
n w de naphtol.
L'activite de la phosphatase alcaline du placenta est tres forte des le 14eme
jour lorsqu'elle est rapportee au g. de tissu frais (767/*M/H) OU au rag de
proteines (6,13 mM/H). Elle subit quelques variations ensuite mais faibles
(Tableau 2). L'activite enzymatique totale de l'organe varie beaucoup plus,
passant de 43 mM de naphtol au 14eme jour a 620 au 21eme. C'est egalement
sur l'activite totale de l'enzyme que la carence en riboflavine a le plus d'effet.
Toujours significatives, les differences entre les activities des placentas temoins
et carences vont de 21 a 51 %, l'ecart le plus grand se situant au 14eme jour de
gestation, mais le stade du 20eme jour etant marque comme pour le foetus par
une activite particulierement basse de la phosphatase alcaline (Fig. 5).
L'activite enzymatique du foetus augmente rapidement a partir du 16eme jour
mais se stabilise a partir du 18eme jour en ce qui concerne l'activite specifique
(Fig. 6) alors que l'activite totale du foetus continue a augmenter fortement
jusqu'au 21 erne jour (709 /m. de naphtol/H).
L'activite de l'enzyme foetale est tres fortement freinee par la carence en
riboflavine quel que soit le stade considere. Elle est particulierement reduite le
20eme jour de la gestation ou elle est inferieure en quantite totale de 73 % a la
normale (Fig. 6). C'est a ce stade egalement que le poids du foetus carence est
le plus bas, relativement au temoin (46 %).
EMB
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G. POTIER DE COURCY ET COLL.
DISCUSSION
L'analyse electrophoretique de la phosphatase alcaline montre deux bandes
bien marquees et distinctes dans le placenta et la presence de ces deux memes
'isoenzymes' dans l'embryon et la vesicule ombilicale en fin de gestation. Ces
donnees posent le probleme de la pluralite des isoenzymes phosphatasiques et
de leur specificite dans les tissus considered.
Le fait que nous ayons trouve un Km et un pH optimum differents pour la
phosphatase alcaline du foetus et du placenta est un argument (Motzok &
Branion, 1959) contre l'identite d'origine et de nature des deux enzymes comme
le soutiennent, tout au moins pour rhomme, Ghosh & Fishman (1969) en
s'appuyant sur les proprietes biochimiques differentes des deux enzymes, et
Posen (1967) par etude immunologique. II a cependant ete etabli recemment
que c'etait le genotype du foetus humain et non de la mere, qui determinait le
phenotype de la phosphatase alcaline placentaire (Robson & Harris, 1965) et
que sa localisation etait presque exclusivement trophoblastique en fin de
gestation chez la Souris (Sherman, 1972) et par consequent dans un tissu
d'origine embryonnaire. Le probleme de la specificite de la phosphatase alcaline
foetale par rapport a celui du placenta reste done pose.
Par contre la vesicule ombilicale possede, outre les 'isoenzymes' placentaires
et fcetales, une bande propre tres rapide du 16eme au 21eme jour de la gestation.
On sait que cette annexe joue le role de placenta pour le Rat avant la mise en
fonction de la circulation chorio-allantoidienne, mais que meme plus tard, elle
est capable de capter des macromolecules (Johnson & Spinuzzi, 1966) du type
de la B12 ou du complexe B12-facteur intrinseque (Padykula, Deren & Wilson,
1966) et de transferer les anticorps maternels au foetus (Brambell & Halliday,
1956). L'apparition d'une bande specifique le 16eme jour dans nos echantillons,
de meme que la complexity croissante de l'image electrophoretique de l'endoderme vitellin au 18eme jour correspondent tres exactement sur un plan qualitatif, aux donnees histochimiques et biochimiques de Padykula (1958) et font
une fois de plus resortir l'importance physiologique de la vesicule ombilicale
interne chez les Rongeurs en fin de gestation.
Bien que les isoenzymes de la phosphatase alcaline foetale apparaissent
tardivement (17eme, 18eme jour) dans notre etude, alors que Johnson (1965)
decele des bandes phosphatasiques dans l'embryon de Rat des le 11 erne jour de
gestation, la date d'apparition des 'isoenzymes' foetales que nous trouvons
correspond bien au debut de l'ossification (Jost, Moreau & Fournier, 1960),
comme le montrent les essais de clarification a l'alizarine. Cette simultaneite est
une preuve supplementaire de la participation etroite de l'enzyme au processus
de la mineralisation des cartilages (Teller et ah 1971).
Les isoenzymes de la LDH sont d'autre part un indicateur de l'etat de maturation (Koskimies, 1967), et du metabolisme dominant des tissus (Everse, Berger
& Kaplan, 1970). Or, notre analyse des organes foetaux montre que le cceur,
Evolution enzymatique
195
dont Porganogenese est terminee le 15eme jour de la gestation (Overman &
Beaudoin, 1971) possede bien, le lendemain, la gamme complete des isoenzymes
de la LDH avec, deja, une predominance des bandes rapides H(2 et 3), le placant
tres tot dans la vie intra-uterine au niveau de la naissance (Markert & Ursprung,
1962) et meme de l'adulte (Wiggert & Villee, 1964). Quant au rein foetal,
1'evolution progressive de son facies electrophoretique nous fait dire qu'il
n'atteint qu'au 21eme jour sa maturite fonctionnelle. Le cceur et le rein du foetus
se situent d'autre part parmi les organes a caractere aerobie si Ton pense, comme
Everse et ah (1970), que les bandes rapides (H) indiquent une predominance
de la voie oxydative, alors que l'intestin reste dans notre etude, comme a Petat
adulte (Markert & Ursprung, 1962) un tissu a metabolisme anaerobie ne
possedant toujours que des bandes lentes (M).
La carence en riboflavine provoque un retard d'apparition ou une attenuation
des bandes d'electrophorese dans le cas de la LDH du rein foetal et de la phosphatase embryonnaire. Cette modification de la phosphatase alcaline suggere
une diminution de la synthese de l'enzyme foetale et confirme sur le plan
physiologique le retard d'ossification du foetus observe a l'aide de la clarification.
Dans le cas de la LDH du rein, il se produit une inhibition specifique de la
synthese des sous unites polypeptidiques H et done probablement une nonderepression dans cet organe du gene responsable de cette synthese (Koskimies,
1967). La deficience en riboflavine retarde done la differentiation metabolique
du rein.
La sensibilite des isoenzymes aux modifications d'ordre qualitatif (phosphatase
alcaline de la vesicule ombilicale) ou fonctionnel (phosphatase alcaline foetale et
LDH renale) n'est pas apparue dans celles du placenta restees totalement stables
au cours de la gestation normale et teratogene. II n'est done pas etonnant que
Shepard, Lemire, Aksu & Mackler (1968) notent par determination histoenzymologique l'absence de modification de P activite de la phosphatase alcaline
placentaire dans la meme carence teratogene en riboflavine.
Par contre, le dosage fluorimetrique de l'enzyme indique que l'activite totale
de la phosphatase placentaire decuple entre le 14eme et le 21eme jour, et que
son activite specifique double pendant cette meme periode. Cette progression
signifie que le volume des transferts operes par la phosphatase alcaline du
placenta augmente avec la gestation, beaucoup plus que le poids de l'organe.
Cela s'explique par la demande accrue du foetus en phosphates, pendant la
periode d'intense ossification.
Mais la phosphatase alcaline placentaire presente une activite tres elevee bien
avant Possification (70 fois celle du foetus en activite/g au 14eme jour). Sa
presence dans le placenta a ete reliee au transfert ou au metabolisme de plusieurs
substances, dont le glycogene et PARN (Christie, 1967), les lipides et les
nucleoproteines (Hafez, 1964). Or, si une baisse du glucose foetal peut engendrer
des malformations chez le Rat (Hannah & Moore, 1971) ou qu'au contraire
Padministration de composes riches en energie previent en partie l'apparition
13-2
196
G. POTIER DE COURCY ET COLL.
des malformations dans l'embryon de Poulet (Landauer & Sopher, 1970), on
peut se demander dans quelle mesure la forte chute de l'activite phosphatasique
observee par nous et done du transfert de ces metabolites ne conduit pas a
provoquer la genese des malformations observees en avitaminose B2.
La carence freine fortement l'activite de l'enzyme dans le foetus a tous les
stades de la gestation et principalement au 20eme jour, stade auquel les foetus
malformes prennent un retard considerable qui ne sera plus rattrape jusqu'a la
naissance. Grainger, O'Dell & Hogan (1954) observent de meme dans les tibias
de rats nouveau-nes une chute de 2,5 fois de la phosphatase alcaline. JafFe (1971)
en carence folique cette fois, attribue a un desequilibre de la balance ionique et
une chute d'activite des phosphatases une partie des anomalies squelettiques des
membres observees chez le foetus au cours de cette avitaminose.
RESUME
L'evolution des isoenzymes de la phosphatase alcaline a ete suivie au cours de la carence
teratogene en riboflavine avec Galactoflavine du 14eme au 21eme jour de la gestation pour
evaluer le degre de differenciation des foetus de Rats temoins et malformes et de leurs annexes.
Pour les organes foetaux, l'image electrophoretique de la LDH, plus sensible et plus precoce,
lui a ete preferee. En outre, dans le cas de la phosphatase alcaline du placenta et du foetus,
nous y avons ajoute le mesure fiuorimetrique de l'activite de l'enzyme car les variations d'ordre
quantitatif semblaient importantes au cours de la carence.
Voici l'essentiel des donnees apportees par notre analyse:
1. Du point de vue general des animaux temoins nous relevons: (a) l'importance metabolique
de la vesicule ombilicale interne du Rat dont l'image electrophoretique atteint sa complexite
maximale du 16eme au 18eme jour de gestation avec la presence d'une bande specifique a
cet organe; (b) le parallelisme entre 1'evolution des isoenzymes et de l'activite de la phosphatase alcaline du foetus et le degre d'ossification de celui-ci; (c) la difference de chronologie
dans la differenciation metabolique des organes foetus, tres precoce dans le coeur et l'intestin,
beaucoup plus progressive dans le cas du rein.
2. La carence en riboflavine agit en freinant fortement l'activite de la phosphatase alcaline
du foetus et du placenta et en abaissant le niveau de synthese de certaines isoenzymes rapides
de la LDH renale et de la phosphatase alcaline du foetus entier, ce qui signifie: une baisse du
volume des elements transferee au foetus par la phosphatase alcaline placentaire, en particulier
au 14eme jour de la gestation; un retard du niveau d'ossification du foetus; un retard specifique
de differenciation et de maturation du rein foetal.
Nous exprimons nos vifs remerciements au Dr Ch. W. Mushett, des Laboratoires Merck
Sharp et Dohme (New Jersey) qui nous a tres aimablement procure la galactoflavine.
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