/. Embryol. exp. Morph. Vol. 33, 2, pp. 335-342, 1975
Printed in Great Britain
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Differenciation in vitro de
cartilage a partir des cretes neurales cephaliques
chez Pleurodeles waltlii Michah.
Par JACQUELINE CORSIN1
Groupe de recherches de Biologie du Developpement,
U.E.R. de Biologie-Genetique, Universite Paris VII
SUMMARY
In vitro differentiation of cartilage from cephalic neural crest of
Pleurodeles waltlii Michah.
Parts of cephalic neural crest o{Pleurodeles waltlii have been cultivated in vitro alone or in
explants containing other cellular components. It was hoped that these experiments would
establish under what conditions cephalic neural crest cells can differentiate into chondroblasts. It has been demonstrated that this differentiation is possible only under the influence
of the dorsal mesoderm and foregut endoderm.
It appears that neural crest cells are relatively pluripotent and progressively differentiate in
response to local environmental factors.
INTRODUCTION
De nombreux travaux ont, apres ceux de Raven realises de 1932 a 1937,
demontre que la majeure partie du squelette cephalique des Amphibiens, et
egalement d'autres Vertebres, trouve son origine dans l'ectomesenchyme issu
des cretes neurales cephaliques. Parmi leurs auteurs on peut en particulier citer
Horstadius & Sellman (1946), Wagner (1949), Okada (1955) et Chibon (1966).
La technique utilisee est dans tous les cas la microchirurgie completee dans le
travail le plus recent par des marquages radioactifs.
D'autres auteurs ont cherche a etudier en culture de tissu la destinee d'explants
de crete neurale, on peut citer Wilde (1955), Petriconi (1964) ainsi que Drews,
Kocher-Becker & Drews (1972). Tous sont parvenus a la conclusion suivant
laquelle la differenciation des cellules issues des cretes neurales cephaliques se
fait sous le controle d'autres structures qui interviennent dans des mecanismes
complexes d'induction. Pour Wilde du cartilage se forme a partir de portions de
crete neurale cephalique en presence d'endoderme mais aussi de mesoderme
dorsal, au contraire pour Drews et ah seul l'endoderme est capable d'entrainer
1
Adresse de Vauteur: Laboratoire d'Anatomie Comparee, Universite Paris VII, 2 Place
Jussieu, 75221 Paris cedex 5, France.
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Explant
Papier impre'gne
d'eau. sterile
Papier filtre
Grille metall.que
Fig. 1. Vue en coupe d'une boite en plastique utilisee pour la realisation des cultures.
l'apparition de cartilage dans les cultures de crete neurale cephalique. Ces
experiences ont done ete reprises en multipliant les recombinaisons tissulaires
et en prelevant les explants chez des neurulas plus ou moins agees.
MATERIEL ET TECHNIQUE
Au cours de ces experiences des embryons de Pleurodeles waltlii Michah. aux
stades 14 a 17 de la table de Gallien & Durocher (1957) ont ete utilises.
Apres avoir ete deganguees puis dechorionnees les neurulas sont placees
pendant 30 min dans la solution de Holtfreter sterile a laquelle ont ete ajoutees
10000 UI de penicilline-streptomycine pour 100 ml.
Les prelevements sont realises dans la solution de Holtfreter normale, puis les
explants sont transportes dans du Holtfreter sans calcium ou ils sejournent
8 a 10 min. Pendant ce temps ou isole les differentes categories tissulaires les
unes des autres a l'aide d'aiguilles constitutes par un fil de platine.
Le milieu de Wolf & Quimby (1964), specialement mis au point pour les
cellules d'Amphibien, sert de base a la confection du milieu de culture utilise ici
et qui est constitue comme suit: 80 % de milieu de Wolf & Quimby, 18 % de
plasma de Poulet, 2 % de penicilline-streptomycine.
Ce milieu remplit la depression placee au centre d'une boite en plastique. Sur
cette depression est posee la grille metallique qui supporte la pastille de papier
filtre sterile sur laquelle on depose la culture (Fig. 1).
Aux stades choisis les bourrelets medullaires sont bien souleves dans toute
la region cephalique et les portions de cretes neurales peuvent done etre facilement isolees des tissus sous-jacents. Pour le reperage des zones a prelever j'ai
utilise le systeme de coordonnees definies par Chibon (1966). Sur chaque
neurula j'ai excise la crete neurale entre 30° et 150° (Fig. 2) e'est-a-dire sur toute
la portion participant a l'edification du chondrocrane de la larve. Suivant les
Cretes newales cephaliques chez P. waltlii
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Fig. 2. Schema d'une neurula permettant de localiser la portion des cretes neurales
qui a ete mise en culture.
experiences realisees j'ai ajoute ou non aux portions de crete neurale, de
l'ectoderme, du neurectoderme, du chordo-mesoderme ou de l'endoderme
preleves sur la meme neurula. A ce stade la taille et la couleur des cellules
permettent de reperer sans difficulte a quel feuillet elles appartiennent et done
d'avoir des explants dont la composition cellulaire est parfaitement connue.
La taille des cultures ayant une certaine importance pour leur bon developpement j'ai pris soin qu'elle soit de meme ordre dans tous les cas: pour les cretes
neurales cultivees seules j'ai associe les deux fragments preleves sur une neurula,
tandis que, lorsqu'il y avait recombinaison avec un autre tissu, j'ai utilise un
seul fragment de crete neurale associe a une portion a peu pres equivalente
d'ectoderme, de mesoderme ou d'endoderme.
Le plus souvent les cultures sont poursuivies 12 a 15 jours, cependant a titre
experimental quelques-unes ont ete conservees plus de 3 semaines en parfait
etat.
Elles sont ensuite fixees dans le liquide de Rossmann et colorees soit par le
bleu de toluidine a pH 4,2 soit par le PAS accompagne d'une coloration de fond
par l'hemalun et le picro-indigo-carmin.
RESULTATS
(1) Crete neurale cephalique seule (20 cultures)
Lorsque les portions de crete neurale cephalique sont cultivees seules, le
prelevement etant fait a n'importe quel moment entre les stades 14 et 17, on
observe uniquement la presence dans la culture de cellules pigmentaires et de
cellules mesenchymateuses indifferenciees d'aspect fibroblastique (Fig. 3).
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(2) Crete neurale cephalique et ectoderme banal (10 cultures)
L'aspect de ces cultures differe uniquement de celui des precedentes par la
presence d'une assise de cellules epitheliales entourant le tissu mesenchymateux
et les cellules pigmentaires.
(3) Crete neurale cephalique et neurectoderme de la plaque medullaire (10
cultures)
Dans ce type de culture on voit apparaitre des formations nerveuses typiques
en meme temps que Ton retrouve des cellules pigmentaires et des cellules
mesenchymateuses indifferenciees (Fig. 4).
Dans ces trois premiers types de combinaison il n'apparait en aucun cas de
formation precartilagineuse ou cartilagineuse.
(4) Crete neurale cephalique et endoderme pharyngien (16 cultures)
Outre des cellules pigmentaires, des cellules mesenchymateuses indifferenciees
et de F epithelium digestif il apparait dans ce type de culture des amas denses
formes par des cellules au contour beaucoup plus regulier, presque rondes, ne
presentant jamais de prolongement de type fibroblastique. Ces groupes de
cellules ont toutes les caracteristiques du pro-cartilage (Fig. 5).
(5) Crete neurale cephalique et me'soderme dorsal (25 cultures)
Dans ce type de recombinaison 2 types de resultats sont obtenus suivant que
les cretes neurales sont prelevees au tout debut du stade neurula (stade 14) ou
bien lorsque ]a neurulation s'acheve et que les bourrelets medullaires commencent a s'affronter dans la region troncale de l'embryon (stade 17-18).
(a) Si les tissus mis en culture sont preleves au stade 14 il se developpe dans la
culture uniquement du mesenchyme indifferencie, des cellules pigmentaires et
des fibres musculaires (Fig. 6).
(b) Par contre si on attend les stades 17-18 pour realiser les prelevements on
constate Papparition de nodules cartilagineux tres nets, nodules qui sont
constitues par des cellules arrondies entourees d'une substance extracellulaire
dense colorable par le PAS (Fig. 7).
(6) Crete neurale cephalique, endoderme pharyngien et mesoderme dorsal (15
cultures)
Que la mise en culture soit realisee au stade 14 ou aux stades 17-18 on obtient
dans tous les cas la formation de nodules de cartilage parfaitement typique
accompagnant les autres types de tissus deja signales, muscle, cellules pigmentaires, fibroblastes, epithelium digestif (Fig. 8).
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Cretes neurales cephaliques chez P. waltlii
i
i
20 /im
Fig. 3. Coupe d'une culture comportant uniquement des cellules issues des cretes
neurales: seul du mesenchyme indifferencie (me) s'est forme, x 500.
Fig. 4. Coupe d'une culture associant a la crete neurale du neurectoderme de la
plaque medullaire: outre du mesenchyme indifferencie (me) on observe des structures nerveuses (n). x 500.
Fig. 5. Coupe d'une culture associant de l'endoderme pharyngien a une portion de
crete neurale cephalique: il s'est constitue de l'epithelium digestif (ed) et du procartilage (pc). x500.
Fig. 6. Coupe dans une culture associant du mesoderme de la voute archenterique
aux cretes neurales cephaliques, le prelevement etant realise au stade 14: outre du
mesenchyme indifferencie (me) on observe la formation de fibres musculaires (m).
x500.
Fig. 7. Coupe d'une culture associant les memes constituants que precedemment
(mesoderme+crete neurale) mais ici le prelevement a ete realise au stade 17: du
cartilage typique (c) s'est differencie. x 500.
Fig. 8. Coupe d'une culture associant aux cretes neurales a la fois de l'endoderme et
du mesoderme: ici aussi il s'est differencie du cartilage (c). x 500.
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EMB
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DISCUSSION
L'ensemble de ces resultats met en evidence la complexity des phenomenes
qui aboutissent a Tedification des cartilages craniens a partir de cellules issues
des cretes neurales cephaliques. La differenciation de ces cellules apparait
comme le resultat de l'interaction de leurs potentialites propres - d'origine
genetique - et de l'influence de leur environnement.
Lorsqu'elles sont cultivees seules les cretes neurales cephaliques s'averent
incapables de differencier des chondroblastes et forment uniquement des
cellules pigmentaires et du mesenchyme indifferencie.
La culture en presence d'endoderme seul aboutit a la differenciation de procartilage: si les cellules ont bien l'aspect qui est normalement celui de futurs
chondroblastes, la substance extracellulaire manque presque totalement. II
semble done que l'endoderme pharyngien puisse modifier l'apparence des
cellules de la crete neurale qui perdent leur aspect fibroblastique et acquierent
la forme arrondie et reguliere des chondroblastes.
Si aux cretes neurales et a l'endoderme on ajoute du mesoderme dorsal on
obtient dans la culture des nodules de cartilage typique aussi bien par la forme
des cellules que par la substance extracellulaire qui les entoure. II semble done
que le mesoderme soit responsable de la secretion de cette substance extracellulaire, du moins au debut de la chondrogenese.
D'autre part les resultats differents obtenus, en associant du mesoderme dorsal
a une portion de crete neurale, suivant que la mise en culture est realisee au
debut ou fin de la neurulation, ne peuvent s'expliquer que si on admet qu'entre
les stades 14 et 18 l'endoderme a modifie soit les cellules de la crete neurale, soit
les cellules mesodermiques.
Les actions du mesoderme dorsal et de l'endoderme pharyngien se completent
done pour controler la differenciation de cartilages a partir du mesenchyme issu
des cretes neurales. Ceci permet d'expliquer en partie au moins les resultats
differents, voir opposes, obtenus par les auteurs. Raven (1933, 1935), apres
avoir realise des greffes de portions de crete neurale cephalique sur le flanc, a
observe la formation de nodules cartilagineux. Ces resultats sont en contradiction aussi bien avec ceux obtenus par Horstadius & Sellman (1946) et Newth
(1954) qu'avec les miens puisque, cultivee seule la crete neurale cephalique ne
differencie jamais de cellules cartilagineuses.
L'isolement total des portions de crete neurale des structures environnantes
est souvent difficile a realiser et peut-etre dans ses experiences Raven a-t-il
greffe, en meme temps que les cellules ectodermiques des cretes neurales, quelques cellules endodermiques ou mesodermiques. Ceci pourrait alors suffire a
expliquer l'apparition de chondroblastes dans les greffons. Pour Wilde (1955),
qui utilise l'Axolotl de la fin de la gastrulation au bourgeon caudal, le mesoderme comme l'endoderme sont capables d'induire du cartilage; au contraire
pour Drews et al. (1972), qui utilisent le Triton alpestre au tout debut de la
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neurulation, seul l'endoderme peut provoquer la differentiation du cartilage.
Ces derniers auteurs semblent d'ailleurs prelever en meme temps que les cretes
neurales et l'endoderme la mince couche de mesoderme qui les separe.
L'evolution chondrogenetique des cellules de la crete neurale cephalique se
realise done a la suite de phenomenes d'induction qui, trouvent leur origine dans
les categories cellulaires qui les entourent. Ceci vient a l'appui de la these de
Weston (1970) suivant laquelle avant leur migration les cellules des cretes
neurales sont plus ou moins totipotentes et subissent une regulation phenotypique progressive sous l'influence des tissus qui les entourent. Cette conclusion
rejoint egalement celle de Le Douarin & Teillet (1973) qui ont montre que la
direction de migration des cellules des cretes neurales troncales depend de leur
environnement et non d'une determination intrinseque.
RESUME
Des portions de crete neurale cephalique de Pleurodeles waltlii ont ete cultivees seules ou
en recombinaison avec des cellules prelevees dans les divers feuillets constituant la neurula.
II s'est avere que la differentiation de chondroblastes a partir de l'ectomesenchyme issu des
cretes neurales cephaliques se realise sous l'influence conjuguee du mesoderme dorsal et de
Tendoderme.
II est apparu que les cellules des cretes neurales cephaliques sont relativement totipotentes
et subissent une regulation phenotypique progressive sous l'influence des tissus qui les
entourent.
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