/. Embryol. exp. Morph. Vol. 24, 1, pp. 43-63, 1970
Printed in Great Britain
43
Organogenese de Testomac de Fembryon de Poulet
Evolution de r£pith61ium du proventricule au contact
de surfaces conditionnees par des mesenchymes
Par MICHEL SIGOT 1 et LEA MARIN 1
Institut d'Embryologie experimentale du College de France et du C.N.R.S.
(Directeur: Professeur Et. Wolff)
RESUME
Lorsque des cellules vivantes sejournent, en culture, au contact d'un support solide, elles
laissent en place, une fois detachees de leur support, une certaine quantite de materiel
organique acellulaire. Cette propriete a permis de conditionner des lamelles de plexiglas par
une culture prealable de tissus inducteurs (mesenchymes de proventricule ou de gesier) qui
laissent sur les lamelles un materiel residuel. Nous avons analyse les proprietes de ce materiel
residuel sur la differenciation de Pepithelium de l'estomac de Poulet.
Le materiel residuel possede des proprietes inductrices analogues a celles du tissu dont il
provient: au contact de lamelles ayant porte du mesenchyme de proventricule, Pepithelium de
proventricule tend a evoluer suivant le type proventricule; au contact de lamelles ayant
porte du mesenchyme de gesier, Pepithelium de proventricule tend a evoluer suivant le type
gesier. Le tissu inducteur, cultive au contact d'un support solide, a done laisse sur celui-ci
une substance inductrice capable d'agir sur Pepithelium.
Le materiel residuel du mesenchyme de gesier a des proprietes stabilisatrices capables
d'arreter la differenciation normale de Pepithelium de proventricule en le maintenant dans la
forme gesier. Remis au contact avec le mesenchyme de proventricule, Pepithelium, qui a subi
Pinfluence du materiel residuel du mesenchyme de gesier, n'est plus capable de donner des
structures de proventricule normales. Par contre, lorsque Pepithelium a sejourne au contact de
lamelles vierges, sa competence reste intacte et il reprend son evolution normale lorsqu'on le
reassocie a du mesenchyme homologue.
Le facteur stabilisant a pu etre mis en solution, a partir de lamelles porteuses de materiel
residuel de mesenchyme de gesier. Cette solution, recueillie sur des lamelles, est eprouvee sur
des epitheliums de proventricules. Ses effets sont les memes que ceux du materiel residuel
dont elle provient: Pepithelium qui a subi Pinfluence de cette solution n'est plus capable de
donner des structures proventriculaires normales lorsqu'il est reassocie a du mesenchyme
homologue.
INTRODUCTION
La morphogenese de l'estomac du Poulet se realise au sein d'une ebauche
constitute de deux tissus: un epithelium, d'origine endodermique et un mesenchyme, d'origine mesodermique. L'un de nous a etudie le role de ces tissus au
cours de la differenciation des deux parties de l'estomac: le proventricule et le
gesier (Sigot, 1962, 1963). Comme dans de nombreux autres cas, le mesenchyme
1
Adresse des auteitrs: Laboratoire d'Embryologie experimentale, College de France, 11,
Place Marcelin Berthelot, Paris 5e, France.
44
M. SIGOT ET L. MARIN
a un effet determinant sur Involution et la destinee de Fepithelium. II est
l'inducteur, capable de declencher, dans l'epithelium, les transformations qui
lui donneront sa structure et sa physiologie propre. Cette induction est un
phenomene fort complexe. Elle est probablement le fait d'un facteur produit
dans le mesenchyme, mais elle se complique, ici, de deux phenomenes, car, non
seulement le facteur inducteur semble lie a une substance peu diffusible mais
encore un contact entre l'epithelium et le mesenchyme parait necessaire pour
que l'induction complete puisse s'effectuer.
Comment etudier le facteur inducteur contenu dans le mesenchyme? Est-il
possible de recueillir des fractions actives de ce tissu et d'en eprouver Faction sur
un epithelium? Nous avons pense a utiliser une technique de culture mise au
point par Fun de nous (Marin, 1962, 1965). Le point de depart de cette methode
est le suivant: lorsque des cellules vivantes sejournent, en culture, au contact
d'un support solide, elles laissent en place, une fois detachees de leur support,
une certaine quantite de materiel organique (Rosenberg, 1960). Ce materiel
renforce Fadhesivite d'une deuxieme culture etablie sur ce meme support
(Weiss, 1961) de meme qu'il en facilite la migration (Marin, 1962, 1965). Dans
les cas ou les tissus cultives seraient inducteurs, tels les mesenchymes de
Festomac du Poulet, le materiel qui reste sur le support, ou 'materiel residuel',
n'aurait-il pas une parente d'action avec le mesenchyme lui-meme.
Cette technique etait seduisante car il nous semblait qu'elle pouvait, en
quelque sorte, concilier ces deux phenomenes que nous avons releve dans
l'induction de l'epithelium stomacal: faible diffusion de l'inducteur et necessite
de contact entre le tissu inducteur et le tissu competent. En effet, en ce qui
concerne la faible diffusion de l'inducteur, cette methode parait tout a fait
adequate puisque le materiel residuel est recueilli sur place, done a Fendroit
meme oil l'inducteur diffuse. D'autre part, il est probable, bien que nous ne le
sachions pas exactement, que le materiel residuel n'est pas homogene. 11 n'a
rien de commun avec un extrait tissulaire au sens que Fon accorde en general a
ce terme. S'il comporte des secretions des tissus cultives, il comporte aussi
des debris cellulaires de taille infra-microscopique. II est possible, de la sorte,
que le tissu competent mis en contact avec ce materiel trouve la une surface
qui offre peut-etre quelque analogie avec celle du tissu inducteur normal.
D'une facon generate, notre technique comporte trois etapes: la premiere, ou
culture primaire, consiste a cultiver du mesenchyme qui, apres avoir ete
elimine, laisse un eventuel materiel residuel inducteur sur le support; la deuxieme,
ou culture secondaire, mise en place a Fendroit ou avait evolue la culture primaire de mesenchyme, est destinee a eprouver l'effet de ce materiel residuel sur
Fepithelium competent. Ces deux etapes sont suivies d'une troisieme qui consiste
en une phase de culture organotypique plus ou moins prolongee dont nous
precisons plus loin les modalites particulieres. Cette technique nous a permis:
(1) d'etudier le comportement de Fepithelium de proventricule mis en contact
avec les materiels residuels des mesenchymes de proventricule et de gesier;
Organogenese de Vestomac
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(2) d'etudier plus particulierement les proprietes du materiel residuel du
mesenchyme de gesier;
(3) de tenter une caracterisation preliminaire de ce materiel.
(1) COMPORTEMENT DE L'EPITHELIUM DE PROVENTRICULE AU
CONTACT DE MATERIELS RESIDUELS DE MESENCHYME DE
PROVENTRICULE ET DE GESIER
Les deux parties de l'estomac du poulet, le proventricule et le gesier, different
aussi bien l'une de l'autre par leur physiologie que par leur morphologie, en
particulier par la structure de leur epithelium; et ce sont precisement des
caracteres histologiques qui ont conduit Tun de nous (Sigot, 1962, 1963) a
definir un certain nombre de criteres permettant de reconnaitre le type de
differenciation presentee par l'epithelium, au cours d'experiences realisees en
culture in vitro.
Ces criteres sont au nombre de quatre:
epaisseur des epitheliums: l'epithelium du gesier est beaucoup plus epais que
celui du proventricule, difference qui est en moyenne du simple au double;
morphologie des cellules: epitheliums palissadiques tous deux, celui du proventricule est constitue de cellules assez larges a noyaux arrondis alors que
l'epithelium du gesier est constitue de cellules beaucoup plus hautes et etroites a
noyaux allonges dans l'axe de la cellule;
accumulation de glycogene: nous avons constate qu'au stade de 7 a 8 jours d'incubation, periode oil les glandes du proventricule se differencient tres activement,
il y a une tres grande difference dans la teneur en glycogene du proventricule et
du gesier: le gesier en contient beaucoup alors que le proventricule en est pratiquement depourvu. Cette difference se retrouve dans ces deux organes apres leur
differenciation in vitro, de meme que sur leurs reassociations homologues in
vitro. La presence ou l'absence de glycogene dans l'epithelium de l'estomac en
culture peut done indiquer le sens de sa differenciation.
secretion de mucus: nous avons constate, en ce qui concerne le mucus
secrete par l'epithelium et visible a sa surface, dans la lumiere stomacale, un
phenomene parallele a celui que nous avons observe avec le glycogene: le
proventricule ne secrete que tres peu ou pas de mucus alors que le gesier en
produit beaucoup. Ces observations peuvent etre faites egalement dans ces
organes cultives in vitro, ainsi que lors de leurs reassociations homologues en
culture.
Appliques a l'etude de diverses associations homologues ou heterologues, ces
criteres nous ont permis de demontrer certaines proprietes de l'epithelium et du
mesenchyme du proventricule et du gesier de 5 jours d'incubation. Seul, le
mesenchyme du proventricule est capable d'induire, dans l'epitheliumhomologue,
les transformations conduisant a revolution normale de cet epithelium, transformations manifestoes, des l'abord, par la formation d'invaginations glandu-
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M. SIGOT ET L. MARIN
laires. Si cet epithelium est cultive seul ou en association avec du mesenchyme
de gesier, non seulement il ne s'y differencie pas de glandes, mais encore il
evolue vers le type gesier, acquerant toutes les caracteristiques de l'epithelium de
ce dernier organe. La morphologie epitheliale de type gesier represente vraisemblablement la forme autodifferenciee de l'epithelium stomacal.
Ces phenomenes d'inductions inter-tissulaires sont probablement, comme nous
Favons vu plus haut, le fait de facteurs contenus dans le mesenchyme. Cest
pourquoi il nous a semble interessant d'en tenter Fetude a Faide de la technique
de culture sous lamelle, pour savoir si le materiel residuel provenant de mesenchymes de proventricule ou de gesier avait une influence analogue a celle de ces
mesenchymes eux-memes (Marin & Sigot, 1963).
Materiel et methodes
{a) Culture primaire: preparation des lamelles portant les materiels residuels.
Nous decoupons, a Faide de fins scalpels, des fragments de mesenchymes de
proventricule et de gesier preleves sur des embryons de 5 jours. Ces fragments
sont repartis a la surface de milieux de culture prepares selon la technique de
Wolff & Haffen (1952). Chaque explant est recouvert d'une lamelle de plexiglas
et place en incubation a 38 °C.
En Fespace de quelques jours, les explants de mesenchyme s'etalent et forment
une nappe cellulaire mince et translucide. Les cultures sont laissees a Fetuve
pendant une semaine. Les lamelles de plexiglas sont alors prelevees et les nappes
cellulaires, dont on a prealablement delimite les contours par un trait grave sur
la lamelle, sont detachees des supports.
Les lamelles, ainsi debarrassees des cellules qui y adheraient sont rincees dans
du liquide de Tyrode et conservees dans celui-ci jusqu'a leur utilisation pour
Fetape suivante.
(b) Culture secondaire: contact entre l'epithelium de proventricule et les
materiels residuels de mesenchyme.
Nous prelevons, comme il a ete dit precedemment, des proventricules sur des
embryons de 5 jours d'incubation. Nous separons le mesenchyme de Fepithelium
par digestion a la trypsine selon la technique classique de Moscona (1952). Les
tubes epitheliaux denudes sont repartis a la surface de milieu de culture frais et ils
sont divises en trois series:
Serie no 1: les explants sont recouverts de lamelles ayant porte du mesenchyme
de proventricule (serie P)
Serie no 2: les explants sont recouverts de lamelles ayant porte du mesenchyme
de gesier (serie G)
Serie no 3: les explants sont recouverts de lamelles n'ayant porte aucune
culture prealable. Cette serie nous sert de temoin (serie T).
Nous avons soin de placer, dans les deux premieres series, les tubes epitheliaux de telle sorte qu'ils se trouvent exactement a Femplacement occupe par
Organogenese de Vestomac
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la culture primaire de mesenchyme. Tous les explants sont alors incubes a 38 °C
pendant 5 a 6 jours. Au cours de cette periode, les tubes epitheliaux qui se
trouvent au contact de lamelles ayant porte du mesenchyme de proventricule ou
de gesier adherent au support de plexiglas et s'etaient a sa surface. Sur les
lamelles vierges (lamelles qui n'ont pas porte de culture primaire de mesenchyme) au contraire, retalementestreduit ou meme nul et les explants n'adherent
que tres faiblement a leur support.
(c) Culture tertiaire: culture organotypique des tubes epitheliaux.
Dans une serie preliminaire, nous avions examine les explants colores in toto,
fixes a la lamelle qui leur avait servi de support de culture. Ces preparations
totales, etalees dans un plan, avaient une topographie aberrante et etaient tres
diffjcilement interpretables. C'est pourquoi, afin d'obtenir une image histologique des explants qui soit directement comparable a la structure obtenue en
culture organotypique, nous avons du recourir a une troisieme phase experimentale, phase de culture organotypique.
Les tubes epitheliaux des trois series experimentales sont detaches avec soin
des lamelles. Us sont transferes a la surface de milieux de culture frais et mis en
incubation pendant 24 h. Les explants se retrouvent, de la sorte, dans des conditions permettant la culture et la croissance organotypique. Et, de fait, nous
constatons que les nappes cellulaires qui s'etaient formees pendant la phase
precedente se retractent. Les contours des explants redeviennent reguliers et
les tubes epitheliaux reprennent l'aspect qu'ils ont en culture organotypique
habituelle.
Les explants sont alors fixes au liquide de Rossmann et inclus a la paraffine.
Les coupes sont colorees selon la technique de Hotchkiss-MacManus ou P.A.S.
Resultats
Les explants des trois series experimentales (Series P, G, et T) presentent, en
quantite variable, une masse de cellules d'apparence indifferenciee formant un
reseau plus ou moins lache. L'epithelium proprement dit, bien organise, est,
dans la plupart des cas, en position interne, done, normale; beaucoup plus
rarement, il enveloppe la masse de cellules 'indifferenciees'. Le reseau lache de
ces cellules provient tres probablement de la retraction de la nappe de cellules
dedifferenciees qui migrent autour de l'explant durant la phase de culture
secondaire de l'experience, histotypique, comme la premiere.
L'evolution des explants est jugee: (a) d'apres la morphologie generate de
l'epithelium; (b) d'apres sa teneur en glycogene et en secretions muqueuses.
(a) Morphologie de Vepithelium. Nous nous referons, comme nous l'avons vu
plus haut, a l'epaisseur de l'epithelium ainsi qu'a la forme de ses cellules. En
fonction de ces criteres, nous repartissons les tubes epitheliaux des trois series
experimentales en trois categories definies arbitrairement: (i) les explants dont
l'aspect est celui de l'epithelium de gesier normal; (ii) les explants dont la structure est intermediaire entre celle de l'epithelium de proventricule et celle de
48
M. SIGOT ET L. MARIN
Fig. \. Epithelium de proventricule cultive au contact de materiel residuel de mesenchyme de proventricule. Coloration: hematoxyline de Groat-eosine.
Fig. 2. Meme experience; coloration: P.A.S. (revelation du glycogene).
Fig. 3. Epithelium de proventricule cultive au contact de materiel residuel de
mesenchyme de gesier. Coloration: hematoxyline de Groat-eosine.
Fig. 4. Meme experience; coloration: P.A.S. (revelation du glycogene).
Fig. 5. Epithelium de proventricule cultive au contact d'une lamelle vierge. Coloration : hematoxyline de Groat-eosine.
Fig. 6. Meme experience; coloration: P.A.S. (revelation du glycogene).
Les fleches montrent des grains de glycogene dans le tissu lache qui accompagne
l'epithelium.
Organogenese de Vestomac
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l'epithelium de gesier; (iii) les explants dont la structure est celle de l'epithelium
de proventricule normal.
Nous savons qu'une des caracteristiques de l'epithelium de proventricule est
son pouvoir de former des glandes par invagination dans le mesenchyme qui
l'entoure. Ceci ne s'observe ni dans l'epithelium de gesier, ni dans l'epithelium de
proventricule cultive seul ou en association avec du mesenchyme de gesier.
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* 12
Figs. 7-12. Dessins schematiques no. 7 a 12 correspondants aux photographies des
Figs. 1 a 6. Les fleches montrent des grains de glycogene dans le tissu lache qui
accompagne l'epithelium (gl. = glandej^/yc. = glycogene).
EMB 24
50
M. SIGOT ET L. MARIN
Cependant, il est difficile de choisir ce critere (presence ou absence de glandes)
pour definir, ici, le type des explants. En effet, dans les conditions experimentales
ou nous sommes places, les tubes epitheliaux sont toujours cultives sans mesenchyme. La masse de cellules indifferenciees formees par la retraction des nappes
histotypiques constitue un tissu tres lache qui n'a pas les memes proprietes
mecaniques que le mesenchyme. C'est pourquoi il est tres rare que se forment
des glandes dans ces conditions. Neanmoins, il s'en forme quelquefois et nous
en verrons des exemples (Figs. 1, 2, 7, 8).
Tableau 1. Differentiation de Vepithelium de proventricule en
presence de differents materiels residuels
Differentiation de l'epithelium
de proventricule
Nombre des
A
Origine du materiel residuel
explants
Gesier
Pas de materiel residuel
Mesenchyme de gesier
Mesenchyme de
proventricule
10
14
14
8
10
2
>
Intermediaire Proventricule
1
1
3
1
7
5
Le Tableau 1 montre comment se repartissent les explants de nos series
experimentales dans les trois categories definies ci-dessus.
II apparait ainsi que, lorsque les explants sont cultives au contact de lamelles
nues ou au contact de materiels residuels produits par du mesenchyme de
gesier, ils sont en general du type epithelium de gesier. Lorsqu'ils sont cultives au
contact de materiels residuels produits par du mesenchyme de proventricule, au
contraire, la proportion d'explants de type proventricule et de type intermediaire
est importante, tandis que le nombre d'explants de type gesier diminue. La
differenciation de l'epithelium de proventricule depend done de l'origine du
materiel residuel au contact duquel il a ete cultive.
Les resultats que nous venons d'exposer nous permettent de considerer le role
du tissu lache qui accompagne l'epithelium comme etant essentiellement passif.
En effet, on constate que, dans la serie no 3 ou serie temoin (epithelium cultive
sous lamelle vierge), malgre la presence de ce tissu d'aspect mesenchymateux,
l'epithelium s'est bien differencie selon le type gesier, comme il le fait toujours,
Figs. 13-18. Coloration: P.A.S. (revelation du glycogene).
Fig. 13. Explant ne contenant pas de glycogene ni de mucus: groupe 0 a ±.
Fig. 14. Dessin schematique correspondant a la Fig. 13.
Fig. 15. Explant contenant un peu de glycogene et de mucus: groupe+.
Fig. 16. Dessin schematique correspondant a la Fig. 15.
Fig. 17. Explant contenant beaucoup de glycogene et de mucus: groupe + +.
Fig. 18. Dessin schematique correspondant a la Fig. 17.
51
Organogenese de Vestomac
10//
18
4-2
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M. SIGOT ET L. MARIN
en culture, lorsqu'il est prive de son mesenchyme propre. Ce tissu, qui est pourtant d'origine proventriculaire, n'a eu aucune influence sur la differenciation de
l'epithelium. Comme nous l'avons suppose plus haut, son origine doit done bien
etre epitheliale. Remarquons, a l'appui de cette hypothese, que nous decelons du
glycogene dans ce tissu lache alors que nous n'en observons jamais dans le
mesenchyme veritable (Figs. 4, 6, 10, 12).
(b) Teneur en glycogene et en mucus. Les explants provenant de chacune des
trois series experimentales sont repartis en categories arbitrairement definies
selon leur teneur en glycogene: (i) explants contenant des quantites importantes
de glycogene (groupe + + : Figs. 17, 18); (ii) explants contenant du glycogene,
mais en quantite beaucoup plus faible (groupe + : Figs. 15, 16); (iii) explants
contenant tres peu ou pas de glycogene (groupe 0 a ± : Figs. 13, 14).
Nous adoptons la meme classification en ce qui concerne la teneur en secretions muqueuses.
Le Tableau 2 montre comment se repartissent les explants dans ces trois
categories.
Tableau 2. Teneur en glycogene et en mucus a" explants d'epitheliums de
proventricule cultives en presence de differ ents materiels residuels
Nombre Teneur en glycogene
des
Origine du materiel residuel
Pas de materiel residuel
Mesenchyme de gesier
Mesenchyme de
proventricule
i
explants + +
9
12
12
5
5
1
Teneur en mucus
,
A
,
0a±
++
+
0a±
2
1
4
3
5
0
3
1
2
3
6
10
*
,
+
2
6
7
La differenciation sur le plan histochimique se montre parallele a celle que
nous avons observe sur le plan morphologique. En effet, lorsque les tubes
epitheliaux sont cultives au contact de materiels residuels produits par du
mesenchyme de gesier ou au contact de lamelles nues, une forte proportion
d'entre eux accumule du glycogene et secrete un mucus abondant. Les Figures 4,
6, 10 et 12 represented de tels explants. Lorsque les tubes epitheliaux sont
cultives au contact de materiels residuels produits par le mesenchyme de proventricule, la proportion d'explants vides ou pauvres en glycogene et en secretions
muqueuses devient, au contraire, importante. Les Figures 2 et 8 presentent un
explant de ce type. Nous y voyons meme des formations glandulaires. Cependant,
les resultats exposes dans le Tableau 2 appellent une remarque. Nous observons,
tout au moins en ce qui concerne le glycogene, que les explants de type intermediaire sont assez nombreux par rapport a ceux des deux types extremes. Comment
expliquerce phenomene? Les recherches de l'un de nous (Sigot, 1970) demontrent le role energetique du glycogene dans l'epithelium. La differenciation de ce
tissu vers le type gesier represents, au stade de 5 a 7 jours d'incubation, une
Organogenese de Vestomac
53
evolution qui ne se manifeste que par une simple croissance du tissu. Celui-ci
n'aurait done pas de grands besoins d'energie et le glycogene s'y accumulerait.
La differentiation vers le type proventricule necessite, au contraire, une evolution tres active du tissu avec d'importants remaniements structuraux dus a la
formation des glandes. 11 doit s'y developper une grande consommation
d'energie, done de glycogene, et c'est sans doute pour cette raison que nous n'en
voyons que peu ou pas dans le tissu, a ce moment. II ne pourrait, en effet, s'y
accumuler, car il y serait consomme au fur et a mesure de sa formation. Or,
dans les series experimentales dont nous venons de parler, nous avons vu que les
explants ne sont pas dans d'excellentes conditions pour former des glandes car
l'epithelium ne dispose pas de mesenchyme dans lequel elles peuvent trouver
appui. Ainsi, les explants dont la differenciation s'est orientee vers le type
proventricule acquierent un certain nombre de caracteristiques de l'epithelium
de proventricule (forme generate des cellules et epaisseur de F epithelium) mais,
comme ils ne peuvent former des glandes, le glycogene s'y accumule. C'est ce
qui expliquerait la presence d'un certain nombre d'explants contenant une
quantite notable de glycogene tout en ayant une structure proventriculaire.
L'epithelium de proventricule, cultive au contact de materiels residuels
produits par un mesenchyme inducteur, tend a evoluer comme s'il etait au contact du mesenchyme lui-meme; le materiel organique que le mesenchyme a laisse
sur son support de culture manifeste des proprietes inductrices analogues a celles
du tissu dont il provient.
Ainsi le materiel residuel presente une parente certaine avec le mesenchyme
lui-meme, parente qui doit vraisemblablement etre due a la presence de l'inducteur
ou de groupements contenant l'inducteur. De plus, il est probable que ce materiel
presente certains aspects physico-chimiques semblables a ceux presentes par le
mesenchyme puisque l'induction peut se produire a son contact tout comme au
contact du mesenchyme lui-meme.
(2) PROPRIETE DU MATERIEL RESIDUEL DU
MESENCHYME DE GESIER
L'epithelium de proventricule, debarrasse de son mesenchyme propre, tend a
evoluer vers le type gesier, qu'il soit ou non associe a du mesenchyme de gesier.
Ce fait, reconnu experimentalement, nous amene, tout naturellement, a nous
poser la question suivante: puisque la differenciation de l'epithelium stomacal en
epithelium de type gesier est, apparemment, une autodifferenciation, quel est le
role de ce mesenchyme ?
Pour repondre a cette question on pourrait, apres une premiere dissociation,
soumettre l'epithelium du proventricule a Faction du mesenchyme de gesier,
puis, apres une deuxieme dissociation, le reassocier a son mesenchyme propre.
Mais ces operations sont dedicates et risquent de leser beaucoup trop profondement les explants. Aussi avons-nous eu recours a une methode indirecte
54
M. SIGOT ET L. MARIN
utilisant la technique de culture sous lamelle que nous avons decrite plus haut.
Au lieu d'associer l'epithelium au mesenchyme de gesier lui-meme, nous
l'avons cultive au contact de materiel residuel provenant de cultures de mesenchyme de gesier sous lamelle de plexiglas (Marin & Sigot, 1965).
Methodes
Les ebauches sont cultivees selon la meme technique que celle utilisee pour nos
experiences precedentes. Cette experience se deroule egalement en trois etapes:
(a) Cultureprimaire: des fragments de mesenchyme de gesier, preleves sur des
embryons de 5 jours, sont transplanted sur des milieux de culture puis recouverts
de lamelles de plexiglas et incubes a 38 °C. Apres 8 jours de culture les fragments
de mesenchyme ont forme une nappe cellulaire plus ou moins etendue. Nous en
gravons les contours puis nous les detachons soigneusement et nous lavons les
lamelles dans du liquide de Tyrode. Elles sont ainsi pretes pour la 2e phase de
l'experience.
(b) Culture secondaire: nous prelevons des ebauches de proventricule sur des
embryons de 5 jours d'incubation. Les tubes epitheliaux sont dissocies, par
digestion a la trypsine, du mesenchyme qui les entoure. 11s sont ensuite transplanted sur des milieux de culture frais.
Ces explants sont divises en deux groupes: 1 groupe temoin ou les epitheliums
sont recouverts de lamelles de plexiglas n'ayant porte aucune culture prealable
et simplement rinces dans du liquide de Tyrode; 1 groupe experimental, ou les
epitheliums sont recouverts par les lamelles obtenues en culture primaire.
Les deux groupes sont portes a 38 °C d'incubation pendant 7 jours.
(c) Culture tertiaire: tous les explants de la culture secondaire sont detaches
des lamelles auxquelles ils adherent puis ils sont transplanted sur des milieux de
culture frais. Ils sont alors reassocies a du mesenchyme de proventricule de 5 jours
et remis en incubation a 38 °C pour une periode de culture organotypique
normale. Nous les laissons evoluer pendant 4 jours puis nous les flxons au
liquide de Rossmann. Les coupes sont colorees pa la rtechnique de HotchkissMacManus.
Resultats
Nous etudions les explants d'apres les criteres que nous avons expose au
premier chapitre. Cela nous permet de les classer en trois categories que nous
deflnissons de la facon suivante:
(1) Explants de type proventricule: epithelium mince a cellules assez larges,
presence de quelques glandes ou d'ebauches d'invagination, peu ou pas de
glycogene et de mucus.
(2) Explants de type gesier: epithelium nettement plus epais a cellules etroites,
pas de glandes, glycogene et mucus abondants.
(3) Explants de type intermediaire: ces explants sont tres varies et presentent
a la fois des caracteristiques de proventricule et de gesier: par exemple, epithelium peu epais avec du glycogene et du mucus, ou bien encore, epithelium
Organogenese de Vestomac
55
20
21
Figs. 19-22. Coloration: P.A.S. (revelation du glycogene). gl. = glande; glyc. =
glycogene
Fig. 19. Epithelium de proventricule cultive au contact d'une lamelle vierge et
reassocie a du mesenchyme de proventricule.
Fig. 20. Dessin schematique de la photographie, Fig. 19.
Fig. 21. Epithelium de proventricule cultive au contact de materiel residuel de mesenchyme de gesier et reassocie a du mesenchyme de proventricule.
Fig. 22. Dessin schematique de la photographie, Fig. 21.
22
56
M. SIGOT ET L. MARIN
epais mais ne contenant que tres peu de glycogene, etc
II faut noter,
neanmoins, que l'on n'y observe jamais de glandes ou d'ebauches glandulaires.
Le Tableau 3 indique la repartition des explants temoins et experimentaux
dans ces trois categories.
Tableau 3. Repartition des explants
Nature des explants
Experimentaux
Temoins
Differentiation de l'epithelium
Nombre des
explants
Proventricule Intermediate
Gesier
15
11
1
9
1
2
13
0
II apparait ainsi que l'epithelium de proventricule qui a ete cultive quelque
temps au contact de materiel residuel de mesenchyme de gesier garde l'empreinte
de celui-ci et ne peut plus donner des structures de proventricule normales
lorsqu'on le reassocie a son mesenchyme propre (Figs. 21, 22). Par contre,
lorsque l'epithelium a simplement sejourne au contact de lamelles vierges,
c'est-a-dire de lamelles n'ayant porte aucune culture prealable, son pouvoir de
differenciation reste intact et il reprend son evolution normale lorsqu'on le
reassocie a du mesenchyme homologue (Figs. 19, 20).
Ces resultats peuvent etre rapproches de ceux que l'un de nous a obtenus en associant l'epithelium de gesier de differents ages a du mesenchyme de proventricule
de 5 jours. L'epithelium de gesier de 5 jours n'est jamais influence par la presence
du mesenchyme de proventricule inducteur; il garde sa structure de type gesier.
Par contre, l'epithelium de gesier de 4 jours peut subir l'influence du mesenchyme de proventricule auquel il est associe: il se transforme alors en epithelium de type proventriculaire et des glandes s'y differencient. 11 s'avere ainsi
qu'a partir d'un certain stade, situe entre 4 et 5 jours d'incubation, l'epithelium de
gesier a perdu certaines de ses potentialites et a ete fixe dans sa differenciation de
type gesier, probablement sous l'influence de son mesenchyme propre. C'est cette
meme propriete que nous retrouvons dans le materiel residuel issu de ce mesenchyme, propriete qui consiste ici en la stabilisation dans le type gesier de la
differenciation de l'epithelium de proventricule.
Ainsi comprenons-nous Faction des mesenchymes du proventricule et du
gesier sur l'epithelium eminemment malleable qu'est celui de l'estomac. Ce
tissu qui a tendance a s'autodifferencier vers le type gesier est induit vers le type
proventricule dans la premiere partie de l'estomac (proventricule) et fixe dans sa
destinee dans la deuxieme (gesier). Tout se passe comme si le mesenchyme du
proventricule avait une action inductrice 'positive' et celui du gesier une action
inhibitrice, ou plutot, stabilisante sur l'epithelium.
Organogenese de Vestomac
57
(3) ESSAI DE CARACTERISATION PRELIMINAIRE
DU MATERIEL RESIDUEL
Nous venons de voir que le materiel residuel possede les memes proprietes
inductrices que les mesenchymes dont il provient. Nous avons done reeueilli sur
la lamelle, apres culture d'un mesenchyme inducteur, un materiel qui represente,
en quelque sorte, un produit actif de ce mesenchyme. Ce produit, que nous
obtenons directement sur les lamelles, se prete bien, malgre sa tres faible
quantite, a des etudes biochimiques. II est facile, en effet, de soumettre les
lamelles elles-memes a l'action de divers agents physiques ou chimiques, puis
d'eprouver les effets de ces agents sur le materiel residuel en placant la lamelle au
contact d'un tissu competent.
La technique de culture sous lamelle presente un avantage non negligeable sur
la facon classique d'obtenir un extrait de tissu inducteur, e'est a-dire par broyage. Nous nous heurtons habituellement, en effet, a une difficulte technique,
difficulte qui reside dans la tres faible quantite de tissu obtenue a partir d'une
ebauche d'organe. L'obtention de Textrait' lui-meme a partir des tissus preleves
necessite d'assez longues manipulations. De plus, ces 'extraits' tissulaires
contiennent un tres grand nombre de substances dans lesquelles le facteur
inducteur peut se trouver dilue. Enfin, il n'est pas sur qu'a un moment donne, le
facteur inducteur soit reellement accumule dans le mesenchyme, meme s'il y est
synthetise. La technique de culture sous lamelle, au contraire, non seulement rend
les manipulations faciles, mais permet egalement de recueillir le facteur produit
par le mesenchyme pendant toute la duree de la culture.
Cette technique, ainsi que les resultats obtenus grace a elle, nous ont permis
d'envisager des essais de caracterisation preliminaire du materiel residuel, tels
que Petude de sa sensibilite a des agents proteolytiques et de sa thermosensibilite,
essais analogues a ceux que l'un de nous avait deja realise dans un precedent
travail (Marin, 1965).
Marin avait demontre que lorsqu'une culture histiotypique est detachee du
substratum solide sur lequel elle a sejourne, il subsiste sur celui-ci un materiel
qui facilite la migration cellulaire a partir d'explants nouvellement preleves: les
explants, cultives au contact de la zone ou se trouvait la premiere culture,
s'etalent plus, en une periode donnee, que lorsqu'ils sont cultives directement au
contact du support vierge.
Marin a alors realise des experiences de caracterisation de la nature chimique
du facteur responsable de la stimulation de la migration. Elle a soumis le
materiel residuel reeueilli sur les lamelles a differents traitements et en a eprouve
ensuite les capacites stimulantes. Ce materiel est peut-etre de nature lipoproteique, puisque son efficacite est abolie aussi bien sous l'action de la trypsine que
sous l'action de la lipase. Le traitement des lamelles a la lipase et a la trypsine est
suivi d'un traitement a l'eau bidistillee bouillante afin d'inactiver l'enzyme qui
pourrait rester adsorbe sur les lamelles traitees. Marin a verifie au prealable que
58
M. SIGOT ET L. MARIN
ce traitement a l'eau bidistillee bouillante ne detruit pas le pouvoir stimulant
du materiel residuel.
C'est ainsi que, nous basant sur les resultats obtenus par Marin, nous avons
voulu eprouver l'effet de la trypsine et de la chaleur sur le facteur inducteur
(ou plutot, stabilisateur) present dans le materiel residuel issu du mesenchyme de
gesier.
Methodes et resultats
Les experiences se deroulent toujours en trois etapes.
(a) Culture primaire: nous preparons, suivant le meme processus experimental
que celui que nous avons decrit page 46, des lamelles porteuses de materiel
residuel de mesenchyme de gesier de 5 jours.
(b) Culture secondaire: les lamelles issues de la culture primaire sont divisees
en trois series:
(i) Premiere serie: les lamelles sont directement posees sur des tubes epitheliaux de proventricule de 5 jours dissocies du mesenchyme par Faction de
la trypsine. Cette serie que nous appelons: ' G ' , sera l'une de celles qui
nous serviront de temoins.
(ii) Deuxieme serie: les lamelles sont placees dans une boite de Petri, la face
porteuse de materiel residuel dirigee vers le haut. Nous deposons sur chaque
lamelle quelques gouttes d'une solution de trypsine a 0,1 % dans du liquide
de Tyrode sans Ca 2+ ni Mg 2+ et nous placons la boite de Petri en
incubation dans une etuve a 38 °C pendant \ h. Les lamelles sont ensuite
rincees au liquide de Tyrode. Elles sont alors plongees 10 sec dans de l'eau
bidistillee bouillante pour inactiver la trypsine, rincees a nouveau au
liquide de Tyrode et placees sur des tubes epitheliaux de proventricule de
5 jours. Cette serie est appelee: 'Tr'.
(iii) Troisieme serie: les lamelles sont plongees pendant 10 sec dans de l'eau
bidistillee a 100 °C puis rincees au liquide de Tyrode et posees sur des
tubes epitheliaux de proventricule de 5 jours. Nous appelons cette serie:' B'.
Nous realisons enfin, en meme temps que les trois series decrites ci-dessus, une
quatrieme serie experimentale qui nous sert egalement, comme la premiere, de
temoin. Nous recouvrons des epitheliums de proventricule de 5 jours de lamelles
n'ayant porte aucune culture prealable ou lamelles vierges, processus identique
a celui que nous avons decrit page 54. Cette derniere serie est appelee: ' V .
Toutes ces cultures sont portees a 38 °C pendant 5 jours.
(c) Culture tertiaire: tous les explants des 4 series de la culture secondaire sont
detaches des lamelles. Us sont ensuite transplanted sur des milieux de culture
frais et reassocies a du mesenchyme de proventricule de 5 jours. Ces associations
sont portees en incubation a 38 °C pendant 3 jours puis les explants sont fixes au
liquide de Rossmann. Les coupes sont colorees suivant la technique de Hotchkiss-MacManus.
Les explants sont repartis en quatre groupes, definis d'apres nos memes
Organogenese de Vestomac
59
criteres histologiques et histochimiques: (1) explants de type proventricule; (2)
explants de type gesier; (3) explants intermediaires; (4) explants aberrants: nous
rangeons, sous cette denomination, certains explants (peu nombreux) qu'il
nous est impossible de classer dans une des trois autres categories. Tels, par
exemple, ceux qui sont necroses en partie ou bien encore ceux dont l'epithelium
et le mesenchyme ne sont plus distinguables, formant une masse cellulaire
dedifferenciee.
Le Tableau 4 montre la repartition des explants de nos quatre series experimentales dans les quatre groupes ci-dessus.
Tableau 4. Repartition des explants des series 'G', iV\
Nature des
explants
Serie G
Serie V
Serie Tr
Serie B
S
7>' et 'B'
Differenciation de l'epithelium
Nombre des
Gesier
explants
Proventricule Intermediate
17
12
14
16
1
10
9
10
1
2
0
2
15
0
3
1
Explants
aberrants
3
3
L'examen des series experimentales 'Tr' et ' B ' fait apparaitre les resultats
suivants (Figs. 25, 26, 31, 32):
Serie 'TV'; action de la trypsine + action de la chaleur. Le facteur stabilisant ne
se manifeste plus. Nous pouvons nous demander quel est l'effet de la trypsine
dans cette experience. En effet, Marin avait demontre que la trypsine detruisait
le facteur favorisant la migration alors que la chaleur etait sans influence.
Serie ' B': action de la chaleur. Nous trouvons ici le meme resultat que dans la
serie ' Tr'. L'action de la seule chaleur a suffi pour supprimer le facteur stabilisant.
Ce resultat semble indiquer qu'il serait thermolabile. Mais nous pouvons aussi
faire une 2e supposition: ce facteur serait soluble et, dans les deux series
experimentales, il aurait ete simplement detache des lamelles et non pas detruit.
C'est pour tenter de resoudre ce probleme que nous avons realise une derniere
serie experimentale destinee a etudier l'activite de la solution d'incubation des
lamelles. Nous avons choisi la solution de trypsine pour etre sur d'avoir une
bonne solubilisation, au cas ou notre seconde hypothese se verifierait.
Les lamelles porteuses de materiel residuel de mesenchyme de gesier sont
traitees a la trypsine comme les lamelles de la serie 'Tr'. Le liquide d'incubation
est repris sur toutes les lamelles et recueilli dans un tube de verre. Cette solution
est bouillie pendant 10 sec puis elle est concentree. Elle est ensuite repartie sur des
lamelles vierges (lamelles n'ayant porte aucune culture prealable) et evaporee.
Puis ces lamelles sont placees sur des tubes epitheliaux de proventricule de
5 jours et les cultures sont portees a 38 °C pendant 5 jours.
Les explants sont alors detaches des lamelles, reassocies a du mesenchyme de
proventricule de 5 jours et cultives a 38 °C pendant 3 jours. Us sont ensuite
60
M. SIGOT ET L. MARIN
28
Figs. 23-28. Coloration: P.A.S. (revelation du glycogene).
Fig. 23. Epithelium de proventricule cultive au contact d'une lamelle vierge et
reassocie a du mesenchyme de proventricule (serie V).
Fig. 24. Epithelium de proventricule cultive au contact de materiel residuel de
mesenchyme de gesier et reassocie a du mesenchyme de proventricule (serie G).
Fig. 25. Epithelium de proventricule cultive au contact d'une lamelle porteuse de
materiel residuel de mesenchyme de gesier bouillie et reassocie a du mesenchyme de
proventricule (serie B).
Fig. 26. Epithelium de proventricule cultive au contact d'une lamelle porteuse de
materiel residuel de mesenchyme de gesier trypsinee et bouillie et reassocie a du
mesenchyme de proventricule (serie Tr).
Figs. 27 et 28. Epitheliums de proventricule cultives au contact d'une lamelle
porteuse de la solution de trypsination bouillie et reassocies a du mesenchyme de
proventricule (serie R).
Organogenese de Vestomac
61
fixes et colores comme precedemment. Nous avons appele ' R ' cette derniere
serie.
Le Tableau 5 montre comment se repartissent les explants de la serie 'R'.
Les explants sont essentiellement du type gesier. L'epithelium a ete stabilise
dans sa differenciation par la solution que nous avons depose sur les lamelles.
Cette solution contient done le facteur de stabilisation dont nous avions pu,
precedemment, montrer l'effet (Figs. 27, 28, 33, 34).
Les resultats de la serie' R' confirment ainsi notre deuxieme hypothese, celle de
" ^ ^ 2 9
33
Figs. 29-34. Dessins schematiques no. 29 a 34 correspondants aux photographies des
Figs. 23 a 28 (gl. = glande; glyc. = glycogene).
62
M. SIGOT ET L. MARIN
la solubilite du facteur stabilisant. Us demontrent egalement la thermostabilite
de ce facteur qui a resiste a l'ebullition. Nous ne savons pas quel est le role de la
trypsine mais il est fort probable qu'elle n'a pas d'efFet direct et que son seul
role est de favoriser la solubilisation. Nous pouvons d'ailleurs nous attendre a ce
que ce facteur soit soluble simplement dans l'eau. Ces experiences sont en cours.
De toute maniere, le fait que le facteur stabilisant puisse etre recueilli dans une
solution ouvre la voie a la caracterisation veritable de cette substance.
Tableau 5. Repartition des' explants de la serie 'JR'
Differentiation de l'epithelium
Nature des
explants
Nombre des
explants
Serie R
16
Proventricule Intermediate
0
3
Gesier
Explants
aberrants
11
2
CONCLUSIONS
Nous avons pu etudier la transformation de l'epithelium du proventricule
cultive au contact de lamelles conditionnees par des cultures de mesenchymes.
Le materiel residuel depose sur ces lamelles a des proprietes analogues a celles
du tissu dont il provient. Nous avons pu, en outre, mettre en evidence, dans le
cas du mesenchyme de gesier, une activite stabilisatrice qui provoque une
evolution irreversible de l'epithelium de type gesier. Cette activite n'avait pas
ete decelee jusqu'ici. II nous a ete possible, egalement, de recueillir, dans une
solution, le facteur responsable de cette activite. Nous n'avons, pour l'instant,
aucune donnee qui nous permette de definir les caracteristiques et les proprietes physiques ou chimiques de ce facteur, ni meme de savoir si nous avons
affaire a un seul ou plusieurs composes. Mais le fait que nous puissions recueillir
ce facteur dans une solution en rend possible, comme nous l'avons dit plus haut,
la caracterisation veritable. Une solution se prete facilement aux analyses
biochimiques les plus diverses. Toute une gamme de techniques s'offre a nous
qui devrait nous permettre d'isoler la fraction active responsable de la stabilisation de l'epithelium. La dialyse, la chromatographie, l'electrophorese et la
separation sur colon ne sont peut-etre les plus favorables.
SUMMARY
Organogenesis of the stomach in the chick embryo:
Development of the proventricular epithelium in contact with surfaces
conditioned by mesenchyme.
When living cells are cultured in contact with a solid support they leave in place, once they
are detached from their support, a certain amount of acellular organic material. This property
has permitted us to condition sheets of plexiglass with a preculture of inductive tissues
(proventricular or gizzard mesenchymes) which leave a residual material on the sheets. We
have studied the effects of this residue on the differentiation of the stomach epithelium of the
embryonic chick.
Organogenese de Vestomac
63
The residual material possesses inductive properties analogous to those of the tissue
from which it came: proventricular epithelium tends to develop according to the proventricular type when it is in contact with sheets precultured with homologous mesenchyme;
proventricular epithelium tends to develop according to the gizzard type when it is in contact with sheets precultured with gizzard mesenchyme. The inductive tissue, cultivated in
contact with a solid support, leaves in place an inductive substance which is able to act on the
epithelium.
The residual material of gizzard mesenchyme has stabilizing properties capable of arresting
the normal differentiation of the proventricular epithelium by maintaining it in the gizzard
form. Once the epithelium has been influenced by the residual material of gizzard mesenchyme, and then put back with proventricular mesenchyme, it is no longer able to form normal
proventricular structures. On the other hand, when the epithelium is cultured in contact with
untreated sheets its competence is maintained; reassociated with homologous mesenchyme, it
resumes normal proventricular development.
The stabilizing factor has been dissolved from sheets carrying residual material of gizzard
mesenchyme. Plexiglass sheets, coated with this solution, are tested on proventricular epithelia. The results are the same as those obtained with the residual material from which the
extract was made: this epithelium is no longer able to produce normal proventricular structures when it is reassociated with homologous mesenchyme.
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