/. Embryo!. exp. Morph. Vol. 24, 1, pp. 119-138, 1970
119
Printed in Great Britain
Action de la puromycine
et d'une substance analogue sur la differentiation
de cellules embryonnaires d'amphibiens,
cultivees in vitro
Par A. M. DUPRAT 1
Laboratoire de Biologie generale, Faculte des Sciences, Toulouse
RESUME
Des cellules embryonnaires de Pleurodeles waltlii et d'Ambystoma mexicanum (Amphibiens,
Urodeles) ont ete cultivees //; vitro en presence de diverses concentrations de puromycine,
inhibiteur des syntheses proteiques, ou d'aminonucleoside de la puromycine, substance
analogue n'agissant pas sur les syntheses proteiques. Lorsque le puromycine est introduite
dans le milieu de culture (0,15 /<g/ml) avant que la differenciation morphologique des cellules
ne se manifeste, on constate:
(a) L'apparition sur le vivant d'anomalies affectant divers organites cellulaires (nucleoles,
chromatine, chondriome...).
(b) L'inhibition de la differenciation morphologique des cellules, bien que d'autres fonctions
cellulaires continuent a se derouler.
(c) La reversibilite de ce phenomene de blocage, a condition que la duree du traitement
n'excede pas trois jours, meme en presence d'actinomycine D (troisieme lot, Fig. 5).
Ces resultats sont comparables a ceux obtenus avec la cycloheximide, autre inhibiteur
des syntheses proteiques.
Une etude autoradiographique nous a permis de constater que la puromycine inhibe
rincorporation de [3H]uridine dans Je nucleole mais ne perturbe apparemment pas celle qui
se fait dans Je nucleoplasme. De plus, le passage du RNA du noyau au cytoplasme ne paratt
pas affecte par l'antibiotique. La puromycine (0,15/tg/ml) a une action inhibitrice plus ou
moins marquee sur l'incorporation de deux acides amines selon la sensibilite de la ponte
utilisee. Cette inhibition des syntheses proteiques semble en correlation avec celle de la
differenciation morphologique. En effet, Paminonucleoside de la puromycine qui n'est pas
un inhibiteur des syntheses proteiques aux concentrations utilisees, n'affecte pas la differenciation morphologique des cellules.
On conclut que 1'effet de la puromycine est lie a son action inhibitrice des syntheses
proteiques.
INTRODUCTION
Les effets de la puromycine, antibiotique inhibiteur des syntheses proteiques,
ont fait Pobjet de nombreux travaux dans un domaine de recherches tres
etendu. L'action de cet antimetabolite sur l'oogenese (Ficq, 1964; DettlafF,
1966) et la morphogenese d'organismes animaux (Hultin, 1961; Brachet, 1963;
1
Adresse de Vauteur: Laboratoire de Biologie generale, Faculte des Sciences, 118, route de
Narbonne, 31-Toulouse, France.
120
A. M. DUPRAT
Brachet, Denis & De Vitry, 1964; Yaffe & Feldman, 1964; Malpoix & Limbosch, 1966; Legros & Brachet, 1965; Thomson & Biggers, 1966) et vegetaux
(De Vitry, 1965*7, b\ Boloukhere-Presburg, 1966) ainsi que son action sur
diverses fonctions cellulaires telles que la mitose (Legros & Brachet, 1965), la
respiration (Frankel, 1966), sur les syntheses de proteines (Wheelock, 1962;
Nathans, 1964, De la Haba & Holtzer, 1965), d'acides nucleiques (Tamaoki &
Mueller, 1963; Estensen & Baserga, 1966; Studzinski & Jackson, 1966; Latham
& Darnell, 1965) et sur certains constituants de la cellule tels que le reticulum
endoplasmique (Stenram & Willen, 1967), a ete etudiee a l'aide de materiels et
de techniques les plus varies.
Les resultats que nous avons precedemment obtenus par action de Pactinomycine D sur la differenciation morphologique de cellules embryonnaires en
culture in vitro, nous ont permis de constater que les myoblastes se differencient
en presence d'actinomycine D sans aucun retard sur les myoblastes-temoins,
contrairement a ce qui se produit pour Jes autres types cellulaires, notamment
les neuroblastes. De plus, ce meme type de cellules est capable, toujours en
presence d'actinomycine D, de se marquer par la [3H]leucine — meme apres
plusieurs jours de traitement. Ces recherches nous ont conduite a emettre
deux hypotheses: (a) possibility d'existence de m-RNA(s) a longue duree de vie
impliques dans la differenciation morphologique des myoblastes (Duprat,
Zalta & Beetschen, 1966); (b) le materiel proteique necessaire a la differenciation morphologique des myoblastes serait deja, en partie ou totalement, synthetise dans ce type cellulaire.
Afin de completer et de preciser ce premier travail sur la differenciation des
myoblastes, nous avons etudie Faction d'un inhibiteur des syntheses proteiques,
la puromycine (PURO), sur ces memes cellules embryonnaires encore morphologiquement indifferenciees ou en cours de differenciation morphologique. Cet
antimetabolite intervient, semble-t-il, au niveau meme des ribosomes; en se
substituant au RNA-t, il forme un complexe avec les derives amino-acyl et
interrompt l'assemblage des acides amines aux polypeptides en cours de
synthese (Nathans & Neidle, 1963; Nathans, 1964).
Si comme nous l'avons suppose, le materiel proteique necessaire a la differenciation des myoblastes etait deja en place dans la cellule lorsque le traitement
par l'actinomycine D debute, la PURO ne devrait pas empecher l'apparition
de la differenciation morphologique de ce type de cellules, contrairement a ce
qui se produirait pour les autres types cellulaires. Par contre, si la PURO bloque
la differenciation morphologique des myoblastes, on pourra penser qu'elle
inhibe des processus cellulaires impliquant sans doute des syntheses proteiques.
Dans ce dernier cas, afin de preciser davantage le mode d'action de la PURO,
nous avons etudie les effets de l'aminonucleoside de la puromycine (ANP),
analogue de cet antimetabolite qui, comme plusieurs travaux l'ont deja montre,
possede quelques proprietes biologiques de la PURO mais n'est pas un inhibiteur specifique des syntheses proteiques (Nathans & Neidle, 1963; Studzinski
Puromycine et cellules embryonnaires
121
& Ellem, 1966; Farnham & Dubin, 1967), excepte s'il est utilise a de fortes
concentrations (Studzinski & Ellem, 1966). Si des cellules embryonnaires
encore morphologiquement indifferenciees traitees par l'ANP, se differencient
alors que les cellules traitees par la PURO ne se differencient pas, nous pourrons penser que la PURO inhibe un (ou des) mecanisme(s) cellulaire(s) particulier(s) lie(s) a la synthese de proteines. Par contre, si les cellules traitees par
l'ANP ne se differencient pas, cela pourra signifier que le mecanisme de la
differentiation perturbe par la PURO et par son analogue n'est pas directement en relation avec des syntheses proteiques.
Notre present travail consiste done en l'etude des effets de la PURO et
d'un de ses analogues, l'aminonucleoside de la puromycine, sur la differenciation morphologique de cellules embryonnaires d'Amphibiens. Dans un travail
preliminaire (Duprat, 1967) nous avons pu determiner 3 categories de concentrations (c) de PURO. La premiere n'a pas d'action apparente sur le comportement des cellules et les divers organites cellulaires. Elle comprend les c ^
0,075 /*g/ml (1,3 x 10~ 7 M; C tres faibles). La seconde s'est averee la plus interessant pour effectuer une etude sur la differenciation cellulaire. Elle englobe les
c comprises entre 0,10 et 0,25/tg/ml ( 2 , 7 X 1 0 ~ 7 M ; C faibles). La troisieme
categorie, c ^ 0,25/4g/ml (4,5 x 10~ 7 M; C elevees) agit tres rapidement sur les
cellules et entraine des dommages considerables.
MATERIEL ET METHODES
Des cultures de cellules embryonnaires de neurulas de Pleurodeles waltlii (st.
13 et 14) et d'Ambystoma mexicanum (st. 14) ont ete effectuees selon la technique de Jones & Elsdale (1963) adaptee a notre materiel et deja utilisee pour
nos travaux anterieurs (Duprat, 1965; Duprat et al. 1965; Duprat et al. 1966;
Duprat, 1967; Duprat, Beetschen & Zalta, 1967). Des cellules de la plaque et des
bourrelets neuraux, et du feuillet mesodermique sous-jacent, sont dissociees
dans une solution de Steinberg tamponnee, sans Ca ++ ni Mg ++ , en presence de
versene (EDTA). Elles sont ensuite placees dans une chambre de culture constituee par une lame de verre de 4 mm d'epaisseur percee d'un orifice central de
10 mm de diametre, ferme par deux lamelles de verre scellees a la paraffine.
Le milieu de culture utilise est une solution minerale de Barth (Barth & Barth,
1959) a laquelle on ajoute 0,1 % d'albumine bovine (Armour Lab.) ou 3 % de
serum de cheval (Difco). L'albumine ou le serum ont un role protecteur vis-avis des cellules dont ils favorisent l'etalement; ils ne semblent pas avoir d'action
sur la differenciation cellulaire (Barth & Barth, 1959), puisque les cellules une
fois etalees peuvent se differencier normalement en leur absence (observation
personnelle). Les cultures sont maintenues a 18 °C.
Dans les cultures temoins, les cellules commencent leur differenciation morphologique peu apres leur etalement. Nous obtenons ainsi dans une meme
chambre de culture des categories cellulaires tres variees: cellules de type
122
A. M. DUPRAT
epithelial ciliees ou non, melanophores, cellules nerveuses sans axone, neurones, cellules musculaires lisses et striees et quelquefois cellules chordales
(Duprat et al. 1966) qui evoluent progressivement en utilisant leurs reserves
vitellines et restent vivantes pendant 3 semaines environ a 18 °C (Fig. 1A).
Lorsqu'elles ont epuise leurs reserves deutoplasmiques, elles degenerent.
Au total nous avons effectue 1000 cultures, la moitie d'entre elles ayant ete
traitee, l'autre moitie ayant servi de temoin.
C'est soit avant la mise en culture des cellules, soit immediatement apres
leur etalement, soit encore apres que la differentiation morphologique a
debute, que le traitement par l'antibiotique commence. Le milieu de culture est
alors remplace par une meme solution de Barth a laquelle on a ajoute la puromycine (Nutritional Biochemical Co) a diverses concentrations (de 0,025 a
100 /tg/ml). Selon les series, les durees de traitement ont varie de quelques heures
a plusieurs jours, le milieu traitant etant ensuite remplace, apres plusieurs
lavages, par du milieu normal.
Ces cultures mixtes presentent l'avantage de permettre la comparaison
aisee du comportement de plusieurs categories cellulaires (myoblastes, neuroblastes, etc.) traitees de maniere identique.
II faut aussi noter que les phenomenes observes au cours des traitements ne
correspondent apparemment pas a une selection de cellules resistantes telle
qu'on en observe dans les cultures de masse chez les Mammiferes. Dans l'ensemble, tandis que les cellules non etalees sont eliminees par le changement de
milieu, les cellules etalees reagissent toutes de facon semblable au traitement.
Pour une categorie cellulaire donnee, certaines cellules ne degenerent pas pendant que les autres continueraient a vivre.
Les radioelements utilises pour l'etude autoradiographique sont [3H]uridine
(C. E. A. Saclay, activite specifique 21Ci/mM) comme precurseur du RNA,
[3H]leucine (C. E. A. Saclay, activite specifique 15 Ci/mM), [3H]lysine (C. E. A.
Saclay, activite specifique 15 Ci/mM), comme precurseurs des proteines. Les
autoradiographies sont effectuees apres fixation des cultures par le liquide de
Carnoy ou par une solution aqueuse saturee d'acide picrique. Nous avons
utilise l'emulsion Ilford L4 selon la technique de Ficq (Ficq, 1961) adaptee a
notre materiel. Le temps d'exposition a varie selon les series de 3 a 12 jours.
Nous avons pu verifier par digestion a la RNase (Armour Lab., 0,2 mg/ml a
37 °C pendant 1 h), sur des cultures temoins ayant ete incubees pendant 1 h
dans la [3H]uridine, l'absence totale de tout marquage des cellules. De plus,
l'incorporation de [3H]thymidine dans des cellules de neurulas est nulle, ce qui
suggere que ces cellules ne synthetisent pas de DNA dans leur grande majorite.
Ces resultats permettent de penser que, sur notre materiel, contrairement a
ce qui se produit dans des cellules plus jeunes pendant la segmentation de
l'oeuf (Bieliavsky & Tencer, 1960), la [3H]uridine s'incorpore uniquement dans
le RNA.
Puromycine et cellules embryonnaires
123
RESULTATS
I. EfTets cytologiques de la puromycine
Quel que soit le type de cellules auquel ils appartiennent, les organites cellulaires reagissent de la meme fagon en presence de PURO. Nous ne decrirons pas
ict en detail les anomalies qui apparaissent tant dans le noyau que dans le
cytoplasme, qui ont deja fait l'objet d'une publication anterieure (Duprat,
1967).
FIGURE 1
Photographies effectuees sur le vivant, en contraste de phase.
chr, chromatine; n, nucleole; p.v., plaquettes vitellines.
(A) Cellule temoin de type epithelial presentant des nucleoles plus ou moins
ovoides, d'aspect homogene.
(B) Cellules traitees par la puromycine (0,25 /*g/ml). Un noyau possede des nucleoles
nettement vacuolaires, 1'autre presente un aspect tres heterogene avec la chromatine en mottes fortement contrastees.
(C) Cellule traitee par la puromycine (0,25/tg/ml). Cellule binucleee presentant
egalement des noyaux tres heterogenes dans lesquels il est difficile de distinguer
Jes mottes de chromatine des nucleoles.
124
A. M. DUPRAT
Nous rappellerons simplement que, dans le noyau, on observe des modifications des nucleoles qui prennent des formes tres variees, presentant par
endroits des condensations optiquement plus foncees en contraste de phase ou
qui se vesiculisent plus ou moins fortement. La chromatine se modifie egalement et presente un aspect heterogene, en mottes ou en filaments epaissis
* * ,-
FIGURE 2
Photographies effectuees sur le vivant, en contraste de phase.
ch, chondriome; g.m., grains de melanine; N, noyau.
(A) Chondriome d'une cellule-temoin. Presence de longs filaments flexueux, mitochondries en batonnets peu nombreuses.
(B) Myoblaste traite par la puromycine (0,25 /tg/ml). Le chondriome a tendance
a se fragmenter en mitochondries et a se cavuler. Absence de myofibrilles striees.
(Fig. 1B, C). La membrane nucleaire se plisse et il s'etablit des contacts beaucoup plus frequents entre nucleoles et membrane nucleaire que dans les cultures
temoins. Dans le cytoplasme on note une modification tres nette du chondriome.
Habituellement constitue par de longs chondriocontes flexueux (Fig. 2 A), il se
fragmente sous Faction de la PURO en elements generalement punctiformes, de
dimensions plus ou moins importantes (Fig. 2B). Nous avons egalement
observe une retraction cellulaire et l'apparition de vacuoles en nombre et de
dimensions variables.
Puromycine
et cellules embryonnaires
125
II. Action de la puromycine sur la differentiation
morphologique des cellules
1. Action de concentrations tres faibles (^ 0,075 /.ig/ml)
De meme qu'elles n'ont pas d'effet visible au microscope photonique sur les
divers organites cellulaires, les concentrations tres faibles n'agissent apparemment pas sur la differentiation morphologique des cellules. Nous n'avons pas
note de decalage dans revolution des cultures traitees par la PURO immediatement apres l'etalement des cellules, ou en cours de differentiation, par rapport
aux cultures temoins. Nous avons pu observer l'apparition simultanee des
myofibrilles striees dans les myoblastes temoins et traites. De la meme facon,
des axones se sont formes dans les neuroblastes traites et temoins.
2. Action de concentrations elevees (^ 0,25
Les concentrations elevees qui entrainent des dommages tres importants au
point de vue cytologique, provoquent un blocage immediat de la differentiation
morphologique et des autres fonctions de la cellule (mitose, utilisation des
reserves...). L'action inhibitrice de la PURO s'exerce sur tous les types cellulaires y compris les myoblastes (Fig. 2B). Les cellules meurent quelques jours
apres le debut du traitement. Ce blocage de toutes les fonctions cellulaires est
irreversible lorsque le traitement par l'antibiotique est interrompu et que les
cellules sont replacees dans un milieu de culture normal. II faut toutefois
apporter une restriction a ceci. En effet lorsqu'on fait subir aux cellules, des
leur etalement, un choc par une forte c de PURO (100 /*g/ml) pendant 1 h puis
qu'on les replace dans un milieu normal, on constate l'apparition de toutes les
anomalies morphologiques precitees; mais apres quelques jours un certain
nombre d'entre elles presentent une attenuation de ces anomalies et la differentiation morphologique s'y manifeste.
Si un tel choc est pratique lors de la mise en culture des cellules, on peut
constater qu'il n'empeche pas i'etalement, ni la differentiation et revolution
normale de ces cellules. Ceci indique bien, comme nous l'avons deja signale,
que la c utilisee et la duree du traitement par I'antimetabolite jouent un role tres
important.
Ann de preciser quels sont les effets sur les syntheses de proteines et de RNA
de ces c elevees qui entrainent des modifications irreversibles dans le metabolisme
cellulaire, nous avons effectue une etude autoradiographique en utilisant la
[3H]uridine et la [3H]leucine. Nous nous bornerons ici a rappeler brievement les
resultats obtenus qui ont deja fait l'objet de publications anterieures (Duprat,
1967; Duprat & Mathieu, 1969).
(a) L'incorporation de [3H]leucine dans les proteines est totalement inhibee
par la PURO (2 /tg/ml).
(b) L'utilisation de [3H]uridine nous a permis de constater comme d'autres
126
A. M. DUPRAT
auteurs (Studzinski & Jackson, 1966; Jackson & Studzinski, 1968) que la
presence de l'antibiotique entraine une baisse tres sensible du marquage
nucleolaire dans les cellules traitees, que le marquage nucleaire extra-nucleolaire
n'est apparemment pas affecte et que le passage du RNA du noyau vers le
cytoplasme n'est pas inhibe.
3. Action de faibles concentrations
1. Influence sur la differenciation morphologique
On a traite par une c de 0,15/*g/ml des cellules encore morphologiquement
indifferenciees. Tandis que les cultures temoins presentent la differenciation de
tous les types cellulaires, la differenciation des cellules traitees n'apparait pas,
FIGURE 3
Photographies effectuees sur le vivant, en contraste de phase.
cy, cytoplasme; my, myofibrilles striees; N, noyau; p.v., plaquettes vitellines.
(A) Myoblastes traites des leur etalement par la puromycine (0,15/tg/ml). Leur
cytoplasme s'etale et s'accroit normalement mais la differenciation des myofibrilles
striees ne se manifeste pas.
(B) Cellules musculaires striees temoins.
(C) Cellule musculaire traitee des son etalement, par Paminonucleoside de la
puromycine (10/4g/ml). Les myofibrilles sont nettement visibles.
Puromycine et cellules embryonnaires
127
axones et myonbrilles striees font notamment defaut. Cependant, toutes les
fonctions de la cellule ne sont pas bloquees pour autant. Nous avons pu constater la presence de mitoses se deroulant normalement et aboutissant a la
formation de deux cellules filles, meme au troisieme jour du traitement. Le
cytoplasme des cellules s'accroit et s'etale (Fig. 3 A). Nous avons egalement pu
observer la resorption de plaquettes vitellines avec apparition de globules
lipidiques. Les cellules continuent done ainsi a vivre en presence de PURO
pendant 8 jours environ meme en l'absence de toute differenciation morphologique. Ensuite les anomalies precedemment decrites affectant le noyau et le
cytoplasme deviennent importantes, les cellules degenerent plus ou moins
rapidement.
On a egalement traite par la PURO des cellules en cours de differenciation
morphologique. Contrairement a ce qui se passe dans le cas precedent, nous
n'avons pas decele de difference, apres 24 h de traitement, entre les cultures
temoins et traitees. C'est environ 48 h apres le debut du traitement qu'on peut
observer un arret de la differenciation, notamment de la croissance des axones
et du progres de la striation dans les myoblastes. Ici encore, toutes les fonctions
de la cellule ne sont pas bloquees.
2. Etude de la reversibilite des phenomenes
Si apres avoir inhibe la differenciation morphologique par la PURO pendant
1, 2, 3, 4 et 5 jours, on remplace le milieu traitant par une solution de Barth
normale, on constate la reversibilite du blocage. La striation apparait dans les
myoblastes pres du noyau et gagne ensuite les extremites de la cellule. Les
axones apparaissent egalement et s'allongent tres rapidement. On peut aussi
noter la formation, sur les cellules de type epithelial, d'une ciliature animee de
battements rapides. La differenciation n'est pas visible immediatement dans les
cellules, il s'ecoule environ 48 h apres le retour en milieu normal avant qu'elle
ne se produise. D'autre part la reversibilite a lieu aussi bien dans les cellules
tiaitees des leur etalement que dans celles qui avaient deja commence leur differenciation morphologique avant le debut du traitement, a condition que la
duree de ce dernier rfexcede pas trois jours. Au-dela de ce delai, les cellules
replacees en milieu normal degenerent tres rapidement.
Nous avons note dans les cultures replacees en milieu normal Fapparition
de cellules 'geantes' generalement de type epithelial, possedant une tres importante plage cytoplasmique et presentant un chondriome tres fourni. Leur
noyau de dimensions superieures a la moyenne renferme souvent de gros
nucleoles. Le phenomene de fusion nucleolaire est assez frequent dans ces
cellules.
128
A. M. DUPRAT
3. Etude autoradiographique
Dans ce cas encore et afin de preciser quelle est l'action de ces faibles concentrations de PURO sur les syntheses de proteines et de RNA, nous avons eu
recours a la methode autoradiographique.
Action sur le RNA. Nous avons effectue deux series d'experiences avec la
[3H]uridine. Dans un premier cas, la [3H]uridine et la PURO sont introduites
Tableau 1. Inhibition de Vincorporation de [3H]leucine par une
concentration de puromycine de 0,
Cultures temoins
Cultures traitees
A
Moyennes des observations effectuees
Nombre d'obser-
Moyennes des observations effectuees
par unite de
vations effectuees
par unite de
vations effectuees
surface sur chaque
culture temoin
sur chaque culture
temoin
surface sur chaque
culture traitee
(*i, 0
(«i, 0
(*2, 0
sur chaque culture
traitee
O2, 0
61,33
66,03
62,28
46,97
54,42
23
33
33
33
33
51,54
49,17
42,20
50,37
38,77
33
22
33
33
32
Nombre d'obser-
Cytoplasme
Noyau
23
43,32
50,34
61,33
33
43,95
60,12
33
33,25
40,66
33
50,33
49,39
33
44,24
L'utilisation du test de Mann-Whitney nous permet de constater que, pour
de 5 % (a = 0,05), les limites etant t et = 17 et t' a = 38, nous avons:
33
22
33
33
33
un seuil efficace
(a) Premier cas (cytoplasme):
tx = 18; t2 = 37; ta < tx < t2 < t'a; 17 < 18 < 37 < 38.
(b) Deuxieme cas (noyau):
tx = 20; t2 = 35; to. < tx < t2 < t'a; 17 < 20 < 35 < 38.
La difference entre tx et t2 n'est pas suffisamment grande pour qu'il faille raisonnablement
1'imputer a une difference entre les fonctions de repartition de xx et x2 (cf. Duprat & Mathieu,
1969).
11 semble done que le traitement n'a pas eu d'effet sur les cellules.
ensemble dans le milieu de culture; la duree d'incubation a ete de 1 h. Dans
un deuxieme cas, nous avons commence le traitement par l'antibiotique 24 h
environ avant l'introduction de [3H]uridine. Pendant la duree d'incubation
dans le precurseur marque (1 h), la PURO est toujours presente.
Dans ces deux series d'experiences nous n'avons pas note de difference dans
le marquage des cultures traitees et des cultures temoins (Duprat, 1967, 1969 c).
Pur omy cine et cellules embryonnaires
129
II semble done qu'a cette faible concentration, la PURO n'a pas d'action
decelable par autoradiographie, sur les syntheses de RNA.
Action sur les proteines. Dans un premier temps, on a egalement fait les
deux memes series d'experiences avec la [3H]leucine. Dans une serie, [3H]leucine
et la PURO sont introduites ensemble dans le milieu de culture, dans une
deuxieme serie le traitement par la PURO debute avant Introduction de
Tableau 2. Inhibition de Vincorporation de [sH]lysine par une
concentration de puromycine de 0,15
Cultures temoins
Cultures traitees
A
f
•V
Moyennes des observations effectuees
par unite de
surface sur chaque
culture temoin
Nombre d'observations effectuees
sur chaque culture
temoin
Moyennes des observations effectuees
par unite de
surface sur chaque
culture traitee
C*2. 0
Nombre d'observations effectuees
sur chaque culture
traitee
("2,
')
Cytoplasme
77,92
90,46
55,34
104,40
107,36
85,14
50
50
50
50
50
50
78,42
86,30
44,32
107,66
106,14
92,54
50
50
50
50
50
50
2,04
5,86
10,98
5,34
1,98
6,12
50
50
50
50
50
50
2,64
6,91
13,24
6,02
3,30
8,34
50
50
50
50
50
50
Noyau
L'utilisation du test de Mann-Whitney nous permet de constater que, pour un seuil de
5%, les limites etant toe = 26 et t'ct = 52, nous avons pour les 2 cas:
tx = 21; /2 = 57; tx < tot < t'ot < t2; 21 < 26 < 52 < 57.
Le test est tres significatif.
Le traitement a done une action inhibitrice significative sur le cytoplasme et sur le noyau.
la [3H]leucine. Nous avons constate que, contrairement a ce qui se produit avec
une concentration elevee de PURO, les syntheses proteiques ne sont pas
totalement inhibees. Elles continuent a avoir lieu dans le cytoplasme comme
dans le noyau des cellules. Les resultats numeriques obtenus apres comptage
des grains d'argent reduit par unite de surface tant dans le cytoplasme que dans
le noyau sont consignee dans le Tableau 1.
Dans un deuxieme temps, nous avons repris ces experiences en utilisant la
[3H]lysine. Dans ce cas nous avons constate une tres forte baisse dans le marquage cytoplasmique et nucleaire des cellules traitees (Tableau 2).
11 n'etait pas interdit de penser, d'apres ces deux series d'experiences, que les
9
EM B 24
130
A. M. DUPRAT
syntheses de certaines proteines jouant un role important dans la differenciation
morphologique des cellules, pourraient etre plus sensibles a la PURO que
d'autres. Une nouvelle serie experimental a ete effectuee; 1'incorporation de
[3H]lysine est encore fortement inhibee, tandis qu'une nouvelle experience
d'incorporation de [3H]leucine dans des conditions identiques a la premiere, a
montre que le marquage des cellules traitees par la PURO (0,15/tg/ml) etait
cette fois-ci fortement inhibe (Tableau 3).
Tableau 3. Inhibition de I'incorporation de [3B]leucine par une
concentration de puromycine de 0,15 ptgjml (deuxieme serie)
Cultures temoins
Cultures traitees
A
i
Moyennes observations effectuees
par unite de
surface sur chaque
culture temoin
Nombre d'observations effectuees
sur chaque culture
temoin
30,96
52,10
45,60
62,12
50
50
50
50
51,04
Moyennes des observations effectuees
par unite de
surface sur chaque
culture traitee
CY2, i)
Nombre d'observations effectuees
sur chaque culture
traitee
Cytoplasme
3,60
3,14
0,60
0,78
0,54
50
50
50
50
3,94
67,70
50
2,94
61,14
72,44
50
50
1,72
1,34
0,98
50
50
50
50
50
50
50
Noyau
L'utilisation du test de Mann-Whitney nous permet de constater que, pour un seuil de
5%, les limites etant toe = 11 et t'a = 29, nous avons pour les 2 cas:
/x = 10; t2 = 35; tx < tx < t'a < t2; JO < 11 < 29 < 35.
Le test dans les 2 cas est tres significatif.
Le traitement a done une action inhibitrice significative sur le marquage du cytoplasme et du
noyau.
4. Etude autoradiographique effectuee au cours de la phase de reversibilite
Nous avons vu precedemment que, utilisee a la c de 0,15/tg/ml, la PURO
empeche l'apparition de la differenciation morphologique des cellules mais ne
bloque pas certaines autres fonctions cellulaires. Lorsque le milieu traitant est
remplace par une solution de Barth normale, la cellule est capable d'assurer
toutes ses fonctions, notamment celles qui lui permettent de se differencier, a
condition que la duree du traitement n'ait pas depasse un certain delai. Afin de
connaitre ce qui se passe pendant la periode de reversibilite des phenomenes,
nous avons encore une fois eu recours a la technique autoradiographique.
Puromycine et cellules embryonnaires
131
Apres avoir traite les cultures par 0,15 ^g/ml de PURO pendant 2 jours, on a
remplace le milieu traitant par du milieu normal dans lequel les cellules sont
restees pendant 24 h. Les cultures ont ensuite ete incubees pendant 1 h avec
de la [3H]leucine afin de deceler, le cas echeant, une modification dans le taux
de synthese de proteines.
Tableau 4. Incorporation de [*H]leucine apres traitement par une
concentration de puromycine de 0,15 /-ig/ml, puts une duree
de re'versibilite de 24 h
Cultures temoins
Cultures traitees
A.
r
Moyennes des observations effectuees
Nombre d'obserpar unite de
vations effectuees
surface sur chaque sur chaque culture
culture temoin
temoin
("i,
')
(*,/)
Moyennes des observations effectuees
Nombre d'obserpar unite de
vations effectuees
surface sur chaque sur chaque culture
culture traitee
traitee
Cv2, 0
Cytoplasme
40,24
30,64
46,10
38,22
42,30
50
50
50
50
50
35,06
32,50
38,58
34,06
38,02
50
50
50
50
50
56,78
49,44
46,94
61,44
57,98
50
50
50
50
50
54,54
47,62
46,42
54,26
56,14
50
50
50
50
50
Noyau
L'utilisation du test de Mann-Whitney nous permet de constater que, pour un seuil de
5%, les limites etant ta = 17 et t'oc = 38, nous avons pour les 2 cas:
tv = 40; t, = 15; t2 < ta < t'a < tx; 15 < 17 < 38 < 40.
Le test dans les 2 cas est tres significatif.
Vaugmentation du taux d'incorporation de [3H]leucine dans les cellules traitees est done
significative.
Apres une duree de reversibilite de 24 h., nous avons constate une augmentation de l'incorporation de [3H]leucine dans les cellules traitees (Tableau 4). Cet
accroissement du marquage cellulaire pourrait expliquer la formation de
cellules 'geantes' dans des cultures traitees.
III. Action d'un analogue de la puromycine, l'aminonucleoside
de la puromycine
1. Effets cytologiques
L'ANP a ete utilisee a une c molaire equivalente a celle utilisee avec la PURO
soit 0,1/tg/ml ( 2 , 5 X 1 0 ~ 7 M ) et a diverses autres concentrations c: 0,01-1 et
J0/<g/ml.
9-2
132
A. M. DUPRAT
Les anomalies nucleaires qui apparaissent affectent principalement les nucleoles. Ces organites cellulaires se determent parfois et deviennent plus ou moins
vesiculeux ou contrastes (Fig. 4B). La chromatine generalement peu visible en
contraste de phase s'epaissit en mottes ou filaments egalement assez contrastes.
FIGURE
4
Photographies effectives sur le vivant, en contraste de phase.
ch, chondriome; n, nucleole.
(A) Cellule temoin presentant 4 nucleoles arrondis d'aspect homogene, une
chromatine diffuse peu visible, et un chondriome filamenteux.
(B) Cellule traitee par Faminonucleoside de la puromycine (1 /<g/ml). Les nucleoles
presentent des zones tres contrastees, la chromatine a tendance a former des amas
contrastes, le chondriome est fragmente en petites mitochondries.
Dans le cytoplasme, sous Faction de cette substance, le chondriome habituellement constitue de filaments flexueux dans les cellules temoins, se gonfle en
donnant parfois des images de cavulation ou au contraire se fragmente comme
il le fait sous l'action de la PURO (Fig. 4B). On note egalement une retraction
cellulaire de plus ou moins grande importance accompagnee quelquefois de
l'apparition de ' vacuoles' cytoplasmiques. Nous avons pu observer des mitoses
dans des cultures traitees par l'analogue de la PURO, meme apres que le
traitement a debute depuis plusieurs jours. L'utilisation des reserves deutoplasmiques ne semble pas inhibee par le traitement.
Puromycine et cellules embryonnaires
133
2. Action de I'ANP sur la differentiation cellulaire
Nous avons traite par cet analogue de la PURO des cellules encore morphologiquement indifferenciees, immediatement apres que leur etalement se soit
produit. Nous n'avons pas observe d'action inhibitrice sur la differenciation
morphologique. Des myofibrilles striees sont apparues et se sont developpees
dans les myoblastes (Fig. 3C). De meme nous avons pu suivre l'apparition et la
croissance d'axones dans des neurones ou la formation d'une ciliature animee
de battements sur des cellules de type epithelial.
Ces resultats appuient done l'hypothese precedemment formulee et permettent de penser que la PURO (0,15/tg/ml) qui empeche l'apparition de Ja
differenciation morphologique, inhibe pour ce faire des mecanismes lies a la
synthese proteique.
IV. Action combinee de l'actinomycine D et de la puromycine
sur la differenciation morphologique des cellules
Compte tenu des connaissances acquises en etudiant les effets de la PURO
sur la differenciation cellulaire, nous avons associe l'action de ces deux inhibiteurs afin de preciser la possibility d'existence dans les myoblastes de m-RNA a
vie longue. Pour ce faire, on a traite les cellules indifferenciees par une solution
contenant a la fois de la PURO (0,15/*g/ml) et de l'actinomycine (0,25 /^g/ml)
pendant des durees de 24, 48, 72 et 96 h, afin de bloquer la differenciation
morphologique des cellules et la synthese de RNA. Ces cultures ont ensuite ete
reparties en trois lots (Fig. 5).
Dans le premier lot, les cultures sont maintenues en presence de PURO seule
et aucune differenciation ne s'y manifeste; dans le second, elles sont remises
en contact avec un milieu normal sans actinomycine ni PURO, et les myoblastes seuls s'y differencient et y survivent, ce qui confirme nos resultats
precedents concernant Faction a long terme de l'actinomycine D (Duprat et al.
1966). Dans le troisieme lot, le milieu traitant (actinomycine + puromycine) a
ete remplace par une solution contenant de l'actinomycine seule, a la meme
c (0,25 /Ag/ml) afin de permettre la reprise eventuelle des syntheses proteiques
specifiques de la differenciation des myofibrilles tout en maintenant le blocage
des syntheses de RNA. La differenciation des myoblastes en fibres striees est
alors intervenue apres 48 h de delai, quand le traitement prealable en presence
de PURO n'avait pas depasse 72 h. L'actinomycine n'a done pas d'effet inhibiteur sur cette differenciation, ce qui confirme nos precedents resultats (Duprat
et al. 1966).
La differenciation des myofibrilles intervient done alors que les syntheses de
RNA ont ete bloquees depuis 5 jours par l'actinomycine. Ceci renforce l'hypothese que nous avions formulee sur la presence de RNA(s) de type messager a
longue duree de vie, dans les myoblastes d'Amphibiens Urodeles. En effet,
134
A. M. DUPRAT
l'information genetique presente dans le cytoplasme de ces cellules n'a pu
aboutir au debut de la formation des myofibrilles qu'apres un delai de 5 jours
du a Faction inhibitrice de la PURO, et alors que les autoradiographies montrent que la [3H]uridine n'est pas incorporee dans le RNA, pendant cette meme
periode, sous Faction de l'actinomycine. Des recherches biochimiques ont
Mise en culture
i,1°jour
I
I
2
3
I
Etalement
5 6
4
I
I
I
A
Temoins
\
f
r-
lot
\
I
8
I
9
I
10
I
11
I
*
(tous les types cellulaires)
X A.
I
I
I
Y///Y///X///A77/A///A///A'/A
Actinomycine D (0,25-5 Ag/ml)
Premier
7
I
' • * ' • * (myofibrilles seulement)
.
Pas de differenciation morphologique
Deuxieme J
'
^ P.
'
A (tous les types cellulaires)
lot
I
I
I
k\\\T\\\H\\\
Puromycine (0,15/<g/ml)
I P•y
Troisieme
•.*•: Hu
A (tous les
types cellulaires)
A (myofibrilles seulement)
P. + A.
lot
Puromycine+actinomycine D
^
W-
A(myofibrilles
seulement)
A Apparition de la differenciation morphologique
|
A. Introduction de l'actinomycine D, Y//\
|
P. Introduction ou retrait de la puromycine, [ \ \ j
f
i.i. Apparition d'inclusions intranucleaires sous faction de l'actinomycine D
Fig. 5. Action combinee de l'actinomycine D et de la puromycine.
certes etabli que de tres faibles syntheses de RNA peuvent persister en presence
d'actinomycine et elles pourraient ne pas etre decelees par autoradiographie. 11
faudrait alors supposer que de telles syntheses persisteraient uniquenient dans
les myoblastes en depit des alterations intranucleaires (Duprat et al. 1965, 1966),
et y conduiraient a la formation de m-RNA(s) specifiques des syntheses proteiques intervenant dans la structuration des myofibrilles.
Si Ton admet done la presence dans les myoblastes de m-RNA(s) a vie
longue gouvernant la mise en place des structures myofibrillaires, le fait que sa
longevite puisse depasser de plusieurs jours le delai normal de cette mise en
place apparait comme particulierement significatif.
Puromycine et cellules embryonnaires
135
DISCUSSION
Nous venons de voir que selon la concentration a laquelle elle est utilisee et la
duree du traitement, la PURO a une action inhibitrice ou non sur la differenciation morphologique de cellules embryonnaires d'Urodeles cultivees in vitro.
Des concentrations elevees entrainent un blocage irreversible de la differenciation des cellules, accompagne d'une inhibition des syntheses proteiques et du
RNA nucleolaire. Studzinski & Love (1964) ont observe dans le cytoplasme de
cellules HeLa traitees par de fortes c de PURO la formation d'inclusions riches
en ribonucleoproteines semblables a des nucleoles. L'auteur suggere que 1'apparition de ces inclusions cytoplasmiques resulterait de ^interruption des syntheses
proteiques. Nous n'avons pas note un tel phenomene dans nos cultures. Les
concentrations tres faibles ne semblent pas affecter le metabolisme cellulaire.
Des concentrations faibles bloquent la differenciation morphologique des
cellules sans toutefois inhiber toutes les fonctions cellulaires. Quand les cellules
sont replacees en milieu normal apres une duree de traitement variable, on
peut observer la reversibilite du phenomene de blocage a condition que le
traitement ne depasse pas trois jours a 18 °C. La technique autoradiographique
ne decele pas de difference dans le marquage par la [3H]uridine des cellules
temoins et traitees. II semble done que ces concentrations de PURO ne perturbent pas les syntheses de RNA. L'incorporation de deux acides amines
marques, neutre et basique, est plus ou moins fortement inhibee selon les
series de cultures. Des resultats analogues ont ete obtenus par action de la
cycloheximide, autre inhibiteur des syntheses proteiques (Duprat, 1969a). Un
analogue de la PURO, l'aminonucleoside de la puromycine, qui n'est pas un
inhibiteur specifique des syntheses proteiques, n'empeche pas l'apparition, ni
revolution de la differenciation morphologique des cellules.
On peut done d'ores et deja conclure que la differenciation morphologique de
tous les types de cellules cultivees implique des systemes cellulaires qui sont en
relation etroite avec des syntheses proteiques.
Faut-il exclure la possibilite que le materiel proteique fondamental soit deja
en place dans la cellule? Ce serait admettre qu'il devrait pouvoir se structurer
meme en l'absence de toute synthese proteique nouvelle. Or, des enzymes
specifiques, e'est-a-dire d'autres proteines, doivent etre indispensables a cette
structuration et e'est leur formation qui pourrait etre inhibee selectivement,
empechant l'organisation des proteines eventuellement pre-existantes.
Deux hypotheses peuvent etre avancees pour essayer d'expliquer les effets de
concentrations faibles de puromycine (ou de cycloheximide), qui bien que
n'inhibant pas totalement l'incorporation de divers acides amines, entrainent
un blocage reversible de la differenciation morphologique des cellules. On peut
supposer:
(a) Soit que Pantimetabolite inhibe qualitativement ou quantitativement la
synthese de certaines proteines specifiques structurales ou enzymatiques impli-
136
A. M. DUPRAT
quees dans la differentiation morphologique (formation des myofibrilles,
formation et croissance des axones, par exemple).
(b) Soit que l'antimetabolite, tout en n'inhibant pas completement les syntheses proteiques fondamentales, perturbe des constituants ou organites cellulaires precis intervenant dans l'organisation structurale de ce materiel proteique.
Ces constituants alteres pourraient ne plus remplir eux-memes leur role, ce
qui entrainerait indirectement l'arret des syntheses proteiques concernant la
differentiation morphologique.
Dans le cadre de cette derniere hypothese nous avons ete amenee a envisager
le role actif que pourrait jouer le chondriome dans la structuration des myofibrilles par exemple, etant donne d'une part les contacts etroits que Ton observe
entre eux et d'autre part le fait qu'il existe des syntheses proteiques mitochondriales. On a vu que le chondriome presente des alterations morphologiques
sous l'action de la puromycine (ou de la cycloheximide).
Mais les resultats obtenus apres action de l'actinomycine D sur les myoblastes, de l'aminonucleoside de la puromycine et de temperatures supranormales sur toutes les cellules (Duprat, 19696), montrent que la differentiation
cellulaire survient malgre la presence d'alterations souvent importantes du
chondriome, ce qui parait exclure la necessite d'une integrite absolue des
chondriosomes au cours de cette phase ultime de la differentiation. 11 semblerait done que contrairement a ce que nous avions suppose le chondriome ne
jouerait pas un role direct dans les mecanismes de la differentiation morphologique des cellules.
II est done vraisemblable que le processus de la differentiation morphologique des cellules implique un ensemble de mecanismes lies a des syntheses
proteiques specifiques, inegalement sensibles a l'action de la PURO ou d'autres
inhibiteurs des syntheses proteiques comme la cycloheximide.
SUMMARY
Action of puromycin and an analogous substance on the differentiation of
amphibian embryonic cells cultured in vitro
Embryonic cells of Pleurodeles waltlii and Ambystoma mexicanum neurulae were cultivated in vitro in the presence of various concentrations of puromycin and of puromycin
aminonucleoside. When puromycin, an inhibitor of protein synthesis, is added to the culture
medium (0-15/*g/ml) before morphological differentiation of cultivated cells is established,
the following effects are observed:
(a) Cytological damage becomes conspicuous (nucleolus, chromatin, mitochondria, etc.).
(b) Cellular morphological differentiation is inhibited although other cellular functions
remain active.
(c) This blockage phenomenon is reversible, but only if the duration of the treatment does
not exceed 3 days, even in presence of actinomycin D (third group, Fig. 5).
These results are similar to those obtained with cycloheximide, another inhibitor of
protein synthesis.
An autoradiographic study allowed us to state that puromycin inhibits [3H]uridine incorporation into the nucleolus but has no effect on that into the nucleoplasm. Similarly, the
RNA migration from nucleus to cytoplasm does not seem to be affected by the drug. On
Puromycine et cellules embryonnaires
137
the other hand, puromycin (0-15/<g/ml) has an inhibitory effect on the incorporation of
various amino acids which is more or less noticeable according to the sensitivity of the batches
of spawn. Inhibition of protein synthesis is therefore correlated with inhibition of morphological differentiation. Indeed, puromycin aminonucleoside, which is not an inhibitor of
protein synthesis, does not affect morphological differentiation of cells.
It is concluded that the effect of puromycin is related to its inhibitory action on protein
synthesis.
TRAVAUX CITES
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