/. Embryol. exp. Morph. Vol. 24, 1, pp. 1-12, 1970
Printed in Great Britain
Etude histochimique de
la distribution des sialomucines dans l'oviducte et
les gangues muqueuses des ovocytes de Rana
pipiens. Comportement dans Feau des differentes
gangues
Par JAIME PEREDA 1
Laboratoire d'Anatomie Comparee, Faculte des Sciences,
7, Quai St-Bernard, Paris (5eme)
Les recherches histochimiques ont revele chez les amphibiens divers mucopolysaccharides, situes dans l'oviducte a des niveaux bien definis et dont la
topographie est tres precise dans les gangues gelatineuses qui entourent les
ovocytes (Humphries & Hughes, 1959; Humphries, 1966; Humphries &
Workman, 1966; Pereda, 1969).
D'autre part, les methodes histochimiques ont recemment mis en evidence des
sulfomucines dans la zone superieure de l'oviducte et dans la couche 1 interne
des gangues ovocytaires de Rana pipiens (Pereda, 1970); toutefois, dans
cette espece, la nature des autres constituants mucopolysaccharidiques qui les
accompagnent dans la zone mediane et la zone distale, et dans les couches 2 et
3 des gangues, n'a pas ete determined.
Warren (1963) admet, sans preciser cependant sa localisation, la presence
d'acide sialique dans l'ovocyte de R. catesbeiana. Humphries & Workman (1966)
affirment egalement son existence dans l'oviducte et la gangue des ovocytes de
Triturus viridescens, et Bolognani et al. (1966) dans celle des ovocytes de
Bufo vulgaris. Lee (1967), recourant a l'analyse histochimique et chimique, a
demontre, sans toutefois en specifier la localisation, que l'oviducte et les
gangues ovocytaires de Rana pipiens contiennent de l'acide sialique.
L'interet du present travail, oriente surtout vers la determination des interactions des sialomucines et des sulfomucines dans l'oviducte et les gangues
ovocytaires de R. pipiens, se justifie par l'importance du role biophysique de ces
substances.
1
Adresse de Vauteur: Departamento de Anatomia, Facultad de Quimica y Farmacia,
Universidad de Chile, Vicuna Mackenna 20, Santiago, Chile.
E M B 24
2
J. PEREDA
MATERIEL ET METHODES
A des femelles adultes de R. pipiens, en periode de pre-ovulation, on a injecte
de l'extrait hypophysaire aux doses recommandees pour chaque epoque de
l'annee (Rugh, 1962). Les oviductes preleves sur des femelles en periode d'ovulation (ovocytes repartis tout au long de l'oviducte), ont ete divises en trois
parties constituant les regions proximate, mediane et distale. De petits echantillons de chaque portion, fixes a l'alcool-formol a —15 °C ou au liquide
alcoolique de Bouin, ont ete, apres inclusion a la paraffine, coupes a 5 jti.
(a) La mise en evidence des sialomucines a ete realisee conformement aux
techniques suivantes: reaction a l'acide periodique-Schiff (PAS) (McManus,
1946), colorants basiques tels que le bleu alcian (BA) pH 2,5 (Mowry, 1956) et
le bleu de toluidine (BT) a differents pH (Spicer, 1963), methodes combinees
telles que le BA pH 1,3-PAS et le BA pH 2,5-PAS (Mowry & Winkler,
1956).
Nous avons utilise egalement la neuraminidase (Vibrio cholerae, 500 unites/ml)
(Spicer, 1963), ainsi que l'hydrolyse en tampon acetate 0,02 N a pH 2,5, pendant
4 h a 70 °C, suivie d'un controle de la basophilie (Quintarelli, Tsuiki, Hashimoto
& Pigman, 1961).
Pour preciser mieux la nature histochimique des acides sialiques presents,
nous avons employe des methodes combinees de desacetylation-neuraminidase
telles que la methode de Ravetto (1968) utilisant le melange d'ammoniaqueethanol-eau de Lillie (1951), pendant 24 h a 37 °C, avec lavage, puis incubation
a la neuraminidase pendant 18 h a 39 °C; la basophilie a ete revelee par le BA
pH 2,5 et le BT au raeme pH.
Nous avons aussi employe, comme agent desacetylant, le KOH selon la
technique de Spicer & Duvenci (1964), suivi d'une incubation a la neuraminidase pendant 18 h a 39 °C; controle par le blocage de la basophilie.
(b) Pour la mise en evidence des proteines, on a utilise les techniques suivantes: la methode de Bensley & Gersh (1933), la technique de Yasuma &
Itchikawa (1953) et la methode de Glenner (1957); la methode de Sakaguchi,
modifiee par Baker (1947); la technique de Barrnett & Seligman (1952) avec et
sans reduction a l'acide thioglycolique; la technique au 'Red Sulphydril
Reagent' (R.S.R.) avec et sans reduction a l'acide thioglycolique qui, par la
formation de mercaptans, revele les groupes sulfhydriles.
(c) Pour le dosage des acides sialiques libres, nous avons utilise l'acide 2thiobarbiturique selon la methode de Warren (1959). De petits echantillons de
chaque niveau de l'oviducte de 5 femelles en periode d'hibernation et de 5
femelles en periode de pre-ovulation ont ete broyes dans la proportion de 0,1 g
de tissu frais pour 2 ml d'une solution d'acide sulfurique a pH 1. On preleve
0,2 ml d'homogenat apres hydrolyse pour determiner les acides sialiques libres.
La lecture des densites optiques est effectuee sur un spectrophotometre (Unicam
SP 800) a 549 mpt. Avant de choisir cette longueur d'onde, nous avons dose une
g
J
;
||
Sialomucines dans Voviducte
3
gamme connue de concentrations d'acide TV-acetylneuraminique (Behring
Werke, A. G.).
Pour le calcul des taux de concentration, nous avons utilise les formules
proposees par Warren (1959).
La technique a l'acide 2-thiobarbiturique de Warren nous a perm is de deceler
les acides sialiques libres dans le surnageant et les solutions de lavage (0,2 ml)
des lames soumises aux differents traitements enzymatiques avec la neuraminidase et celles successivement desacetylees et traitees a la neuraminidase (ammoniaque-ethanol et KOH).
(d) Des ovocytes preleves systematiquement dans les zones proximale,
mediane et distale de l'oviducte, et respectivement pourvus de la couche 1, des
couches 1 et 2, et 1,2 et 3, ont ete plonges dans une solution de Holtfreter a
10 %, pendant des durees allant de 2 min a plus de 10 h, afin d'etablir le comportement dans l'eau des dififerentes couches qui enveloppent les ovocytes.
RESULTATS
(a) Zone proximale et couche 1 (Z.p. et C-l)
Z.p. et C-l, comme nous l'avons deja etabli, contiennent une forte concentration de mucopolysaccharides (MPS) sulfates (Pereda, 1970) ce qui
entraine, dans la detection histochimique des sialomucines, des interferences.
En effet, la methylation en milieu acide a 60 °C lors de la detection des sulfomucines provoque aussi l'hydrolyse des residus d'acide sialique (Quintarelli,
1963). Cependant, la presence d'acide sialique dans la Z.p. de l'oviducte a ete
confirmee par l'essai a l'acide 2-thiobarbiturique, ce qui nous permet de penser
qu'il se retrouve aussi en C-l en faible concentration.
Dans les deux cas, la coloration est tres faible par la reaction de Millon et
l'alloxane-Schiff donne une coloration diffuse au niveau des granules de
secretions des cellules glandulaires. Dans Z.p. et C-l, on obtient une faible
coloration rose avec le D.D.D. apres reduction des groupements disulfures, et
une coloration orange pale avec le R.S.R., mais seulement apres reduction a
l'acide thioglycolique. Ces resultats confirment l'absence de groupes sulfhydriles
et une faible concentration en groupes disulfures.
(b) Zones mediane et distale {Z.m. et Z.d.)
Dans la Z.m., l'alcianophilie, tres faible a pH 1,3, augmente d'intensite a
pH 2,5. La metachromasie au BT, nulle a pH 1,3, devient significative a pH
2,5 (Fig. 2A); elle se transforme en orthochromasie aux pH superieurs a 3,5.
Avec la methode combinee BA pH 1,3-PAS, on n'obtient que la coloration
rouge due au PAS, alors qu'on obtient un melange bleu-rouge avec le BA pH
2,5-PAS.
L'effet de l'hydrolyse avec une solution tampon acetate a pH 2,5 (4 h a 70 °C)
provoque, au niveau de Z.m., une diminution importante de l'alcianophilie et
4
J. PEREDA
de la metachromasie et, dans Z.d., seulement une faible alcianophilie. Ces
resultats n'ont cependant pas ete confirmes d'une facon precise par remploi de
la neuraminidase, dont Faction est semblable a celle de l'hydrolyse pour la
destruction de la liaison sialyl.
Dans les deux regions, on constate, sur les lames desacetylees, puis traitees a
la neuraminidase, un blocage partiel de la basophilie, resultat comparable a
celui obtenu apres hydrolyse acide.
220
200
I
180
I
160
0)
-o 14-0
-5?
r-i
? 100 80 60
-
40 20 00
Z.p.
I
Z.m.
Zone de I'oviducte
Z.d.
Fig. 1. Concentration totale de l'acide sialique dans les differentes zones de I'oviducte
de Rana pipiens, exprimee en /tmol d'acide sialique/g de tissu frais. Q, Femelle en
periode de pre-ovulation; • , femelle en periode de repos.
D'ailleurs, nous avons observe que la desacetylation provoque un accroissement de la basophilie, qui serait du au fait que l'elimination des groupements
acetyl rendrait reactifs les groupements carboxyliques prealablement masques.
L'alcianophilie et la metachromasie (pH 2,5) qui persistent dans la Z.m.
apres ces differents traitements seraient dues aux sulfomucines, et la faible
alcianophilie, dans les memes conditions, de Z.d., pourrait etre attribute a une
action incomplete du traitement enzymatique sur la molecule glycoproteique.
Ces faits nous permettent de confirmer la presence de sialomucines dont la
concentration, tres importante au niveau de Z.m. de I'oviducte, diminue dans
Z.d.
L'alloxane-SchifT a donne dans les deux zones un resultat faiblement positif
au niveau des granulations des cellules glandulaires (coloration rose).
Sialomucines dans Voviducte
5
La reaction de Glenner, specifique des composes a groupements indol et
pyrrol (notamment du tryptophane) a donne une reponse positive nette dans
C-2 et plus faible dans C-3.
Les techniques qui utilisent le D.D.D. ou le R.S.R. donnent des resultats
comparables. Dans les deux cas, on observe une faible coloration dans Jes
deux zones et une reaction plus intense quand les coupes sont soumises a une
reduction prealable avec l'acide thioglycolique, destinee a mettre en evidence les
groupes disulfures. On n'observe de coloration ni avec le D.D.D., ni avec le
R.S.R. apres blocage des groupes sulfhydriles par l'acide iodo-acetique.
L'analyse des resultats obtenus par la methode colorimetrique et representes
sur la figure 1 confirme la presence d'acide sialique a tous les niveaux de l'oviducte. Toutefois, tant chez les femelles en periode de repos que chez celles en
periode de pre-ovulation, la concentration, faible en Z.p. de Foviducte, atteint
son maximum dans Z.m. pour decroitre legerement dans Z.d.
Chez les femelles en periode de pre-ovulation, les concentrations d'acide
sialique augmentent a tous les niveaux, mais elles sont nettement plus elevees
dans Z.m. de l'oviducte.
Les valeurs representees sur la figure 1, qui sont exprimees en fimol d'acide
sialique par gramme de tissu animal frais correspondent aux valeurs moyennes
des densites optiques obtenues dans chaque niveau de l'oviducte.
Couche 2 et couche 3 (C-2jet C-3)
L'alcianophilie a pH 1,3, intense en C-2, est tres reduite en C-3. L'emploi de
BA pH 2,5 determine un renforcement de la coloration dans les deux couches.
La methode combinee BA pH 1,3-PAS montre, dans les deux cas, une preponderance de la reaction PAS. En revanche, l'emploi de BA pH 2,5 permet
d'equilibrer les colorations bleue et rouge; toutefois, la coloration bleue
augmente moins en C-3 qu'en C-2 (Fig. 2B).
A pH 1,3 on note une reponse metachromatique de C-2 avec le BT; a pH
2,5 elle est nette, mais faible en C-3. Dans les deux cas, on obtient de l'orthochromasie pour le BT a pH 3,5.
L'hydrolyse acide (Quintarelli et al. 1961) a demontre que, si en C-2 on
obtient une diminution notable de l'alcianophilie, la metachromasie a pH
2,5 n'est pas affectee. Au contraire, dans C-3 il y a en meme temps reduction de
ralcianophilie et abolition de la metachromasie.
Avec la methode combinee BA pH 2,5-PAS, on observe dans C-2 une preponderance manifeste de la reaction PAS qui masque presque completement
l'alcianophilie. La reaction PAS ne semble pas etre modifiee apres hydrolyse.
La concentration en proteines de C-2 est nettement plus elevee que celle de
C-3, comme le montrent les resultats obtenus avec l'alloxane-Schiff qui conduit
a une coloration rose plus intense dans C-2 que dans C-3; de meme, avec la
reaction de Millon, les resultats sont plus nets en C-2, tandis que seule C-2 se
colore en bleu par la technique de Glenner.
J. PEREDA
La methode au D.D.D. qui decele les groupements sulfhydriles par esterification du groupe thiol, ne donne que dans C-2 une reaction positive, d'ailleurs faible;
avec un traitement prealable a l'acide thioglycolique, l'intensite de la coloration
augmente fortement dans C-2 et une coloration diffuse apparait dans C-3.
FIGURE 2
(A) Zone mediane de l'oviducte. Bleu de Toluidine pH 2,5. Reaction positive.
(xl28).
(B) Ovocyte au niveau de la zone distale de l'oviducte. Bleu Alcian pH 2,5-PAS.
La couche 1 et la couche 2 sont colorees au bleu-pourpre intense. Dans la couche 3
et les glandes de l'oviducte, faible reaction bleue. (x 128).
ABREVIATIONS
GL = glandes de l'oviducte
ep. = epithelium cilie
Ov. = ovocyte
C-l = couche 1
C-2 = couche 2
C-3 = couche 3
Ces observations demontrent la presence dans C-2 de groupes sulfhydriles et
dans C-2 et C-3 de groupes disulfures. Dans C-2, le R.S.R. donne une coloration
orange qui est renforcee par un pretraitement a l'acide thioglycolique. Dans
C-3, la coloration, d'ailleurs diffuse, n'apparait qu'apres ce pretraitement.
Dans les observations sur le processus d'hydratation, il faut tenir compte de
phenomenes lies a la constitution et aux fonctions des couches. La forte teneur
en sialomucines et en proteines de C-2 pourrait expliquer l'aspect de bande
Sialomucines dans foviducte
1
dense qu'elle presente malgre son epaisseur reduite: sa constitution chimique
est differente de celle de C-3 dont l'aspect est assez lache. Voici nos resultats sur
la vitesse d'hydratation des differentes couches muqueuses:
FIGURE 3
(A) Volume de la couche gelatineuse (C-l) des ovocytes preleves dans la zone
proximale apres 5 min dans une solution de Holtfreter. ( x 40).
(B) Volume des couches gelatineuses 1, 2, et 3 des ovocytes preleves dans le faux
uterus apres 10 h dans une solution de Holtfreter. (x 70).
ABREVIATIONS
Ov. = ovocyte
C-l = couche 1
C-2 = couche 2
C-3 = couche 3
Le volume de la couche C-l des ovocytes preleves dans la zone proximale,
augmente rapidement apres 2 min de contact avec la solution de Holtfreter a
10 %, et il peut meme atteindre 10 fois le volume initial (Fig. 3 A).
D'autre part, le volume de C-3 des ovocytes preleves dans la zone distale et le
faux uterus (qui comporte 3 couches muqueuses), plonges dans la meme solution,
est multiplie environ 5 fois; l'epaisseur des deux autres couches varie faiblement,
que le sejour dans le Holtfreter a 10 % dure 2 min ou se soit prolonge pendant
10 h. Le volume de C-l et C-2 se maintient comme celui des ovocytes oviductaux
qui n'augmente presque pas (Fig. 3B).
5
J. PEREDA
DISCUSSION
L'emploi de la neuraminidase pour la mise en evidence des sialomucines dans
les gangues des amphibiens n'a pas demontre clairement un blocage de la
basophilie (Humphries, 1966; Lee, 1967; Pereda, 1969).
Nos experiences ne nous ont pas permis non plus de bien deflnir une action
enzymatique dans le blocage partiel ou total de la basophilie quand elle a ete
employee sans un traitement prealable de desacetylation. Mais l'action hydrolytique (Quintarelli, et al. 1961) dans la reduction de la basophilie nous a conduits a admettre l'existence d'acide sialique a la fois dans Z.m. et Z.d. de l'oviducte et dans C-2 et C-3 des gangues de l'ovocyte.
L'action enzymatique n'est pas toujours efficace pour la rupture de la liaison
sialyl; on a signale des echecs dans le cas de diverses mucines animates (Quintarelli, 1963; Spicer & Warren, 1960). Ces fairs montrent une sensibilite inegale
des sialomucines a Faction de la neuraminidase, phenomene qui serait du a
des variations du mode de liaison de l'acide sialique a la molecule proteique.
Des recherches chimiques donnent a penser que, dans les cas ou l'enzyme est
efficace, comme dans les mucines des glandes sublinguales, l'acide sialique
occupe une position terminate, ce qui permet de le liberer facilement par
l'hydrolyse acide sans detruire le restant de la molecule de mucine (Gottschalk,
1960).
Les experiences de digestion enzymatique avec desacetylation prealable
mettent en evidence les glycoproteines, qui se presentent sous forme d'acide
JV-acetyl-0-diacetylneuraminique. Ces sialomucines, qui sont surtout concentrees dans la zone mediane de l'oviducte et dans C-2 des gangues qui entourent l'ovocyte, sont moins abondantes dans la zone distale et dans la couche
externe (C-3) des ovocytes.
On a observe, au cours des investigations realisees sur les proprietes chimiques
des mucines salivaires, que la plus grande partie des sialomucines capables de
resister a l'action de la neuraminidase, contiennent de l'acide sialique sous la
forme d'acide iV-acetyl-O-diacetylneuraminique, dont la structure moleculaire
confere une grande resistance a Faction de la neuraminidase. II a ete en outre
etabli que, par un traitement alcalin, on provoque la desacetylation des mucines
contenues dans ces glandes de telle sorte que la molecule resultante est facilement
digeree par l'enzyme (Faillard, 1959; Gibbons, 1963).
Ravetto (1968), utilisant le melange ammoniaque-ethanol, a montre qu'apres
une incubation prolongee, suivie d'un traitement a la neuraminidase, on provoque
le blocage de la basophilie liee aux sialomucines. Cette technique presente une
specificite superieure a celle qui utilise le KOH comme element desacetylant.
Cette observation de Ravetto corrobore nos resultats sur la detection des
sialomucines au niveau histochimique.
La methode de Warren (1959), appliquee a Fanalyse du surnageant des lames
soumises au traitement desacetylation-neuraminidase a montre, au spectro-
Sialomucines dans Voviducte
9
photometre, que Je pourcentage des residus d'acides sialiques libres elimines est
presque deux fois moindre dans le cas du traitement KOH-neuraminidase.
Barch & Shaver (1963) ont mis en evidence la repartition de differents composes antigeniques le long de l'oviducte. Leurs observations sont plus interessantes
encore si on les rapproche des travaux qui ont demontre la presence de composes
antigeniques a la surface externe de diverses membranes cellulaires. En particulier, Watkins (1964) a pu attribuer les proprietes antigeniques des erythrocytes
humains a la presence de macro-molecules contenant des glucides, des glycolipides par exemple.
Le meme auteur a signale que les proprietes antigeniques de divers liquides
tissulaires pourraient etre attributes a des mucopolysaccharides. Etant donne
que, chez R. pipiens, C-2 presente, comme constituant principal, des glycoproteines, et que C-3 contient, elle aussi, des sialomucines, on peut suggerer que
les proprietes antigeniques localisees a differents niveaux de l'oviducte pourraient etre liees aux glycoproteines.
La presence d'acide sialique dans les enveloppes gelatineuses des ovocytes
admet d'autres interpretations. Humphries (1966) a suggere que l'acide sialique
jouerait un role essentiel dans le declenchement de la penetration du spermatozoide dans les oeufs de Triturus viridescens.
D'autre part, Soupart & Noyes (1964) ont avance l'hypothese selon laquelle la
penetration du spermatozoTde dans la zone pellucide de diverses especes de
mammiferes serait en relation avec la presence de residus d'acide sialique.
Enfin, il faut tenir compte du rapport architectural des differentes couches
avec leur constitution chimique et leurs fonctions. Les observations au niveau
histochimique sont a rapprocher des resultats des experiences sur 1'hydrophilie
des differentes couches muqueuses. En effet, la forte hydrophilie observee dans
la C-l des ovocytes preleves dans la zone proximale de l'oviducte, pourrait
trouver son explication dans le comportement biophysique des mucopolysaccharides sulfates: Fessler (1957) a signale que leur grande affinite pour l'eau
serait due, plus qu'a des phenomenes osmotiques, a leur forte tendance a
occuper un grand volume en solution. Ce processus d'hydratation serait bloque
par la couche 2, quand les ovocytes sont preleves de la zone distale ou du faux
uterus.
Entre autres roles, C-2 jouerait done celui, fort important, de barriere au
passage de l'eau: les relations entre sialomucines et proteines lui confereraient
une architecture moleculaire telle qu'elle bloquerait ce passage. L'equilibre du
milieu extra-ovocytaire entourant l'ovocyte serait ainsi maintenu, ce qui
faciliterait les echanges normaux, gazeux et metaboliques et permettrait, en fin
de compte, a l'ovocyte la reception du spermatozoide (Glick & Shaver, 1963).
10
J. PEREDA
RESUME
Au moyen de techniques de coloration histochimiques, on a etudie la nature et
la distribution des sialomucines et des proteines dans l'oviducte et les gangues
muqueuses entourant les ovocytes de Rana pipiens.
1. On a observe que les sialomucines, qui sont abondantes dans la zone
mediane de l'oviducte et dans la couche 2 des gangues, ne sont que faiblement
representees dans la zone proximale de l'oviducte et dans la couche 1, ou predominent fondamentalement des sulfomucines.
2. La zone distale de l'oviducte, ainsi que la couche 3 des gangues, contient
par contre moins de sialomucines, et la concentration en mucopolysaccharides
neutres semble y etre plus importante qu'aux autres niveaux etudies.
3. Seules la zone mediane et la couche 2 des gangues contiennent des proteines en quantite importante. Les zones proximale et distale de l'oviducte,
ainsi que les couches 1 et 3 des gangues, ne donnent que des reactions diffuses.
4. Certains aspects du comportement et de la signification de ces differentes
couches muqueuses dans l'eau ont ete discutees.
SUMMARY
Histochemical study of the distribution of sialomucins in the oviduct and jelly coat
of the oocytes o/Rana pipiens. Behaviour of the different layers of the coat in
water.
The nature and distribution of sialomucins and proteins in the different
regions of the oviduct as well as in the jelly coat surrounding the oocyte of
Rana pipiens were studied.
1. It was found that the 'median zone' of the oviduct and the second layer of
the oocyte jelly coat contained a large amount of sialomucins in contrast to the
'proximal zone' and the first layer (inner layer) which revealed only a small
amount of the sialomucins.
2. The 'distal zone' and the third layer of the jelly coat also showed small
amounts of sialomucins but revealed a preponderance of neutral mucopolysaccharides.
3. The 'median zone' and the second layer of the jelly coat gave definite
positive reactions for proteins while the 'proximal' and the 'distal zone' as well
as the first and the third layers of the jelly coat revealed diffuse reactions only.
4. Some aspects of the behaviour of the different jelly coats in water and
their significance are discussed.
Je tiens a exprimer ma plus vive reconnaissance au Professeur Dr Jean Rosenberg, dont
les conseils m'ont ete si utiles pendant l'elaboration de ce travail.
Sialomucines dans Voviducte
11
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