/ . Emhryol. c.xp. Morpli. Vol. 29, 3, pp. 663-679, 1973
Printed in Great Britain
663
Etude morphologique de
Faction du bromure d'ethidium sur des cellules
embryonnaires de Pleurodeles waltlii en
culture in vitro
Par MARIE-THERESE MIQUEL 1 ET
ANNE-MARIE DUPRAT 1
Laboratoire de Biologie Generate, Equipe de recherche associee au
CNRS no. 327 et Laboratoire de Microscopie electronique
appliquee a la Biologie, Universite Paul Sabatier, Toulouse
SUMMARY
Morphological studies on the action of ethidium bromide on in vitro
cultured Pleurodeles waltlii embryonic cells
Ethidium bromide (EB) induces characteristic and constant nuclear changes on Pleurodeles
waltlii embryonic cells cultured in vitro:
(a) Nucleolar segregation - that is, a modification of ribonucleic constituents which are
present in the nucleolus in two forms, granular and fibrillar particles; this phenomenon is
reversible after short treatments (until 12h) and not reversible after 24 h and longer
treatments.
(b) Appearance of ribonucleoprotein intranuclear inclusions which is not reversible,
whatever the treatment duration may be.
(c) Important changes are also observed at the chromatin level.
At the cytoplasmic level an important alteration of the chondrioma morphology occurs
and an inhibition of the utilization of yolk platelets.
On the other hand EB generally inhibits neuroblast and myoblast differentiation. This
inhibition appears to be reversible in myoblasts after short treatments.
The chromosomal DNA synthesis (incorporation of [3H]thymidine) does not seem to be
affected by EB treatments while [3H]uridine incorporation in RNAs is completely inhibited
after 24 h and longer treatments.
INTRODUCTION
Le bromure d'ethidium (BE), antibiotique synthetique appartenant au groupe
des phenanthridines, forme comme de nombreux autres antimetabolites, un
complexe avec FADN, inhibant ainsi l'action de l'ARN-polymerase en
s'intercalant entre les paires de bases de l'helice d'ADN (Elliott, 1963; Ward,
Reich & Goldberg, 1965; Waring, 1965).
Des etudes recentes realisees au moyen de la spectrophotometrie et de la
fluorometrie ont montre que la liaison du BE a l'ADN est limitee par la presence
1
Adresse des auteurs: Laboratoire de Biologie generale, Universite Paul Sabatier, 118
route de Narbonne, 31077-Toulouse Cedex, France.
4 3
E M B 29
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M.-T. MIQUEL ET A.-M. DUPRAT
des proteines fixees a cette molecule et plus particulierement la fraction f 1 des
histones (Angerer & Moudrianakis, 1972).
Des travaux biochimiques et biophysiques ont permis d'obtenir entre autres
des donnees sur les relations BE-acides nucleiques (Kleiman & Huang, 1971)
et de faire une distinction entre certains ARN apparemment semblables (Gray
& Sounders, 1971). Des etudes biologiques in vivo ont ete realisees a l'aide du
BE; de ces travaux il ressort essentiellementune action inhibitrice specifique du
produit sur les ADN non chromosomiques, aussi bien chez les protozoaires
que chez les especes plus evoluees. Riou (1969) et Steinert (1969) ont montre
un effet inhibiteur du BE sur l'ADN du kinetoplaste des trypanosomes; Slonimski, Perrodin & Croft (1968) ont obtenu une mutation entrainant une deficience
respiratoire dans des cellules 'petites' de levure, Zylber, Vesco & Penman
(1968) ont montre, dans des cellules Hela, une inhibition selective de l'ARN
associe aux mitochondries. Ces resultats sont conformes a ceux obtenus par
Soslau & Nass (1971) d'une part et Naum & Pious (1971) d'autre part, qui ont
montre des modifications du contenu en cytochromes des mitochondries dans
differents types de cellules de mammiferes. De facon plus generale, il a ete
constate a la suite d'etudes biochimiques et cytologiques une inhibition selective
de l'ADN mitochondrial (Leibowitz, 1971; Heilporn & Limbosch, 1971).
Peu d'auteurs ont etudie Faction du BE sur le noyau de la cellule; Vacquier &
Brachet (1969) et Truhaut & Deysson (1972) ont montre l'action du BE sur le
deroulement des mitoses, Risueno & Gimenez-Martin (1971) ont entre autres
mis en evidence la presence d'une segregation nucleolaire dans des cellules vegetales soumises a Faction du BE. Nass (1972) a observe une accentuation de
l'incorporation de thymidine dans le noyau a la suite de traitements par le BE.
Enfin, Six & Brachet (1971) ont utilise le BE pour aborder un problems tres particulier de la morphogenese: la digestion du vitellus. A la suite de traitements
d'oeufs de Pleurodele par une solution de BE ils ont observe en particulier une
inhibition, a un stade precis du developpement, de la synthese ou de l'activite
d'une enzyme, la cathepsine. Cette inhibition pourrait expliquer le ralentissement marque de l'utilisation des reserves vitellines dans les embryons traites,
dont la morphogenese, se deroule cependant jusqu'a un stade avance, les dosages
d'ADN et d'ARN ne revelant d'autre part pas de differences quantitatives avec
les embryons temoins.
Nous disposons pour notre part d'un materiel reactif particulierement
adapte a l'etude des effets d'une telle substance sur la cellule et sur son comportement. II s'agit de cellules embryonnaires de ces memes Amphibiens Urodeles
determinees mais non encore differenciees morphologiquement, dont la differenciation se manifeste ensuite en culture in vitro, materiel sur lequel nous avons
deja etudie Faction de divers autres antimetabolites (Duprat, Miquel, Beetschen
& Zalta, 1967).
Notre travail a consiste: d'une part en l'observation en microscopie photonique (sur le vivant en contraste de phase, ainsi que par cytochimie) et en
Uaction du bromure d'ethidium
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microscopie electronique, des modifications cytologiques liees a l'action du BE;
d'autre part, en l'etude de ses effets sur la differentiation des divers types
cellulaires cultives. Nous avons etudie de plus la reversibilite eventuelle des
modifications cytologiques, aussi bien que celle ayant trait a la differentiation
morphologique.
Nous avons enfin recherche par autoradiographie, les effets de cette substance
sur le metabolisme des acides nucleiques des cellules ainsi soumises a l'action
du BE. Ces observations ont ete effectuees sur 8 series de 70 cultures chacune,
done au total 560 cultures, une moitie etant utilisee comme cultures temoins,
l'autre ayant subi les divers traitements par le BE.
MATERIEL ET METHODES
Les cultures de cellules embryonnaires de PleurodeJes waltlii Michah ont ete
effectuees selon une technique deja utilisee pour nos travaux anterieurs (Duprat
et a/. 1965, 1967; Duprat, Zalta & Beetschen, 1966).
Des cellules de la plaque medullaire, des cretes neurales et du feuillet mesodermique sous-jacent, sont dissociees dans une solution tamponnee, sans
Ca 2f ni Mg2+, en presence d'EDTA. Elles sont ensuite placees dans une
chambre de culture remplie de la solution minerale de Barth & Barth (1959) a
laquelle on ajoute 0,1 % d'albumine bovine (Armour Labor.). Ce n'est qu'apres
etalement des cellules sur leur support que nous les avons traitees par le BE a
differentes concentrations: 10, 20 et 50/^g/ml. Un traitement plus precoce par
Tantimetabolite empeche l'etalement des cellules, done l'observation du comportement des divers organites cellulaires sur le vivant.
L'etude des cellules en microscopie photonique a ete realisee apres fixation
par les liquides de Champy ou de Helly, les cellules etant colorees selon la
methode de Benda au violet cristal, de Unna au vert de methyle pyronine, de
Feulgen, d'Alfert et Geschwind au vert solide a pH 8,2.
Les cellules destinees a l'etude ultrastructurale ont ete fixees au formol neutre
a 5 % dans le liquide de Sorensen pendant 12 h a 4 °C, apres quoi elles ont subi
une post-fixation osmiee. La coloration des coupes ultrafines sur treillis a ete
effectuee par l'acetate d'uranyle 2,5 % et par le citrate de plomb selon la methode
de Reynolds (1963). L'observation et les micrographies ont ete realisees sur un
microscope Hitachi HU 11 (HT 75 kV, diaphragme objectif 50 /on).
L'incorporation de precurseurs radioactifs, [3H]uridine (C.E.A. Saclayactivite specifique 20 Ci/mM; 10/tCi/ml) pour TARN; [3H]thymidine (C.E.A.
Saclay - activite specifique 20 Ci/mM; 10/tCi/ml) pour l'ADN a ete localisee
par autoradiographie en microscopie photonique a l'aide de l'emulsion L4
llford.
Des digestions enzymatiques realisees avec la RNAase et la DNAase nous
ont permis de constater que le marquage observe correspondait bien a un
marquage specifique par les precurseurs radioactifs de l'ARN ou de l'ADN et
non a un artefact (Sakai & Kihara, 1968).
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M.-T. MIQUEL ET A.-M. DUPRAT
L'action du bromure cTethidium
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RESULTATS
A. Effets cytologiques du bromure d'ethidium.
L'action du BE, quelle que soit la concentration utilisee (10, 20, 50 /*g/ml)
provoque l'apparition d'anomalies affectant divers organites cellulaires. Certaines paraissent specifiques de cette substance: modifications chromatiniennes,
alterations mitochondriales, d'autres sont egalement observees a la suite de
traitements par d'autres antimetabolites (chromomycine A3, nogalamycine,
actinomycine D, 4NQO): segregations nucleolaires, apparition d'inclusions
intranucleaires, epaississements de la membrane nucleaire.
Dans les cellules-temoins observees sur le vivant (Fig. 1), les noyaux presentent un aspect relativement homogene. Us renferment plusieurs nucleoles
fortement contrastes, arrondis ou ovoides. La membrane nucleaire apparait
reguliere avec par endroits de legers epaississements. Au niveau cytoplasmique,
les plaquettes vitellines et globules lipidiques, tres refringents, entourent le
noyau. Ces reserves n'occupent qu'une partie de la plage cytoplasmique, laissant
visible une zone hyaline peripherique dans laquelle on distingue nettement le
chondriome.
L'ultrastructure de la cellule-temoin montre dans le noyau limite par une
double membrane, une chromatine dense aux electrons repaitie de facon homogene dans le nucleoplasme. Les nucleoles presentent la structure bien connue
avec coexistence de deux zones de texture differente, l'une granulaire, l'autre
fibrillaire, souvent plus ou moins enchevetrees en reseau et laissant apparaitre
frequemment le nucleoplasme entre les mailles de ce reseau. Nous n'avons
jamais observe de zone amorphe dans ces nucleoles.
Sous l'action du BE le premier phenomene qui se manifeste dans le noyau est
la segregation du nucleole. Sur le vivant, un tel nucleole apparait constitue le
plus souvent de deux zones tres distinctes, l'une contrasted, l'autre plus claire
(Fig. 2). Cette derniere, peu importante au debut, s'accroit tandis que la zone
FIGURES 1-5
Fig. 1. Noyau de cellule-temoin (JV). Noter son aspect relativement homogene et la
presence de quatre nucleoles (w) arrondis, contrastes.
Fig. 2. Noyau de cellule traitee par le BE (10/ig/ml) pendant 24 h. Noter la presence d'un nucleole en cours de segregation (s.n) et d'inclusions intranucleaires (/./.).
La chromatine (c/;) apparatt heterogene.
Fig. 3. Noyau de cellule traitee par le BE (10/an/ml) pendant 48 h. Les inclusions
intranucleaires (/./.) apparaissent nettement, la chromatine (ch) devient moins
dense.
Fig. 4. Dans cette cellule traitee par le BE a la meme concentration que les precedentes, pendant 72 h, la chromatine (ch) semble constituer un reseau tres lache.
Fig. 5. Noyau de cellule ayant subi un traitement par le BE pendant 33 h a une
concentration de 50/tg/ml. La chromatine (ch) prend finalement un aspect granuleux et laisse encore voir des inclusions intranucleaires (/./.).
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M.-T. MIQUEL ET A.-M. DUPRAT
Vaction du bromure d'ethidium
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tres contrastee se reduit, prend une forme de croissant puis disparait. A cote
de ce schema typique de segregation des constituants nucleolaires, nous avons
observe des nucleoles presentant une segregation differente, deux ou plusieurs
poles contrasted coiffant la zone claire. Dans tous les cas, le terme final de la
segregation est un nucleole homogene de dimensions reduites par rapport au
nucleole normal. Nous avons essaye par des tests cytochimiques de determiner
la nature des differentes zones du nucleole en segregation. La coloration de
Feulgen a donne des resultats negatifs, par contre une legere pyroninophilie a
ete observee apres la coloration de Unna ainsi qu'une nette reaction positive
apres la coloration d'Alfert et Geschwind par le vert solide a pH 8,2 (mise en
evidence des proteines basiques). Dans ces deux derniers cas, il y a une coloration
plus forte au niveau de la zone contrastee du nucleole.
Les micrographies nous ont revele les figures classiques des nucleoles en segregation constitues d'une zone granulaire et d'une zone fibrillaire nettement individualisees, le nucleole residuel ayant en fin devolution un aspect finement
fibrillaire (Fig. 6). 11 semble que cette partie fibrillaire corresponde a la zone qui
apparait peu contrastee en contraste de phase et tres legerement pyroninophile,
zone qui seule persiste en fin de segregation. Nous avons egalement retrouve en
microscopie electronique, des segregations nucleolaires presentant une zone
fibrillaire flanquee de deux zones granulaires.
Lorsque la segregation nucleolaire est amorcee, des inclusions intranucleaires
s'individualisent sur le vivant 6 a 10 h apres le debut du traitement (Fig. 3); ces
inclusions petites et sombres persistent sous cet aspect pendant toute la vie de
la cellule, soit 10 a 15 jours environ. Ces inclusions intranucleaires presentent
les memes caracteristiques cytochimiques que le nucleole segrege, elles sont
Feulgen-negatives mais sont colorees tres legerement par la pyronine et par le
vert solide. Leur ultrastructure granulo-fibrillaire (Fig. 6) permet de les distinguer des nucleoles en fin de segregation, distinction impossible a faire en
microscopie optique.
Le reste du noyau, dans son ensemble, subit des modifications tres particulieres qui, comme celles precedemment decrites, peuvent etre observees quelle
que soit la concentration utilisee et la duree du traitement.
Des le debut, la chromatine apparait dense en contraste de phase, tres vite
elle forme un reseau compact irregulier occupant la majeure partie du noyau.
Par la suite ce reseau devient plus lache, puis diffus et finalement l'interieur du
noyau apparait uniformement granuleux (Figs. 4, 5). Cet aspect final tres
FIGURES 6, 7
Fig. 6. Micrographies de noyaux de cellules traitees par le BE (20 /*g/ml) pendant
48 h. La chromatine (ch) est tres apparente. Observer la difference de texture de
Tinclusion intranucleaire. (/./.) et du nucleole (/?) en fin de segregation.
Fig. 7. Autre stade de 1'evolution du noyau au cours de traitement par le BE, la
chromatine (ch) apparait plus lache; noter la presence d'une inclusion intranucleaire (/./.).
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M.-T. MIQUEL ET A.-M. D U P R A T
10
FIGURES 8-11
Fig. 8. Cellule-temoin montrant dans son cytoplasme de nombreuses niitochondries
(mi.).
Fig. 9. Cellules traitees par le BE (10/*g/ml) pendant 45 h. Les niitochondries (/;//.)
apparaissent arrondies et gonflees.
Fig. 10. Micrographie d'une cellule-temoin. Les mitochondries (mi.) presentent
une double membrane nette et de nombreuses cretes internes.
Fig. 11. Micrographie d'une cellule traitee par le BE (10/<g/ml) pendant 45 h. Les
mitochondries (mi.) apparaissent gonflees, leur membrane interne est absente par
endroits, les cretes mitochondriales sont tres peu nombreuses et en mauvais etat.
Noter l'abondance de polysomes (ps.) en forme de spirale.
Vaction du bromure d'ethidium
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caracteristique du noyau des cellules traitees par le BE persiste jusqu'a la mort
des cellules, soit une dizaine de jours en moyenne.
La microscopie electronique nous a permis de suivre les differentes etapes de
revolution chromatinienne qui correspondent a celles observees sur le vivant
(Figs. 6, 7). L'etude ultrastructurale a egalement confirme, au debut du traitement, la presence d'epaississements de la membrane nucleaire, constitues
d'amas de chromatine.
Dans le cytoplasme, les efTets les plus marquants affectent le chondriome qui
sous Faction du BE se modifie immediatement et de fac.on constante. Alors que
les cellules-temoins renferment principalement des elements en batonnets
(chondriocontes) (Fig. 8), les mitochondries des cellules traitees paraissent
dilatees et presentent souvent des figures de cavulation (Fig. 9). Les alterations
mitochondriales ainsi obervees, sont differentes de celles obtenues par traitement avec la chromomycine A3 ou avec la nogalamycine qui entrainent simplement une elongation plus ou moins importante du chondriome.
La microscopie electronique a aussi permis de deceler de profondes modifications des mitochondries dans les cellules traitees par le BE; tandis que les
mitochondries des cellules-temoins presentent des cretes assez nombreuses et
regulieres (Fig. 10), les mitochondries des cellules traitees apparaissent gonflees
et partiellement ou totalement depourvues de cretes (Fig. 11).
Cet antimetabolite provoque enfin un ralentissement tres marque de l'utilisation des reserves vitellines. A la fin de la vie des cellules en culture (15 jours
approximativement) les cellules-temoins ont utilise la presque totalite de leurs
reserves vitellines tandis que les cellules ayant subi Faction du BE possedent une
quantite importante de plaquettes vitellines.
B. Reversibilite des phenomenes observes
Pour realiser ces experiences, nous avons utilise trois lots de cellules; les unes
sont maintenues dans le milieu de Barth normal, un second lot de cellulestemoins a ete place en permanence dans le milieu traitant, tandis que les cellules
du troisieme lot ont ete replacees dans le milieu de Barth normal, apres des
traitements de duree variable: 15, 30, 60 min et 24 h avec une concentration en
BEde 10/fg/mI.
(a) Traitements de 24 h
Les cultures traitees pendant 24 h ne presentent pas de reversibilite des
anomalies apparues, notamment des segregations nucleolaires. Nous avons
cependant observe dans quelques cas une amorce de reconstitution d'un nucleole
normal 3 ou 4 jours apres la fin du traitement. II est a noter que ces rares tentatives de reconstitution nucleolaire, n'aboutissent jamais a un nucleole parfaitement constitue. D'autre part elles apparaissent toujours dans des cellules
groupees ou localisees a proximite d'un explant.
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(b) Traitements de 15, 30 et 60 min
Nous rappellerons que les alterations cytologiques ne se manifestent en
presence de BE que plusieurs heures apres le debut du traitement. Dans les
cellules traitees pendant des durees tres courtes (15, 30, 60 mm) les anomalies
cytologiques precitees apparaissent bien que les cellules soient deja replacees en
milieu normal: cependant le delai de leur formation est plus long que lorsque
les cellules sont constamment maintenues en presence de l'antimetabolite. Par
la suite, la segregation nucleolaire n'atteint pas le stade final de son evolution
tel que nous l'avons decrit dans le paragraphe precedent. Certains nucleoles
morphologiquement alteres persistent sous cette forme segregee, alors que
d'autres tendent a reprendre un aspect normal: dans ce cas, ils passent par une
phase de vacuolisation importante.
Dans toutes les series experimentales realisees, nous avons observe l'apparition puis la persistance des inclusions intra-nucleaires, meme si par la suite les
nucleoles tendent a se reconstituer.
II est a noter que dans le cas ou il y a une restauration des constituants nucleolaires, cette derniere s'accompagne d'une reversibilite de faction du produit
sur le chondriome.
C. Etude de Vaction du BE sur la differentiation cellulaire
Nous rappellerons brievement les differents types de cellules obtenus en
culture:
-cellules de type conjonctif ou epithelial, de forme reguliere et arrondie,
certaines d'entre elles etant ciliees.
- cellules de type fibroblastique ayant un contour un peu plus decoupe et
une plage cytoplasmique plus etroite.
- melanophores, les unes de forme etoilee, a cytoplasme tres decoupe, les
autres a cytoplasme elargi tres riches en melanine.
- neurones dont le corps cellulaire reste arrondi, emettant un ou plusieurs
prolongements cytoplasmiques termines par des arborescences caracteristiques
(les axones apparaissent 5 jours environ apres la mise en culture des cellules).
- myoblastes generalement fusiformes, qui presentent une striation paranucleaire 5 a 6 jours apres la mise en culture, striation s'etendant par la suite
jusqu'aux extremites de la cellule.
Dans nos observations, nous nous sommes limites a l'etude de types cellulaires
presentant une difTerenciation morphologique tres caracteristique et done
aisement identifiables. L'apparition dans les cellules de certains constituants
particuliers (axones, myofibrilles striees), 5 a 6 jours apres la mise en culture,
permet d'effectuer les traitements de fa?on sure soit avant l'apparition de toute
differenciation morphologique, soit au cours de cette difTerenciation.
Vaction du bromure d'ethidium
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(a) Traitements par le BE avant V apparition de toute differencial ion morphologique
Nous n'avons jamais observe, a la suite de ces traitements, Papparition de
prolongements axoniques a partir des cellules nerveuses. De meme dans les
myoblastes traites, excepte pour une seule serie experimentale, il n'y a pas eu
apparition de myofibrilles striees.
(b) Traitement des cellules en cows de differenciation morphologique
Alors que dans les cultures-temoins, les axones continuent a proliferer, leur
croissanee est inhibee dans les cellules traiteespar le BE. Par la suite ils presentent une cytolyse de leur partie terminate, se courbent et degenerent. Environ
48 a 72 h apres le debut du traitement, l'ensemble des cellules nerveuses se
retractent et degenerent. Les cellules musculaires en cours de differenciation
presentent egalement des signes de degenerescence a la suite de traitements, elles
survivent cependant plus longtemps que les cellules nerveuses (6 a 7 jours).
(c) Reversibilite de Vinhibition de la differenciation morphologique des cellules
Dans des series experimentales complementaires, nous avons etudie le devenir
des cellules replacees apres traitement dans un milieu de culture normal. Ainsi
done, apres avoir subi des traitements de durees variables (15, 30, 60 min et 24 h)
les cellules ont ete replacees dans du milieu de Barth normal.
Alors que les myoblastes maintenus dans le milieu traitant ne presentent
generalement pas de differenciation morphologique, les myoblastes replaces
dans le milieu de culture normal apres 15, 30 et 60 min de traitement presentent
une striation tout a fait normale. Dans ce cas, Papparition de la striation dans
les myoblastes traites puis replaces en milieu normal et dans les myoblastes
temoins, se deroule de facon quasi simultanee.
Pour ce qui est des neurones, ces derniers paraissent etre definitivement
inhibes, quelle que soit la duree du traitement.
Par contre, les myoblastes traites pendant 24 h n'ont jamais presente de striation par la suite.
Dans tous les cas, qu'il s'agisse de traitements de courtes durees (15, 30,
60 min) ou de traitements plus longs (24 h), les anomalies nucleaires caracteristiques de Paction de ce produit sur les cellules se sont toujours manifestoes.
D. Observations autoradiographiques sur le metabolisme des acides nucleiques
L'action du BE sur le metabolisme du RNA a ete etudiee apres traitements
de 3, 6, 10 et 24 h prealablement a Pincorporation de [3H]uridine- (10/«Ci/ml
pendant 1 h), toujours en presence de Pantimetabolite.
Des durees de traitement relativement courtes (3 et 6 h) n'entrainent pas une
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M.-T. MIQUEL ET A.-M. DUPRAT
inhibition totale de 1'incorporation de [3H]uridine dans les noyaux, bien qu'il
y ait une baisse sensible du marquage des noyaux traites par rapport aux noyaux
temoins.
Des traitements de 10 et 24 h ont entraine une inhibition totale du marquage
des cellules traitees.
L'incorporation de [3H]thymidine realisee dans les memes conditions experimentales que celle de [3H]uridine (pretraitement de 24 h precedant l'incorporation du precurseur radioactif) a revele un marquage nucleaire similaire dans les
cellules traitees et les cellules-temoins. Rappelons que des tests enzymatiques
(RNase, DNase) ont ete effectues afin de verifier la speciflcite du marquage
observe.
DISCUSSION
La plupart des travaux realises jusqu'a ce jour avec le BE ont permis de deceler
une action preponderate de cette substance sur certaines organelles cytoplasmiques: kinetoplaste, chondriome.
Peu d'auteurs dans l'ensemble ont decrit son effet sur les constituants
nucleaires.
Nos experiences et les observations qui en decoulent donnent une vue d'ensemble des effets du BE sur les constituants cellulaires, tant nucleaires que cytoplasmiques et sur la differentiation morphologique de ces cellules. Ces resultats
sont completes par un apercu sur la reversibilite des phenomenes observes.
Du point de vue morphologique, la segregation nucleolaire correspond a un
phenomene connu et deja decrit par de nombreux auteurs dans des cellules
soumises a l'action de divers antibiotiques (Schoefl, 1964; Duprat et ah 1965,
1967; Simard & Bernhard, 1966), de substances chimiques hepatocancerogenes
(Reddy & Svoboda, 1968), de mycoplasmas (Jezequel, Shreeve & Steiner,
1967): d'agents physiques tels que les rayonnements u.v. (Montgomery, Reynolds & McClendom, 1966).
II semble que ce phenomene soit etroitement lie a l'action de ces divers agents
sur les acides nucleiques.
En ce qui concerne les inclusions intranucleaires apparues sous l'action du
BE, une etude in vivo nous a permis de suivre leur evolution et de constater que
ce phenomene est irreversible; l'etude cytochimique nous a revele leur nature
ribonucleoproteique et l'etude ultrastructurale leur texture granulo-fibrillaire.
Dans l'etat actuel de nos travaux, nous ne pouvons qu'emettre des hypotheses
quant a leur origine. Apres avoir introduit simultanement dans le milieu de
culture, de la puromycine a une concentration suffisante (0,5 /ig/ml) pour inhiber
totalement les syntheses proteiques, et le BE a la concentration utilisee pour
faire apparaitre les anomalies nucleaires, nous avons constate que malgre la
presence de puromycine, les inclusions intranucleaires sont apparues
normalement.
D'autre part, nous n'avons jamais observe de marquage preferentiel des
Vaction du bromure d'ethidium
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inclusions apres incorporation de lysine ou de leucine tritiees, ni apres incorporation d'uridine tritiee.
II semblerait done que l'apparition de ces anomalies ne soit pas directement
liee a des syntheses de proteines ou d'acides nucleiques mais provienne plutot
du remaniement d'un materiel deja present dans la cellule. Une etude au
microscope electronique destinee a montrer l'origine exacte de ces inclusions
intranucleaires et a mieux connaitre leur mode de formation est actuellement
en cours a l'aide de substances a effets plus specifiques a cet egard.
Le BE provoque egalement l'apparition sur notre materiel d'autres anomalies
qui lui sont plus specifiques, notamment des modifications de l'aspect de la
chromatine, jamais encore decrites a notre connaissance.
Malgre ces remaniements importants de la chromatine, les syntheses d'ADN
ne paraissent pas etre inhibees par l'action du BE puisque Incorporation de
thymidine tritiee est comparable dans les noyaux des cellules-temoins et des
cellules traitees. Ce marquage n'apparait pas apres digestion prealable par la
DNase.
Des resultats apparemment contradictories ont ete obtenus a ce sujet par
differents auteurs; e'est ainsi que des fibroblastes de souris et des cellules renales
de hamster continuent a incorporer de la thymidine tritiee dans leur ADN
nucleaire, au cours de traitements par le BE, cette incorporation etant meme
accentuee par rapport a celle observee dans les cellules-temoins (Nass 1972).
De meme des ceufs d'oursins soumis a l'action du BE presentent des clivages
normaux, ce qui implique la presence de syntheses d'ADN et le deroulement
normal des mitoses (Craig & Piatigorsky, 1971), tandis que Vacquier & Brachet
(1969) ont observe une inhibition des syntheses d'ADN dans des embryons
d'oursins, ainsi qu'une inhibition du clivage des ceufs avec des concentrations
relativement elevees, ce qui peut provenir d'une inhibition des syntheses d'ADN.
Mais Six & Brachet (1971) ont cependant montre que le BE 'ne semble pas
provoquer d'inhibition mesurable de la synthese nette d'ADN' au cours du
developpement des ceufs de Pleurodeles traites.
Dans notre cas, les syntheses d'ADN continuant a se derouler en presence
de BE dans le milieu de culture, il semblerait que l'ADN-polymerase continue
a jouer son role malgre la presence de l'antibiotique, puisque les profondes
modifications chromatiniennes et autres qui apparaissent au niveau du noyau,
laissent bien supposer que le BE penetre effectivement dans ces noyaux-la.
Alors que Six & Brachet (1971) n'ont pas constate d'inhibition des syntheses
d'ARN dans les embryons entiers de Pleurodeles traites au BE, nous avons par
contre observe une inhibition de l'incorporation d'uridine 3 H dans l'ARN des
cellules embryonnaires en culture. Ce resultat contradictoire pourrait etre du
aux conditions differentes des deux types d'experiences.
II est possible que la penetration du BE dans les germes entiers, reelle d'apres
les controles par fluorescence executes par les auteurs beiges, ait ete finalement
moins importante que dans le cas des cellules isolees de nos cultures. II est
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egalement possible que, dans un embryon entier, les cellules associees a un systeme integre normal, presentent des capacites regulatives leur permettant de
resister aux effets du BE, capacites qu'elles perdraient lorsqu'elles ne sont plus
associees en un systeme pluricellulaire coherent.
Nous n'insisterons pas ici sur les effets du BE sur le chondriome, de nombreux travaux ayant deja traite de ce sujet. Les modifications morphologiques
observees pourraient s'expliquer par Faction de cet antimetabolite sur l'ADN
mitochondrial qui est tres sensible a cette substance.
Nous pouvons aussi souligner un net retard de l'utilisation des reserves
vitellines. A ce sujet plusieurs hypotheses ont pu etre emises; ce retard pourrait
s'expliquer, soit par une deficience energetique qui provoquerait un ralentissement marque de l'utilisation de ces reserves, soit par l'action du BE sur un
eventuel ADN vitellin (Brachet, 1968). Ce ne sont la que des hypotheses nos
travaux ne nous permettent pas d'infirmer ni de confirmer les resultats obtenus
par Six & Brachet (1971) qui attribuent ce phenomene a l'absence ou l'inactivite
d'une enzyme proteolytique normalement presente dans le vitellus et qui se
trouverait sous le controle du noyau.
Comme nous l'avons signale, les inclusions intranucleaires persistent meme
si, apres traitement, les cellules sont replacees en milieu normal et ceci quelle
que soit la duree du traitement. Les nucleoles segreges ont tendance a se reconstituer a la suite de traitements de courtes durees (15, 30, 60min) mais persistent a l'etat segrege apres des durees de traitement superieures a 1 h. Dans le
cas ou les nucleoles tendent a se reconstituer, on observe aussi une reversibilite
de l'action du produit sur le chondriome. Ces observations morphologiques
sont peut-etre a rapprocher des observations biochimiques et biophysiques de
Naum & Pious (1971) qui ont note une inhibition reversible de l'accumulation
de cytochrome oxydase dans des cellules humaines apres action du BE. Elles
permettraient de supposer qu'il y a un rapport entre les alterations structurales
et fonctionnelles que subissent les mitochondries lors du traitement.
Pour ce qui est de l'action du BE sur la differenciation morphologique des
cellules cultivees, il nous parait interessant de comparer les effets de cette substance avec ceux des divers autres inhibiteurs des syntheses d'ARN: actinomycine D, chromomycine A3, nogalamycine.
Tandis que le BE inhibe generalement la differenciation morphologique des
neuroblastes et des myoblastes lorsqu'il est administre avant l'apparition de
toute differenciation, les autres antibiotiques utilises dans les memes conditions
n'inhibent pas la differenciation morphologique des myoblastes qui presentent
par la suite une striation tout a fait normale.
Nous avons constate dans ces myoblastes traites et normalement differencies
que les syntheses proteiques ont lieu bien que les syntheses d'ARN soient
bloquees depuis plusieurs jours. D'autre part des travaux complementaires nous
ont permis de constater que les myoblastes morphologiquement indifferencies
au debut du traitement, ne contenaient pas encore de myosine (Romanovsky
Vaction du bromure d'ethidiwn
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& Duprat, resultats non publies). Ce seratent done des ARN messagers de longue
duree qui dirigeraient la differentiation de ces cellules en permettant les syntheses de novo impliquees dans ces phenomenes.
Le fait que la striation myofibrillaire n'apparaisse que rarement apres traitement par le BE ne sufiit pas a exclure la presence d'ARN messager de longue
duree dans les myoblastes: il est probable qu'il s'agisse dans ce cas d'une action
indirecte et que la deficience energetique entrainee par l'action du BE empeche
le deroulement normal des processus de la differentiation, bien que les elements
necessaires a cette differentiation soient presents dans la cellule.
Ces phenomenes d'inhibition de la differentiation morphologique des myoblastes sont reversibles apres des traitements de courte duree, mais totalement
irreversibles a la suite de traitements superieurs a 24 h. Ces constatations sont
a rapprocher de celles faites a propos du chondriome dans les memes conditions
et appuieront notre hypothese d'un effet secondaire de Faction du BE sur la
differentiation des myoblastes.
En conclusion, les effets du BE sur les cellules embryonnaires en culture in
vitro presentent de nombreux points communs avec ceux observes a la suite des
traitements par l'actinomycine D, la chromomycine A3 et la nogalamycine.
Les differences les plus notables entre les effets du BE et ceux provoques par
ces autres antimetabolites concernent les modifications chromatiniennes particulieres, jamais observees a la suite d'autres traitements, les modifications
mitochondriales qui apparaissent beaucoup plus marquees dans le cas du BE,
Pinhibition tres poussee de l'utilisation des reserves vitellines et enfin l'inhibition
de la differentiation des myoblastes, jamais observee avec l'actinomycine D, la
chromomycine A3 et la nogalamycine.
II est possible que les modifications concernant le chondriome, l'utilisation
du vitellus aussi bien que l'absence de differentiation morphologique des
myoblastes soient dues a l'action du BE sur 1'ADN cytoplasmique, mitochondrial en particulier.
RESUME
Le bromure d'ethidium provoque des modifications nucleaires constantes et
caracteristiques dans les cellules embryonnaires de Pleurodeles waltlii cultivees
in vitro.
II s'agit:
(a) Du phenomene de segregation nucleolaire, qui correspond a un remaniement des constituants ribonucleiques (particules granulaires et fibrillaires) presents dans le nucleole; ce phenomene etant reversible a la suite de traitements
de courte duree, jusqu'a 12 h, et irreversible a la suite de traitements de 24 h et
plus.
(b) De l'apparition d'inclusions intranucleaires de nature ribonucleoproteique, irreversible quelle que soit la duree du traitement.
(c) D'importantes modifications chromatiniennes.
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Au niveau cytoplasmique, apparaissent des modifications mitochondriales,
ainsi qu'une inhibition de l'utilisation des plaquettes vitellines.
Par ailleurs, le bromure d'ethidium inhibe generalement la differentiation
des myoblastes et des neuroblastes, cette inhibition etant reversible, dans le
cas des myoblastes seulement, apres un traitement de courte duree.
La synthese de l'ADN chromosomique, controlee par l'incorporation de
thymidine tritiee, ne semble pas affectee par l'action du bromure d'ethidium,
tandis que l'incorporation d'uridine tritiee dans les ARN est totalement
inhibee a la suite de traitements de 24 h et plus.
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