J. Embryo!, c.xp. Morph. Vol. 29, 2, pp. 383-396, 1973
Printed in Great Britain
383
Developpement des organes tymphoides
chez FAmphibien Urodele Triturus alpestris Laur.;
tolerance des allogreffes apres la thymectomie
larvaire
Par ANNICK TOURNEFIER1
Laboratoire de Biologie animate 2, Universite Paris 6
(Directeur, Professeur Ch. Houillon)
SUMMARY
The development of lymphoid organs in the urodele amphibian Triturus
alpestris Laur.; skin allograft tolerance after larval thymectomy
The first part of this work is an attempt to extend anatomical knowledge of lymphoid
organ differentiation: thymus, spleen and liver in Triturus alpestris Laur.
The purpose of the second part is to compare afirst-setallograft reaction in normal adult
newts (100% rejection) and the allograft reaction of larval-thymectomized adult newts.
Thymectomy was performed on 39 newts in the tenth week of their life at a known stage of
their splenic and thymic differentiation. These thymectomized newts were grafted 18 months
later with two different adult skin grafts. A daily observation of the 78 grafts showed that
larval thymectomy induced 72 % of tolerance.
However, 11 newts rejected their grafts in the same way as normal adult newts, but with a
longer median survival time (36 days instead of 23 or 27 days). Infiveof these newts, dissection
showed one or two functional thymic nodules and the allograft rejection was due to an incomplete larval thymectomy.
In the six other newts, one thymic nodule was found, so the rejection was probably because
the thymectomy was too late. Triturus alpestris Laur., like other urodeles, has no bonemarrow, and splenic lymphocytes are probably, for the most part, of thymic origin.
Lymphocytes first appear in the spleen during ths ninth week of larval life. Tf thymectomy
is performed at the end of the tenth week, splenic differentiation is completed and the spleen
may substitute for thymus function in allograft rejection.
INTRODUCTION
Depuis les premieres thymectomies neonatales realisees chez la souris (Miller,
1961), rimportance du thymus sur le devenir des allogreffes est bien connue
chez les Mammiferes.
Chez les Amphibiens Anoures, Pablation du thymus des jeunes larves provoque
rapparition de la maladie des avortons (wasting disease) (Du Pasquier, 1968),
1
Aclresse de Vauteur: Universite Paris 6, Laboratoire de Biologie animale 2, 12 rue Cuvier,
75005, Paris, France.
25-2
384
A. TOURNEFIER
Tableau 1. Evolution des allogreffes chez Triturus alpestris Laur.
Etapes
1
2
3
4
Definition de chaque etape
Infiltration erythrocytaire
Etablissement de la circulation
Arret de la circulation
Disparition du greffon
Temps moyens en jours
3
10
27*
54
* Temps moyen de survie.
et la survie prolongee des allogreffes (Cooper, Hildemann & Pinkerton, 1963;
Du Pasquier, 1965).
Chez les Amphibiens Urodeles, Pinfluence de la thymectomie sur le rejet des
allogreffes et sur l'apparition de la maladie des avortons est moins bien connue.
La thymectomie larvaire realisee au stade 50-52 chez Pleurodeles waltlii
Michah. entraine dans 10 a 15 % des cas une maladie des avortons vers l'age de
15 mois, soit 1 an apres la metamorphose. L'evolution de la maladie est tres lente
et les femelles semblent plus atteintes que les males (Charlemagne & Houillon,
1968). De plus, la tolerance naturelle aux allogreffes qui est de 25%, passe
apres la thymectomie larvaire a un taux de 90 % (Tournefier, Charlemagne &
Houillon, 1969). Mais il est difficile, en raison de la consanguinite de ces
animaux eleves depuis de nombreuses generations au Laboratoire, de savoir
avec certitude, pour un greffon donne, si la tolerance obtenue est naturelle ou
due a la thymectomie.
Dans une autre espece d'Urodele, Triturus alpestris Laur., en provenance
directe de mares naturelles, les allogreffes cutanees sont rejetees dans 100% des
cas (Tournefier, Charlemagne & Houillon, 1970). L'observation quotidienne de
351 allogreffes pratiquees sur 66 Tritons adultes, a permis de definir quatre
etapes successives dans leur evolution: (1) infiltration du greffon par les
erythrocytes de l'hote, (2) etablissement d'une circulation sanguine dans le
greffon, (3) arret de la circulation dans le greffon accompagne de vasodilatation
et de l'apparition de nombreux points hemorragiques, (4) disparition du greffon
par necrose totale ou par substitution progressive des tissus du greffon par les
tissus de l'hote (Tableau 1). Le temps moyen de chaque etape correspond au
temps qui s'est ecoule depuis la greffe jusqu'au jour ou 50% des greffons
atteignent la fin de l'etape. Le critere de rejet absolu est celui de l'arret de la
circulation dans le greffon. Le temps moyen correspondant a cette etape est
done le temps moyen de survie (MST) des allogreffes chez le Triton alpestre,
soit 27 jours.
Le present travail se rapporte a revolution des allogreffes chez le Triton
alpestre adulte ayant subi la thymectomie a l'etat larvaire. Mais au prealable, il
convenait d'envisager le developpement des organes lymphoides au cours de la
vie larvaire. Au meme titre que les autres Amphibiens Urodeles, le Triton
alpestre ne possede ni moelle osseuse, ni ganglions lymphoides et le mesonephros
Developpement des organes lymphoides
385
ne presente pas, comme chez les Anoures, des foyers lymphoides (Jordan &
Speidel, 1924, 1930; Jordan, 1933; Deparis, 1968; Charlemagne, 1972). L'essentiel des organes lymphoides chez ces Yertebres inferieurs se ramene au thymus,
a la rate et au foie. L'organogenese de ces organes permettra de definir leur
etat au moment precis de la thymectomie larvaire.
MATERIEL ET METHODES
1. Conditions d'elevage
L'elevage des oeufs, des larves et des adultes se fait toujours dans l'eau
ordinaire a la temperature ambiante de 18° a 20 °C.
Les pontes, obtenues au Laboratoire, sont issues d'adultes provenant des
mares naturelles de l'Est de la France (Vosges). Les oeufs sejournent dans des
coupelles de verre jusqu'au moment de l'eclosion. Les jeunes larves sont ensuite
elevees en cuvette de matiere plastique et nourries les premiers jours de larves
d'artemies puis de tubifex ou de larves de chironomes. Apres la metamorphose,
les jeunes Tritons alpestres sont eleves en eau courante dans des aquariums et
nourris de viande hachee.
2. Histologie
Les larves issues d'une meme ponte sontfixeesau Bouin-Hollande a intervalles
reguliers d'une semaine, depuis l'eclosion jusqu'a la metamorphose. Elles sont
incluses in toto dans du Paraplast. Les coupes histologiques de 5 jum d'epaisseur
sont seriees et colorees selon la methode de Lillie, a pH 4,1 (1965).
3. Technique de la thymectomie
La thymectomie larvaire est pratiquee a l'age de 10 semaines, soit 1 a 2
semaines avant le metamorphose alors que les larves mesurent 25 a 30 mm
(Fig. 1). Apres anesthesie dans une solution de MS 222 a 0,5 %, les larves sont
deposees sur un tampon de coton humide et placees sous la loupe binoculaire.
Les deux thymus sont situes latero-dorsalement au niveau de la troisieme
paire de branchies (Fig. 2). Une petite incision entre la troisieme paire de
branchies et le flanc permet de soulever un fin volet epidermique sous lequel
chaque thymus apparait comme une masse blanchatre, le plus souvent spherique
et parfois bilobee. Accroche au plan musculaire sous-jacent par un mince repli
de tissu conjonctif qu'il faut sectionner, le thymus est ensuite preleve a l'aide de
pinces fines. Une fois le volet epidermique rabattu dans sa position initiate, la
larve est replacee dans son eau d'elevage. L'ablation pratiquee bilateralement se
fait sans hemorragie. La cicatrisation s'effectue dans les 12 a 24 h suivantes et la
mortalite post-operatoire est pratiquement nulle.
Les larves thymectomisees sont elevees dans les memes conditions que les
larves temoins et presentent un developpement ulterieur comparable.
386
A. TOURNEFIER
Developpement des organes lympho'ides
387
4. Technique de la greffe
Le prelevement et l'implantation des allogreffes cutanees se font selon la
technique de Squadroni & Wolsky (1962) deja utilisee chez le Triton alpestre
(Tournefier et al. 1970).
Les Tritons adultes donneurs et notes sont ages de 18 mois et mesurent
75 a 80 mm. Les animaux notes, temoins ou thymectomises, pesent enmoyenne
2,5 g. Chaque note rec.oit deux allogeffes provenant de deux donneurs issus de
pontes differentes afin d'eliminer tout risque de tolerance par suite de la consanguinite.
RESULTATS
1. Formation des organes lympho'ides chez le Triton a I pestre
Nos observations portent sur toute la vie larvaire, depuis le jour de Peclosion.
jusqu'a la metamorphose. C'est au cours de la 7eme semaine apres la ponte
qu'apparaissent le thymus et la rate, et c'est a partir de cet age que nous decrivons
revolution des organes lympho'ides.
7erne semaine
Les larves s'alimentent depuis 5 semaines, mesurent 10 a 12 mm et ne possedent pas encore de membres posterieurs.
Le thymus apparait comme un bourgeon issu de l'epithelium branchial au
niveau de jonction de la 2eme et de la 3eme paire de branchies (Fig. 5).
La rate n'est represented que par un bourgeonnement de l'epithelium mesenterique, situe medio-dorsalement au niveau de la region stomacale (Fig. 6).
Lefoie est un massif de cellules endodermiques encore tres riches en plaquettes
vitellines. Les erythroblastes sont nombreux, sans qu'il y ait d'apparente
erythropoiese active a ce niveau (Fig. 7).
Seme semaine
Les larves mesurent 13 a 15 mm. Les ebauches des membres posterieurs
apparaissent.
FIGURES 1 A 4
br., branchie; d., derme; ep., epiderme; ly., lymphocytes; th., thymus.
Fig. 1. Larve de Triton alpestre au moment de la thymectomie larvaire, a Page
de 10 semaines. x 4.
Fig. 2. Coupe frontale de la larve precedente au niveau de la region thymique. x 15.
Fig. 3. Coupe transversale dans un greffon en cours de rejet. L'epiderme du greffon
est hypertrophie et de nombreux lymphocytes ont envahi le derme et la couche
musculaire sous-jacente. x 35.
Fig. 4. Coupe transversale dans un greffon porte par un Triton alpestre thymectomise.
La tolerance est parfaite, epiderme et derme sont normalement developpes, il n'y
a pas de lymphocytes au niveau du greffon. x 35.
388
A. TOURNEFIER
Developpement des organes lympho'ides
389
Le thymus se detache de l'epithelium branchial originel. Chaque bourgeon
thymique est forme de 5 a 10 cellules epitheliales a gros noyau et abondant
cytoplasme clair (Fig. 8).
La rate forme un petit massif cellulaire allonge dans la cavite generale audessus de Tintestin. Les cellules spleniques dont le cytoplasme constitue un
reseau lache, sans limites bien definies, possedent un noyau clair et ovoide. Les
erythroblastes a noyau arrondi et granuleux sont encore tres rares dans cette
ebauche de pulpe splenique (Fig. 9).
Dans lefoie entoure d'une mince capsule conjonctive continue, apparaissent
les sinusoides et les fibres reticulaires. Les cellules hepatiques sont desormais
debarassees de leurs plaquettes vitellines (Fig. 10).
9eme semaine
Les larves mesurent 18 a 20 mm; les membres posterieurs coudes possedent
Tebauche des deux premiers doigts.
Chaque thymus formant un massif bien individualise, migre en position dorsale
par rapport a la region branchiate initiate. Parmi les cellules epitheliales apparaissent quelques cellules a cytoplasme reduit et noyau colore et compact. Ces
dernieres representent les premiers lymphoblastes souvent en cours de division
(Fig. 11).
La rate s'est considerablement accrue et s'entoure d'une capsule conjonctive.
La pulpe splenique est envahie par tous les elements de la lignee erythrocytaire
souvent en mitose. La rate constitue des lors l'organe essentiel de Perythropoiese
(Fig. 12).
Lefoie presente sur sa face externe des petits massifs irreguliers de promyelocytes et de myelocytes qui ne forment pas encore une couche granulocytaire
continue. Les seuls erythrocytes visibles sont situes dans les capillaires hepatiques
(Fig. 13).
FIGURES 5 A 10
Aspect histologique des organes lymphoides au cours de la 7emeet de la 8eme semaine.
b.s., bourgeon splenique; br., branchie; c.ep., cellule epitheliale; c.e., cellule
endodermique; ep.b., epithelium branchial; ep.m., epithelium mesenterique; er.,
erythroblaste;/.r., fibres reticulaires; p.s., pulpe splenique;/?.v., plaquettes vitellines;
s., sinusoides.
Fig. 5. Isolement du thymus a partir de l'epithelium branchial, x 700.
Fig. 6. Formation de la rate a partir de l'epithelium mesenterique. x 400.
Fig. 7. Cellules endodermiques hepatiques riches en plaquettes vitellines. x 1200.
Fig. 8. Cellules epitheliales formant le thymus desormais detache de l'epithelium
branchial, x 700.
Fig. 9. Bourgeon splenique dans la cavite generale. x 320.
Fig. 10. Cellules endodermiques du foie. x 1200.
390
A. TOURNEFIER
Developpement des organes lymphoides
391
lOeme semaine
Les larves mesurent 25 a 30 mm. Elles possedent des membres posterieurs
longs, coudes, avec quatre doigts bien formes. II faut noter que la thymectomie
dont il sera question ulterieurement, est pratiquee a la fin de cette lOeme semaine.
Chaque thymus est maintenant en position dorsale au niveau de la troisieme
paire de branchies. L'organe a beaucoup augmente de volume par rapport au
stade precedent. II n'est pas possible de definir, comme chez les Mammiferes,
une zone corticale et une zone medullaire. On distingue pourtant parmi de
tres nombreuses cellules a Failure classique de lymphocytes (noyau rond tres
colore entoure d'un mince lisere cytoplasmique) des grands massifs clairs formes
de cellules epitheliales (noyau irregulier et cytoplasme abondant). La partie
dense, lymphocytaire, du thymus de Triton alpestre pourrait correspondre au
cortex des Mammiferes et les massifs clairs, epitheliaux a la medulla (Fig. 14).
La rate d'une larve agee de 10 semaines a deja l'aspect histologique definitif
de Torgane adulte avec une pulpe rouge et une pulpe blanche (Fig. 15). La
pulpe rouge dispersee dans tout l'organe, presente un aspect lache et correspond
a la partie erythropoietique de la rate. La pulpe blanche correspond aux amas
lymphocytaires tres denses groupes autour des arteres spleniques.
Lefoie possede un couche granulocytaire continue sous sa capsule conjonctive.
Elle est constitute de deux ou trois assises de myelocytes et de granulocytes
(Fig. 16).
Metamorphose et stade adulte
La metamorphose du Triton alpestre intervient vers Page de 11 a 12 semaines.
Les animaux mesurent alors 35 a 40 mm. Les organes lymphoides deja bien
difTerencies a Tage de 10 semaines ne subissent aucun changement histologique
important.
Chez Tanimal adulte:
Le thymus s'allonge et se trouve situe immediatement sous la peau entre les
muscles et le derme dans la region dorsale et posterieure de la tete. II diminue
FIGURES 11 A 16
Aspect histologique des organes lymphoides au cours de la 9eme et de la lOeme
semaine. c.ep., cellule epitheliale; e.g., couche granulocytaire; ly., lymphoblaste;
m.ep., massif epithelial; m.ly., massif lymphocytaire; p.b., pulpe blanche; p.r., pulpe
rouge; pr., promyelocyte; p.s., pulpe splenique.
Fig. 11. Bourgeon thymique avec lymphoblaste en mitose. x 750.
Fig. 12. Rate avec pulpe splenique riche en cellules erythrocytaires. x 320.
Fig. 13. Foie: les promyelocytes apparaissent sous la capsule conjonctive. x 400.
Fig. 14. Thymus: massifs epitheliaux et lymphocytaires. x 750.
Fig. 15. Rate: pulpe rouge et pulpe blanche, x 300.
Fig. 16. Foie: la couche granulocytaire est epaisse et continue, x 400.
392
A. TOURNEFIER
tp.
p.s.
Developpement des organes lymphoides
393
de volume et peut montrer a l'age de deux ou trois ans quelques foyers de
degenerescence musculaire parmi les lymphocytes toujours nombreux (Fig. 17).
La rate augmente encore de volume apres la metamorphose, lapulpe splenique
blanche et rouge est tres riche en cellules (Fig. 18).
Le foie presente sous une couche granulocytaire epaisse de nombreuses
cellules pigmentaires (Fig. 19).
2. Evolution des allogreffes chez le Triton alpestre thymectomise
L'evolution des allogreffes de peau se rapporte a une serie experimentale de
52 Tritons alpestres ages de 18 mois et repartis en deux lots: 13 Tritons temoins,
39 Tritons thymectomises a l'age de 10 semaines. L'observation quotidienne
porte sur 26 allogreffes placees sur les temoins, 78 allogreffes placees sur les
Tritons thymectomises. Les differentes etapes evolutives de ces 104 allogreffes
sont resumees dans le Tableau 2.
Chez les Tritons temoins porteurs des 26 allogreffes, on retrouve revolution
classique en quatre etapes d'une premiere greffe. En particulier, le temps moyen
de survie (MST) de 23 jours est comparable a celui de 27 jours precedemment
signale. Aucun cas de tolerance n'a ete observe, le rejet affecte 100% des
greffons chez les animaux temoins (Fig. 3).
L'observation quotidienne des 39 Tritons thymectomises durant leur vie
larvaire soit 15 a 16 mois plus tot, montre deux types d'individus: 28 Tritons
tolerent indefiniment leurs deux greffons (56 allogreffes tolerees); 11 Tritons
rejettent leurs deux greffons (22 allogreffes rejetees). Dans les cas de tolerance,
la vascularisation des greffons s'etablit dans les delais habituels, mais de plus, la
circulation demeure reguliere et aucun signe de rejet, vasodilatation des capillaires ou arret de la circulation, ne sera ensuite observe. Les greffons garden! en
outre leur pigmentation orangee et sont encore bien reperables deux ans apres
la greffe (Fig. 4).
Dans les cas de rejet, malgre la thymectomie, 1'evolution qualitative est la
meme que chez les animaux temoins. Cependant, le temps moyen de survie
augmente sensiblement, il passe de 23 a 36 jours; de meme, le rejet definitif
intervient plus tard. L'observation histologique des 11 Tritons non tolerants
apres la thymectomie larvaire revele pour 5 d'entre eux, la presence unilaterale
FIGURES 17 A 19
Aspect histologique des organes lymphoides chez Padulte.
e.g., couche granulocytaire; c.p., cellule pigmentaire; d., derme; ep., epiderme;
p.s., pulpe splenique; //;., thymus.
Fig. 17. Thymus allonge entre le derme et la couche musculaire. x 150.
Fig. 18. Rate: pulpe splenique tres riche en cellules lymphocytaires et erythrocytaires.
x 300.
Fig. 19. Foie: couche granulocytaire epaisse, cellules hepatiques et pigmentaires.
x 300.
394
A. TOURNEFIER
Tableau 2. Evolution des allogreffes chez les Tritons temoins et
thymectomises
Temps moyens en jours
r
Thymectomises
r
Etapes
1
2
3
4
Definition de chaque etape
Temoins
rejet 100%
Rejet
28%
Tolerance
72%
4
10
23*
52
4
14
36*
69
4
14
Infiltration erythrocytaire
Etablissement de la circulation
Arret de la circulation
Disparition du greffon
* Temps moyen de survie.
d'un petit nodule thymique attestant d'une ablation incomplete de l'organe. Pour
les 6 autres Tritons, en depit du rejet des allogreffes, l'etude histologique n'a
revele aucun element thymique, au meme titre que chez les 28 individus tolerants.
DISCUSSION
L'etude ontogenique des organes lymphoides du Triton alpestre a permis de
mettre en evidence l'apparition tres tardive du thymus au cours de la 7eme
semaine et la differentiation encore plus tardive des lymphocytes thymiques au
cours de la 9eme semaine de la vie larvaire.
La thymectomie ne provoque pas chez le Triton alpestre l'apparition de la
maladie des avortons (wasting disease). Les larves thymectomisees se developpent normalement, la taille et le poids des adultes sont semblables a ceux des
temoins. Les adultes thymectomises possedent un foie normal, leur rate est
legerement plus petite en volume.
Le rejet des allogreffes par le Triton alpestre, adulte, non thymectomi.se, dans
des delais assez courts de 23 a 27 jours, confirme les observations faites chez les
autres Urodeles tels que le Pleurodele (Tournefier et al. 1969), l'Axolotl (Meier
& Delanney, 1962) et Triturus viridescens (Horowitz, 1937; Pizzarello &
Wolsky, 1960; Erickson, 1962; Squadroni & Wolsky, 1962; Cohen, 1966a, b,
1968).
D'autre part, comme chez les Vertebres superieurs apres thymectomie
neonatale, la thymectomie larvaire chez le Triton alpestre, le Pleurodele
(Charlemagne & Houillon, 1968), et l'Axolotl (Cohen, 1969-70) entraine chez
l'adulte une tolerance definitive aux allogreffes. Ceci souligne les similitudes
des reactions immunitaires de transplantation entre Vertebres superieurs et
Amphibiens Urodeles, et le role determinant du thymus dans ces reactions.
Chez les Anoures, le role du thymus dans 1'immunite de transplantation ne
semble pas aussi clairement etabli. En effet, les greffes pratiquees chez de jeunes
Developpement
des organes lymphoides
395
larves thymectomisees de Rana catesbeiana (Cooper & Hildemann, 1965),
d'Alytes obstetricans (Du Pasquier, 1965), de Rana pipiens (Curtis & Volpe,
1971), de Xenopus laevis (Horton & Manning, 1972), ou chezde jeunes adultes
thymectomises a un stade larvaire (Horton & Manning, 1972), finissent toujours
par etre rejetees dans des delais plus ou moins longs.
Le rejet des allogreffes est egalement observe chez 11 Tritons alpestres thymectomises, il s'explique pour 5 d'entre eux, par une thymectomie larvaire
incomplete. L'activite d'un seul petit nodule thymique est suffisante pour
entrainer le rejet des greffons. Mais chez 6 autres Tritons dont l'absence de
thymus a ete confirmee histologiquement, le rejet intervient pourtant, avec
cependant des delais plus longs que chez les animaux temoins.
^interpretation de ce phenomene egalement rencontre chez Ambystoma
tigrinum (Cohen, 1968, 1969), pourrait correspondre a l'etat du thymus et de la
rate lors de la thymectomie. L'operation est realisee chez le Triton alpestre a la
fin de la dixieme semaine de la vie larvaire. Or, il a ete precedemment indique
qu'a ce stade, le thymus tout comme la rate acquierent des structures comparables
a celles des organes adultes. Les foyers de lymphocytopoiese y sont tres actifs
alors qu'au cours de la neuvieme semaine il est encore difficile de reconnaitre des
lymphocytes. Si Ton admet qu'en l'absence de moelle osseuse ou de ganglions
lymphoides chez le Triton, les lymphocytes spleniques ont surtout une origine
thymique, il est probable que chez certains animaux l'emigration des cellules
thymodependantes est deja assez importante au cours de la dixieme semaine pour
qu'ulterieurement la thymectomie n'ait aucun effet sur le rejet des allogreffes.
Chez ces animaux dont le developpement general a pu etre legerement plus
rapide que dans les conditions habituelles, la thymectomie a dix semaines etait
trop tardive.
11 existerait done chez le Triton alpestre un seuil situe entre 9 et 10 semaines de
vie larvaire au dela duquel Pablation du thymus sera sans effet sur le devenir des
allogreffes au meme titre que la thymectomie pratiquee chez l'adulte. On peut,
malgre la petite taille des larves agees de 9 semaines, envisager la thymectomie avant la differentiation complete du thymus, ou meme la thymectomie
embryonnaire permettant Pablation de lebauche presomptive de l'organe. L'etude
des reactions immunitaires de larves agees ou d'adultes totalement depourvus
de lymphocytes thymiques pourrait ainsi etre envisagee.
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(Received 8 July 1972, revised 8 November 1972)