/. Embryo/, exp. Morph. Vol. 25, 3, pp. 423-438, 1971
423
Printed in Great Britain
Etude par cytochimie
ultrastructurale des corpuscules perinucleaires
presents dans les jeunes oocytes de Ilyanassa
obsoleta Say (Mollusca gasteropode)
Par YVES GERIN 1
Laboratoire de Morphologie animate, Universite libre de Bruxelles
SUMMARY
An ultrastructural cytochemical study of the perinuclear corpuscles
found in young oocytes of Ilyanassa obsoleta Say (molluscan gastropod)
Ultrastructural study of the perinuclear region of young oocytes of Ilyanassa obsoleta shows
the existence of numerous corpuscles which we have called 'perinuclear corpuscles'.
These are composed of filaments, of variable thickness (15-45 nm) and frequently show
contacts with the nuclear envelope. With the development of the oocyte, they scatter in the
cytoplasm and then disappear.
Treatment of ultrathin sections by pronase or by pepsin provokes the disappearance of the
main part of the perinuclear corpuscle. The residual structures of these corpuscles are not
digested either by RNase or by DNase. However, if a digestion is carried out with DNase and
pronase together, it increases the contrast of the residual structures. On the other hand, the
contrast of the perinuclear corpuscles is not altered by specific techniques for polysaccharides.
The constitution and the role of the perinuclear corpuscles is discussed.
INTRODUCTION
Les travaux des pionniers de l'embryologie experimentale sur les embryons de
mollusques (Crampton, 1896; Conklin, 1897; Wilson, 1904*7, b) ont conduit
ceux-ci a la conclusion que chaque blastomere resultant des premieres divisions de
l'oeuf feconde possede un potentiel morphogenetique determine, que Ton peut
suivre dans sa lignee cellulaire au cours du developpement. En d'autres termes,
le type de differentiation qui s'exprime dans chaque lignee, dependrait de la
region particuliere du cytoplasme de l'oeuf ou le blastomere initial s'est forme.
D'une maniere generate, on sait maintenant que le cytoplasme des ceufs est
different, dans differentes regions, et que ces differences initiales, deja presentes
dans les oocytes, s'accusent a mesure que progresse la segmentation. Rien n'interdit d'imaginer, comme l'a fait Morgan (1936), que des differences initiales dans
ces regions cytoplasmiques, affectent l'activite des genes, et que ceux-ci, a
leur tour, affectent le cytoplasme, d'ou resulterait une nouvelle suite de reactions
1
Adresse de Vauteur: Laboratoire de Morphologie animale, Faculte des Sciences, Universite libre de Bruxelles, 67 rue des Chevaux, 640 Rhode-Saint Genese, Belgique.
28-2
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Y. GERIN
reciproques. On peut done concevoir, par des interactions nucleo-cytoplasmiques incessantes, et survenant tres tot dans l'oogenese, la formation et la
differentiation graduelles des diverses regions embryonnaires.
Depuis ces travaux, de nombreux auteurs se sont interesses aux jeunes stades
du gasteropode Ilycmassa obsoleta. Grace a la facilite de manipulation de ce
materiel, les toutes premieres tentatives furent purement experimentales. Elles
consistaient en l'etude des effets sur le developpement de la larve, de Pexcision
du lobe polaire (Clement, 1952), de l'excision des cellules mesentoblastiques
(Clement, 1960, 1962, 1963, 1967) et de la compression du lobe polaire (Styron,
1967). Elles consistaient aussi en l'etude du developpement de blastomeres
isoles (Clement, 1956).
Entretemps, la constitution chimique des oeufs d'Hyanassa a aussi ete etudiee.
On a localise et mesure la quantite de certaines enzymes proteolytiques (Collier,
1954a, b, 1957), de certains composes phosphores (Collier, 19606), des acides
ribonucleiques (Collier, 1958, 1960tf) et des polynucleotides (Berg & Kato,
1959). On a egalement etudie les syntheses et le metabolisme des acides nucleiques et des proteines (Collier, 1961 a, b, 1963, 1965; Tyler & Clement, 1967;
Collier & Weinstein, 1968; Collier & Shuhi Yuyama, 1969; Collier & Schwartz,
1969; Mirkes, 1970).
On a enfin etudie la distribution de certains organites cellulaires en microscopie
photonique (Clement & Lehman, 1956) et en microscopie electronique (Crowell,
1964; Pucci-Minafra & Collier, 1968; Pucci-Minafra, Minafra & Collier, 1969;
Geuskens, 1969). Tous ces travaux ont ete faits sur des oeufs fecondes mais
jamais sur des oocytes, a Fexception du travail de Taylor & Anderson (1969)
qui decrit l'ultrastructure des oocytes et la formation de ses constituants, mais
ne traitant pas du sujet de notre travail.
Nous nous sommes done proposes dans ce travail d'etudier la morphologie et
la cytochimie ultrastructurale du cytoplasme des oocytes d'llyanassa en formation
en nous attachant plus particulierement a la region perinucleaire. Celle-ci nous a,
en effet, paru fort interessante car elle peut etre consideree comme le siege de
relations nucleo-cytoplasmiques.
MATERIEL ET METHODES
Fixation-inclusion
Morphologie ultrastructurale. Des fragments d'ovaire ont ete fixes: (1) dans
une solution de glutaraldehyde a 1,5% dans du tampon au phosphate de
Sorensen 0,1 M (pH 7,3) pendant 15 min a 4 °C. (2) Dans une solution de paraformaldehyde a 2 % dans le meme tampon pendant 30 min a 4 °C. Les fragments
sont ensuite laves une nuit dans le tampon et postfixes le lendemain avec du
tetroxyde d'osmium a 1 % toujours tamponne de la meme facon. Apres un bref
rincage a l'eau distillee, les fragments sont deshydrates dans des bains d'alcool a
concentration croissante et ensuite inclus dans l'Araldite suivant la technique de
Glauert & Glauert (1958).
Corpuscules perinucleaires des oocytes
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Cytochimie ultrastructurale. Des fragments d'ovaire ont ete fixes soit a la
glutaraldehyde soit a la paraformaldehyde comme decrit plus haut et laves au
tampon Sorensen. La postfixation n'a pas lieu et l'inclusion est faite dans le
glycol-methacrylate suivant la technique de Leduc & Bernhard (1967).
Traitement des coupes
Les coupes ultrafines sont obtenues a l'aide d'un ultrotome Reichert muni de
couteaux de verre.
Morphologie ultrastructurale. Les coupes servant a la morphologie ultrastructurale sont directement recueillies sur des grilles a 150 trous recouvertes d'un
film de Formvar. Elles sont contrastees par l'acetate d'uranyle a 5 % dans le
tampon de Michaelis (Kellenberger, Ryter & Sechaud, 1958) et par le citrate de
plomb suivant Reynolds (1963). Les grilles sont carbonnees avant d'etre
examinees au microscope electronique A.E.I. type EM6B.
Cytochimie ultrastructurale. Les coupes servant a la cytochimie ultrastructurale
ont ete recueillies sur le bac au moyen d'anneaux en plastique selon la technique
de Marinozzi (1964) puis mises a flotter sur les differentes solutions d'enzymes
ou d'oxydants ou les solutions temoins correspondantes.
Traitements enzymatiques
L'incubation des coupes enrobees au glycol-methacrylate se fait a 37 °C,
pendant des temps compris entre 10 min et 2 h. Les coupes rincees soigneusement puis recueillies sur des grilles, sont contrastees par l'acetate d'uranyle et le
citrate de plomb comme nous l'avons decrit plus haut.
Solutions d'enzymes employees. (1) Pronase: (Calbiochem, B grade, 45.000
PUKg) 0,01 % dans de l'eau distillee ajustee au pH 7,4 pendant 10 min; (2)
pepsine: (Sigma 1:10.000) 0,1 % dans HC10,1 N pendant 30 min et 1 h; (3) ribonuclease: (Sigma, type 1-A, 5x cristallisee) 0,1 % pendant 1 h et 0,5 % pendant
2 h dans de l'eau distillee ajustee au pH 6,8; (4) desoxyribonuclease: (Worthington Biochemical Corp. D 7 AB) 0,1 % dans du MgCl2 0,03 M pendant 3 h.
Mise en evidence des polysaccharides
1. Par la technique de Perry (1967). Les coupes enrobees a l'Araldite sont
flottees sur de l'acide periodique 2 % pendant 30 min, rincees a l'eau distillee
puis contrastees par le citrate de plomb pendant 22 min.
2. Par la technique de Thiery (1967). Les coupes enrobees a l'Araldite sont
flottees sur l'acide periodique 1 % pendant 20 min, soigneusement lavees puis
flottees sur la thiosemicarbazide a 1 % dans de l'acide acetique a 10 % pendant
67 h. Les coupes sont ensuite lavees a l'acide acetique 10 %, 5 %, 2 % puis a
l'eau distillee. Elles sont finalement traitees par le proteinate d'argent a 1 % dans
de l'eau bidistillee pendant 30 min a Pobscurite et soigneusement rincees.
426
Y. GERIN
OBSERVATIONS
Les corpuscules perinucleaires
C'est surtout dans les jeunes oocytes encore depourvus de vitellus que Ton
note la presence des corpuscules perinucleaires qui font l'objet de ce travail. Au
fur et a mesure que progresse l'oogenese, ces corpuscules s'eloignent du noyau
et finissent par disparaitre. La Fig. 1A nous montre la veritable abondance de ces
corpuscules autour d'un jeune noyau; ce noyau est relativement grand (environ
10 JLL) par rapport a l'oocyte (25 a 30 JLI) et presente un nucleoplasme a chromatine
diffuse. Le cytoplasme, lui, est encore pauvre en constituants: a cote de l'hyaloplasme a ribosomes il y a des mitochondries et une multitude de vesicules
endoplasmiques. Dans les oocytes un peu plus ages, les mitochondries devien-
nent plus nombreuses, l'ergastoplasme (Fig. IB) et les appareils golgiens
apparaissent (Fig. 2). Ces dictyosomes, tres nombreux en certaines plages
proches du noyau, presentent un tres grand nombre de saccules (Fig. 2). Les
corpuscules disparaissent dans les oocytes plus ages, charges de plaquettes
vitellines, de glycogene et de lipochondries.
Notons egalement la presence de vacuoles contenant des granules et des
membranes (Fig. 2). Ces vacuoles sont assez rares et sont vraisemblablement
autophagiques. Nos observations ne nous ont pas permis de mettre en evidence
une relation existant entre les granules presents dans ces vacuoles et la disparition
des corpuscules perinucleaires.
L'aspect des corpuscules perinucleaires est tres constant que les pieces aient
subi la double fixation et I'enrobage a l'Araldite (Fig. 4A) ou une fixation aldehydique suivie d'enrobage au glycol-methacrylate (Fig. 4B). Us paraissent constitues de filaments qui s'enroulent et s'enchevetrent en une petite pelote. Les
filaments ont une largeur variable comprise entre 15 et 45 nm.
Enfin, certaines micrographies temoignent de contacts tres intimes entre les
corpuscules perinucleaires et l'enveloppe nucleaire (Fig. 3A-C). A leur niveau,
les deux membranes nucleaires sont frequemment decollees l'une de l'autre
(Fig. 3B). Elles presentent parfois une invagination contenant plusieurs corpuscules (Fig. 3 A).
Traitements enzymatiques
Ribonuclease. Apres deux heures d'action, a une concentration de 0,5 %, cette
enzyme n'a provoque aucun effet sur la structure des corpuscules (Fig. 4C).
Desoxyribonuclease. Le test est egalement negatif (Fig. 4D).
Pronase. Ici, Faction de cette enzyme est nettement visible: les filaments sont
disparus, mais il subsiste un reste non digere (Fig. 4E). Les temoins flottes sur
de l'eau distillee a 37 °C pendant un temps equivalent ne paraissent pas alteres
(Fig. 4F).
Corpuscules perinucleaires des oocytes
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' B
FIGURE 1
(A) Corpuscules perinucleaires (cp) presents tout autour du noyau (ri) d'un tout
jeune oocyte. Dans le cytoplasme peripherique apparaissent les vesicules du reticulum
endoplasmique (ve) et les mitochondries (mi). 10125 x .
(B) Region perinucleaire plus agrandie montrant les ribosomes (ri), les vesicules
endoplasmiques (ve), les corpuscules perinucleaires (cp), les mitochondries (mi)
et Pergastoplasme (er). 40500 x .
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FIGURE 2
Les pores nucleaires (po) sont bien visibles dans la region de la membrane nucleaire
(mri) qui est coupee tangentiellement. On observe des corpuscules perinucleaires (cp)
a proximite immediate de celle-ci. Le cytoplasme presente une grande abondance de
dictyosomes (d) presentant chacun de tres nombreux saccules. Des saccules ergastoplasmiques (er) bordent la region riche en dictyosomes. Notons egalement la presence de vacuoles autophagiques (va). 20250 x .
Corpuscules perinucleaires des oocytes
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FIGURE 3
(A) Invagination de la membrane nucleaire (mn) contenant des corpuscules perinucleaires (cp); n = noyau. 27000 x .
(B) Decollement de la membrane externe de Penveloppe nucleaire avec contact
intime d'un corpuscule perinucleaire (cp). 54000 x .
(C) Membrane nucleaire (mn) presentant des contacts avec des corpuscules perinucleaires (cp). 40 500 x.
430
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Corpuscules perinucleaires des oocytes
431
Nature des structures non digerees par la pronase
Pronase + DNase. Ce qui reste du corpuscule est condense, mais son contraste
augmente (Fig. 5 A).
DNase + pronase. Ce qui reste du corpuscule est moins condense, mais son
contraste augmente egalement (Fig. 5B).
Pronase + RNase. II n'y a pas de difference perceptible entre les coupes ayant
subi cette double digestion (Fig. 5C) et celles traitees par la seule pronase
(Fig. 4E). Les temoins flottes sur de l'eau distillee a 37 °C pendant des temps
equivalents ne paraissent pas alteres (Fig. 5D).
Pepsine. Ici, le test est demonstratif: Faction de cette enzyme est presque
totale sur les corpuscules. Malgre tout, il subsiste une legere trame a Femplacement des corpuscules (Fig. 5E). Les coupes temoins flottees sur une solution
d'HCl 0,1 N a 37 °C pendant un temps equivalent n'ont subi aucune modification (Fig. 5F).
Tests pour la mise en evidence des poly sacchar ides. Les deux tests employes (Perry
et Thiery) paraissent totalement negatifs au niveau des corpuscules perinucleaires.
DISCUSSION
Les resultats obtenus par extractions enzymatiques tendent a prouver que les
corpuscules perinucleaires sont composes en majeure partie de proteines. En
effet, seule les digestions proteiniques (pepsine et pronase) ont donne de bons
resultats. Cependant, il subsiste toujours un reste non digere dont la nature n'est
pas definie.
La double digestion DNase + pronase et inversement a pour effet d'augmenter
le contraste du corpuscule. Cela pourrait suggerer qu'il y a, dans ces corpuscules,
une substance qui fixe la DNase et cette substance pourrait etre de TARN (acide
ribonucleique). Rappelons toutefois que les digestions a la RNase n'ont pas
d'effet sur les corpuscules dans nos conditions experimentales. D'autre part,
certaines micrographies laissent supposer que ces corpuscules pourraient
FIGURE 4
Toutes les micrographies proviennent de coupes contrastees par Pacetate d'uranyle
et le citrate de plomb. Leur grandissement est de 40500 x .
(A) Corpuscule perinucleaire au voisinage du noyau. Fixationglutaraldehyde-OsO4,
enrobage Araldite.
(B) /^/em-fixation glutaraldehyde, enrobage glycol-methacrylate.
(C) Corpuscule perinucleaire ayant subi la digestion a la RNase 0,5 % pendant 2 h
a 37 °C.
(D) Digestion a la DNase 0,1 % pendant 3 h a 37 °C.
(E) Digestion a la pronase 0,01 % pendant 10 min a 37 °C.
(F) Coupe temoin flottee sur de l'eau distillee a pH 7,4 pendant 10 min a 37 °C.
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Y. GERIN
Corpuscules perinucleaires des oocytes
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provenir du noyau. Ces corpuscules, fort nombreux au debut de l'oogenese,
dans la region perinucleaire, s'eloignent ensuite du noyau et finissent par disparaitre au debut de la vitellogenese.
De nombreux travaux de microscopie electronique revus dans Bernhard
(1959) ont relate l'existence d" emissions nucleaires' temoignant d'echanges
nucleo-cytoplasmiques: chez les insectes (Anderson, 1964), chez les ascidies
(Kessel & Beams, 1963), chez les tuniciers (Kessel, 1966), chez les poissons
(Kessel & Beams, 1968) et chez les echinodermes (Kessel, 1968).
Quant a la nature chimique de ces extrusions, elle a ete recherchee dans les
oocytes de diverses especes animales. Pour Ficq & Urbani (1969) chez le
dytique, ces emissions comportent de Facide desoxyribonucleique et sont
Feulgen positives. D'autres auteurs demontrent que ces emissions sont tres
basophiles. Par methodes autoradiographiques, Geuskens (1965) chez l'asterie
et Dhainaut (1970) chez Nereis, parlent de transfert de ribonucleoproteines
provenant de la disintegration du nucleole. Koulish (1965), travaillant sur des
oocytes d'un trematode, et Favard-Sereno (1968) chez le grillon, ont emis
l'hypothese que, ce qu'ils ont appele les 'pseudo-nucleoles', decouverts dans la
region perinucleaire, pourraient etre le produit d'activite du nucleole, et que ces
'pseudo-nucleoles' etaient composes d'acide ribonucleique. Tout recemment,
Goldstein, Rao & Prescott (1969) ont prouve le passage d'acide ribonucleique
dans les deux sens, c'est-a-dire du noyau vers le cytoplasme et inversement du
cytoplasme vers le noyau, contre un gradient de concentration d'acide ribonucleique. D'autres auteurs enfin, ont demontre que ces extrusions etaient de
nature proteinique. Clerot (1968) a decrit, dans les auxocytes de batraciens, des
emissions nucleaires de proteines. Ces proteines constituent un 'ciment intermitochondrial', dont les granules de 35 nm ressemblent a ceux du noyau et a
ceux presents dans les pores de la membrane nucleaire. II n'exclut pas, cependant, un transfert d'acide ribonucleique associe a ces proteines.
Les etudes cytochimiques de Davenport & Davenport (1965) sur les oeufs de
FIGURE 5
Toutes les micrographies proviennent de coupes contrastees par l'acetate d'uranyle
et le citrate de plomb. Leur grandissement est de 40500 x .
(A) Corpuscule perinucleaire ayant subi la double digestion pronase 0,01 % pendant
10 min + DNase 0,1 % pendant 3 h a 37 °C.
(B) Double digestion DNase 0,1 % pendant 3 h + pronase 0,01 % pendant lOmin
a 37 °C.
(C) Double digestion pronase 0,01 % pendant 10 min + RNase 0,5 % pendant 2 h
a 37 °C.
(D) Coupe temoin flottee sur de l'eau distillee a pH7,4 + eau distillee a pH 6,8
pendant des temps correspondants; temperature de 37°.
(E) Digestion a la pepsine 0,1 % dans HC1 0,1 N pendant 30 min a 37 °C.
(F) Coupe temoin flottee sur de l'HCl 0,1 N pendant 30 min a 37 °C.
434
Y. GERIN
trois mollusques Deroceras gracile, Lima scabra et Ischnoradsia australis, ont
demontre que les proteines cytoplasmiques basiques presentes dans les jeunes
oocytes de ces animaux, sont tres vraisemblablement liees a de l'acide ribonucleique cytoplasmique.
De nombreux travaux sur les proteines nucleaires ont ete faits sur Famibe par
des experiences de transplantation (Goldstein, 1958; Prescott & Bender, 1963;
Byers, Platt & Goldstein, 1963a, b\ Goldstein & Prescott, 1966, 1967, 1968;
Prescott & Goldstein, 1968, 1969). Ces proteines passent du noyau vers le
cytoplasme, y sejournent quelque temps pour retourner ensuite au noyau. Ces
proteines ne seraient pas necessairement synthetisees dans le noyau, mais
pourraient servir de transporteur d'acide ribonucleique vers le cytoplasme.
Des mouvements de proteines nucleaires a partir du cytoplasme vers le noyau
ont ete egalement decrites dans les cellules des glandes salivaires (Kroeger,
Jacob & Sirlin, 1968). Les observations de Stevens & Swift (1966) montrent que
des granules presents dans le nucleoplasme et dans les pores nucleaires representent sans doute le produit des anneaux de Balbiani, probablement des acides
ribonucleiques messagers lies a des proteines, qui passeraient regulierement dans
le cytoplasme au travers des pores nucleaires. Ces acides ribonucleiques et
proteines contenues dans les extrusions nucleaires proviennent vraisemblablement du nucleole comme Font prouve les etudes autoradiographiques de Ficq
(1968), Romanova & Gazaryan (1966) et Allen (1967).
CONCLUSION
En ce qui concerne Ilyanassa, les corpuscules perinucleaires paraissent etre
essentiellement de nature proteinique. II est possible que les proteines y soient
associees a de l'acide ribonucleique, mais nos observations ne nous ont apporte
aucun argument sur en faveur de cette hypothese. Quant a la nature des proteines contenues dans les corpuscules perinucleaires de Ilyanassa, elle n'est pas
encore definie mais elle est sans doute basique. En effet, KaufTman, Gay &
McDonald (1950) pensent que la principale action de la pepsine est Fextraction
de proteines de la variete non-histone, contenant du tryptophane.
Davidson et al. (1965) ont montre l'existence de chromosomes plumeux dans
les oocytes de Ilyanassa; la transcription des genes aurait lieu a ce stade et cette
transcription impliquerait la formation d'acide ribonucleique ribosomal et une
variete d'acides ribonucleiques messagers. Similairement, la presence d'un
grand nucleole dans la vesicule germinative suggere que l'acide ribonucleique
ribosomal a ete synthetise pendant l'oogenese.
A partir de cet ensemble d'observations, on peut imaginer que, pendant
l'oogenese, des acides ribonucleiques sont fabriques a partir du nucleole et des
boucles des chromosomes plumeux; les proteines, vraisemblablement basiques,
et egalement synthetisees dans le nucleole, se lieraient a certains de ces acides
ribonucleiques, et sortiraient du noyau en formant, du cote cytoplasmique, des
Corpuscules perinucleaires des oocytes
435
corpuscules qui s'eloignent du noyau pour ensuite disparaitre dans le cytoplasme.
L'usage de techniques autoradiographiques a haute resolution devrait nous
permettre de tester cette hypothese.
RESUME
L'etude ultrastructurale de la region perinucleaire des jeunes oocytes & Ilyanassa obsoleta
a mis en evidence, dans cette region, l'existence de nombreux corpuscules que nous avons
nommes 'corpuscules perinucleaires'.
11s sont formes de filaments enchevetres, d'epaisseur variable (15 a 45 nm) et presentent
frequemment des contacts avec la membrane nucleaire. Au cours des etapes ulterieures de
Foogenese, ils se dispersent dans le cytoplasme puis disparaissent.
Le traitement des coupes ultrafines par la pronase ou par la pepsine fait disparaitre la
majeure partie des corpuscules perinucleaires. Les structures residuelles de ces corpuscules ne
sont pas digerees par la RNase. La DNase ne les digere pas davantage mais, si elle est combinee avec la pronase, augmente le contraste des structures residuelles. D'autre part, les
corpuscules perinucleaires ne sont pas contrasted par les techniques specifiques de mise en
evidence des polysaccharides.
La constitution et le role des corpuscules perinucleaires sont discutes.
Yves Gerin: boursier de FInstitut pour FEncouragement de la Recherche Scientifique dans
FIndustrie et FAgriculture (I.R.S.I.A.).
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