J. Embryol. exp. Morph. Vol. 23, J, pp. J53-]67, 1970
Printed in Great Britain
153
Caractérisation et évolution
des hémoglobines dans le cours du développement
postembryonnaire chez la Poule
Par J. GODET, 1 D. S C H Ü R C H 1 ET V. N I G O N 1
Section de Biologie générale et appliquée,
Laboratoire associé au C.N.R.S., Faculté des Sciences de Lyon
Un certain nombre de travaux ont déjà montré l'existence, dans le cours du
développement embryonnaire et postembryonnaire de la Poule, de plusieurs
hémoglobines se succédant dans le temps. Cependant une difficulté considérable
provient du désaccord entre les auteurs au sujet des résultats que donne le
fractionnement des hémolysats. Chez la poule adulte, le nombre des fractions
obtenues va de deux à cinq selon les auteurs. Les hémoglobines de l'adulte
servant de référence dans l'étude des hémoglobines de l'embryon et du poussin,
l'insécurité de leur définition rend aléatoire toute conclusion concernant les
changements qui peuvent intervenir sur ce point au cours du développement.
Il nous a donc paru nécessaire de soumettre au recoupement d'un ensemble de
techniques les fractions d'hémoglobine que l'on peut obtenir à partir d'un
hémolysat de poule et de poussin. L'ensemble de ces techniques nous a conduit
à admettre l'existence de quatre constituants dans les hémoglobines de poule
adulte. Elles aboutissent également à une caractérisation d'hémoglobines
propres au jeune poussin, apparemment distinctes des hémoglobines de l'embryon de 5 à 7 jours.
MATERIEL ET METHODES
Préparation des hémolysats. Les animaux utilisés appartiennent à la race
Leghorn. Les adultes sont âgés d'au moins 6 mois et les poussins de 1 à 4 jours.
Les erythrocytes, fraichement collectés par décapitation, sont lavés trois fois
avec une solution saline isotonique avant d'être lysés par un mélange d'eau et
de toluène (1/0,2). Dans certains cas, on a incorporé à l'eau de lyse du mercaptoéthanol (concentration finale 4 mM). Toutes les opérations suivantes sont
pratiquées à 4 °C. Après 1 h de contact, le lysat est centrifugé à 30000# pendant
30 min. Les chromatographies et electrophoreses successives sont ensuite
enchaînées sans perte de temps, de telle façon que l'ensemble des opérations,
1
Adresse des auteurs: Section de Biologie générale et appliquée, Faculté des Sciences,
Université de Lyon, 69 Villeurbanne, France.
154
J. GODET, D. SCHÜRCH ET V. NIGON
depuis la récolte du sang, ne dure pas plus de 4 jours. La conservation plus
longue des hémolysats modifie en effet leurs propriétés et provoque l'apparition
de constituants artefactuels. Dans certains cas, afin de tester, parmi les causes
possibles d'artefacts, celles résultant d'une transformation de l'hémoglobine en
composés dotés d'états d'oxydation différents, l'hémolysat a été traité par une
solution de ferricyanure-cyanure de potassium (concentration 1 mM-0,5 mM
par g d'Hb) afin d'obtenir une cyanméthémoglobine; les opérations ultérieures
sont alors conduites en présence de KCN (10 mg/1.).
100
200
300
Volume de l'éluant (ml)
Fig. .1. Filtration d'un hémolysat de Poule sur Sephadex G 75. La fraction 1 renferme
les protéines autres que l'hémoglobine. La fraction 2 contient la totalité de
l'hémoglobine. La fraction 3 comprend des composants de faible poids
moléculaire de nature non protéique.
Purification des hémolysats sur Sephadex. Une colonne de Sephadex G 75
(2x40 cm) est équilibrée avec un tampon 0,35 M-NaCl-0,01 M-Tris ajusté à
pH 7,0 par N-HC1. Elle est chargée avec 150 mg de protéines et éluée à un débit
horaire de 20 ml. La densité optique de l'éluat est enregistrée de façon continue à
253 m/t par un Uvicord LKB (fig.l).
Concentration et dialyse de la solution d'hémoglobine. Pour être passées en
electrophorese ou en Chromatographie, les solutions obtenues à la sortie de la
colonne de Sephadex (ou à la sortie d'une colonne de Chromatographie) doivent
être concentrées et dialysées contre un tampon adéquat. Pour cela, elles sont
filtrées, sous aspiration par le vide, dans un sac de collodion (Membranfilterges,
Göttingen), placé au contact du tampon choisi pour l'opération suivante.
Chromatographie sur celluloses échangeuses d'ions. On a utilisé d'une part les
CM- et DEAE-celluloses Serva (capacités respectives de 0,7 m-equiv/g et 0,8 mequiv/g), d'autre part les CM53 et DE52 microgranulaires Whatmann (capacité
1 m-equiv/g). Les celluloses Serva subissent, avant d'être utilisées, plusieurs
lavages pratiqués selon la méthode de Peterson & Sober (1958). Elles sont
ensuite équilibrées contre le tampon de départ de la chromatographic Seule la
dernière étape est nécessaire pour les celluloses Whatmann. Les colonnes de
CM-celluloses (35 x 0,6 cm) reçoivent 21 mg d'hémoglobine et les colonnes de
Caractérisation
des hémoglobines
155
DE-celluloses (15 x0,6 cm) 15 mg. L'éluant est un tampon Tris-HCl maintenu
à pH 6,9 pour les CM-celluloses et à pH 8,6 pour les DE-celluloses; il est
fourni à un débit constant de 18 ml/h. On a employé selon les cas une élution
par paliers de concentration ou par un gradient linéaire de concentration; les
conditions exactes de l'élution seront définies plus loin.
Electrophorèse sur gel d'amidon. Elle est pratiquée selon la technique déjà
décrite (Godet, 1967). Dans de nombreux cas, on a substitué au tampon acide
borique 0,03 M ajusté à pH 8,6 par N-NaOH, qui exige en moyenne 3 h d'électrophorèse, un tampon Tris 0,03 M ajusté à pH 8,0 par l'acide borique cristallisé.
Dans ces conditions, une bonne séparation des hémoglobines est obtenue en une
heure.
Electrophorèse sur gel de Polyacrylamide. Elle est conduite selon la technique
décrite antérieurement (Schüren, Godet, Nigon & Blanchet, 1968). Dans quelques cas, on a employé aussi la technique de Davis (1964). Pour éluer les hémoglobines ainsi séparées, les boudins de Polyacrylamide sont découpés, broyés
Tableau 1. Modes d* élution utilisés en Chromatographie sur
CM- et DE-celluloses et séparations obtenues
Paliers discontinus de concentration
r
Tampon
de
charge
Hb
éluée
Tampon
du 1er
palier
Hb
éluée
Tampon
Tampon
Gradient
du 2e Hb du 3e Hb
linéaire de
palier éluée palier éluée concentration
CM-cellulose
Adulte
Poussin
M/43
M/43
M/30
M/30
0
Ax
Ai
Ax + A2
Ax + A2
M/30
M/10
M/20
A3 + A4
A3
M/.15
A4
M/43
M/30
Ax
Ax + A2
M/30
M/20
A2
A3
M/15
A4
M/100
A2
Ai, A2, A3 + A 4
M/5
F
A i , A 2 , A3 + A4,
F
DE-cellulose
Adulte
Poussin
M/100
M/100
0
F
M/20
M/20
A4
A4
M/5
M/5
A2
A2
A4, A 2
r , A4, A 2
Toutes les molarités indiquées sont celles du Tris présent dans le tampon. Celui-ci est
ajusté, par N-HCI, à pH 6,9 pour les colonnes de CM-cellulose (35 x 0,6 cm) et à pH 8,6 pour
les colonnes de DE-cellulose (15 x 0,6 cm).
Elution par paliers: la concentration indiquée pour le tampon de charge correspond à celle
du tampon avec lequel la colonne d'echangeurs est équilibrée. On a indiqué pour chaque
palier le type d'hémoglobine éluée.
Elution par gradient: chaque colonne d'echangeurs est équilibrée avant la charge de
l'hémolysat avec un tampon contenant 0,01 M de Tris. On a indiqué la succession des hémoglobines éluées par l'application d'un gradient linéaire de concentration M/100 à M/5.
156
J. GODET, D. SCHÜRCH ET V. NIGON
dans un potter en présence de tampon Tris-acide borique (Tris 0,01 M, pH 8,0)
et laissés 1 h au froid. Le surnageant est recueilli après centrifugation pendant
30 min à 30000 #.
RESULTATS
1. Les hémoglobines
Chromatographie
sur CM52 Whatmann
de Vadulte
avec élution par paliers discontinus
de
concentration. On obtient ainsi quatre constituants distincts que nous dénommerons Ax à A4. Le tableau 1 et la figure 2 résument les résultats. L'utilisation
30
50
Volume de l'éluant (ml)
Fig. 2. Chromatographie sur cellulose Whatmann CM 52 d'un hémolysat de Poule.
Elution par paliers discontinus de concentration. L'indication de molarité correspond à la concentration en Tris, le pH étant ajusté à 6,9 par N - H C I . La première
molarité est celle du tampon de charge.
d'hémolysats d a n s lesquels l'oxyhémoglobine a été transformée en cyan-
méthémoglobine n'apporte aucune modification au diagramme de séparation.
Nous examinerons successivement les propriétés des diverses fractions obtenues.
Hémoglobine
Ax
Cette fraction est éluée par un tampon de concentration M/43. Lorsqu'elle
est passée en electrophorese sur gel d'amidon, on obtient une bande majeure
qui migre à la même vitesse que la bande la plus anodique de l'hémolysat total
(fig. 3 A). Derrière cette bande majeure, on trouve constamment quelques traces
des bandes suivantes (à peine visibles sur la figure 3 A). Toutes les tentatives
Caractérisation
des hémoglobines
157
effectuées en vue d'éliminer ces fractions contaminantes dans d'autres systèmes
de Chromatographie se sont soldées par l'échec. Sur gel de Polyacrylamide, la
fraction ainsi obtenue donne une seule bande anodique (fig. 3B). L'hémoglobine Ax représente 2 à 5 % de la quantité totale d'hémoglobine présente chez
l'animal adulte.
Hémoglobine A2
Cette fraction est éluée par un tampon de concentration M/30. Elle se comporte en gel d'amidon comme la bande la plus faiblement anodique de l'hémolysat total et apparaît convenablement pure. Sur gel de Polyacrylamide, elle
A3+A4 mm
Origine ,,
—.
M
«-^—
EJSJSK
.
+
.
.
m
d
_ « ^
^^^^
.
A4
.
Origine /
A,
m •
A'3
A,A2
P
A
A,
A2
B
m
A3
m
A4
m
P
F
C
Fig. 3. Electrophorèse des hémoglobines de la Poule et du poussin d'un jour.
(A) Electrophorèse sur gel d'amidon en présence de tampon Tris 0,03 M ajusté à
pH 8,0 par l'acide borique cristallisé. (B) Electrophorèse sur gel de Polyacrylamide
selon notre technique (Schùrch et al. 1968). (C) Electrophorèse sur gel de Polyacrylamide selon la technique de Davis (1964). A = hémolysat total de Poule. P =
hémolysat total de poussin d'un jour. Al5 A2, A3, A3, A4 = hémoglobines de la Poule
et du poussin d'un jour obtenues par Chromatographie sur cellulose Whatmann
CM52. F = hémoglobine du poussin d'un jour obtenue par Chromatographie sur
DE-cellulose Serva.
migre exactement comme l'hémoglobine A±. L'hémoglobine A2 comprend 20 à
23 % de la quantité totale d'hémoglobine contenue dans les hémolysats d'adulte.
Hémoglobine As
Cette fraction est éluée par un tampon de concentration M/20. Elle migre en
gel d'amidon en position légèrement cathodique, au même niveau que la large
158
J. GODET, D. SCHÜRCH ET V. NIGON
bande cathodique fournie par l'hémolysat total. C'est seulement en gel de
Polyacrylamide qu'elle apparaît parfaitement individualisée comme la deuxième
bande de l'hémolysat total, en partant de l'extrémité anodique. L'hémoglobine A3
représente moins de 1 % de l'hémoglobine totale chez la poule adulte.
Hémoglobine A±
Cette fraction est éluée par un tampon de concentration M/15. En électrophorèse sur gel d'amidon, elle migre en position légèrement cathodique et se
confond avec l'hémoglobine A3. Sur gel de Polyacrylamide, elle se divise en
trois bandes que l'on retrouve parfaitement dans les résultats fournis par
l'hémolysat total. Cette division conduit à se demander s'il s'agit d'une fraction
50
100
Volume de l'éluant (ml)
Fig. 4. Chromatographie sur cellulose Whatmann DE52 d'un hémolysat de Poule.
Elution par paliers discontinus de concentration. L'indication de molarité correspond
à la concentration en Tris, le pH étant ajusté à 8,6 par N-HC1. La première molarité
est celle du tampon de charge.
homogène. Pour répondre à cette question, les trois constituants visibles sur
Polyacrylamide ont été élues et repassés en électrophorèse. Dans ces conditions,
chacune des bandes isolées a fourni de nouveau les trois bandes caractéristiques.
Il semble donc que l'hémoglobine A4 soit un constituant homogène, susceptible
d'apparaître sous trois formes distinctes liées entre elles par un système de
transformations réversibles. Après conversion en cyanméthémoglobine, l'hémoglobine A4 ne fournit plus qu'une seule bande en gel de Polyacrylamide; ceci
nous incite à penser que ses transformations concernent l'état d'oxydation de la
molécule. L'hémoglobine A4 représente 75 % de la quantité totale d'hémoglobine contenue chez l'adulte.
Autres modes de séparation. Diverses autres modalités ont été employées afin
de recouper les techniques des auteurs. Les résultats sont présentés dans le
tableau 1 et les figures 4 et 5. Les conclusions suivantes ressortent :
(1) Les chromatographies sur DE-cellulose conduisent à la perte des fractions
Ai et A3, même lorsque celles-ci ont fait l'objet d'un enrichissement préalable
par Chromatographie sur CMC. Ceci se produit aussi bien par paliers discontinus (fig. 4) que dans les élutions par gradients (fig. 5D).
Caractérisation
des hémoglobines
159
(2) Les élutions par gradient de concentration conduisent à une résolution
amoindrie. En particulier, sur CMC, les fractions A 3 et A4 ne sont pas séparées
(fig. 5B).
(3) Lorsqu'on soumet à la Chromatographie des hémolysats qui n'ont pas été
préalablement purifiés sur Sephadex, on obtient des fractions supplémentaires
(fig. 5 A, C). Leur étude par électrophorèse montre que les hémoglobines ainsi
séparées sont les mêmes que les fractions déjà décrites. L'explication la plus
vraisemblable voit, dans ces fractions, la séparation de protéines non hémoglobiniques entraînant avec elles une certaine quantité d'hémoglobine.
Volume de l'éluant (ml)
Fig. 5. Chromatographie sur CM- et DE-celluloses d'un hémolysat de Poule.
A partir de la flèche G, élution par gradient linéaire de concentration (cf. tableau 1).
(A) Chromatographie sur CM-cellulose d'un hémolysat entier. (B) Chromatographie
sur CM-cellulose d'un hémolysat purifié au préalable sur Sephadex. (C) Chromatographie sur DE-cellulose d'un hémolysat entier. (D) Chromatographie sur DEcellulose d'un hémolysat purifié au préalable sur Sephadex. Les zones hachurées
correspondent à des protéines non hémoglobiniques entraînant avec elles une
fraction d'hémoglobine.
2. Les hémoglobines du poussin de 1 à 4 jours
On trouve chez le poussin des hémoglobines qui paraissent, en première
analyse, semblables aux fractions Al5 A2 et A4 de l'adulte. En effet, leurs comportements électrophorétiques et chromatographiques paraissent analogues
(tableau 1); cependant de plus amples vérifications employant des méthodes de
comparaison plus fines doivent être réalisées avant que ces homologies puissent
être considérées comme définitives. En revanche, la fraction A3 est absente et
l'on trouve au moins deux fractions qui n'existent pas chez l'adulte, les hémoglobines A3 et F.
160
J. GODET, D. SCHÜRCH ET V. NIGON
Hémoglobine A'3
Nous la désignons provisoirement ainsi car elle est éluée en Chromatographie
sur CM-cellulose dans les mêmes conditions que la fraction A3 de l'adulte
(tableau 1). Cependant elle diffère de celle-ci par son comportement électrophorétique. En gel d'amidon, elle fournit une bande très légèrement anodique
alors que l'hémoglobine A3 est faiblement cathodique; l'électrophorèse d'un
mélange de A 3 et A3 fournit deux bandes migrant de part et d'autre de l'origine
(fig. 6). En gel de Polyacrylamide, l'hémoglobine A3 prend une position intermédiaire entre celles des hémoglobines A2 et A 3 de l'adulte. Elle représente chez
le poussin de 1 jour environ 1 % de l'hémoglobine totale.
Origine
WÊÊ
__
ÊÊÈ
A' 3
A3 + A' 3
+
A3
Fig. 6. Electrophorèse sur gel d'amidon des hémoglobines mineures A3 et A3 de la
Poule et du Poussin de 1 jour (tampon Tris 0,03 M ajusté à pH 8,0 par l'acide borique
cristallisé).
Hémoglobine F
Elle est isolée au mieux par Chromatographie sur DE-cellulose Serva qui
présente pour cette fraction particulière un pouvoir séparateur supérieur à celui
de la DE 52 Whatmann (fig. 7). En electrophorèse sur gel d'amidon, elle migre
comme la bande la plus cathodique fournie par un hémolysat de poussin (fig. 3 A).
En electrophorèse sur gel de Polyacrylamide, elle ne peut être mise en évidence
dans les conditions que nous avons employées pour les autres hémoglobines. En
effet, elle ne pénètre pas dans le gel espaceur et passe dans le tampon du réservoir
supérieur. En revanche, lorsque l'électrophorèse est pratiquée selon la technique
de Davis (1964), l'Hb F fournit une bande nette qui se comporte comme la
bande la plus cathodique donnée dans ces conditions par un hémolysat de
poussin (fig. 3C). Chez le poussin d'un jour, elle représente 6 à 7 % de l'hémoglobine totale.
Le tableau 2 résume les proportions relatives des diverses hémoglobines contenues dans les hémolysats de poussin et de poule. Il apparaît que les proportions
de Ax et A2 varient peu au cours du développement post-embryonnaire. Au
Caractérisation
des hémoglobines
161
contraire, l'hémoglobine A 4 augmente après l'éclosion. On enregistre aussi,
pendant cette période, la disparition de l'hémoglobine F et le remplacement de
A3 par A 3 .
50
100
150
Volume de l'éluant (ml)
Fig. 7. Chromatographie sur DE-cellulose Serva d'un hémolysat de Poussin de
1 jour. L'hémoglobine F est directement eluée par le tampon de charge (Tris 0,01 M
ajusté à pH 8,6 par N-HCI). A partir de la flèche G, élution par gradient linéaire
de concentration (cf. tableau 1).
Tableau 2. Proportions relatives des diverses hémoglobines dans
F hémolysat de poussin de 1 jour et de poule
A;
Ax
Poussin de 1 jour
Poule
3-5%
2-5%
20-25%
20-23%
1%
0
0
1%
55-60%
75%
6-7%
0
L'indication l % signifie la présence certaine du constituant considéré mais en quantité
non dosable avec précision.
L'indication 0 signifie que, compte tenu de la sensibilité des méthodes employées, la
présence d'un certain constituant n'a pu être mise en évidence.
DISCUSSION
Les méthodes que nous avons employées se distinguent de celles des auteurs
par la filtration préalable des hémolysats sur Sephadex, l'emploi préférentiel de
la Chromatographie sur CM-cellulose et de l'élution par paliers discontinus de
concentration. En électrophorèse sur gel de Polyacrylamide, les conditions que
nous employons produisent une meilleure résolution.
1. Les hémoglobines de Vadulte
Sur DE-cellulose, nos résultats recoupent parfaitement ceux des auteurs
(Huisman & Schillhorn Van Veen, 1964). Les deux constituants définis par ce
mode de séparation migrent en électrophorèse selon des modalités déjà décrites
et que nous pouvons confirmer (Kabat & Attardi, 1967; Manwell, Baker &
Betz, 1966); ils se distinguent par leur composition en acides aminés (Saha,
162
J. GODET, D. SCHÜRCH ET V. N I G O N
1964; Manwell et al. 1966; Hashimoto & Wilt, 1966) et leurs groupements
terminaux (Matsuda, Maekawa & Otsubo, 1965; Miyoshi, 1965). Mais nous
avons vu que cette méthode de Chromatographie fait disparaître les fractions
Ax et A3.
Les auteurs qui ont utilisé la Chromatographie sur CM-cellulose (Matsuda &
Takei, 1963; Simons, 1966; Hashimoto & Wilt, 1966) ont opéré Pélution par des
gradients linéaires de concentration. Ils séparent ainsi trois fractions qui pourraient correspondre aux trois constituants identifiés par certains auteurs à l'aide
d'électrophorèse sur acétate de cellulose (Fraser, 1966) et d'immunoélectrophorèse (D'Amelio & Salvo, 1961). La fraction initiale obtenue par Hashimoto
& Wilt se subdivise en deux bandes par électrophorèse alors que la nôtre est
formée principalement d'hémoglobine Kx associée à quelques traces de A2. Il
est possible que les observations des auteurs qui décrivent cinq constituants
(Hashimoto & Wilt, 1966; Marchis-Mouren & Lipman, 1965; Schall & Turba,
1963) soient dues à l'entraînement des hémoglobines par des fractions protéiques de nature différente. Dans cette hypothèse, on pourrait supposer que les
fractions II et III obtenues par Hashimoto & Wilt contiennent respectivement
les hémoglobines A! + A2 et A3 + A4 identifiées par nos méthodes.
Notons enfin que l'électrophorèse sur gel d'amidon pratiquée à pH 8,3 et
8,6 fournit un plus grand nombre de constituants que lorsqu'elle est faite à
pH 8,0 (Godet, 1967). L'état actuel de nos analyses conduit à penser que
certaines de ces bandes peuvent correspondre à des séparations secondaires
analogues à certaines de celles que fournit l'électrophorèse sur gel de Polyacrylamide.
2. Les hémoglobines du poussin
Les observations de divers auteurs (Huisman & Schillhorn Van Veen, 1964;
Manwell et al. 1966; Raunich, Callegarini & Cucchi, 1966; Salvatorelli,
Callegarini, Gulinati & Gardenghi, 1968; Godet, 1967; Washburn, 1968) ont
déjà montré que les jeunes poussins et les embryons âgés possèdent certains
constituants hémoglobiniques différents de ceux de l'adulte. Nos résultats
viennent confirmer ces conclusions en démontrant l'existence d'une hémoglobine
foetale très différente des autres (HbF) ainsi qu'une hémoglobine mineure (A3)
très voisine de l'hémoglobine A 3 de l'adulte.
L'existence d'une hémoglobine fœtale chez les Oiseaux a déjà été constatée
chez le caneton par Borghese & Bertles (1965). Elle disparaît dans cette espèce
deux mois après l'éclosion et se comporte de façon analogue à l'hémoglobine F du
poulet.
Quant à la situation respective des hémoglobines A3 et A3, elle pose un certain
nombre de problèmes intéressants. D'une part, le comportement de ces deux
hémoglobines, identique en Chromatographie, est très proche en électrophorèse. D'autre part, elles représentent respectivement dans les hémolysats de
poussin et d'adulte des participations équivalentes en quantité. De sorte que
Caractérisation
des hémoglobines
163
l'hypothèse d'une parenté structurale et génétique entre ces deux constituants
surgit d'elle-même. On pourrait supposer, par exemple, que ces deux hémoglobines résultent de l'activité d'une même unité génétique, modifiée par une
altération limitée du processus de traduction. Des systèmes de cette nature ont
déjà été envisagés dans certains cas pour les hémoglobines de lapin (Weisblum,
Gonano, Von Ehrenstein & Benzer, 1965) et de souris (Rifkin, Rifkin &
Königsberg, 1966). Dans le cas des hémoglobines de poulet, cette interprétation doit être considérée comme une simple hypothèse de travail à soumettre
à des études ultérieures.
3. La nomenclature des hémoglobines de poulet
Il est certain que le nombre de travaux effectués en vue d'analyser les constituants hémoglobiniques de poule est actuellement élevé, que les techniques
sont diverses et aboutissent à des résultats différents. On peut estimer que le
progrès des analyses nous rapproche actuellement d'une description proche de
la réalité exacte. A partir de ce moment, se pose le problème des homologies
entre nomenclatures différentes, génératrices d'une confusion extrême.
Dans cet esprit, il nous a paru utile de présenter, dans le tableau 3, un résumé
des principaux résultats décrits dans la littérature et concernant les hémoglobines de l'adulte. Nous n'avons pas tenu compte dans ce tableau des constituants
hémoglobiniques cités occasionnellement par certains auteurs, considérés par
eux comme des artefacts ou dont ils attribuent la formation à des conditions
d'analyse particulière (Huisman & Schillhorn Van Veen, 1964; Manwell, Baker,
Roslansky & Foght, 1963; Manwell, et al, 1966).
Notre opinion est que les observations présentant l'existence de deux ou
trois hémoglobines tiennent, soit à un pouvoir résolvant insuffisant des méthodes
employées, soit à la rétention, au cours de la séparation, de certaines hémoglobines présentes en faible quantité. Quant aux résultats présentant plus de
quatre hémoglobines, ils pourraient découler de phénomènes d'entraînement
par des protéines non hémiques, de l'altération de certains constituants ou
d'équilibres plus ou moins réversibles entre des états différents d'une même
molécule.
Nous fondons cette opinion sur le fait que, par les mêmes moyens qu'eux,
nous avons pu obtenir des séparations analogues à celles des auteurs; un contrôle plus poussé des fractions obtenues nous a chaque fois restitué la séparation
en quatre fractions. Notons enfin que les quatre constituants observés par
Simons (1966) se distinguent des fractions que nous décrivons tant par leur
mode d'élution en Chromatographie que par leur participation respective dans
l'hémolysat de Poule.
Les études faites sur la composition en acides aminés et sur les chaînes polypeptidiques constitutives des hémoglobines majeures (Saha, 1964; Manwell et
al 1966; Hashimoto & Wilt, 1966; Paul et al 1968; Bargellesi, Callegarini &
Conconi, 1969) suffisent dès à présent à nous assurer que ces deux hémoglobines
ii
E M B 23
164
J. GODET, D. SCHURCH ET V. NIGON
Tableau 3. Principales données de la littérature concernant le nombre de constituants obtenus à partir d'un hémolysat de Poule
Nombre de
constituants
2*
Techniques de séparation
Chromatographie
Sur CM-cellulose et élution
par gradient de pH
Nomenclature
des auteurs
Hb»! et Hbo
Pi et P 2
Sur CM-cellulose et élution
par paliers de concentration
Sur Amberlite 1RC 50 et élution
par gradient de concentration
Sur DEAE-cellulose et élution
Hbi et Hb 2
par gradient de concentration
et de pH
Electrophorèse
Sur papier
Tampon veronal, pH 8,6
pH9,l
3f
Tampon phosphate pH 7,2
Sur gel de Polyacrylamide
selon la technique de Davis
(I964Ï
Chromatographie
Sur CM-cellulose et élution
par gradient de concentration
Sur CM-cellulose et élution
par gradient de concentration
Electrophorèse
Sur acétate de cellulose,
tampon Tris pH 8,9
Sur gel d'amidon, tampon
borate pH 8,6
Sur gel d'agar et par immunoélectrophorèse, tampon
veronal ou borate pH 8,2
4
5
Chromatographie sur CMcellulose et élution par gradient
de concentration
Chromatographie sur Amberlite
IRC50 et élution par gradient
de concentration
Electrophorèse sur gel d'amidon,
tampon glycine pH 7,5
Chromatographie et electrophorèse
Chromatographie sur CMcellulose et élution par
gradient de concentration
Electrophorèse sur gel d'amidon,
tampon de Poulik pH 8,6
Van der Helm & Huisman,
1958; Saha, 1959
Schnek et al. 1963
Fraser, 1961
Saha, 1964; Bargellesi et al.
1969
Huisman et al. 1964
Dunlap et al. 1956 ; Dutta et al.
1958; Saha&Gosh, 1960;
Kabat & Attardi, 1967
Miyoshi, 1965
Fraser, 196.1
Washburn, 1968
Tampon Tris EDTA borate,
Tampon phthalate, pH 5,9
Sur acétate de cellulose, tampon
Tris-EDTA borate pH 9,1
Sur gel d'agar, tampon veronal
pH 8,6
Sur gel d'amidon
Tampon borate, pH 8,6
Références
Hbj et Hb 2
Wilt, 1962
Ambs & Thoreil, 1960;
Schnek et al. 1963; Manwell
et al. 1963; Huisman et al.
1964; Raunich et al. 1966;
Bargellesi et al. 1969
Manwell et al. 1963
Hell, 1966
Dans l'ordre d'élution: At = 20%,
AH = 64 %, A„ t
= 3%
Alekseenko & Orekhovich,
1964
Matsuda & Takei, 1963
d = 20 % C2 =
80 %,C 3 très mineure
Fraser, 1964, 1966
au a 2 , a 3
Buschmann, 1963
Cj = majeure,
basique surtout
nucléaire, C2 =
mineure, acide,
C3 = très mineure
Dans l'ordre d'élution : Hbiu = 3 %,
HbIV = 3 % Hb! =
32 %, Hb„ = 62 %
D'Amelio & Salvo, 1959,
1961;D'Amelio, 1966
Simons, 1966
Marchis-Mouren & Lipman,
1965
Schall & Turba, 1963
Dans l'ordre d'élution: Ax (2 constituants) < 1 %, A,
(A2f+A2s) = 30%,
A3 = 70 %
Hashimoto & Wilt, 1966
* Un constituant majeur représentant de 70 à 80 % de l'hémoglobine totale, de nature basique,
présent en quantité importante dans les noyaux des erythrocytes (Miyoshi 1965); un constituant
mineur représentant de 20 à 30 % de l'hémoglobine totale, de nature plus acide.
f C'est-à-dire les deux constituants principaux détectés par les auteurs précédents et un constituant
mineur supplémentaire.
Caractérisation des hémoglobines
165
correspondent à la traduction de cistrons différents. La question se pose désormais s'il en va de même pour les hémoglobines mineures (A l5 A 3 et A3) ou si
celles-ci représentent en réalité des états transformés des hémoglobines majeures.
Des études poursuivies au niveau de la structure primaire de la molécule sont
seules susceptibles de répondre à cette question et présenteraient à coup sûr
un intérêt tout particulier dans la comparaison des hémoglobines A 3 et A3.
RESUME
1. L'hémolysat de poussin de 1 jour renferme cinq constituants: deux hémoglobines majeures A 2 et A 4 et trois hémoglobines mineures A l5 A 3 et F.
2. Les hémoglobines A l5 A 2 et A 4 sont également présentes dans l'hémolysat
de poule. En revanche, chez l'animal adulte, l'hémoglobine A3 est remplacée
par l'hémoglobine A 3 et l'hémoglobine F a complètement disparu.
3. La nomenclature retenue, à la suite de ces observations, pour les hémoglobines de Poulet est comparée à celles données dans la littérature.
SUMMARY
The characterization and post-embryonic development of
the haemoglobins of the fowl
1. The 1-day chick hemolysate provides five fractions: two major haemoglobins A 2 and A 4 and three minor haemoglobins A1? A3 and F.
2. Haemoglobins A l5 A 2 and A 4 are also present in the hemolysate of the adult
chicken ; but, in the adult, haemoglobin A3 is replaced by haemoglobin A 3 and
haemoglobin F disappears completely.
3. The nomenclature given here for chicken haemoglobins is compared with
the nomenclatures found in the literature.
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{Manuscrit reçu le 3 avril 1969)