J. Embryol. exp. Morph. Vol. 22, 3, pp. 373-94, November 1969
Printed in Great Britain
373
Etude comparative
des effets de Fyperite azotee sur les constituants,
mesodermique et ectodermique, des bourgeons
de membres de Fembryon de Poulet
Par BERTHE SALZGEBER 1
Institut cTEmbryoiogie du College de France et du C.N.R.S.
(Directeur: Professeur Et. Wolff)
Des recherches recentes (Salzgeber & Pinot, 1968) ont montre que les ebauches de membres d'embryons de 3 a 3^ jours d'incubation (stades 18 a 20 de
Hamburger & Hamilton, 1951) traitees in vitro a l'aide d'une solution d'yperite
azotee et de liquide de Tyrode, et greffees apres lavage a l'embryon de Poulet,
evoluent en membres micromeles, phocomeles ou ectromeles. Le type de malformation obtenue depend de la duree du traitement et de la concentration de
la solution. Ces experiences apportent la preuve d'une action directe de l'yperite
azotee sur les ebauches de membres.
Des experiences de dissociation et de reassociation des constituants de
Febauche, apres traitement de l'un d'entre eux par l'yperite azotee, ont en
outre montre une difference tres nette de la sensibilite entre les deux territoires
(Salzgeber & Wolff, 1966), Salzgeber (1967, 19686). Des bourgeons provenant
de la reassociation d'un mesoderme traite et d'un ectoderme sain evoluent dans
certaines conditions experimentales en membres micromeles, phocomeles ou
ectromeles alors que le meme traitement applique au constituant ectodermique
determine, dans la plupart des cas, l'apparition de membres normaux.
Nous nous proposons, au cours de ce travail, de soumettre le constituant
ectodermique a Faction de doses croissantes d'yperite azotee et de comparer les
malformations ainsi obtenues a celles qui sont determinees par Faction de la
substance toxique sur le constituant mesodermique. Ces observations morphologiques du squelette ont ete completees par des examens histologiques portant
sur des greffons preleves 6, 15, 24 et 48 h apres le traitement.
Les recherches exposees dans ce travail concernent des associations de tissus
provenant de bourgeons de pattes. Elles corroborent les resultats obtenus avec
les bourgeons alaires au cours de travaux anterieurs (Salzgeber, 1968<z) et
1
Adresse de Vauteur: Institut d'Embryologie du College de France et du C.N.R.S., 49
bis Avenue de la Belle Gabrielle, Nogent-sur-Marne, France.
374
B. SALZGEBER
montrent, d'une part, que les deux constituants de l'ebauche n'ont pas la
meme sensibilite envers l'agent radiomimetique, et d'autre part, que les malormations obtenues sont differentes selon que le tissu traite est de nature
ectodermique ou mesodermique.
Des associations chimeres resultant d'une recombinaison d'un mesoderme
de patte et d'un ectoderme d'aile ou inversement d'un mesoderme d'aile et
d'un ectoderme de patte ont aussi ete realisees. Les recherches de Zwilling
(1955), de Hampe (1959) ont montre que dans les cas d'echanges entre constituants alaires et pedieux, c'est toujours le constituant mesodermique qui determine revolution des pieces squelettiques du membre. Ainsi un bourgeon,
constitue d'un mesoderme de patte, recouvert d'un ectoderme d'aile, evolue en
patte, et inversement, un ectoderme de patte associe a un mesoderme d'aile
donne une aile. Ces experiences mettent en evidence le role du mesenchyme dans
la determination de la qualite du membre, de son evolution en aile ou en patte.
Comment evolue le bourgeon provenant d'une association chimere apres
traitement a l'yperite azotee du constituant mesodermique? Ce tissu altere est-il
capable d'orienter revolution du membre en patte ou en aile ?
TECHNIQUES
Les bourgeons, preleves au stade 18-19 de Hamburger & Hamilton (3 jours
d'incubation), sont plonges dans une solution d'yperite azotee et de liquide de
Tyrode a des concentrations variant de 0,05 mg a 0,5 mg/ml. La duree du
traitement est de 5 a 20 min pour une concentration de 0,05 mg/ml et de 5 min
pour une concentration de 0,1 a 0,5 mg/ml. Apres lavage des embryons au
liquide de Tyrode, on excise les bourgeons de pattes ou d'ailes et on les traite
selon la methode de Zwilling (1955) soit par une solution de trypsine (2%
Difco dans le Tyrode sans calcium ni magnesium) pour obtenir le constituant
ectodermique, soit par une solution de versene EDTA (Kestranal 1 %0) pour
obtenir le constituant mesodermique. Les deux territoires sont ensuite reassocies; le mesoderme d'un bourgeon traite est recombine a l'ectoderme d'un
bourgeon sain et inversement le mesoderme d'un bourgeon sain est place au
contact d'un ectoderme d'un bourgeon traite.
L'ensemble de l'ebauche est greffe a un embryon hote de stade 19-20, a la
place des bourgeons d'ailes prealablement excises, selon une methode mise au
point par Hampe (1959). Les bourgeons temoins subissent les memes traitements, l'yperite azo :ee etant remplacee par le liquide de Tyrode. Pendant les
24 et 48 h qui suiveni: l'operation, on controle 1'evolution des bourgeons greffes;
les transplants mal greffes sont elimines.
Tous les embryons sont autopsies et fixes au liquide de Bouin le 10° jour de
l'incubation, soit 7 jours apres le traitement. Afin de mettre en evidence le
squelette, la plupart d'entre eux sont traites selon la technique de Lundvall
(1927).
Uyperite azotee et les bourgeons de membres
375
Des bourgeons de membres sont fixes au liquide de Bouin a differents intervalles apres le traitement (6 a 48 h) en vue d'une etude histologique. Les colorations sont effectuees a l'hemalun de Mayer-Eosine.
RESULTATS
A. Associations homogenes de mesoderme et a"1 ectoderme de bourgeons de patte
Les observations ont porte sur 29 membres temoins et sur 116 membres
'traites a Typerite azotee'. Cinquante quatre d'entre eux proviennent de l'association d'un mesoderme 'traite' (0,05 a 0,5 mg/ml) et d'un ectoderme sain;
62 sont constitues d'un mesoderme sain et d'un ectoderme 'traite' (0,05 a 0,5
mg/ml). Sur les 29 pattes temoins, 16 appartiennent a la serie 'traitement du
mesoderme' et 13 a la serie 'traitement de l'ectoderme' Fyperite azotee etant
dans ces cas remplacee par le liquide de Tyrode. Les etudes histologiques concernent 18 cas temoins et 47 bourgeons traites a l'yperite azotee. Les greffons
ont ete preleves 6, 15, 24 ou 48 h apres la greffe.
Tableau 1. Traitement du constituant mesodermique
Doses
(mg/ml)
Duree du
traitement Nombre
(min)
de cas
Temoins
I'0,05
Yperite
azotee
i 0,1-0,3
0,4-0,5
1
5-8
5
5
Totaux Yp.
Normaux
Micromeles
16
27
19
8
13
3
54
—
Phocomeles
Ectromeles
—
21
8
6
—
29
25
Hemimeles
Autres
malformations*
—
3
11
8
Tableau 2 . Traitement du constituant ectodermique
Doses
(mg/ml)
Temoins
Yperite
azotee
Duree du
Maltraitement Nombre
formations
(min)
de cas Normaux distales
—
0,05
—
5-8
10-20
5
0,1-0,3
5
0,4-0,5
Totaux Yp.
* Autres malformations
13
10
9
18
22
13
8
2
62
10
—
1
3
13
20
5
2
8
38
10
4
= micromeles ou ectromeles
1. Etudes morphologiques
Les resultats de ces experiences sont consignes dans les tableaux 1 et 2.
Apres traitement du constituant mesodermique (tableau 1) la malformation
phocomele (fig. 1 A) domine pour des doses de 0,05 mg/ml. Vingt et un membres
376
B. SALZGEBER
sur 27 sont de type phocomele. Le nombre de sujets ectromeles (fig. 1B) et celui
des phocomeles ne possedant qu'un seul doigt augmentent avec la concentration
de la solution ou avec la duree du traitement. Pour des doses superieures a
0,3 mg/ml, le developpement des bourgeons greffes est inhibe dans 8 cas sur 8.
Vyperite azotee et les bourgeons de membres
311
Le denombrement des pieces squelettiques (fig. 2B, tableau 3) revele l'absence
d'elements proximaux dans 18 cas sur 25. Le perone manque dans tous les cas.
La partie distale, constitute par les metatarsiens et les doigts, est aussi affectee,
mais elle Test moins que la partie proximale. Le doigt III est toujours present.
Les mesures de l'axe squelettique (femur + tibia + metatarsien 3 +doigt III) et
de la partie distale (metatarsien 3 et doigt III) ont ete portees dans le tableau 4
Le rapport D/A (longueur de la partie distale/longueur de l'axe squellettique) est
de 0,60 dans les cas de phocomelie ou la partie proximale subsiste, alors que
chez les temoins, ce rapport est de 0,46. J'ai mentionne dans ce tableau des
mesures de pattes provenant de bourgeons entiers traites par 1'yperite azotee
(0,05 mg/ml), mais non dissocies et grefifes entiers a l'embryon hote. Dans les
deux series d'experiences, les rapports sont semblables. Ces mesures montrent
la dominance de la partie distale sur la partie proximale; elle represente 60%
de l'axe squelettique total.
Les effets de 1'yperite azotee sur le constituant ectodermique (tableau 2)
portent essentiellement sur la partie distale du membre. Sur 62 greffons ayant
atteint .Page de .10 jours, 10 sont normaux, 38 presentent des malformations
distales et 10 sont depourvus d'articles distaux (hemimeles); 2 bourgeons n'ont
pas evolue (ectromeles); 2 pattes sont raccourcis (micromeles). On constate que
les doses faibles (0,05 mg/ml, 5 a 8 min) n'ont pas d'action sur Pectoderme; la
plupart des membres, 8 sur 9, evoluent normalement. (fig. 1 C). Une patte
presente une legere reduction de taille mais les pieces squelettiques sont presentes.
Dans les cas ou Pectoderme provient de bourgeons soumis a des doses plus
elevees (0,05 mg/ml, 10 a 20 min de traitement ou des doses superieures a
0,05 mg/ml, pendant 5 min) des malformations distales apparaissent, alors que
la region proximale n'est pas ou peu atteinte (fig. 1D). Des doses de 0,1 a 0,3 mg/
ml sont essentiellement responsables de Papparition de ces anomalies distales.
Vingt membres ont des doigts deformes, soudes ou raccourcis, 2 ne possedent
que la partie proximale: tibia et femur. Enfin dans le cas des 13 membres dont
FIGURE 1
Les ebauches de membres, provenant de la reassociation d'un mesoderme de
patte et d'un ectoderme de patte, ont ete greffees a l'emplacement de bourgeons alaires
prealablement excises d'embryons hotes de 3i jours. Stade de traitement des bourgeons: 3 jours. Autopsie de tous les embryons hotes: 7 jours apres le traitement.
(A). Patte phocomele a 3 doigts. Le mesoderme avait ete traite pendant 6 min.
Dose d'yperite azotee: 0,05 mg/ml de Tyrode.
(B). Un minuscule moignon (fleche) est visible a l'emplacement du bourgeon d'aile.
Malformation de type ectromele. Dose: 0,05 mg/ml. Duree de traitement du mesoderme: 8 min.
(C). Patte d'aspect normal. Traitement de l'ectoderme, concentration de 0,05 mg/ml
pendant 8 min.
(D). Patte de type micromele et a partie distale reduite. Soudure des doigts. Traitement de l'ectoderme: 0,05 mg/ml pendant 20 min.
Temoins
Mesoderme
Ectoderme
Yperite Azotee
Mesoderme
Phocomele
Ectoderme
Normaux
Malformations distales
9
42
9
42
9
42
13
11
Tibia
--> 7
13
11
Femur
25
13
11
de cas
I N KJl I L L / l w
9
32
0
13
11
Perone
9
9
4
5
28 <—- ^ 2 8
9
17
21
13
11
MT 3
14
13
11
MT 2
Metatarsiens
0
13
11
MTX
c
—• 2
9
32
8
13
11
MT 4
r
25
14
• 8
9
28
13
11
111
13
11
11
9
9
16
22
1«— —> l
8<
0
13
11
I
Doigts
Tableau 3. Denombrement des pieces sauelettiaues vresentes dans les membres etudies
{les fleches indiquent les soudures de pieces squelettiques)
9
33
8
13
11
IV
oCO
N
r
C/3
a
oo
Vyperite azotee et les bourgeons de membres
379
r ectoderme a ete soumis aux doses de 0,4 et 0,5 mg/ml pendant 5 min, 8 ont
evolue en hemimeles, leurs squelettes etant reduits a la seule partie proximale
et 5 presentent des anomalies des doigts et des metatarsiens. Les experiences
effectuees a l'aide de doses elevees (I mg/ml de Tyrode) n'ont pas ete mentionnees dans le tableau, car la reassociation d'un tel ectoderme traite avec un
mesoderme sain s'est averee difficile; l'ectoderme trop altere ne reste pas au
contact du mesoderme et se detache de ce constituant au moment de la grefre.
Sur 12 membres provenant d'associations reussies, 4 possedent des doigts malformes, 2 n'ont pas evolue et 6 ne presentent qu'une seule piece cartilagineuse,
Tableau 4. Moyenne des longueurs des axes squelettiques A {femur + tibia
+ metatarsien 3 + doigt III) et des parties distales D {me'tatarsien 3
+ doigt III) en mm. Rapport de ces longueurs dans le cas des diffe'rents traitements
A
Nombre
de cas
Traitement
Bourgeons entiers
Temoins
Yperite azotee
Bourgeons dissocies
1. Mesoderme
Temoins
Yperite azotee
D
(axe squelettique) (partie distale)
Longueur en mm 1Longueur en mm
Rapport
D/A
18
23
19,01+0,54
5,65 ±0,59
8,13 ±0,22
3,34 ±0,34
0,43 ± 0,02
0,59 ± 0,04
13
7
16,58 ±0,61
5,34 ±1,06
2,83 ±0,28
7,67 ±0,19
3,21 ±0,48
2,83 ±0,28
0,46 ±0,01
0,60 ± 0,06
1,00
16,47 ±0,43
7,58 ±0,25
0,46 ± 0,01
14,36 ±0,43
5,88 ± 0,24
0,41+0,01
9,93 ± 0,29
2,37 ±0,14
0,24 ± 0,01
10,61 ±0,51
2,68 ± 0,27
0,25 ±0,01
8,98 ±0,84
2,10 ±0,27
0,23 ± 0,02
D* 18
2. Ectoderme
II
Temoins
Yperite azotee
8
0,05 mg/ml,
5-8 min
9
0,05 mg/ml,
10-20 min
20
0,1-0,3 mg/ml,
5 min
5
0,4-0,5 mg/ml,
5 min
D* Membre phocomele reduit a saL partie distale.
le femur. A Paspect exterieur, ces pattes a parties distales malformees presentent
des doigts soudes ou reduits de taille (Fig. 2, C a F). L'etude du squelette montre
des deformations de doigts caracterisees par la courbure des articles distaux,
l'absence d'un ou plusieurs doigts (ectrodactylie), ou des soudures de doigts et
de phalanges (syndactylie). Les alterations portent aussi bien sur les doigts que
sur les metatarsiens (tableau 3):
Dix-sept pattes seulement sur 42 membres etudies possedent le metatarsien
1 (MT^. Dans 28 cas, les metatarsiens 2 et 3 (MT2 et MT3) ont fusionne (la
fusion est indiquee par une fleche^—>dans le tableau 3). Le metatarsien 4 (MT4)
380
B. SALZGEBER
est present dans 34 cas sur 42. Notons que le doigt III persiste dans la plupart
des cas (36 sur 42), rnais il est generalement plus court que le doigt IV. Dans
3 cas seulement, il possede le nombre normal de 4 phalanges; dans 29 cas, il est
reduit a une phalange; dans 8 cas, il est soude au doigt II.
L'yperite azotee et les bourgeons de membres
381
Pour les autres doigts I, II, IV, on observe aussi des reductions du nombre de
phalanges. Les 42 membres etudies presentent tous un femur et un tibia. Ceux-ci
sont parfois de taille reduite. Le perone est visible dans 32 cas sur 42 alors
qu'apres traitement du mesoderme, il est toujours absent.
Les moyennes des mesures concernant la longueur de l'axe squelettique et la
longueur de la partie distale sont consignees dans le tableau 4. On observe un
net raccourcissement de la partie distale. Le rapport D/A est nettement inferieur
a celui du temoin. II est de 0,23 et 0,25 dans le cas des malformations distales
alors qu'il est de 0,46 pour les pattes temoins.
2. Etudes histologiques
Les etudes histologiques ont porte sur 18 bourgeons temoins et 47 bourgeons
'traites'. Dans 20 cas, c'est le mesoderme qui a ete soumis a Faction de l'yperite
azotee, aux concentrations de 0,05 a 0,5 mg/ml pendant 5 min. Dans 27 cas,
l'ectoderme a ete traite avec des doses de 0,2 et 0,5 mg/ml de Tyrode, pendant
FIGURE 2
Squelettes de pattes provenant d'ebauches de membres 'recombinees'. Les agrafes
indiquent Pemplacement du greffon. F= femur; T= tibia; MT = metatarsiens;
P = perone; doigts = I, II, III, IV.
(A). Patte temoin a 4 doigts. Toutes les phalanges sont presentes: le doigt I a 2
phalanges, le doigt II a 3 phalanges, le doigt III a 4 phalanges, le doigt IV a 5
phalanges, mais la demiere phalange des doigts III et IV est peu visible sur la photo.
(B). Patte phocomele obtenue a partir d'un bourgeon dont le mesoderme avait ete
soumis a un traitement a l'yperite azotee pendant 6 min (concentration 0,05 mg/ml).
(C). Traitement de l'ectoderme pendant 10 min a la concentration de 0,05 mg/ml.
Faible raccourcissement du tibia. Presence d'un perone de meme longeur que le tibia.
Les metatarsiens sont de taille normale. Les doigts sont malformes. Le doigt II ne
possede qu'une seule phalange, laquelle est soudee a la premiere phalange du doigt
III. Celui-ci presente 4 phalanges et le doigt IV n'en possede que 4 au lieu de 5.
(D). Traitement de l'ectoderme pendant 5 min, concentration d'yperite: 0,4 mg/ml.
Tibia de taille normale. Le perone est present mais n'est pas visible sur la photo.
Malformation de la partie distale. Le doigt III possede 1 phalange, le doigt IV a 2
phalanges.
(E). Traitement de l'ectoderme pendant 5 min. Concentration de la solution d'yperite:
0,1 mg/ml de Tyrode. Faible raccourcissement du tibia. Le perone est present.
L'extremite distale du membre est malformee. Soudure des metatarsiens 2 et 3.
Doigt IV a 2 phalanges, doigt 111 a 1 phalange, doigt II a 1 phalange? Fusion
des doigts.
(F). Patte provenant d'un bourgeon dont l'ectoderme avait ete traite pendant 5 min
a la dose de 0,2 mg/ml. Tibia bien developpe, mais absence du perone. Soudure des
doigts et des metatarsiens.
(G). Traitement de l'ectoderme, 0,5 mg pendant 5 min. Membre reduit a un
moignon.
(H). Traitement de l'ectoderme pendant 5 min. Dose de 0,5 mg/ml. Presence
d'un perone. Reduction considerable des doigts, mais les metatarsiens MT4 et MT3
sont bien developpes.
382
B. SALZGEBER
C.a
Vyperite
azotee et les bourgeons de membres
383
5 min. Les bourgeons de pattes ont ete fixes au liquide de Bouin 6, 15, 24 et 48 h
apres avoir ete greffes a Fembryon de Poulet hote. Des bourgeons entiers, non
dissocies, traites pendant 5 min (doses de 0,05 a 0,2 mg/ml) et greffes apres
lavage sur un embryon hote, presentent, 24 h apres le traitement, des alterations
comparables a celles decrites pour les bourgeons de membres d'embryons
traites dans Foeuf (Salzgeber, 1964, 1966). Sous une cape apicale, de structure
dense, a cellules petites, d'aspect cylindrique, s'etend un mesenchyme lache a
gros noyaux et a nombreuses figures mitotiques anormales (fig. 3 B). De fortes
doses d'yperite azotee (0,5 mg/ml) sont toxiques pour les deux constituants;
apres 24 h de traitement, on observe de nombreux noyaux pycnotiques non
seulement dans le tissu mesodermique mais aussi dans le tissu ectodermique.
Les bourgeons provenant de la reassociation d'un ectoderme sain et d'un
mesoderme traite dans les memes conditions que les bourgeons entiers, evoluent
comme ces derniers. La figure 3D montre les zones de la cape apicale normale
et du mesenchyme sous-jacent a gros noyaux, 24 h apres transplantation a
l'embryon hote. Des amas de cellules necrotiques apparaissent dans les cas
d'alterations importantes du tissu mesodermique, et au cours du developpement
ulterieur, entre 30 et 48 h apres le traitement. Notons que les doses superieures
a 0,1 mg/ml affectent le mesoderme de la meme maniere que les doses plus
faibles. La cape apicale est maintenue et parait normale. Au contact d'un
mesoderme tres altere, contenant de nombreux noyaux en pycnose, et obtenu
apres traitement avec des doses de 0,2 a 0,5 mg/ml, la cape apicale evolue
d'abord normalement pendant 24 h; des signes de degenerescence apparaissent
ulterieurement. La structure de la crete est desorganisee et des pycnoses sont
visibles. La plupart de ces bourgeons ne se developpent pas (malformations
ectromeles).
Comment evolue l'ectoderme provenant de bourgeons traites avec des doses
croissantes d'yperite azotee et place au contact d'un mesoderme de bourgeons
FIGURE 3
Coupes transversales de bourgeons de membres, 24 h apres le traitement. M =
mesoderme; E = ectoderme; c.a. = cape apicale. Coloration: hematoxyline-eosine.
(A). Bourgeon temoin non dissocie. Traitement au liquide de Tyrode pendant
6 min.
(B). Bourgeon non dissocie, greffe a l'embryon apres un traitement de 6 min a
Typerite azotee, dose de 0,05 mg/ml de Tyrode. Mesenchyme (M) a gros noyaux;
la cape apicale (c.a.) est bien developpee.
(C). Bourgeon temoin provenant de la reassociation d'un mesoderme traite au
liquide de Tyrode et d'un ectoderme sain.
(D). Bourgeon provenant de la recombinaison d'un mesoderme traite a l'yperite
azotee (0,05 mg/ml pendant 5 min) et d'un ectoderme sain. Le mesenchyme
presente une structure lache. Le bourgeon de membre a le meme aspect qu'un bourgeon traite non dissocie (fig. 3B).
384
B. SALZGEBER
sains? Nous avons utilise au cours de ces experiences, deux concentrations
differentes d'yperite azotee, d'une part, 0,2 mg/ml, dose qui determine l'apparition de malformations de la partie distale (fig. 2F) et d'autre part 0,5 mg/ml,
dose qui affecte le developpement de maniere plus intense; la croissance du
membre est affectee et la formation de la partie distale est inhibee (fig. 2G, H).
Vyperite azotee et les bourgeons de membres
385
Les tissus soumis a des doses faibles d'yperite azotee (0,05 mg/ml) ont le meme
aspect que les temoins. L'examen de coupes effectuees dans la zone distale du
bourgeon de membre, 24 h apres la reassociation d'un mesenchyme sain et
d'un ectoderme traite par l'yperite azotee (dose de 0,2 mg/ml, Fig. 4C) montre
un mesenchyme normal de structure dense a nombreuses figures mitotiques.
L'ectoderme et la cape apicale qui le recouvrent presentent des signes d'alterations. Les anomalies restent neanmoins faibles et localisees; la crete est presente,
elle contient des cellules alterees et des noyaux pycnotiques. Par endroits,
l'ectoderme et la crete s'efTritent. Au cours du developpement ulterieur, 48 h
apres le traitement, on observe des regions saines et des zones en degenerescence
(fig. 4D). La cape apicale, de petite taille dans la plupart des cas, est presente;
elle contient quelques elements pycnotiques et des cellules s'en detachent. Si
l'ectoderme provient de bourgeons traites avec de fortes doses d'yperite azotee
(0,5 mg/ml) et s'il est associe a un mesenchyme sain, le bourgeon ainsi reconstitue montre des figures de degenerescence, 6 h apres la greffe, alors que le
bourgeon temoin est sain. Non seulement, l'ectoderme et la crete, mais aussi le
mesoderme sous-jacent sont atteints. La zone de necrose est particulierement
nette dans la region distale; du cote proximal, on observe des cellules saines
parmi les elements necrotiques. Vingt quatre heures apres le traitement, la
disorganisation des tissus est complete (fig. 4E). Ces bourgeons ressemblent
aux bourgeons denudes, greffes a l'embryon apres traitement par le Versene
et non associes a une calotte ectodermique. Ces observations histologiques
mettent en evidence la sensibilite differentielle des deux constituants, mesodermique et ectodermique, de l'ebauche. Les doses necessaires pour detruire le
FIGURE 4
Sections transversales ou sagittales de bourgeons de membres fixes 24h, 48 h apres
la greffe a l'embryon de Poulet hote. Tous les bourgeons proviennent de la reassociation d'un ectoderme 'traite' et d'un mesoderme sain.
M = mesoderme; E = ectoderme; c.a. = cape apicale.
(A). Bourgeon temoin reassocie a partir d'un ectoderme traite au liquide de Tyrode
et d'un mesoderme. Fixation du bourgeon, 24h apres la greffe. Nombreuses mitoses
dans le mesenchyme (M).
(B). Bourgeon temoin, 48h apres la greffe.
(C). Traitement de l'ectoderme pendant 5 min a la dose de 0,2 mg/ml. Fixation
24 h apres le traitement. Alterations de la cape apicale.
(D). L'ectoderme a subi le meme traitement que celui du bourgeon de la fig. 4 C
(0,2 mg pendant 5 min), mais la fixation a ete effectuee 48 h apres le traitement.
La cape apicale est peu developpee et l'ectoderme s'effrite.
(E). Traitement de l'ectoderme pendant 5 min a la dose de 0,5 mg/ml. Fixation de
l'ebauche: 24h apres le traitement. Alterations de la calotte ectodermique et presence
de nombreuses zones de necrose dans le mesenchyme.
(F). Traitement de l'ectoderme (0,5 mg/ml pendant 5 min). Fixation 48h apres le
traitement. Effritement de la cape apicale. Presence de vacuoles dans le mesenchyme
provenant vraisemblablement de la degenerescence de cellules.
25
JEEM 22
386
B. SALZGEBER
composant ectodermique sont superieures a celles qui determinent I'alteration
du constituant mesodermique.
Au cours de nos experiences, nous avons observe dans la plupart des bourgeons, fixes 6 a 24 h apres la greffe, la presence de pycnoses ou de cellules
MT
L'yperite azotee et les bourgeons de membres
387
degenerees au sommet de la crete apicale. De telles alterations ont ete decrites
par Searls & Zwilling (1964) qui constatent, en outre, la degenerescence suivie
de regeneration de la cape apicale, dans certaines conditions experimentales.
B. Etude des associations chimeres
Des associations chimeres ont ete effectuees entre le mesoderme de bourgeon
d'aile et Fectoderme de bourgeon de patte et inversement entre le mesoderme
de bourgeon de patte et l'ectoderme de bourgeon d'aile.
1. Association: mesoderme de bourgeon d'aile et ectoderme de bourgeon de patte
Quinze greffons temoins ont atteint le stade de 10 jours. Les 15 membres sont
de type aile: 12 ont evolue normalement (fig. 5 A) et 3 sont legerement raccourcis
(micromeles).
Apres traitement a l'yperite azotee du bourgeon alaire dont le mesoderme est
ensuite place au contact d'un ectoderme de bourgeon de patte normal, on voit
apparaitre des malformations ectromeles, phocomeles ou micromeles (fig. 5C).
Toutes les pieces squelettiques, lorsqu'elles sont presentes, sont de type aile.
Quatorze bourgeons ont ete soumis a un traitement variant de 4 a 6 min (0,05
mg/ml); 11 d'entre eux ont evolue jusqu'au stade de l'autopsie de l'hote (10
jours). Ces membres sont de type phocomele (6 cas), micromele (2 cas) ou
ectromele (3 cas).
L'experience inverse qui consiste a recombiner un mesoderme d'une ebauche
alaire saine avec un ectoderme d'une ebauche de patte traitee a l'yperite azotee
(0,2 et 0,4 mg/ml, duree 5 min) fait apparaitre des anomalies de la partie distale.
FIGURE 5
Squelettes de pattes ou d'ailes provenant d'ebauches chimeres: associations entre
le mesoderme de bourgeon d'aile et l'ectoderme de bourgeon de patte et inversement
entre le mesoderme de bourgeon de patte et l'ectoderme de bourgeon d'aile. F =
femur; T = tibia; P = Perone; MT = metatarsiens; D = doigts; H = Humerus;
R = Radius; C = Cubitus; MC = metacarpiens. Les grossissements des figures
sont identiques a ceux des figures 2.
(A). Temoin: mesoderme de bourgeon d'aile + ectoderme de bourgeon de patte.
Formation d'une aile normale.
(B). Temoin: mesoderme de bourgeon de patte + ectoderme de bourgeon d'aile.
Formation d'une patte normale.
(C). Mesoderme de bourgeon d'aile (4 min de traitement a l'yperite azotee, 0,05 mg/
ml) associe a l'ectoderme d'un bourgeon de patte. Formation d'une aile de taille
reduite.
(D). Mesoderme de bourgeon de patte (5 min de traitement, 0,05 mg/ml) associe a
l'ectoderme d'un bourgeon alaire. Patte d'aspect phocomele.
(E). Mesoderme sain de bourgeon d'aile associe a un ectoderme de bourgeon de patte
(5 min de traitement, 0,2 mg/ml). Developpement d'une aile a partie distale reduite.
(F). Mesoderme normal de bourgeon de patte associe a l'ectoderme de bourgeon
d'aile traite (5 min de traitement, 0,2 mg/ml). Bon developpement de la partie
proximale, mais reduction de la partie distale.
25-2
388
B. SALZGEBER
Sur 9 greffons, observes a l'age de 10 jours: 2 ont evolue normalement, 4presentent des fusions et des raccourcissements de doigts et 3 sont reduits a leur seule
partie proximale, la partie distale est absente (fig. 5E).
2. Associations: mesoderme de bourgeon depatte et ectoderme de bourgeon d'aile
Les observations ont porte sur 10 bourgeons temoins et sur 31 bourgeons
dont le mesoderme ou l'ectoderme ont ete sounds a l'action de l'yperite azotee.
Les 10 bourgeons temoins ont tous evolue en membres de type patte: 9 d'entre
eux sont normaux (fig. 5B), 1 patte presente 1 doigt supplementaire a 2 phalanges.
Les membres provenant de bourgeons 'reconstitues' a partir d'un mesoderme
de patte traite a l'yperite azotee (0,05 mg/ml) pendant 4 a 6 min et d'un ectoderme d'aile ont evolue soit en phocomeles de type patte (13 cas, fig. 5D), en
micromeles (2 cas) on en ectromeles (12 cas).
Dans les 4 cas d'une association de mesoderme de bourgeon de patte sain et
d'ectoderme de bourgeon d'aile traite (0,2 mg/ml pendant 5 min), on obtient
egalement des pattes mais dont la partie distale est reduite (fig. 5F). Les malformations obtenues s;ont identiques a celles qu'on obtient dans les combinaisons
homogenes de mesoderme de patte avec l'ectoderme de patte.
Les experiences temoins qui consistent a soumettre le constituant mesodermique au liquide de Tyrode (duree 8 min) confirment les resultats obtenus par
Zwilling (1955), Hampe (1959), Kieny (1959) et Amprino & Camosso (1963) sur
le developpement des membres chimeres. L'evolution du membre est conforme
a l'origine du mesoderme. Tous les bourgeons de membres 'reconstitues'
donnent des pattes si le mesoderme est de type patte ou des ailes si le mesoderme
est de type aile. Le traitement du constituant mesodermique ne modifie pas cette
evolution du membre: en aile ou en patte. Les pieces squelettiques qui subsistent
sont determinees par le constituant mesodermique, quel que soit son degre
d'alteration. Les malformations obtenues sont identiques a celles qu'on obtient
dans le cas de combinaison: mesoderme de patte et ectoderme de patte ou
mesoderme d'aile avec ectoderme d'aile, apres traitement de l'un d'entre eux
par l'yperite azotee.
CONCLUSIONS
On sait, d'apres les travaux de nombreux auteurs, Saunders (1948), Zwilling
(1955, 1961), Hampe (1957, 1959), Kieny (1960), que la morphogenese normale
du membre de l'embryon de poulet depend d'interactions reciproques entre les
deux constituants du. bourgeon, le mesoderme et l'ectoderme. L'epiblaste et sa
crete apicale assureraient la croissance et la formation des parties distales du
membre, le mesoderme maintiendrait l'activite de l'ectoderme apical. Nos
recherches montrent qu'en agissant a l'aide d'un facteur toxique, sur l'un ou
l'autre des constituants des bourgeons de membres, cette morphogenese normale est perturbee. On obtient differents types de malformations selon que
Uyperite azotee et les bourgeons de membres
389
l'action porte sur le territoire mesodermique ou ectodermique de Febauche
(tableau 5).
Le traitement du constituant mesodermique determine essentiellement des alterations des territoires proximaux. C'est le cas de la phocomelie, malformation
caracterisee par l'absence ou la reduction extreme du femur, du tibia et parfois
Tableau 5. Resultats
5 min
5-8
Doses (mg/ml) . . .
Mesoderme
Ectoderme
0,05
Phocomeles
77,8 %
Ectromeles
22,2 %
Normaux
88,8%
Micromeles
11,2%
0,1
0,2
0,3
Phocomeles
42%
Ectromeles
0,4
0,5
Ectromeles 100 %
58%
Malformations
distales
91%
Hemimeles
9%
Malformations distales
38,5 %
Hemimeles
61,5%
des metatarsiens. Le perone manque dans tous les cas. La partie distale persiste
et presente 2, 3, ou 4 doigts. Dans les cas de degenerescence plus accentues, on
n'observe qu'un seul doigt, le doigt III; et, dans les cas extremes, le bourgeon
degenere completement; il en resulte la malformation de type ectromele. Ces
experiences apportent une explication embryologique a la genese des malformations phocomeles et ectromeles obtenues apres traitement de l'embryon dans
l'oeuf, a un stade precis du developpement. En effet, au stade de Fintervention,
les territoires proximaux, en voie de differenciation, sont sensibles a Faction de la
substance teratogene alors que la calotte ectodermique n'est pas alteree.
Celle-ci peut done induire la formation de parties distales a partir de territoires
qui n'ont pas ete detruits par le traitement; mais la croissance des zones proximales du bourgeon de membre est inhibee, le mesoderme altere ne pouvant
repondre a l'action inductrice de la cape apicale. Une atteinte plus intense du
mesoderme entraine la degenerescence du bourgeon. Des experiences chimeres,
realisees en associant un mesoderme d'un bourgeon de patte, traite a Fyperite
azotee, avec un ectoderme d'aile normale, ou inversement un mesoderme de
bourgeon alaire traite a Fyperite azotee associe avec un ectoderme pedieux
normal, ont montre que devolution en patte ou en aile du mesenchyme n'etait
pas modifiee par le traitement. Les membres obtenus au cours de ces experiences
sont des phocomeles de type patte ou de type aile selon Forigine du mesoderme.
Le traitement du constituant ectodermique a pour consequence Fapparition de
membres normaux ou de membres malformes selon la concentration d'yperite
390
B. SALZGEBER
azotee utilisee au cours de ces experiences. Notons que les malformations sont
tres differentes de celles qu'on observe apres traitement du constituant mesodermique. Ce sont les parties distales qui sont alterees alors que les territoires
proximaux sont normalement developpes ou ne presentent qu'un faible raccourcissement de leurs pieces squelettiques. Le perone est present dans la plupart des cas alors qu'il manque apres traitement du mesoderme. Ces malformations distales consistent en deformations de doigts, en soudures ou pertes de
phalanges. L'examen au microscope revele des anomalies dans le developpement de la crete apicale, mais les degenerescences cellulaires restent localisees
et n'affectent qu'une partie du tissu. Avec l'augmentation de la dose (0,5 mg/ml),
on voit apparaitre des malformations plus graves, ectrodactyles, hemimeles ou
des moignons reduits a une piece cartilagineuse. Les observations histologiques
montrent que la calotte ectodermique est nettement alteree, mais le mesenchyme
sous-jacent n'est pas epargne. Bien que provenant d'un bourgeon sain, il
presente, deja 6 h apres la greffe, d'importantes zones de necrose. Ces experiences montrent qu'en presence d'une cape ectodermique alteree, le mesoderme ne
peut poursuivre un developpement normal; il contient de nombreux elements
pycnotiques, la croissance est faible et la partie distale ne se forme pas. Les
bourgeons evoluent comme les bourgeons denudes auxquels on aurait enleve la
calotte ectodermique. Ces recherches confirment les travaux de Saunders
(1948), de Zwilling (1955), de Hampe (1959), Gasseling & Saunders (1959,
1961); selon ces auteurs, la croissance du membre serait inhibee en Fabsence de
cape apicale. II ressort de notre serie experimentale que les malformations distales
obtenues sont dues a 1'alteration de la calotte ectodermique.
Mais ici une remarque s'impose. Apres traitement dans l'oeuf des embryons
ages de 3 a 3^ jours, nous n'avons jamais observe ce type de malformations
distales; le mesoderme etant plus sensible au traitement que l'ectoderme, ce
sont surtout les parties proximales qui sont atteintes et les malformations sont
toujours de type micromele, phocomele ou ectromele. Les recherches que nous
poursuivons actuellement montrent qu'on peut obtenir des malformations
distales, des ectrodactyles et des hemimeles en traitant les embryons dans l'oeuf
entre 4 et 5 jours (stades 24 a 26 de Hamburger & Hamilton). En examinant
les bourgeons au microscope, 24 h apres le traitement, on constate que la zone
distale du mesenchyme presente d'importantes lesions, alors que la calotte
ectodermique parait intacte. Dans ce cas, les malformations sont dues, non pas
a une disorganisation de la crete apicale telle que nous l'avons observee apres
traitement de Fectodsrme de bourgeons dissocies, au stade 18-19 de H. et H.,
mais a une alteration du mesenchyme et en particulier de ses territoires les plus
distaux en voie de differentiation, les territoires proximaux n'etant que peu ou
pas leses.
L'ensemble des recherches apportent la preuve experimentale d'une difference
de sensibilite entre les deux constituants de l'ebauche de membre, confirmant
ainsi les observation:; histologiques effectuees par differents auteurs, sur l'em-
Vyperite azotee et les bourgeons de membres
391
bryon de Poulet (Salzgeber, 1966), de souris (Jurand, 1961, 1963) ou sur les
batraciens (Gillette & Bodenstein, 1946).
Les resultats evoquent ceux qui ont ete obtenus a l'aide des rayons X par
Schue (1951), Wolff & Kieny (1962). Ces auteurs ont montre qu'il existe une
competition de materiel entre les ebauches du tibia et du perone d'une part,
entre les differents rayons des doigts d'autre part.
Les lesions du constituant mesodermique dues a l'yperite azotee font apparaitre une dominance du tibia sur le perone et du doigt III sur les autres doigts.
Les alterations du territoire ectodermique provoquent des malformations
variees des doigts, mais le doigt III, bien que reduit a 1 ou 2 phalanges dans la
plupart des cas, persiste en dernier lieu.
RESUME
Les effets de l'yperite azotee sur les deux constituants du bourgeon de membre
ont ete etudies chez l'embryon de Poulet.
1. Les embryons, preleves au stade 18-19 de Hamburger & Hamilton (3 jours
d'incubation), sont immerges dans une solution d'yperite azotee et de liquide de
Tyrode a des concentrations variant entre 0,05 et 0,5 mg/ml. La duree du
traitement est de 5 a 20 min pour des doses de 0,05 mg/ml et de 5 min pour des
doses superieures a 0,05 mg/ml.
2. Les bourgeons de membres sont ensuite traites selon la methode de Zwilling
(1955), soit par le Versene pour obtenir le constituant mesodermique, soit par la
trypsine pour obtenir le constituant ectodermique. La recombinaison des deux
constituants a lieu selon 2 modalites: un mesoderme traite est associe a un
ectoderme sain et inversement un ectoderme traite est recombine a un mesoderme
sain. Les deux composants proviennent de bourgeons de pattes dans la plupart
des cas, mais des associations chimeres ont aussi ete effectuees entre les constituants des bourgeons alaires et pedieux.
3. Les bourgeons de membres ainsi reconstitues sont greffes, selon la methode
de Hampe (1959) a l'emplacement de bourgeons alaires, prealablement excises,
d'embryons notes ages de 3 a 3^ jours. La plupart des bourgeons, ainsi greffes,
sont preleves 7 jours apres le traitement. D'autres ebauches sont fixes 6 a 48 h
apres le traitement, en vue d'une etude histologique.
4. Les malformations obtenues different selon qu'on soumet le constituant
mesodermique ou ectodermique a Faction de l'yperite azotee (tableau 5). Le
traitement du constituant mesodermique determine l'apparition de membres
phocomeles et ectromeles, alors que le traitement du constituant ectodermique
a fortes doses fait apparaitre des malformations distales (deformation ou
raccourcissement des doigts, des ectrodactyles et des hemimeles), figs. 1 et 2.
5. Le degre d'alteration du membre depend de la dose d'yperite appliquee a
l'ebauche. Les 2 constituants presentent une difference de sensibilite nette
(tableau 5).
392
B. SALZGEBER
— Apres traitement du constituant mesodermique avec une dose de 0,05 mg/
ml pendant 5-8 min, on obtient essentiellement des membres phocomeles
(77,8 %). Les autres sont ectromeles (22,2 %). A l'inverse, les bourgeons dont
l'ectoderme est soumis au meme traitement, evoluent normalement dans 88,8 %
des cas ou presentenu un faible raccourcissement de leur squelette.
— Une augmentation de la duree du traitement ou des doses croissantes
d'yperite azotee (0,1 a 0,3 mg/ml pendant 5 min.) appliquees au mesoderme
determinent l'apparition d'un nombre eleve d'ectromeles (58%); le nombre de
phocomeles atteint 42%. Apres traitement du constituant ectodermique, on
observe d'importantes malformations des doigts (91 %).
— Pour des doses superieures a 0,3 mg/ml, le pourcentage des malformations
distales est de 38,5 % et celui des hemimeles depourvus de parties distales
atteint 61,5%. Le traitement du mesoderme produit l'ectromelie (100%).
6. L'etude histologique des bourgeons, 6 a 48 h apres la greffe, montre
d'importantes alterations apres traitement soit du constituant mesodermique
(fig. 3), soit du territoire ectodermique avec de fortes doses d'yperite azotee
(fig. 4).
7. Les experiences portant sur des associations chimeres montrent que le
traitement du constituant mesodermique ne modifie pas la qualite du membre;
celui-ci evolue en patte ou en aile selon l'origine du mesoderme. Les malformations sont identiques a celles qu'on observe apres traitement et reassociation
homogene de constituants de bourgeons de pattes ou de bourgeons d'ailes.
8. L'ensemble de ces recherches permettent de donner une interpretation
embryologique de la genese des malformations de membres, en particulier de la
phocomelie.
SUMMARY
Comparative study of the effects of nitrogen mustard on mesodermal and
ectodermal limb bud components of chick embryos
The effects of nitrogen mustard on the two components of chick embryo limb
buds have been studied.
1. The embryos, taken at stages 18—19 of Hamburger & Hamilton (3 days'
incubation) were immersed in a solution of Tyrode and nitrogen mustard, the
concentration of which varied from 0-05-0-5 mg/ml. The treatment lasted from
5 to 20min for doses of 005 mg/ml and 5 min for doses over 005 mg/ml.
2. Limb buds were then excised and treated according to Zwilling's method
(1955) either with Versene (EDTA) to get the mesodermal component or with
trypsin to get the ectodermal component. The tissues were recombined in two
ways: treated mesoderm was associated with normal ectoderm or treated
ectoderm was placed in contact with healthy mesoderm. The two components
were mainly taken from leg buds, but chimeric associations were also carried
out between wing and leg bud components.
3. The limb buds which were recombined in this way were grafted into host
Vyperite azotee et les bourgeons de membres
393
embryos, 3-3^ days old, according to Hampe's method (1959), in place of the
wing buds previously excised. Most buds, thus treated, were removed 7 days
after treatment and submitted to morphological study. Other grafts were fixed
6-48 h after treatment for histological study.
4. According to which tissue had been exposed to nitrogen mustard, varied
malformations of the limbs were produced. Treatment of the mesodermal part
resulted mostly in phocomelia and ectromelia, whereas treatment of the ectodermal part resulted in malformations of the digits (deformations or shortening
of the digits, ectrodactylia and hemimelia).
5. The degree of alteration of the limbs depends on the dose of nitrogen
mustard originally applied to the tissue. The two components showed an obvious difference in their sensitivity (Table 5).
(a) After treatment of the mesodermal component with a dose of 005 mg/ml
for 5-8 min, phocomelian limbs (77-8 %) were usually obtained. The others
were ectromelian (22-2 %). On the other hand, the buds whose ectoderm underwent similar treatment, developed normally in 88-8 % of the cases or showed a
slightly shortened skeleton.
(b) After increasing the time of treatment (10-20 min) or increasing the
doses of nitrogen mustard (01 to 0-3 mg/ml for 5 min) applied to the mesoderm,
a high proportion of ectromelian limbs (58 %) was obtained. The proportion of
phocomelian limbs was 42%. After treatment of the ectodermal component
(0-1-0-3 mg/ml), important malformations of the digits (91 %) were observed.
(c) With doses over 0-3 mg/ml, the percentage of distal malformations was
38-5 % and that of hemimelias deprived of distal parts reached 61-5 %.
6. Histological study of leg buds, 6-48 h after treatment, showed important
alterations either in the mesodermal or ectodermal component with strong
doses of nitrogen mustard.
7. Experiments with chimeric associations showed that the treatment of the
mesoderm did not change the nature of the limb. The latter developed into leg
or wing according to the origin of the mesoderm. The malformations were
similar to those one may observe after treatment and homologous reassociation
of limb bud components.
8. As a whole, these experiments allow us to give an embryological explanation of the genesis of limb malformations, especially of phocomelia.
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