/. Embryo!, exp. Morph. Vol. 22, I, pp. 69-98, August 1969
69
Printed in Great Britain
Etude des ribosomes et du glycogene des gastrules
de Xenopus laevis par cytochimie ultrastructurale
Par P. VAN GANSEN et A. SCHRAM 1
Laboratoire de Morphologie Animate, Universite Libre de Bruxeiles
Les travaux de J. Brachet et de ses collaborateurs sur le role des acides
nucleiques dans le developpement embryonnaire des Amphibiens ont eu
pour hypotheses directrices, ces dernieres annees (Brachet, 1965, 1967a, b,
1968), que les syntheses proteiniques specifiques des differentes etapes de la
morphogenese se feraient dans le cytoplasme au niveau des polyribosomes.
Les RNA messagers de ces organites existeraient dans l'ceuf sous des formes
stables qui se demasqueraient au moment de la maturation et assureraient
les syntheses proteiniques pendant la segmentation; a partir de la gastrulation,
ils seraient synthetises au contact de DNA chromosomiaux dereprimes de
facon differentielle par les territoires cytoplasmiques ou ils se trouvent. Au
gradient ribosomial animal-vegetatif de l'oeuf indivis se superposerait ainsi
dans les gastrules un gradient polysomial dorso-ventral, ce double gradient
etant l'equivalent biochimique des gradients morphogenetiques des embryologistes. Cette conception s'appuie actuellement sur un tres grand nombre
d'experiences faites a l'aide de techniques biochimiques et autoradiographiques
(Brachet, 19676).
Nous avons entrepris dans notre laboratoire l'etude de la distribution des
structures ribosomiales chez Xenopus laevis par les techniques de la microscopie
electronique: (1) dans les oocytes aux differents stades de l'oogenese (Thomas,
1967); (2) dans les oocytes murs et les oeufs vierges, tant dans le cytoplasme
peripherique (Van Gansen, 1966a) que dans le cytoplasme perinucleaire au cours
de la maturation (Brachet, Hanocq & Van Gansen, 1969); (3) dans les oeufs
fecondes (Van Gansen, 19666); (4) dans les oeufs en segmentation (Van Gansen,
1967). Le but du present travail est de decrire la distribution des structures
ribosomiales dans les differents territoires des jeunes gastrules de Xenopus laevis.
Cependant, au cours de nos recherches, il est devenu evident qu'il etait
possible de confondre des ribosomes, isoles ou associes en polyribosomes, avec
des granules de glycogene diversement associes (Hay, 1966; Perry, 1967; Van
Gansen, 1967; Brachet, Hanocq et Van Gansen, 1969). II etait des lors indispensable de poursuivre nos observations sur les embryons de Xenope a l'aide de
1
Adresse desauteurs: Universite Libre de Bruxelles, Laboratoire de Morphologie Animale,
67, rue des Chevaux, Rhode-St-Genese, Belgium.
70
P. VAN GANSEN ET A. SCHRAM
techniques de mise en evidence specifique, au niveau ultrastructural, tant du
glycogene que des ribosomes. Ces essais de cytochimie ultrastructurale ont ete
faits essentiellement sur les levres dorsales des gastrules observees.
MATERIEL ET METHODES
Materiel biologique
De jeunes gastrules de Xenopus laevis (stades 10 et 11 de Nieuwkoop & Faber,
1956) sont fixees suivant les modalites decrites ci-dessous. Chaque embryon
fixe est ensuite depose avec une goutte de tampon au phosphate dans une cupule
de diametre adequat decoupee dans de la cire. Quatre fragments y sont preleves
sous loupe binoculaire de maniere a obtenir un echantillon des blastomeres
situes: (a) pres du pole animal, (b) pres du pole vegetatif, (c) dans le territoire
ventral et (d) dans la levre dorsale du blastopore. Au total, une cinquantaine de
gastrules ont ete ainsi traitees.
Fixations
Toutes les fixations, excepte celles au permanganate, se font a la temperature
du laboratoire (environ 22 °C):
(1) Par Valdehyde glutarique. Le fixateur est de Faldehyde glutarique Fluka a
3 % dans un tampon au phosphate 0,1 M a pH 7-4 (Millonig, 1962). Les durees
de fixation sont de 30 min, 2 h et 4 h.
(2) Par le tetroxyde d'osmium. Le fixateur est une solution a 1 % de tetroxyde
d'osmium dans du tampon de Michaelis contenant du chlorure de calcium
(Ryter & Kellenberger, 1958a).
(3) Par Valdehyde glutarique suivi du tetroxyde d'osmium. Dans tous les essais,
l'aldehyde glutarique (AG) est en solution dans le tampon Millonig, le tetroxyde
d'osmium est en solution a 1 % dans le tampon Millonig et un lavage de 24 h
par le tampon Millonig a la temperature du laboratoire est intercale entre les
deux bains de fixation.
Quatre couples de fixateurs ont ete essayes: (a) AG a 6 % pendant 24 h + OsO4
pendant 1 h (Van Gansen, 1966a); (b) AG a 3 % pendant 2 h + OsO4 pendant
1 h; (c) AG a 3 % pendant 30 min + OsO4 pendant 1 h; (d) AG a 3 % pendant
4 h + OsO4 pendant 2 h (Perry, 1967).
(4) Par le permanganate de potassium en solution a 1 % dans de l'eau distillee
suivant Luft (1956). La fixation, pratiquee a 0 °C, dure 30 min.
Inclusions
(1) Dans l'Araldite apres deshydratation par l'alcool ethylique suivant
Glauert & Glauert (1958).
(2) Dans le glycolmethacrylate (GMA) suivant Leduc et Bernhard (1967).
(3) Dans le Vestopal, apres deshydratation par l'acetone suivant Ryter &
Kellenberger (19586).
Ribosomes et glycogene des gastrules
71
Traitement des coupes
(1) Contrastants generaux des structures cellulaires
(a) Acetate d'uranyle en solution dans l'alcool ethylique (apres Araldite) ou
dans du tampon Michaelis (apres GMA), suivi du citrate de plomb suivant
Reynolds (1963).
(b) Les memes contrastants (apres Araldite) precedes d'une oxydation par
flottaison des coupes fines sur une solution a 1 % d'acide periodique pendant 30,
45 min et 60 min.
(2) Contrastants mettant en evidence les ribosomes
(a) D'apres Sabatini, Miller & Barnett (1964), la 'coloration' par le plomb
seul apres une fixation par le seul aldehyde glutarique ne met en evidence que
les ribosomes. Des essais de coloration au plomb ont ete faits apres fixation a
TAG 3 % pendant 30 min, 2 h et 4 h et enrobage par l'Araldite, le Vestopal ou
le GMA, soit par la methode de Karnovsky (1961), soit par celle de Reynolds
(1963). Les colorations etaient pratiquees tantot sur des coupes flottantes, tantot sur des coupes fixees aux grilles.
(b) La technique de Watson & Aldridge (1961, 1964) mettant les acides
nucleiques en evidence en impregnant les pieces par de Yindium (fixation AG
3 % pendant 30 min, enrobage au Yestopal).
(3) Digestion specifique des ribosomes
Essais de digestion pratiques a 37 °C sur des coupes flottantes de pieces fixees
pendant 30 min par FAG a 3 % et enrobees dans le GMA:
(a) par la ribonuclease en solution a 0,5 % dans de l'eau distillee pendant 1 et
2h:
(b) par la ribonuclease a 0,5 % pendant 0,5 h ou 2 heures, precedee de pronase
en solution a 0,01 % dans de l'eau distillee pendant 30 min.
Lors de chaque digestion, des coupes controles sont maintenues sur l'eau
distillee a 37 °C pour des durees equivalentes a celles des digestions enzymatiques.
(4) Contrastants spicifiques des polysaccharides
Les trois techniques que nous avons utilisees se pratiquent sur des pieces
fixees a TAG et au tetroxyde d'osmium et enrobees dans l'Araldite.
(a) Coloration par le citrate de plomb apres oxydation des coupes par l'acide
periodique, suivant Perry (1967);
(b) Coloration par l'acetate d'uranyle apres oxydation successive des coupes
par l'acide periodique et un oxydant transformant les groupes aldehydes en
groupes carboxyls contrasted par le sel d'uranyle, suivant J. P. Revel & M.
Karnovsky (communication personnelle);
P. VAN GANSEN ET A. SCHRAM
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Ribosomes et glycogene des gastrules
73
(c) Coloration au proteinate d'argent apres oxydation des coupes par l'acide
periodique suivi d'un traitement par la thiosemicarbazide, suivant Thiery (1967).
(5) Digestions spe'cifiques des polysaccharides
Les pieces sont flxees successivement par TAG et le tetroxyde d'osmium, puis
enrobees au GMA, suivant Perry (1967); la surflxation par le tetroxyde d'osmium preserve le glycogene qui est extrait par le GMA apres fixation par le seul
aldehyde glutarique.
Les coupes flottantes sont digerees a 37 °C par Vamylase en solution a 1 %
dans de l'eau distillee pendant 10 a 20 min. Des coupes controles sont flottees
sur l'eau pour des durees et a une temperature equivalente.
Les coupes sont faites a l'aide d'un Ultrotome LKB et observees a l'aide d'un
microscope AEI type EM 6 B.
OBSERVATIONS
A. Pole animal et levre dorsale
1. Mise en evidence du glycogene /3 intracellulaire
Apres double fixation (aldehyde glutarique-osmium), enrobage a PAraldite
et double coloration (acetate d'uranyle-plomb), on observe dans le cytoplasme
un tres grand nombre de petits granules dont la dispersion n'est pas homogene.
En efFet, des groupes de granules serres les uns contre les autres au sein d'un
hyaloplasme moderement contraste alternent avec des groupes de granules
disperses dans des plages claires (fig. 1A).
Dans ces conditions techniques, en particulier lorsque la fixation aldehydique
est forte (6%, 24 h), tous les granules ont un aspect tres semblable; leurs
ABREVIAT1ONS
A
C
E
Er
G
L
M
annelets nucleaires
chromidies
espace extracellulaire
ergastoplasme
glycogene
lipochondrie
mitochondrie
noyau
N
Nu nucleole
P
plaquette
Pg polygranules
Pi pigment
Ps polysaccharide
R
ribosome
FIGURE 1
A. Blastomeres dorsaux de gastrule de Xenope. Repartition des granules en plages
claires (glycogene p) et plages plus denses (ribosomes). Entre les deux blastomeres,
Tespace extracellulaire est rempli de glycogene ft. Aid. glut.-Os., Araldite, uranyleplomb. x 20.000.
B. Blastomere animal de gastrule de Xenope. Plage claire a polygranules (Pg) et
vesicules ergastoplasmiques (Er). Aid. glut.-Os., Araldite, uranyle-plomb. x 20.000.
C. Blastomere dorsal de gastrule de Xenope. Une plage a polygranules, du glycogene P parmi les ribosomes (R) faiblement contrasted. Aid. glut.-Os., Araldite,
Revel-Karnovsky. x 60.000.
74
P. VAN GANSEN ET A. SCHRAM
Ribosomes et glycogene des gastrules
75
diametres se repartissent suivant une courbe de Gauss unimodale, le diametre
moyen est de 26 nm. Par contre, Jorsqu'on applique des techniques de mise en
evidence specifique du glycogene — Revel-Karnovsky, Thiery ou Perry —
certains granules seulement se contrastent, en particulier tous ceux qui occupent
les plages claires (fig. 1 C). Le contenu des plages claires est d'ailleurs digere par
J'amylase ainsi que nous le preciserons plus loin. Le diametre des granules ainsi
contrasted varie entre 25 et 33 nm. Ces granules paraissent done pouvoir etre
identifies comme etant du glycogene ft (Drochmans, 1962).
Par ailleurs, on observe quelquefois de petits groupes compacts de granules
ft delimites par une membrane (fig. 1A). Les plus petits de ces groupes ont
l'aspect des 'chromidies'' que nous avons decrites dans les stades embryonnaires
plus precoces. Signalons que l'aspect du glycogene ft mis en evidence par la
technique de Perry varie a la fois avec la duree de la fixation aldehydique et la
duree de l'oxydation par l'acide periodique. En efifet, si la fixation est breve
(3 %, 2 h ou moins) et le temps de l'oxydation long (1 %, 45 min ou plus), les
granules ont tendance a confluer les uns avec les autres en un amas plus ou
moins vermicule (fig. 2F) rappelant l'aspect du glycogene a du foie fixe par le
permanganate (Drochmans, 1960). On peut tirer profit de cette particularite
pour mettre le glycogene en evidence dans des coupes dont le contraste general
est bon en faisant suivre une oxydation longue (60 min) d'une double coloration
acetate d'uranyle-citrate de plomb (fig. 2D). Les petits granules de quelque
20 nm qui alternent dans ces coupes avec les plages de glycogene sont probablement des ribosomes, comme nous le verrons plus loin.
2. Autres polysaccharides intracellulaires
Dans certaines plages claires particulierement etendues, on peut observer des
granules associes en chainettes de longueurs variables (fig. 1 B). La taille de ces
granules comme leurs affinites pour les divers contrastants testes sont identiques
a celles des particules de glycogene ft. Le nombre de granules associes varie de
2 a 20, les chainettes pouvant d'ailleurs presenter des ramifications laterales
FIGURE 2
A. Vesicule extracellulaire a polygranules. Aid. glut.-Os., Araldite, uranyle-piomb.
x 100.000.
B. Polygranules extracellulaires. Aid. glut., Araldite, Thiery. x 100.000.
C. Polygranules intracellulaires. Aid. glut.-Os., Araldite, Perry (30 min ac. periodique). x 100.000.
D. Blastomere dorsal d'une gastrule de Xenope; plages a ribosomes (/?) alternant
avec des plages a glycogene (C). Aid. glut.-Os., Araldite, ac. periodique 60 min,
uranyle-plomb. x 60.000.
E. Polygranules intracellulaires. Aid. glut.-Os., Araldite, Revel-Karnovsky.
x 100.000.
F. Polysaccharides extracellulaire et intracellulaire. Aid. glut.-Os., Araldite,
Perry (60 min ac. periodique). x 100.000.
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P. VAN GANSEN ET A. SCHRAM
Ribosomes et glycogene des gastrules
11
(fig. 1 C). De plus, on observe frequemment un court filament unissant deux
granules voisins, que ce soit apres double coloration acetate d'uranyle-citrate
de plomb (fig. 2A), Revel-Karnovsky (fig. 1C, 2E), Thiery (fig. 2B) ou Perry
(fig. 2C). Dans la suite du travail nous designerons ces granules associes en
chainettes sous le terme de 'polygranules'.
Enfin, dans certains blastomeres externes, on observe de grandes plages
limitees par une membrane (fig. 3A, B) etremplies d'un enchevetrement de fines
fibrilles epaissies en petites nodosites irregulieres (fig. 3C). Ce materiel est
fortement contraste par les techniques de Perry et de Thiery. Nous n'avons
malheureusement pas observe ces formations dans nos pieces preparees pour la
digestion par l'amylase.
3. Le materiel extracellulaire
Les parties distales des blastomeres externes sont etroitement accolees les
unes aux autres: des desmosomes s'y sont differencies (fig. 3 A, B). Mais a cette
exception pres, les blastomeres des gastrules ne sont pas parfaitement jouxtes.
Dans les etroits espaces qui les separent, on observe frequemment des vesicules
plus ou moins rondes dont le diametre varie de 1 a 5 fi. Limitees par une membrane simple, elles ne contiennent que des granules de quelque 30 nm de diametre, generalement associes en chainettes tout a fait semblables aux polygranules que nous avons decrits dans les blastomeres. Les membranes des
vesicules sont souvent rompues; les granules envahissent alors tout l'espace
interblastomerien (fig. 4A, B). Les granules isoles ou associes en chainettes sont
contrasted par Je 'Thiery' (fig. 5A, B), le 'Perry' (fig. 6A, B) et le 'RevelKarnovsky'. Comme le signale Perry (1967), le glycogene se retrouve dans les
pieces enrobees au glycolmethacrylate apres double fixation AG-tetroxyde
d'osmium, pour autant que la surfixation osmiee soit suffisamment longue
(1 %, 2 h). Dans ces conditions techniques, le contenu des vesicules extracellulaires apparait sous forme, non plus de granules, mais d'une masse plus ou
moins reticulee (fig. 6C). Les granules qui occupent les plages claires des blastomeres presentent un aspect analogue (fig. 6C). Le contenu des vesicules extracellulaires et des plages claires disparait apres digestion breve (1 %, 10 min)
des coupes par l'amylase (fig. 6D).
FIGURE 3
A. Trois blastomeres animaux en peripherie d'une gastrule de Xenope. Les deux
blastomeres de gauche sont unis par des desmosomes (fleches). L'un contient des
plages a polygranules (Pg), l'autre une plage caracterisee par un polysaccharide de
type inconnu (Ps). Aid. glut.-Os., Araldite, uranyle-plomb. x 8.500.
B. Meme legende quefig.A. Aid. glut.-Os., Araldite, ac. periodique 30 min, uranyleplomb. x 8.500.
C. Meme legende que fig. B. x 60.000.
P. VAN GANSEN ET A. SCHRAM
Ribosomes et glycogene des gastrules
79
4. Mise en evidence des ribosomes
La technique a rindium de Watson et Aldridge, specifique des acides
nucleiques, met en evidence un grand nombre de granules d'environ 20 nm dans
le cytoplasme des blastomeres (fig. 7 A). Ces petits granules sont generalement
isoles les uns des autres, mais parfois on les observe associes en chainettes
enroulees en crosses caracteristiques (fig. 7B). D'autre part, les colorations au
plomb apres fixation aldehydique seule, mettent en evidence des granules
d'environ 20 nm de diametre, que ce soit apres enrobage au Vestopal (fig. 7C),
a f Araldite (fig. 7D) ou au GMA (fig. 7E). Signalons que, quel que soit le
processus suivi, les colorations au plomb apres fixation aldehydique seule se
sont montrees capricieuses, certaines coupes ou certaines parties de coupes ne
se colorant pas du tout. D'autre part, le cytoplasme des pieces fixees a FAG et
enrobees au GMA montre une alternance de plages vides de toute structure et
des plages riches en granules (fig. 8 A). Ces granules ne sont plus clairement
visibles apres digestion des coupes par la ribonuclease (fig. 8B) et toute structure
semble avoir disparu apres action de la pronase suivie de la ribonuclease
(fig. 8C).
Cet ensemble d'observations nous permet d'identifier les petits granules de
20 nm comme etant des ribosomes. Signalons que la fixation au permanganate
fait disparaitre du cytoplasme toute structure granulaire (fig. 8D, E).
5. La region nucleaire
Les coupes de noyaux presentent frequemment un ou deux corps nucle'olaires.
Certains de ces nucleoles presentent une structure homogene finement fibrillaire.
D'autres ont une structure bipartite: au sein de la masse fibrillaire on distingue
une zone circulaire, tres contrasted par l'acetate d'uranyle et le plomb et de
constitution granulaire (fig. 9A). Observe au microscope a lumiere ou au
microscope electronique a faible grossissement, le contour des noyaux apparait
circulaire. Mais a plus fort grossissement on observe une profonde et etroite
invagination de l'enveloppe nucleaire qui, sur certaines coupes, se ramifie en
trois ou quatre branches (fig. 10A). Les espaces delimiters par ces replis de
l'enveloppe sont occupes par du cytoplasme ou Ton distingue des mitochondries,
des saccules ergastoplasmiques (fig. 10B), des granules /? de glycogene (contrastes par le 'Perry', le 'Revel-Karnovsky' et le 'Thiery') et des ribosomes
FIGURE 4
A. Espace extracellulaire (£) situe entre quatre blastomeres dorsaux de gastrule de
Xenope. L'espace est rempli de polygranules. Aid. glut.-Os., Araldite, uranyleplomb. x 12.500.
B. Espace extracellulaire (E) situe entre deux blastomeres dorsaux de gastrule de
Xenope. Vesicules a glycogene /? et a polygranules. Aid. glut.-Os., Araldite, uranyleplomb. x 25.000.
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P. VAN GANSEN ET A. SCHRAM
Ribosomes et glycogene des gastrules
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(contrastes par le plomb et l'indium) dont certains associes en polyribosomes
(fig. IOC). D'autre part, en dehors du cytoplasme invagine, on observe frequemment des saccules ergastoplasmiques plus ou moins paralleles a l'enveloppe
nucleaire (fig. 9B, fig. 10A).
6. Le cytoplasme
En dehors de la region nucleaire, on observe un certain developpement de
l'ergastoplasme, plus particulierement dans le cytoplasme peripherique des
blastomeres (fig. 1B).
Entre les plages a ribosomes, glycogene /? et polygranules, on observe en
outre des vesicules lisses et quelques appareils de Golgi peu developpes. La
plupart des mitochondries sont globulaires mais, comme dans les stades precedents, certaines sont allongees, avec des cretes transversales bien developpees
(fig. 9 A). Les Jipochondries et les plaquettes vitellines ont un aspect normal, non
altere. Nous n'avons observe ni lysosomes, ni phagosomes. Les grains de pigments sont presents dans les blastomeres externes. La fixation au permanganate
y met en evidence une structure cristalline centrale (fig. 8D).
B. Pole vegetatif et champ ventral
Les blastomeres de ces territoires se caracterisent evidemment en premier lieu
par l'abondance des plaquettes vitellines apparemment non alterees. A part les
grains de pigments, nous y observons tous les organites que nous venons de
decrire dans les blastomeres animaux et dorsaux.
Certains traits les differencient cependant des cellules animales et dorsales:
(1) Les noyaux ne presentent pas d'invaginations cytoplasmiques.
(2) Les saccules ergastoplasmiques sont peu ou pas developpes.
(3) Les grandes plages a polygranules sont frequemment limitees par une
membrane, fait exceptionnel dans les autres territoires.
(4) Les vesicules extracellulaires a polygranules ou a glycogene /? sont absentes
ou rares. Pour un meme embryon, elles sont toujours beaucoup moins frequentes
dans les fragments ventraux et vegetatifs que dans les autres fragments.
DISCUSSION
1. Preservation du glycogene et des ribonucleoproteines
De tous les fixateurs que nous avons utilises, seul le permanganate de potassium ne preserve pas les ribosomes. Ce fixateur ne conserve pas davantage le
glycogene /?, ni les polygranules. Or, si cet effet de dissolution est bien connu
quant aux ribosomes (Bradbury & Meek, 1960), il n'a pas ete signale jusqu'a
FIGURE 5
A. Vesicule extracellulaire a polygranules. Aid. glut.-Os., Araldite, Thiery. x 27.000.
B. Meme legende que fig. A. x 100.000.
6
JEEM 23
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l
- D
Ribosomes et glycogene des gastrules
83
present pour le glycogene /?. Le permanganate passe meme pour un bon fixateur
du glycogene sous sa forme a (Luft, 1956; Drochmans, 1960). Revel (1964)
estime que la preservation du glycogene par le permanganate permet de differencier cette substance d'avec les ribosomes. Nos observations sur le glycogene
des embryons de Xenope nous entrainent a plus de prudence: la disparition des
granules apres fixation au permanganate ne peut etre tenue pour une preuve de
non-existence de glycogene dans ces granules.
Lesfixateurs osmies et les fixateurs doubles aldehyde glutarique-osmium (ou
formaldehyde-osmium, comme nous l'avons controle) conservent le glycogene.
Mais l'aspect qu'il presentera sur les coupes dependra des traitements que
subissent les pieces apres la fixation.
Apres deshydratation ethylique et enrobage a l'Araldite, le glycogene est
present sous forme de granules. Apres enrobage au GMA, il apparait en amas
plus ou moins reticules, d'autant moins solubles dans l'eau que la post-fixation
osmiee a ete plus longue.
Les resultats sont moins clairs apres fixation par les aldehydes seuls. De fait,
il semble bien que ce mode de fixation preserve le glycogene: Stadhouders a
demontre (1965, p. 53) que 97 % du glycogene initial se retrouvent dans des
tranches de foie fixees par le formaldehyde ou le glutaraldehyde. Cependant,
dans les pieces fixees par TAG et enrobees au GMA, le glycogene a du foie
(Leduc & Bernhard, 1967) comme le glycogene /? des embryons d'Amphibiens
(Perry, 1967) disparaissent. Dans ces conditions techniques, nous n'avons pas
davantage observe de glycogene dans les embryons. La non-preservation apres
fixation aldehydique et enrobage au glycolmethacrylate parait done caracteristique du glycogene.
La mise en evidence du glycogene apres fixation aldehydique et enrobage par
les resines epoxy ou le Vestopal est plus controversee. On sait que le glycogene
isole, qu'il soit du type a (Revel, Napolitano & Fawcett, 1960) ou du type /?
(Rosati, 1967) est fortement contraste par des solutions alcalines de plomb. Par
contre, ces solutions ne contrastent pas le glycogene fixe par un aldehyde puis enrobe, qu'il s'agisse de glycogene a apres enrobage a l'Epon (Sabatini et al. 1964)
ou au Vestopal (Marinozzi, 1963) ou encore de glycogene /? apres enrobage au
Yestopal (Rosati, 1967). Pour Sabatini et al (1964) et Marinozzi (1963), les
solutions alcalines de plomb utilisees dans ces conditions techniques sont des
FIGURE 6
Vesicules extracellulaires a glycogene entre des blastomeres dorsaux
de gastrules de Xenope. x 40.000.
A. Aid. glut.-Os., Araldite, Perry.
B. Aid. glut.-Os., Araldite, ac. periodique 30 min, uranyle-plomb.
C. Aid. glut., glycolmethacrylate, eau distillee a 37 °C pendant 10 min, uranyleplomb.
D. Aid. glut., glycolmethacrylate, amylase a 37 ° C pendant 10 min, uranyle-plomb.
6-2
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Ribosomes et glycogene des gastrules
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contestants specifiques des nucleoproteines. En opposition avec ces differents
travaux, Minio PaJueJlo & Rosati (1968) parviennent a contraster du glycogene
par des solutions alcalines de plomb dans des pieces de foie fixees par 1'aldehyde
glutarique et enrobees a l'Epon. Ces auteurs insistent sur 1'importance, en tant
que fixateur de glycogene, des alcools utilises au cours des processus de deshydratation: des durees de deshydratation plus ou moins longues expliqueraient
Jes resultats contradictories relates.
Dans les embryons fixes par l'aldehyde glutarique (ou le formaldehyde) et
enrobes a l'Araldite, apres deshydratation par l'alcool ethylique (notamment
pendant une nuit par l'ethanol 94 °), nous observons dans les coupes de
grandes plages depourvues de petits granules qui n'existent pas apres double
fixation ou fixation osmiee. Cependant, lorsque deux coupes voisines sont
colorees l'une par le plomb seul, l'autre par l'acetate d'uranyle et le plomb, on
n'observe dans la premiere que de petits granules irreguliers d'environ 20 nm
(que nous supposons etre les ribosomes) et dans la seconde un melange de ces
petits granules et de granules plus gros (±30nm) et plus ronds (que nous
supposons etre un melange de ribosomes et de glycogene /?).
Nous arrivons ainsi a la conclusion que les aldehydes seuls, meme suivis
d'une longue deshydratation ethylique ne preservent que partiellement le glycogene, en particulier sous sa forme /?, et sont done de mauvais fixateurs de cette
substance. Dans ces conditions, les solutions alcalines de plomb ne contrastent
generalement pas le glycogene (et deviennent specifiques des nucleoproteines),
mais de petites modifications techniques (durees respectives de fixation et de
deshydratation) peuvent entrainer une coloration positive du polysaccharide.
L'interpretation des resultats apres fixation aldehydique et coloration au plomb
devra done toujours etre prudente.
2. Critique des techniques de mise en evidence des ribosomes
La mise en evidence des nucleoproteines par une solution alcaline de plomb
apres fixation aldehydique et enrobage aux resines epoxy presente deux types
d'inconvenients: (a) sa specificite, generalement bonne, demeure, nous venons
de le voir, sujette a caution; (b) la colorabilite des ribosomes est capricieuse.
FIGURE 7
A. Blastomere dorsal de gastrule de Xenope. Les ribosomes cytoplasmiques et
mitochondriaux sont mis en evidence. Aid. glut., Vestopal, Watson-Aldridge.
x 15.000.
B. Ribosomes cytoplasmiques et mitochondriaux (M), polyribosomes (fleches).
Aid. glut., Vestopal, Watson-Aldridge. x 50.000.
C. Ribosomes de gastrules. Aid. glut., Vestopal, plomb Reynolds, x 50.000.
D. Ribosomes de gastrules. Aid. glut., Araldite, plomb Reynolds, x 50.000.
E. Ribosomes de gastrules. Aid. glut., glycolmethacrylate, plomb Reynolds
x 50.000.
86
P. VAN GANSEN ET A. SCHRAM
Ribosomes et glycogene des gastrules
87
Nous avons fait des essais pendant des temps variables a l'aide de plomb
Reynolds, de plomb Millonig, de plomb Karnovsky, sur coupes flottantes et
sur grilles, apres enrobage a l'Araldite ou au Vestopal sans arriver a definir
pourquoi certaines coupes ou parties de coupes ne se coloraient pas (alors
qu'apres double fixation tous ces essais nous ont donne des resultats reguliers
et analogues).
La technique a l'indium de Watson & Aldridge (1961, 1964), bien que
fastidieuse, est done extremement utile par sa specificite de mise en evidence des
nucleoproteines. Elle nous parait presenter un inconvenient non signale par les
auteurs: le contraste s'affaiblit avec le temps et il est done necessaire d'examiner
les coupes peu de temps apres qu'elles aient ete effectuees.
Enfin, la digestion des coupes par la ribonuclease apres fixation breve a FAG
et enrobage au GMA nous a donne les resultats attendus. Signalons cependant
que les ribosomes des embryons se sont montres beaucoup plus resistants a la
ribonuclease que ceux des fragments de pancreas de souris que nous avons
traites simultanement.
3. Critique des techniques de mise en evidence du glycoghne
Nous J'avons vu, les techniques de Perry, Revel-Karnovsky et de Thiery nous
ont donne des reponses tres comparables. Cependant, des trois techniques, celle
de Thiery nous parait la plus agreable: (a) le Revel-Karnovsky dissout les
lipochondries tres nombreuses des blastomeres, ce qui rend les coupes fragiles;
(b) le Perry demande des temps d'oxydation assez precisement ajustes aux temps
de fixation, sous peine d'alteration assez importante des granules de glycogene.
Signalons que le 'Perry' comme le 'Thiery' mettent en evidence dans les
granules du glycogene /? une infrastructure granulaire qui pourrait correspondre,
par ses dimensions, aux infragranules y de Drochmans (1960). Dans nos conditions techniques, nous ne pouvons evidemment exclure qu'il s'agisse d'artefacts.
Enfin, nous avons pu montrer que les granules de 30 nm sont digeres par
Yamylase. Nous n'avons cependant obtenu ce resultat qu'apres double fixation
et enrobage au GMA. Apres enrobage a l'Araldite, nous n'avons observe aucune
digestion des granules, meme apres 18 h d'incubation dans une solution d'amylase a 37 °C. Rappelons que Rosati n'a pas davantage obtenu de digestion du
glycogene /? des muscles stries apres double fixation et enrobage au Vestopal,
alors que dans ces memes conditions le glycogene cc du foie est digere.
FIGURE 8
A-C. Ribosomes de gastrules. Aid. glut., glycolmethacrylate, uranyle-plomb.
x 50.000. (A) Coupes flottees 120 min sur eau distillee a 37 °C. (B) Coupes
flottees 120 min sur RNase a 0,5 % a 37 °C. (C) Coupes flottees pendant 30 min
sur pronase 0,01 % puis 60 min sur RNase 0,01 % a 37 °C.
D, E. Blastomere animal de Xenope fixe au permanganate; le cytoplasme est
totalement depourvu de granules. Un reseau apparait au centre des grains de pigments (Pi). KMnO4, Araldite. (D) x 100.000. (E) x 30.000.
88
•»#
P. VAN GANSEN ET A. SCHRAM
Ribosomes et glycogene des gastrules
89
Nos principaux resultats sur la cytochimie des ribosomes et des granules de
glycogene des embryons d'Amphibiens, compares avec certaines donnees de la
litterature, sont resumes dans le tableau 1.
4. Nature des polygranules
II est certain que les granules en chainettes que nous avons decrits dans la
region corticale des ceufs indivis (Van Gansen, 1966&) comme dans les ceufs en
segmentation (Van Gansen, 1967) sont identiques aux polygranules que nous
decrivons dans les blastomeres et les espaces extracellulaires des gastrules de ce
Batracien (observations cytochimiques inedites). II est egalement certain, comme
Hay (1966) 1'a affirme, que ces polygranules ne sont pas des polyribosomes.
Pour cet auteur, qui s'appuie sur des observations faites a l'aide de la technique
de Revel-Karnovsky, les granules en chainettes sont une forme de glycogene
mimetique des structures polyribosomiales. Or, si l'ensemble de nos observations cytochimiques demontrent la presence de polysaccharides dans ces structures, si les granules en chainettes reagissent dans nos essais comme les particules
de glycogene /?, la forme tres originale de ces structures, la presence d'un
filament entre les granules, les localisations particulieres qu'elles occupent au
sein de ces embryons nous incitent a plus de prudence dans nos conclusions.
En effet, sur des bases purement cytochimiques, nous ne pouvons tenir comme
demontree aucune des quatre hypotheses interpretatives suivantes: (1) les polygranules sont une forme nouvelle de glycogene, (2) ils sont formes d'un autre
polysaccharide non identifie, (3) ils sont formes de glycogene /? associe a
d'autres molecules (polysaccharides ou proteines), (4) ils sont formes de polyribosomes associes a des polysaccharides. II nous semble que seule une analyse
biochimique des polygranules isoles peut nous aider a resoudre le probleme.
Le mimetisme que presentent les polygranules et les polyribosomes rend cette
analyse tres souhaitable.
5. Distribution des polysaccharides dans les jeunes embryons de Xenope
La distribution des polysaccharides subit, selon nous, des modifications
importantes au cours des differentes phases du developpement embryonnaire
du Xenope:
(a) Dans l'oocyte mur, ribosomes et glycogene /? forment une population
mixte et dense de granules serres les uns contre les autres.
FIGURE 9
A. Region nucleaire d'un blastomere dorsal de Xenope. Le nucleole (Nu) presente
deux regions nettement distinctes. Les annelets (A) de la membrane sont bien
visibles. Les petits granules perinucleaires sont un melange de ribosomes et de
glycogene /?. Aid. glut.-Os., Araldite, uranyle-plomb. x 22.000.
B. Meme legende que fig. A. Une vesicule ergastoplasmique est proche du noyau,
x 31.000.
90
P. VAN GANSEN ET A. SCHRAM
Ribosomes et glycogene des gastrules
91
(b) Pendant la maturation, c'est d'abord entre les granules de glycogene que
le cytoplasme commence a se transformer de facon caracteristique (Van Gansen,
19666; Brachet, Hanocq & Van Gansen, 1969).
(c) Apres la fecondation, des polygranules apparaissent dans la region
corticale du pole animal (Van Gansen, 19666, et observations cytochimiques
inedites).
Nous avons observe du glycogene /? dans tout le cytoplasme de l'oeuf mais
distribue suivant un gradient decroissant du pole animal au pole vegetatif, les
gradients des ribonucleoproteines et du glycogene se superposant. Nous avons
pu verifier ce fait sur des oeufs fecondes fixes au formaldehyde en colorant in toto
une moitie de chaque oeuf par l'Unna et l'autre par le PAS. Des digestions de
demi-oeufs par l'amylase ou la ribonuclease nous ont permis de controler la
specificite des colorations employees.
(d) Au debut de la segmentation, le cytoplasme redevient homogene, peuple
de ribosomes meles a du glycogene /? et aux polygranules; les plages a polygranules sont frequemment accolees aux plaquettes vitellines. Dans les blastules,
le cytoplasme des blastomeres du pole animal presente un aspect en mosaique,
les plages denses a ribosomes alternant avec les plages claires a glycogene /? et a
polygranules (Van Gansen, 1967).
(<?) Enfln, au debut de la gastrulation ce phenomene de segregation du glycogene s'accentue et les vesicules extracellulaires a glycogene /? et a polygranules
apparaissent dans les territoires animaux et dorsaux de l'embryon.
Rappelons ici que le metabolisme des glucides se modifie de facon importante
dans les embryons de Batraciens a partir de la gastrulation (revue dans Brachet,
1960; Barbieri & Gil, 1962; Legname & Barbieri, 1962; Barbieri, Raisman et
Albarracin, 1967). Signalons enfln que Fouquet (1968), employant la technique
de Thiery observe des vesicules extracellulaires a glycogene dans les tubes seminiferes de Hamster.
6. Distribution des structures ribosomiales dans lesjeunes embryons de Xenope
Notre experience actuelle de la cytochimie des polysaccharides et des nucleoproteines dans les embryons de Batraciens, nous permet de tirer quelques conclusions de l'ensemble de nos observations sur les structures ribosomiales des
jeunes embryons de Xenope.
FIGURE 10
A. Blastomere dorsal de gastrule de Xenope. Le noyau (N) presente une invagination caracteristique (Heche). Des vesicules ergastoplasmiques l'entourent (Er). Aid.
glut.-Os., Araldite, uranyle-plomb. x 15.000.
B. Meme legende que fig. A. Des vesicules ergastoplasmiques {Er) sont presentes
dans l'invagination cytoplasmique. x 16.000.
C. Coupe tangentielle d'une invagination cytoplasmique de noyau. Des annelets
(A) et des polyribosomes (cartouche) sont visibles. Os., Araldite, plomb. x 22.000;
cartouche: x 50.000.
Eau
Eau ou amylase
Eau ou amylase
Eau
RNase
Eau
RNase
GMA
GMA
GMA
GMA
AG
AG
IT r
Vestopal
Araldite
AG
AG + indium
Pb
Vestopal
Formol ou
acroleine
AU + Pb
AU+Pb
AU + Pb
AU+Pb
Pb
Pb
Pb
Pb
Araldite
Vestopal
Epon
IT
I
Epon
Araldite
AU + Pb
AU + Pb
AU + Pb
AU + Pb
Proteinate d'Ag.
AG
AG
AG
KMnO 4
KMnO 4
Acides nucleiques
V
amylase
Vestopal
Araldite
GMA
AG + OsO4
AG + OsO4
AG + OsO4
IV
Araldite
AG + OsO4
III
—
+
-1-
+
+
+
+
+
—
—
_
AU
Araldite
Araldite
AG + OsO4
OsO4
Proteinate d'Ag.
—
—
AU
Double
Araldite
AG + OsO4
11
Double
HIO4 + thiosemicarbazide
HlO 4 + thiosemicarbazide
_
Pb
_
+
+
Pb
Pb
+
+
Ribosomes
AU + Pb
AU + Pb
Colorations
HIO4
HIO4
Oxydation
Araldite
Araldite
OsO4
Digestion
AG + OsO4
Araldite
Araldite
Araldite
Enrobage
AG + OsO4
AG + OsO4
OsO4
Fixation
(impregnation)
I
Glycogene
Contraste
general
Substances
mises en
evidence
Tableau 1
—
—
-
+
.
.
.
—
-
-
.
.
—
+
+
+*
—
.
—
+
+
+
.
* Modifie
— (?)
—
+
+
+
+
+
Cet article
Rosati (1967)
Sabatini
(1964)
Marinozzi
(1963),
p. 146
Minio Paluello &
Rosati
(1968)
Watson &
Aldridge;
cet article
Leduc &
Bernhard
(1967)
Cet article
Rosati (1967)
Cet article
Perry (1967);
cet article
Luft(1956)
Cet article
Cet article
Perry (1967);
cet article
RevelKarnovsky
Cet article
Thiery (1967)
Cet article
(\
Qi£SX\
\Yy\ij)
Cet article
Cet article
Reynolds
+
+*
.
+
Auteurs
Glyco- Glycogene a gene p
ohe
>
H
tn
m
on
o
>
•
K
Ribosomes et glycogene des gastrules
93
(a) Dans Foocyte mur, nous avions observe (Van Gansen, 1966 a, 1967) que
les granules mesures a l'aide d'un analyseur semi-automatique Zeiss avaient
un diametre significativement plus grand (30 nm) que celui des granules
d'oocytes plus jeunes, des oeufs vierges, des oeufs fecondes, d'embryons au stade
8 et de morulas (26 nm). Ces mensurations ayant ete operees sur des populations
mixtes de ribosomes et de glycogene /? sont evidemment entachees d'une erreur
qui les rend ininterpretables: elles doivent etre refaites.
(b) Apres la maturation, ies ribosomes, beaucoup plus disperses que dans
l'oocyte, sont suspendus dans une trame cytoplasmique modifi.ee (Van Gansen,
1966a).
(c) La fecondation, en dehors des phenomenes corticaux, ne modifie pas
l'aspect general du cytoplasme et en particulier des structures ribosomiales.
(d) Au cours de la segmentation, le cytoplasme, dans le pole animal, presente
une mosaique de plages denses a ribosomes et de plages claires a polysaccharides
(Van Gansen, 1967), on y voit apparaitre de rares petites vesicules ergastoplasmiques. Ce fait explique probablement qu'il ait ete impossible jusqu'a present
d'extraire des polyribosomes d'oeufs en segmentation de Xenope alors que la
presence de m-RNA (Brown, 1965; Denis, 19666) et la synthese de proteines
(Brachet, 1965; Legros & Brachet, 1965) y ont ete demontrees. Brown (1965) a
publie une micrographie d'ceuf en segmentation de Xenope montrant une plage
a 'polyribosomes'. Nous pensons qu'il s'agit en fait d'une plage a polygranules.
(e) Dans les gastrules, nous avons observe des polyribosomes libres dans le
cytoplasme surtout a proximite du noyau. Mais il semble bien que la plupart
de ces organites soient fixes au niveau du systeme ergastoplasmique en voie de
developpement.
Les blastomeres des territoires animaux et dorsaux se distinguent des autres
territoires embryonnaires par des caracteres qui paraissent favorables a l'idee
d'une augmentation des echanges nucleo-cytoplasmiques dans ces cellules:
(1) les invaginations cytoplasmiques dans le noyau (deja decrites dans les ectoblastes de gastrules de triton par Karasaki, 1959), (2) les polyribosomes libres
presents dans ces invaginations, (3) les vesicules ergastoplasmiques du cytoplasme voisin du noyau.
Nous devons a Karasaki (1964, 1965) et a Hay & Gurdon (1967) des etudes
tres precises sur revolution de l'ultrastructure des corps nucleolaires dans les
jeunes stades de Triton et de Xenope. Les noyaux des embryons en segmentation
contiennent de petits corps nucleolaires purement fibrillaires; au moment de la
gastrulation, des granules de type ribosomial apparaissent parmi les fibrilles.
Nous avons observe la presence d'invaginations cytoplasmiques et de polyribosomes perinucleaires tant dans des blastomeres presentant encore des
nucleoles purement fibrillaires que dans des cellules a nucleoles plus differencies.
Nos observations sont done dans l'ensemble en bon accord avec les donnees
biochimiques relatives a l'embryogenese du Xenope. La synthese du RNA
ribosomial peut etre mise en evidence (Decroly, Cape & Brachet, 1964; Brown
94
P. VAN GANSEN ET A. SCHRAM
& Littna, 1964) precisement au moment ou de l'uridine-H3 commence a
s'incorporer dans le RNA nucleolaire (Karasaki, 1965, observations portant
sur le triton). La synthese du RNA de transfert commence egalement a ce stade
(Brown & Littna, 19666). Enfin, la synthese des RNA messagers est stimulee
(Brown & Littna, 1966 a; Denis, 1966 a), meme chez les mutants anucleoles qui,
par ailleurs, ne font pas de synthese de r-RNA (Brown & Gurdon, 1966).
L'actinomycine empeche, d'ailleurs, la gastrulation des embryons et non leur
segmentation (Flickinger, 1963; Wallace & Elsdale, 1963; Brachet, Denis &
de Vitry, 1964; Denis, 1964a). Denis a controle que l'antibiotique bloquait
effectivement la synthese de RNA (19646) et, a plus longue echeance, celle des
proteines (1964c). De plus, Denis (19666) a montre que la variete des RNA
messagers synthetises est d'autant plus grande que le developpement embryonnaire est avance. Enfin, plusieurs auteurs ont montre, soit par autoradiographie
(Denis, 19646; Bachvarova, Davidson, Allfrey &Mirsky, 1966; Brahma, 1966)
soit par isolement biochimique (Waddington & Perkowska, 1965; Flickinger,
Greene, Kohl & Miyagi, 1966) que les syntheses de RNA etaient plus fortes dans
les regions dorsales que dans les regions ventrales des embryons aux differents
stades etudies (gastrule, neurule, bourgeon caudal). De plus, Flickinger et al.
(1966) montrent que les syntheses de D-RNA sont plus variees dans les regions
dorsales des embryons.
Signalons enfin, pour conclure, que nous n'avons pas observe de degradation
de plaquettes vitellines dans les differents territoires des gastrules de Xenope.
Karasaki (1963) a relate que les plaquettes commencent a se degrader dans les
territoires animaux des le stade blastula chez Rana pipiens, a partir du stade
gastrula chez Triturus pyrrhogaster. Chez Xenopus laevis, le phenomene est
apparemment encore plus tardif.
RESUME
1. La distribution des structures ribosomiales et du glycogene est etudiee dans
les territoires animaux, dorsaux, ventraux et vegetatifs de jeunes gastrules de
Xenopus laevis a l'aide de techniques de cytochimie ultrastructurale.
2. L'ensemble de ces techniques, resume dans le tableau 1, est critique.
L'emploi de colorations et de digestions specifiques des ribonucleoproteines ou
du glycogene permet de distinguer avec surete les ribosomes du glycogene /?. Le
glycogene /? ne presente pas exactement les memes proprietes cytochimiques
que le glycogene a.
3. Dans les embryons de Xenope, des granules ressemblant au glycogene /?
par leur taille et leurs proprietes cytochimiques s'associent frequemment en
chainettes plus ou moins longues et parfois ramifiees. Nous designons ces
chainettes par le terme de 'polygranules'. Leur nature est discutee.
4. Dans les gastrules, il existe des vesicules extracellulaires de 1 a 5/t de
diametre, coincees entre les blastomeres: elles paraissent ne contenir que des polygranules et du glycogene.
Ribosomes et glycogene des gastrules
95
5. La distribution des polysaccharides varie au cours des premieres etapes de
Fembryogenese (maturation, fecondation, segmentation et gastrulation). Les
polygranules apparaissent dans le cortex de l'ceuf apres la fecondation. Au cours
de Ja segmentation, les plages a glycogene /? et a polygranules se segregent du
reste du cytoplasme. Les vesicules extracellulaires a polygranules se forment au
moment de la gastrulation. Tous ces phenomenes commencent dans les regions
animates et dorsales de l'embryon et y sont plus marques que dans le pole
vegetatif.
6. Au moment de la gastrulation, les blastomeres animaux et dorsaux
se distinguent egalement des autres cellules embryonnaires par l'existence
de minces invaginations cytoplasmiques dans les noyaux, la presence de
polyribosomes libres dans ces invaginations et le developpement de vesicules
ergastoplasmiques qui s'etendent de la region perinucleaire a la peripherie des
blastomeres. Les nucleoles de ces dernieres sont tantot encore uniquement
ftbrillaires, tantot granulo-fibrillaires.
7. Chez Xenopus laevis, la degradation des plaquettes vitellines n'est pas
encore perceptible au moment de la gastrulation.
SUMMARY
A study of the ribosomes and ofglycogen in gastrulae of
Xenopus laevis by cytochemical electron microscopy
1. The localization of ribosomes and glycogen has been studied in the animal,
dorsal, ventral and vegetal parts of young gastrulae of Xenopus laevis by means
of ultrastructural cytochemical techniques.
2. All the techniques used are summarized in Table 1 and criticized. Various
specific methods of staining or digesting ribonucleoproteins or glycogen have
made the unequivocal distinction of ribosomes from /?-glycogen possible. In
some cytochemical methods, /?-glycogen reacts somewhat differently from
a-glygocen.
3. In Xenopus embryos, granules very similar to /9-glycogen associate frequently in chains of variable lengths and shapes. These chains are called 'polygranules' and their nature is discussed.
4. Between the blastomeres, in the gastrula, we have observed extracellular
vesicles with a diameter ranging from 1 to 5 fi. These apparently contain nothing
but polygranules and ^-glycogen.
5. The localization of the polysaccharides changes during early embryogenesis (maturation, fertilization, cleavage and gastrulation). The polygranules
appear in the cortex of the egg just after fertilization. During cleavage, areas of
/?-glycogen or polygranules segregate from the rest of the cytoplasm. The
polygranule-rich extracellular vesicles appear between the blastomeres at
gastrulation. All these phenomena start in the animal and dorsal regions of the
embryo and are more apparent there than they are in the vegetal pole.
96
P. VAN GANSEN ET A. SCHRAM
6. At gastrulation, the dorsal and animal blastomeres show several characteristics: small cytoplasmic invaginations invade the nucleus, free polyribosomes
are observed in these invaginations, and ergastoplasmic vesicles extend from the
perinuclear region to the periphery of the blastomeres. The nucleoli of these
cells are sometimes fibrillar and sometimes granulo-fibrillar.
7. In Xenopus laevis embryos, degradation of the yolk platelets is not yet
visible at gastrulation.
Ce travail a ete execute dans le cadre du contrat Euratom-ULB 007-61-10BiAB.
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REYNOLDS,
(Manuscrit regu le 25 novembre 1968)